Method Article

استنساخ المكوك القائم على كريسبر: طريقة استنساخ عالية الإنتاجية

DOI:

10.3791/68503

⸱

June 13th, 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Institute of Biochemistry and Molecular Biology, Hengyang Medical School, University of South China, 2Clinical Research Institute, The Affiliated Nanhua Hospital, Hengyang Medical School, University of South China, 3Department of Clinical Laboratory, The Affiliated Nanhua Hospital, Hengyang Medical School, University of South China, 4Shanghai Diabetes Institute, Shanghai Key Laboratory of Diabetes Mellitus, Shanghai Clinical Center for Diabetes, Shanghai Sixth People's Hospital Affiliated to Shanghai Jiao Tong University School of Medicine

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نصف بروتوكولا لطريقة الاستنساخ عالية الإنتاجية ، الاستنساخ المكوكي القائم على كريسبر (استنساخ CRISPRshuttle) ، والذي يسمح بنقل شظايا الحمض النووي ذات الأهمية بين النواقل دون الحاجة إلى تضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل لشظايا الحمض النووي.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعد تطوير مكتبات البلازميد على مستوى الجينوم باستخدام مستودعات الجينوم الحالية بمثابة شرط أساسي محوري للتوصيف الوظيفي المنهجي للجينات عبر العمليات البيولوجية المتنوعة. ومع ذلك ، فإن المنهجيات الحالية عالية الإنتاجية لنقل شظايا الحمض النووي بين الناقلات تتطلب تضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل للتسلسلات المستهدفة قبل الاستنساخ ، مما يجعل إنشاء مجموعات البلازميد على نطاق الجينوم متطلبا تقنيا ويستغرق وقتا طويلا. من خلال الاستفادة من كاسيت CRISPRshuttle ، قمنا بتطوير طريقة استنساخ جديدة عالية الإنتاجية ، وهي استنساخ المكوك القائم على CRISPR (استنساخ CRISPRshuttle) ، والتي تسهل نقل العديد من شظايا الحمض النووي من البلازميدات المانحة التي تشترك في تسلسلات العمود الفقري المتطابقة إلى ناقل متوافق مع CRISPRshuttle دون تضخيم PCR لشظايا الحمض النووي. هنا ، نقدم بروتوكولا ل CRISPRshuttle. يتضمن هذا البروتوكول تفاعلين متسلسلين لأنبوب الاختبار قبل التحول البكتيري. أولا ، يتم استئصال شظايا الحمض النووي المستهدف من البلازميدات المانحة عن طريق الانقسام بوساطة Cas9 لتسلسل العمود الفقري المتجه المشترك. ثانيا ، يتم إدخال شظايا الحمض النووي المستأصل في نواقل خطية متوافقة مع CRISPRshuttle من خلال تجميع جيبسون. تظهر نتائجنا أن كفاءة CRISPRshuttle تتجاوز 94٪ وأن باحثين اثنين يمكنهما توليد حوالي 300 بلازميد في 7 أيام باستخدام CRISPRshuttle. يسهل CRISPRshuttle نقل شظايا الحمض النووي بكفاءة وقابلية للتكيف والفعالة من حيث التكلفة بين النواقل ، مما يبسط بشكل كبير توليد مكتبة البلازميد على مستوى الجينوم.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعد إنشاء مكتبات البلازميد على مستوى الجينوم من الموارد المتاحة هو الأساس والشرط الأساسي لاستخدام علم الجينوم الوظيفي لتشريح العمليات البيولوجية. تتطلب طرق الاستنساخ الحالية عالية الإنتاجية ، بما في ذلك أنظمة الاستنساخ Gateway و In-Fusion و Creator و Univector ، تضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل لشظايا الحمض النووي المستهدف1،2،3،4،5. يستلزم هذا الشرط الأساسي مهام سير عمل معالجة خاصة بالجزء تشمل العديد من العمليات القياسية ، بما في ذلك على سبيل المثال لا الحصر تصميم أولي قليل النوكليوتيدات ، وتنقية الهلام ، والتحقق من صحة التسلسل من خلال التسلسل. نتيجة لذلك ، أصبح إنشاء مكتبات البلازميد على مستوى الجينوم (على سبيل المثال ، مكتبات التعبير المفرط عن cDNA / ORF) كثيف العمالة ويستغرق وقتا طويلا ، مما يعيق تقدم علم الجينوم الوظيفي.

في السابق ، قمنا بتطوير CRISPRmass ، وهي طريقة استنساخ عالية الإنتاجية مصممة لدمج أجزاء معينة من الحمض النووي (على سبيل المثال ، وحدة UAS) في بلازميدات متعددة تشترك في العمود الفقري المتطابق6. باستخدام CRISPRmass ، قمنا ببناء أكثر من 5,500 بلازميد UAS-cDNA / ORF قائم على GAL4 / UAS من مكتبة ذبابة الفاكهة cDNA / ORF ، مجموعة الذهب6 لمركز موارد ذبابة الفاكهة الجينومية (DGRC). ومع ذلك ، فإن CRISPRmass تفتقر إلى القدرة على نقل شظايا الحمض النووي بين المتجهات ، مما يحد من تطبيقه في الاستنساخ عالي الإنتاجية.

لمعالجة هذه القيود ، قمنا بتطوير استنساخ المكوك القائم على كريسبر (CRISPRshuttle) ، وهي طريقة جديدة عالية الإنتاجية تسهل نقل شظايا متعددة من الحمض النووي المستهدف إلى نواقل الوجهة من البلازميدات المانحة7. تتطلب هذه العملية تفاعلين متسلسلين فقط لأنبوب الاختبار ، وبالتالي التحايل على متطلبات التعامل مع أجزاء محددة لأهداف الحمض النوويالمنفصلة 7.

يتضمن بروتوكول CRISPRshuttle تفاعلين متسلسلين لأنبوب الاختبار (الشكل 1). أولا ، يتم شق تسلسلات العمود الفقري المتجهات المشتركة للبلازميدات المانحة بواسطة Cas9 / sgRNA لإطلاق شظايا الحمض النووي المستهدفة. ثم يتم نقل هذه الأجزاء إلى كاسيت CRISPRshuttle لناقل متوافق مع CRISPRshuttle عبر تجميع Gibson لتوليد البلازميدات النهائية. يشتمل كاسيت CRISPRshuttle على تسلسل العمود الفقري المتجه ~ 20-40 نقطة أساس الذي يحيط بالأطراف 5 و 3 من شظايا الحمض النووي الناشئة عن البلازميدات المانحة ، وموقع أو موقعين فريدين للتعرف على إنزيم التقييد الموجودين بين هذه التسلسلات المرافقة. يتم إنشاء متجه متوافق مع CRISPRshuttle عن طريق إدخال كاسيت CRISPRshuttle في متجه وجهة ، والذي يتم خطيته لاحقا عن طريق استيعاب مواقع التقييد داخل الكاسيت. يجب أن يحمل ناقل الوجهة جينا لمقاومة المضادات الحيوية متميزا عن تلك الموجودة في البلازميدات المانحة. إذا كان متطابقا ، فيجب استبدال جين المقاومة بآخر مميز قبل الاستخدام.

هنا ، نقدم بروتوكولا مفصلا باستخدام CRISPRshuttle لبناء مكتبة بلازميد UAS-cDNA / ORF. تتضمن هذه العملية نقل ORFs البشرية من مكتبة التعبير الفيروسي العريض CCSB إلى ذبابة الفاكهة ناقل التحول pBID-UASC8،9. يبسط CRISPRshuttle بناء مكتبات البلازميد على مستوى الجينوم ، وبالتالي تسهيل دراسات الجينوم الوظيفية.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. تحديد مواقع الانقسام المثلى Cas9 / sgRNA التي تحيط ب cDNA / ORF

  1. تحضير بلازميدات cDNA / ORF
    1. الحصول على نسخ cDNA / ORF من المستودعات العامة.
      ملاحظة: يستخدم هذا البروتوكول استنساخ ORF المستند إلى المتجهات pLX304 من مكتبة تعبير Lentiviral البشرية على نطاقواسع CCSB 8.
    2. عزل البلازميد باستخدام مجموعة أدوات التحضير المصغر للبلازميد وقياس تركيزه باستخدام مقياس الطيف الضوئي.
  2. تصميم sgRNA
    1. قم بالوصول إلى موقع CHOPCHOP (https://chopchop.cbu.uib.no/). الصق منطقة 20-100 نقطة أساس من العمود الفقري المتجه pLX304 الذي يحيط بنهاية ORF 3 في الحقل المستهدف.
    2. حدد ذبابة الفاكهة السوداء كنوع وانقر فوق البحث عن المواقع المستهدفة. حدد مرشحي sgRNA الذين من المتوقع أن تكون كفاءتهم أكثر من 80٪.
  3. تحضير sgRNA
    1. قم بتجميع برايمر أمامي (5′-TAATACGACTCACTATAGG (N) 20GTTTTAGAGAGCTAGAAATAG-3 ′) حيث يمثل (N) 20 التسلسل المستهدف sgRNA ، والتمهيدي العكسي sgRNA-REV (5′- AAAAGCACCGACTCGGTGCCACTT-3′).
      ملاحظة: يوصى باستخدام بادئات منقاة ب PAGE.
    2. قم بإنشاء قالب DNA ل sgRNA في النسخ المختبري (IVT) عبر تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR). إعداد تفاعل 100 ميكرولتر يحتوي على 5 ميكرولتر لكل من قالب pX330 (بلازميد Addgene 42230 ؛ 0.1 نانوغرام / ميكرولتر) ، التمهيدي الأمامي (10 ميكرومتر) ، والتمهيدي sgRNA-REV (10 ميكرومتر) ؛ 50 ميكرولتر من مزيج رئيسي PCR عالي الدقة 2x ؛ و 35 ميكرولتر من المياه فائقة النقاء المعالجة بثنائي إيثيل بيروكربونات (DEPC).
    3. تضخيم في جهاز تدوير حراري PCR باستخدام البرنامج التالي: 98 درجة مئوية لمدة 30 ثانية ؛ 5 دورات من 98 درجة مئوية لمدة 8 ثوان ، 52 درجة مئوية لمدة 15 ثانية ، 72 درجة مئوية لمدة 5 ثوان ؛ 30 دورة من 98 درجة مئوية لمدة 8 ثوان ، 72 درجة مئوية لمدة 20 ثانية ؛ 72 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة.
    4. قم بحل منتجات تفاعل البوليميراز المتسلسل على جل الاغاروز بنسبة 0.8٪. استئصال النطاق ~ 120 نقطة أساس وتنقية باستخدام مجموعة استخراج الجل.
    5. قم بإعداد تفاعل IVT سعة 10 ميكرولتر يحتوي على 300 نانوغرام من جزء الحمض النووي المنقى ، و 3.33 ميكرولتر من مزيج NTP العازلة ، و 0.67 ميكرولتر من مزيج بوليميراز T7 RNA ، والماء عالي النقاء المعالج ب DEPC. احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 4 ساعات.
    6. قم بتحديد كمية sgRNA غير المنقى عن طريق القياس الطيفي الضوئي ، وتخفيفه إلى 20 نانوغرام / ميكرولتر بالماء فائق النقاء المعالج ب DEPC ، والتجميد عند -80 درجة مئوية في كميات صغيرة.
      ملاحظة: علاج DNase غير ضروري ، لأن الحمض النووي المتبقي لا يتداخل مع التفاعلات النهائية.
  4. تقييم sgRNA
    1. هضم بلازميد cDNA / ORF الذي يحتوي على العمود الفقري للناقل pLX304 باستخدام إنزيم تقييد. قم بحل شظايا الحمض النووي الناتجة عن طريق هلام الاغاروز بنسبة 0.8٪. قم بتنقية ركيزة الحمض النووي باستخدام مجموعة استخراج الجل.
    2. قم بإعداد خليط تفاعل الانقسام Cas9 سعة 5 ميكرولتر يحتوي على 0.2 ميكرولتر من 1.22 ميكرومتر S. pyogenes Cas9 ، 0.5 ميكرولتر من 20 نانوغرام / ميكرولتر sgRNA ، 0.015 ميكرومول من ركيزة الحمض النووي ، 0.5 ميكرولتر من 10x Cas9 Buffer ، وماء عالي النقاء معالج ب DEPC. احتضان التفاعل عند 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة.
    3. قم بحل منتجات الانقسام باستخدام جل الاغاروز 0.8٪. قم بتضمين ركيزة الحمض النووي غير المشقوقة كعنصر تحكم سلبي.
    4. تصور أنماط الانقسام باستخدام نظام تصوير رقمي وحدد sgRNA مع الحد الأدنى من الركيزة غير المشقوقة المتبقية للتجارب اللاحقة (الشكل 2).

2. تبديل جين مقاومة المضادات الحيوية لناقل الوجهة

ملاحظة: في هذا البروتوكول ، نستخدم مثال مبادلة جين مقاومة الأمبيسلين لناقل الوجهة pBID-UASC بجين مقاومة الكلورامفينيكول ، وبالتالي توليد ناقل الوجهة الحامل للكلورامفينيكول pBIDC-UASC.

  1. قم بإزالة جين مقاومة الأمبيسلين من pBID-UASC.
    ملاحظة: تمت إزالة جين مقاومة الأمبيسلين ل pBID-UASC عن طريق هضم Cas9 بالاقتران مع اثنين من sgRNAs ، f1Ori5-G4 (التسلسل المستهدف: 5'-GTCACGGGTTGTAAAACGA-3') و Amp3-G2 (التسلسل المستهدف: 5'-GGAACGAAAACTCACGTTAA-3') ، مما أدى إلى 7،687 نقطة أساس من العمود الفقري الخطي pBID-UASC. يستهدف هذان النوعان من sgRNA 5 'المنبع و 3' في اتجاه مجرى جين مقاومة الأمبيسلين ، على التوالي.
    1. قم بإعداد تفاعل انقسام 10 ميكرولتر يحتوي على 0.03 ميكرولتر من pBID-UASC ، و 0.25 ميكرولتر من 1.22 ميكرومولار S. pyogenes Cas9 ، و 20 نانوغرام من f1Ori5-G4 ، و 20 نانوغرام من Amp3-G2 ، و 1 ميكرولتر 10x Cas9 Buffer ، وماء فائق النقاء معالج ب DEPC. احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة.
      ملاحظة: يخضع البلازميد المشقوق Cas9 ، بدون تنقية ، مباشرة لتجميع جيبسون.
  2. PCR- تضخيم جين مقاومة الكلورامفينيكول.
    ملاحظة: تم تضخيم جين مقاومة الكلورامفينيكول بمقدار 840 نقطة أساس من البلازميد pMartini-Cam6 بواسطة تفاعل البوليميراز المتسلسل باستخدام f1Ori5-Cam-F (5'-TTACAATTCACTGGCC
    GTCGCGTATGTGTATGATACATAAGGTT-3') و Amp3-Cam-R (5'-AGTGGAACGAAAACTCAC
    GTAATTCTCATGTTTGACAGC-3') بادئات.
    1. تحضير جين مقاومة الكلورامفينيكول عن طريق تفاعل البوليميراز المتسلسل لتضخيم جين مقاومة الكلورامفينيكول 840 نقطة أساس. قم بإعداد تفاعل PCR سعة 20 ميكرولتر يحتوي على 2 ميكرولتر من pMartini-Cam (0.1 نانوغرام / ميكرولتر) ، 1 ميكرولتر من f1Ori5-Cam-F (10 ميكرومتر) ، 1 ميكرولتر من Amp3-Cam-R (10 ميكرومتر) ، 4 ميكرولتر من 5x عازلة ، 0.4 ميكرولتر من dNTPs (10 مللي متر) ، 0.4 ميكرولتر من بوليميراز الحمض النووي عالي الدقة (2.5 وحدة / ميكرولتر) ، 11.2 ميكرولتر من الماء عالي النقاء.
    2. قم بإجراء تفاعل البوليميراز المتسلسل باستخدام ظروف التدوير الحراري التالية: دورة واحدة من 95 درجة مئوية لمدة دقيقة واحدة ؛ 5 دورات من 95 درجة مئوية لمدة 15 ثانية ، 46 درجة مئوية لمدة 15 ثانية ، 72 درجة مئوية لمدة 20 ثانية ؛ 30 دورة من 95 درجة مئوية لمدة 15 ثانية ، 61 درجة مئوية لمدة 15 ثانية ، 72 درجة مئوية لمدة 20 ثانية ؛ 1 دورة 72 درجة مئوية لمدة دقيقتين. قم بإجراء التفاعل في جهاز تدوير حراري.
    3. قم بحل منتجات الانقسام بواسطة 0.8٪ جل الاغاروز وتنقية جزء من الحمض النووي 840 نقطة أساس باستخدام مجموعة استخراج الجل.
  3. أدخل جين مقاومة الكلورامفينيكول في العمود الفقري الخطي لناقل pBID-UASC ، مما ينتج عنه pBIDC-UASC.
    1. قم بإجراء تفاعل تجميع جيبسون 2 ميكرولتر: 0.008 ميكرومول من جين مقاومة الكلورامفينيكول 840 نقطة أساس ، 0.002 ملي مول من pBID-UASC الخطي (الخطوة 2.1.1) ، 1.0 ميكرولتر من مزيج تجميع جيبسون 2x. قم بإجراء التفاعل عند 50 درجة مئوية لمدة 1 ساعة.
    2. تحويل 10 ميكرولتر من بكتريا قولونية الخلايا المختصة ب 1 ميكرولتر من ناتج تفاعل الربط. حدد المحولات على صفيحة LB مكملة ب 15 ميكروغرام / مل كلورامفينيكول.
    3. اختر مستعمرة واحدة وأخضعها للثقافة البكتيرية اللاحقة والتحضير المصغر للبلازميد. التحقق من ناقل الوجهة الحامل للكلورامفينيكول pBIDC-UASC عن طريق تحليل التقييد وتسلسل الحمض النووي.

3. بناء ناقلات الوجهة المتوافقة مع CRISPRshuttle

ملاحظة: يشتمل كاسيت CRISPRshuttle على حوالي 20-40 نقطة أساس من تسلسلات العمود الفقري المتجه التي تحيط بطرفي 5 و 3 من شظايا الحمض النووي المستهدف ، مع وجود موقع أو موقعين فريدين للتقييد بينهما.

  1. قليل النوكليوتيدات الصلبة باستخدام جهاز تدوير حراري مع البرنامج التالي: 94 درجة مئوية لمدة دقيقتين ؛ 70 دورة من 52 ثانية عند (95-N) °C ، حيث يمثل N رقم الدورة.
    ملاحظة: يحتوي كاسيت CRISPRshuttle الملدن على 5 بوصات متدلية مكملة ل EcoRI و XbaI.
  2. قم بربط كاسيت CRISPRshuttle الملدن في متجه الوجهة المهضوم EcoRI / XbaI pBIDC-UASC لإنشاء متجه الوجهة المتوافق مع CRISPRshuttle pBIDC-UASC-pLXvect.
    ملاحظة: يزيل هذا الربط مواقع EcoRI و XbaI الأصلية داخل مواقع الاستنساخ المتعددة ، مما يجعل مواقع EcoRI و XhoI في منتصف كاسيت CRISPRshuttle فريدة من نوعها في المتجه النهائي. تتيح مواقع التقييد الفريدة في كاسيت CRISPRshuttle خطية متجه الوجهة المتوافق مع CRISPRshuttle.
    1. قم بإعداد تفاعل ربط 5 ميكرولتر يحتوي على 14 نانوغرام من 8،451 نقطة أساس من pBIDC-UASC المهضوم EcoRI / XbaI ، و 0.02 مليون دولار من كاسيت CRISPRshuttle الملدن ، و 0.5 ميكرولتر من 10x T4 DNA ligase buffere ، 0.3 ميكرولتر من T4 DNA ligase. احتضان التفاعل طوال الليل عند 16 درجة مئوية.
    2. قم بتحويل 10 ميكرولتر من الخلايا المختصة بالإشريكية القولونية ب 1 ميكرولتر من ناتج تفاعل الربط. حدد المحولات على صفيحة LB مكملة ب 15 ميكروغرام / مل كلورامفينيكول وتحتضن طوال الليل عند 37 درجة مئوية.
    3. اختر مستعمرة واحدة وأخضعها للثقافة البكتيرية اللاحقة والتحضير المصغر للبلازميد. تحقق من متجه الوجهة المتوافق مع CRISPRshuttle pBIDC-UASC-pLXvect عن طريق تحليل التقييد وتسلسل الحمض النووي.

4. توليد بلازميدات UAS-cDNA / ORF باستخدام CRISPRshuttle

ملاحظة: يتضمن بروتوكول CRISPRshuttle تفاعلات أنبوب اختبار من خطوتين يتم إجراؤها بالتوازي قبل التحول البكتيري (الشكل 1).

  1. تفاعل أنبوب الاختبار الخطوة 1
    1. ORFs المكوس من بلازميدات pLX304-ORF عن طريق شق العمود الفقري للناقل باستخدام Cas9 بالاقتران مع اثنين من sgRNAs ، pLX304-CMV-G16 (التسلسل المستهدف: 5'-GAGCTCTCTGGCTAACTGTC-3 '، مترجمة في العمود الفقري المتجه pLX304 الذي يحيط بنهاية ORF 5') و pLX304-3'-G1 (التسلسل المستهدف: 5'-TTGGTCTTAAAGTCGACGGGGG-3' ، مترجمة في العمود الفقري المتجه pLX304 الذي يحيط بنهاية ORF 3').
      1. قم بإعداد مزيج رئيسي لعدد معين (N) من تفاعلات الهضم على النحو التالي: (N + 1) × 0.4 ميكرولتر من 1.22 ميكرومتر S. pyogenes Cas9 ، (N + 1) × 0.5 ميكرولتر من 80 نانوغرام / ميكرولتر pLX304-CMV-G1 ، (N + 1) × 0.5 ميكرولتر من 80 نانوغرام / ميكرولتر pLX304-3'-G1 ، (N + 1) × 0.4 ميكرولتر من 10x Cas9 Buffer ، و (N + 1) × 1.45 ميكرولتر من الماء عالي النقاء المعالج ب DEPC.
      2. تخلط جيدا وتدور المزيج الرئيسي. Aliquot 3.75 ميكرولتر من المزيج الرئيسي لكل أنبوب. أضف 0.75 ميكرولتر من 0.03 ميكرومتر pLX304-ORF البلازميد إلى كل أنبوب. تخلط جيدا وتحتضن التفاعلات عند 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة.
        ملاحظة: قم بتخفيف كل بلازميد pLX304-ORF إلى تركيز 0.03 ميكرومتر بماء فائق النقاء معالج ب DEPC. إذا كان التركيز أقل من 0.03 ميكرومتر ، فأضف الحمض النووي البلازميد مباشرة إلى التفاعل. لا تحتاج البلازميدات المشقوقة Cas9 إلى التنقية بعد تفاعلات الانقسام ويمكن استخدامها مباشرة لتجميع جيبسون اللاحق.
  2. تفاعل أنبوب الاختبار الخطوة 2
    1. أدخل ORFs المقطوعة في متجه الوجهة المتوافق مع CRISPRshuttle pBIDC-UASC-pLXvect عبر تجميع Gibson ، مما ينتج عنه بلازميدات UAS-cDNA / ORF.
      1. قم بتلخيص pBIDC-UASC-pLXvect مع EcoRI و XbaI. افصل pBIDC-UASC-pLXvect الخطي عن طريق الرحلان الكهربائي لجل الاغاروز وقم بتنقيتها باستخدام مجموعة استخراج الجل.
      2. قم بإعداد مزيج رئيسي لعدد معين (N) من تفاعلات تجميع جيبسون على النحو التالي: (N + 1) × 0.14 ميكرولتر من 3.36 ميكرومتر pBIDC-UASC-pLXvect خطي ، و (N + 1) × 1.8 ميكرولتر من مزيج تجميع جيبسون الرئيسي.
      3. تخلط جيدا وتدور المزيج الرئيسي. Aliquot 1.94 ميكرولتر من المزيج الرئيسي لكل أنبوب. أضف 1.66 ميكرولتر من البلازميد المشقوق Cas9 إلى كل أنبوب. تخلط جيدا وتحتضن التفاعلات عند 50 درجة مئوية لمدة 1 ساعة.
        ملاحظة: احتفظ بالمزيج الرئيسي وأنابيب الثلج قبل الحضانة عند 50 درجة مئوية.
  3. تحويل الإشريكية القولونية مع منتجات تجميع جيبسون.
    ملاحظة: لا تتطلب منتجات تجميع جيبسون التنقية قبل تحويل الإشريكية القولونية .
    1. قم بإذابة الخلايا البكتيرية المختصة على الجليد. Aliquot 10 ميكرولتر من الخلايا لكل أنبوب 1.5 مل مبرد مسبقا.
      ملاحظة: يوصى باستخدام الخلايا البكتيرية المختصة ذات كفاءة تحويل لا تقل عن 1 × 108 CFU / μg من الحمض النووي pUC19.
    2. امزج 10 ميكرولتر من الخلايا المختصة برفق مع 1 ميكرولتر من منتجات تجميع جيبسون. ضعها على الثلج لمدة 30 دقيقة.
    3. صدمة حرارية عند 42 درجة مئوية لمدة دقيقة واحدة ، ثم تبرد على الثلج لمدة دقيقتين.
    4. أضف 100 ميكرولتر من وسط SOC الدافئ مسبقا (37 درجة مئوية) في كل أنبوب. رج العبوة عند 250 دورة في الدقيقة لمدة ساعة واحدة عند 37 درجة مئوية.
    5. ضع الخلايا على ألواح LB تحتوي على 15 ميكروغرام / مل كلورامفينيكول. احتضان بين عشية وضحاها عند 37 درجة مئوية.
      ملاحظة: عادة ما يتطلب إجراء هذه الإجراءات على نطاق واسع عدة ساعات. ما لم ينص على خلاف ذلك ، احتفظ بكل من الكواشف وإعدادات التفاعل على الجليد.
  4. التحقق من بلازميدات UAS-cDNA / ORF.
    1. تلقيح مستعمرة واحدة في 4.5 مل من وسط LB ب 15 ميكروغرام / مل كلورامفينيكول. رج العبوة عند 250 دورة في الدقيقة طوال الليل عند 37 درجة مئوية.
    2. عزل الحمض النووي البلازميد باستخدام مجموعة أدوات إعداد البلازميد المصغرة.
    3. قم بإعداد تفاعل هضم تقييد 20 ميكرولتر لكل بلازميد يحتوي على 300-500 نانوغرام من الحمض النووي البلازميد ، و 0.3 ميكرولتر من PvuII ، و 2 ميكرولتر من 10x عازلة ، وماء عالي النقاء. قم بإجراء التفاعلات عند 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة.
    4. حل شظايا الحمض النووي بواسطة 0.8٪ هلام الاغاروز. الصورة تحت ضوء الأشعة فوق البنفسجية (الشكل 3).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

استخدمنا CRISPRshuttle لبناء مجموعة بلازميد UAS-cDNA / ORF تغطي 1,397 جينا بشريا محفوظة في ذبابة الفاكهة7. كشف تحليل التقييد أن CRISPRshuttle يصل إلى كفاءة بنسبة 94.5٪ لاستخدام متجهات الوجهة المتوافقة مع CRISPRshuttle التي تحتوي على تسلسلين متكررين و 96.1٪ لاستخدام متجهات الوجهة بدون تتابعاتمتكررة 7. أظهرت بياناتنا أنه بشكل عام ~ 300 بلازميد يمكن إنشاؤها عبر CRISPRshuttle بواسطة باحثين في غضون 7 أيام7. تم التحقق من نقل شظايا cDNA / ORF بوساط...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تتمثل إحدى الخطوات الحاسمة في بروتوكول CRISPRshuttle في إعداد نواقل وجهة خطية متوافقة مع CRISPRshuttle. لضمان الهضم الكامل ، استخدم فائضا من إنزيمات التقييد لهضم النواقل ، ويوصى بشدة بتنقية الهلام للنواقل المهضومة. خطوة أخرى حاسمة هي هضم بلازميدات cDNA / ORF مع Cas9. إذا فشل بناء البلازميد ، فاستخدم الرحلان الكهربائي لهلام الاغاروز للتحقق مما إذا كان قد تم إطلاق cDNA / ORFs جزئيا على الأقل من البلازميدات المانحة. بدلا من ذلك ، تحقق من هضم جميع البلازميدات عن طريق الرحلان الكهربائي قبل ال...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للإفصاح عنه.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم دعم هذه الدراسة بمنحة من المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (32071135) وصندوق بدء التشغيل من مستشفى نانهوا التابع ، كلية الطب في هنغيانغ ، جامعة جنوب الصين. نحن ممتنون للبروفيسور فنغ تشانغ على التفضل بتقديم البلازميد pX330 وللدكتور شياو هوي كاي للمساعدة الفنية.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
مسحوق أجاركيمبيسكيلو بايت - 001 ح
الاغاروزسانجونA600014-0100
نظام تحليل صور الهلام الرقمي الآليتانونتانون 2500 ب
الكلورامفينيكولسانجونA100230-0010
E.Z.N.A. طقم استخراج الجلاوميغاD2500-02
E.Z.N.A. طقم صغير للحمض النووي البلازميد IاوميغاD6942-02
EcoRI-HFنيبR3101S
جيبسون الجمعية ماستر ميكسنيبطراز E2611S
HiScribe T7 طقم تخليق الحمض النووي الريبي السريع عالي الإنتاجيةنيبE2050
NEBuilder HiFi DNA الجمعية ماستر ميكسنيبE2621X
PCR دورة حراريةلونج جينتي 20
بوليميراز الحمض النووي البلاتين SuperFi IIثيرمو ساينتفيك12361010
PvuII-HFنيبR3151L
Q5 بداية ساخنة عالية الدقة 2x ماستر ميكسنيبم 0494
S. pyogenes< / em> Cas9برنامج GenScriptZ03386
حاضنة اهتزازتشيتشوZQLY-180V
مقياس الطيف الضوئيشيمادزوالمواصفات الحيوية نانو
T4 الحمض النووي ليجازبروميجام 1801
Trans < / em>10 خلية مختصة كيميائياترانسجينالقرص المضغوط 101-02
التربتونأوكسويدإل بي 0042
إكسباينيبR0145S
مستخلص الخميرةأوكسويدLP0021

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Hartley, J. L., Temple, G. F., Brasch, M. A. DNA cloning using in vitro site-specific recombination. Genome Res. 10 (11), 1788-1795 (2000).
  2. Brasch, M. A., Hartley, J. L., Vidal, M. Orfeome cloning and systems biology: Standardized mass production of the parts from the parts-list. Genome Res. 14 (10B), 2001-2009 (2004).
  3. Zhu, B., Cai, G., Hall, E. O., Freeman, G. J. In-fusion assembly: Seamless engineering of multidomain fusion proteins, modular vectors, and mutations. Biotechniques. 43 (3), 354-359 (2007).
  4. Liu, Q., Li, M. Z., Leibham, D., Cortez, D., Elledge, S. J. The univector plasmid-fusion system, a method for rapid construction of recombinant DNA without restriction enzymes. Curr Biol. 8 (24), 1300-1309 (1998).
  5. Marsischky, G., Labaer, J. Many paths to many clones: A comparative look at high-throughput cloning methods. Genome Res. 14 (10b), 2020-2028 (2004).
  6. Wei, P., Xue, W., Zhao, Y., Ning, G., Wang, J. CRISPR-based modular assembly of a UAS-cDNA/ORF plasmid library for more than 5500 Drosophila genes conserved in humans. Genome Res. 30 (1), 95-106 (2020).
  7. Liu, X., et al. CRISPR-based shuttle cloning of 1,397 human genes into UAS vectors. Acta Biochim Biophys Sin (Shanghai). , (2025).
  8. Yang, X., et al. A public genome-scale lentiviral expression library of human ORFs. Nat Methods. 8 (8), 659-661 (2011).
  9. Wang, J. W., Beck, E. S., Mccabe, B. D. A modular toolset for recombination transgenesis and neurogenetic analysis of Drosophila. PLoS One. 7 (7), e42102(2012).
  10. Christie, K. A., et al. Precise DNA cleavage using CRISPR-SpRYgests. Nat Biotechnol. 41 (3), 409-416 (2023).
  11. Li, S. Y., Zhao, G. P., Wang, J. C-brick: A new standard for assembly of biological parts using Cpf1. ACS Synth Biol. 5 (12), 1383-1388 (2016).
  12. Lei, C., et al. The CCTL (Cpf1-assisted cutting and taq DNA ligase-assisted ligation) method for efficient editing of large DNA constructs in vitro. Nucleic Acids Res. 45 (9), e74(2017).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

CRISPR Shuttle CloningHigh Throughput CloningGenome Wide Plasmid LibrariesDNA Fragment TransferCas9 Mediated CleavageGibson AssemblyPlasmid Library GenerationDonor PlasmidsVector BackboneFunctional Genomics

Related Articles