مقالة منهجية

في الجسم الحي البيوتينيل القرب لدراسات تفاعل البروتين في Paramecium tetraurelia

1.6K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/68504

⸱

سبتمبر 12, 2025

 ,  ,  , 
1Institute of Cell Biology, University of Bern, 2Graduate School for Cellular and Biomedical Sciences, University of Bern

في هذه المقالة

ملخص

يقدم البروتوكول طريقة للارتباط التساهمي للبيوتين في الجسم الحي بالبروتينات بناء على قربها من البيوتين ليجاز المنصهر ببروتين ذي أهمية. يسمح هذا التعديل بإثراء انتقائي للبروتينات باستخدام حبات الستربتافيدين حسب الحاجة في دراسات تفاعل البروتين.

الملخص

الباراميسيوم هو كائن حي نموذجي رئيسي لدراسة الآليات الجزيئية المشاركة في إعادة الترتيب الجينومي المبرمجة والقضاء على الينقولات أثناء التكاثر الانتصافي. تظل العديد من تفاصيل هذه العملية غامضة بسبب تعقيد الآلية الجزيئية المعنية والتفاعلات العابرة بين البروتين والبروتين. هنا ، نقدم طريقة لوضع العلامات على البروتينات التي تحتوي على البيوتين بالقرب من البروتين المستهدف محل الاهتمام. يمكن بسهولة تكييف الطريقة مع أهداف مختلفة حيث يتم تحقيق البيوتينيل عن طريق حقن الحمض النووي الذي يشفر بروتين مستهدف مدمج في ليغاز البيوتين المصمم هندسيا. يتم التعبير عن بنية الاندماج من محفز الجين الداخلي ، مما يتيح ملف تعريف تعبير خاص بالمرحلة مشابه لملف تعريف البروتين الأصلي. والجدير بالذكر أن جزء البيوتين المرفق تساهميا يسمح بالإثراء الانتقائي للبروتينات المصنفة باستخدام الخرز المطلي بالستريبتافيدين. علاوة على ذلك ، مع تلطيخ التألق المناعي ، نظهر أن وضع العلامات الفعال يتطلب مكملات الثقافة بالبيوتين. يسمح ناقل التعبير المصمم هندسيا بالتوصيل والتشغيل ، جنبا إلى جنب مع إجراء الحقن الفعال الموضح هنا ، بالتوليد السريع لخطوط Paramecium التي تعبر عن بروتين معدل. يمكن متابعة إجراء البيوتينيل الموضح هنا بقياس الطيف الكتلي لتحديد البروتينات المخصبة التي تحتوي على الشركاء المتفاعلين للبروتين المستهدف. يمكن أن يؤدي التحليل البيوتينيلي عن قرب إلى تبسيط وتسريع اكتشاف تفاعلات البروتين والبروتين في Paramecium وتكثيف الجهود لفهم آلية تحرير الجينوم الخاصة به.

المقدمة

يحتوي الكائن أحادي الخلية المهدبي Paramecium tetraurelia على نوعين متميزين من النوى: نواة السلالة الجرثومية للتخزين طويل الأمد للمعلومات الجينية والنواة الجسدية للوظائف الفسيولوجية للخلية1. يتطلب التكاثر الجنسي في هذا الكائن الحي تكوين جينوم جسدي جديد. تتضمن هذه العملية استئصالا لا رجعة فيه لأكثر من 45,000 جزء من الحمض النووي من الجينومالجسدي 2 والتي تتضمن العناصر القابلة للنقل3 والتكرارات الأخرى. اللافت للنظر بشكل خاص هو أن أحداث الاستئصال يتم تنفيذها بدقة وصولا إلى زوج القاعدة الفردي1. هذه الدقة ضرورية بيولوجيا ، نظرا لأن شظايا الحمض النووي المستخرجة تعطل مناطق ترميز البروتين4 وأي استئصال خاطئ يمكن أن يثير طفرات إزاحة الإطار أو أكواد التوقف المبكرة أو تغيير تسلسل ترميز البروتين. تسمح آلية مقارنة الحمض النووي الريبي المعقدة للخلية بالتمييز بين التسلسلات المطلوبة في الجينوم الجسدي الجديد. يبدأ بنسخ جينوم السلالة الجرثوميةبالكامل 5 ، متبوعا بالتشذيب إلى حجم 25 نقطة أساس6 ، والنقل إلى الجينوم الجسديالقديم 7 ، حيث يتم التخلص من جميع الحمض النووي الريبي التكميلي8. يتم نقل الحمض النووي الريبي المتبقي الذي يفتقر إلى التسلسلات التكميلية في الجينوم الجسدي القديم إلى الجينوم الجسدي النامي الجديد ، حيث يتماشى مع أي تسلسلات محدودة السلالة الجرثومية ويوجهت استئصالها9. تتطلب هذه العملية المعقدة متعددة الخطوات تفاعلا دقيقا وفي الوقت المناسب للعديد من المكونات الخلوية ، ولا سيما التفاعلات الضعيفة العابرة حيث تمر الحمض النووي الريبي الصغير بين النوى المختلفة10،11. في السابق ، تم إجراء محاولات لفهم الميكانيكا الجزيئية للعملية باستخدام تجارب ضربة قاضية لتحديد ما إذا كانت المكونات المفترضة ضرورية للعملية ، تليها مناهج الترسيب المناعي للكشف عن تفاعلات البروتينات الأساسية12،13،14. في حين أن هذه الطريقة مفيدة للكشف عن الارتباط القوي والمستمر الذي يتحمل أيضا الظروف غير الفسيولوجية أثناء السحب ، فإن اكتشاف التفاعلات الضعيفة والعابرة قد يتطلب تحسينا مملا. نظرا للطبيعة العابرة المحتملة للعديد من التفاعلات التي تنطوي عليها عملية تحرير الجينوم ، يمكن للطرق في الجسم الحي تحسين اكتشاف مثل هذه التفاعلات. بالإضافة إلى ذلك ، لا يمكن إذابة بعض البروتينات بكفاءة في الظروف خارج الخلية15 ، والتي تمثل مشكلة يمكن حلها من خلال تعديلات البروتين القائمة على التفاعل في الجسم الحي ، مثل وضع العلامات القريبة مع البيوتين.

هنا ، نصف طريقة جديدة تسمح بتكوين بيوتينيل محدد في الجسم الحي للبروتينات المترجمة بالقرب من البروتين المستهدف المطلوب. يمكن استخدام تعديل البيوتين التساهمي للتخصيب الفعال باستخدام مناهج السحب القائمة على الستربتافيدين. تم تطوير هذه الطريقة باستخدام البيوتين ليجاز TurboID16 لإجراء دراسات تفاعل البروتين في Paramecium tetraurelia. يمكن تطبيق نهجنا بسهولة على أي بروتين مستهدف باتباع الخطوات الموضحة في البروتوكول. لذلك ، توفر هذه المقالة استراتيجية فعالة وقابلة للتطوير للبيوتينيل القريب والتي يمكن استخدامها في دراسات البروتين عالية الإنتاجية في كائن حي نموذجي بارز للأوليات.

البروتوكول

1. الطرق العامة

  1. الحصول على المخازن المؤقتة والكواشف والمواد الأخرى كما هو موضح في الجدول 1.
  2. زراعة خطوط Paramecium أحادية النسيلة كما هو موضح سابقا17. باختصار ، انقل خلية واحدة إلى بئر شريحة منخفضة جديدة تحتوي على وسط خفيف مجرم (0.8 ميكروغرام / مل β-سيتوستيرول) بحيث تظل كثافة الخلية أقل من 500 خلية / مل ، لمنع البدء المبكر للدورة الانتصافية. عند 50 انقساما خلويا ، انقل الخلايا إلى مزرعة متوسطة غنية بالجراثيم (مع 0.8 ميكروغرام / مل β-سيتوستيرول) واتركها حتى يتم استهلاك جميع البكتيريا ، وبالتالي تحفيز التكاثر الجنسي (الزواج الذاتي)18.
    ملاحظة: عند الانتهاء من دورة التكاثر الجنسي ، ستبقى الخلايا في حالة ما بعد الزواج الذاتي غير المنقسمة حتى يتم توفير مصدر غذائي جديد.
  3. قم ببناء بروتينات الاندماج للجينات المستهدفة باستخدام ناقل يحتوي على تسلسل 3x HA turboID محسن للكودون مع مواقع قطع إنزيم تقييد المنبع.
    1. قم بإجراء تضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل للجين المستهدف ومنطقة محفزه من الحمض النووي الجيني ، باستخدام بادئات مصممة مع نتوءات تعمل على تشفير مواقع التقييد المناسبة.
    2. أدخل المنتج باستخدام هضم التقييد القياسي في مواقع القطع المتوافقة داخل الإطار19 في اتجاه المنبع من مناطق ترميز turboID.
  4. تسلسل والتحقق من وتضخيم الحمض النووي البلازميد المبني في الإشريكية القولونية DH5α. اعزل البلازميد باستخدام مجموعة ميديبرب البلازميد وخطي 100 ميكروغرام من الحمض النووي البلازميد عن طريق تقييد الهضم.
  5. قم بتنقية باستخدام استخراج الفينول كلوروفورم ، ثم قم بالترشيح من خلال مرشح الطرد المركزي12. قم بترسيب الإيثانول وإذابة حبيبات الحمض النووي في الماء للحصول على تركيز 5 مجم / مل.
    ملاحظة: يمكن إدخال الحمض النووي في النوى الجسدية لخلايا Paramecium باستخدام إجراء الحقن المجهري التالي.

2. الحقن المجهري في النواة الجسدية (MAC)

  1. انقل خلية من مزرعة ما بعد الزواج الذاتي التي تم الحصول عليها في الخطوة 1.2 إلى شريحة اكتئاب جديدة مع وسط ضوئي جرثومي مع 0.8 ميكروغرام / مل من β سيتوستيرول. احتضان عند 27 درجة مئوية لمدة يومين قبل الحقن لاستعادة الخلايا.
  2. استخدم مجهريا مجهريا لنقل الخلايا من المزرعة المستردة إلى شريحة اكتئاب معدة حديثا مملوءة بوسط الغسيل.
  3. أثناء وجود الخلايا في وسط الغسيل ، أضف 20 ميكرولتر من ddH2O على شريحة زجاجية وقم بتغطيتها بغطاء زجاجي.
  4. أضف 200 ميكرولتر من الزيت المعدني فوق زجاج الغطاء.
  5. بعد ذلك ، انقل الخلايا المغسولة الفردية كقطرات تحت الزيت المعدني باستخدام أقل حجم سائل ممكن. ضع ما يصل إلى 20 فقاعة تحتوي على خلية واحدة لكل شريحة ثم ضع الشريحة المعدة على قاعدة مجهر الحقن.
  6. قم بتوصيل إبرة الشفط وحركها إلى موضعها ، ثم ابدأ تشغيل الذراع الروبوتية وآلة الحقن.
  7. باستخدام طرف ماصة اللودر الصغير، أضف 2-3 ميكرولتر من محلول الحمض النووي (DNA) المحضر في الخطوة 1.5 إلى إبرة الحقن. قم بتوصيل الإبرة بالذراع الروبوتية وحركها إلى موضعها ، ثم قم بتوصيلها بصمام الضغط لآلة الحقن.
  8. استخدم الذراع الروبوتية لوضع إبرة الحقن في قطرة ماء فارغة على الشريحة. ثم اضغط على Clean لتطهير أي هواء متبقي في إبرة الحقن حتى يتم ملاحظة تدفق الحمض النووي.
  9. انتقل إلى قطرة تحتوي على خلية ، ثم اخفض إبرة الشفط. قم بإزالة السائل (الماء) برفق من هذه القطرة حتى يتم تثبيت الخلية.
  10. ارفع إبرة الشفط وخفض إبرة الحقن ، ثم قم بالتبديل إلى تكبير أعلى.
  11. تأكد من أن النواة الجسدية (MAC) مرئية الآن كمنطقة داكنة خالية من فجوات الطعام (انظر الشكل 1 ج) حيث يجب إدخال إبرة الحقن.
  12. اهدف إلى اختراق MAC تماما باستخدام إبرة الحقن وسحب الإبرة ببطء على مدى عدة ثوان.
    ملاحظة: عندما تكون الإبرة موجودة داخل MAC ، سوف يتدفق الحمض النووي في MAC بسبب ضغط الهواء المستمر الذي تطبقه آلة الحقن. يمكن أن تصبح فجوة منتشرة تتكون من الحمض النووي المحقون مرئية داخل حدود MAC.
    ملاحظة: من الممكن حقن نفس الخلية عدة مرات لضمان حقنة ناجحة.
  13. بعد اكتمال حقن الخلية ، قم بخفض إبرة الشفط التي تحتوي على الماء المستنشق في الخطوة 2.9. اعكس التدفق لإعادة كمية كافية من الماء إلى القطرة حتى تبدأ الخلية في التحرك مرة أخرى.
  14. استمر حتى تتم معالجة جميع القطرات التي تحتوي على خلية.
  15. استعد كل خلية محقونة عن طريق جمع القطرات من الشريحة ونقل كل منها إلى بئر منفصل مملوء بوسط ضوئي جرثومي ، مع 0.8 ميكروغرام / مل من β سيتوستيرول.
  16. احتضان عند 27 درجة مئوية طوال الليل ، وانقل خلية واحدة من كل بئر إلى بئر جديد ، وحافظ على البئر الأصلي عند 18 درجة مئوية كنسخة احتياطية.
  17. زراعة الخلايا المنقولة بين عشية وضحاها عند 27 درجة مئوية لمدة يوم واحد ثم نقل 5 خلايا من كل بئر أحادي النسيلة إلى أنبوب PCR. استخدم الاشعال الخاصة بالبناء للتضخيم للتحقق من وجود الحمض النووي المحقون في الخلايا.

3. تلطيخ التألق المناعي للتحقق من توطين البروتين الصحيح ووظيفة ليغاز البيوتين

  1. زراعة المستنسخة المختارة إيجابية تفاعل البوليميراز المتسلسل في 20 مل من الوسط المجثم مع 0.8 ميكروغرام / مل من β-sitosterol.
  2. بعد أن يصبح الوسط أقل تعكرا ، اجمع عينة 50 ميكرولتر من الثقافة. أضف 1 ميكرولتر من محلول DAPI (0.1 مجم / مل) و 1 ميكرولتر EDTA (0.5 ملليمتر) لتلوين الحمض النووي للتحقق من بدء الزواج الذاتي.
    ملاحظة: يبدأ الزواج الذاتي عادة بكثافة خلية تبلغ 2,000 خلية / مل.
  3. إذا كنت ترغب في التوصيل الحيوي ، فقم بتكملة وسط الاستزراع بالبيوتين بتركيز نهائي يبلغ 500 ميكرومتر لمدة ساعة واحدة على الأقل قبل حصاد الخلايا.
  4. احصد الخلايا في مرحلة النمو المناسبة باستخدام جهاز طرد مركزي لقياس الزيت مزود بأنابيب على شكل كمثرى عند 280 × جم لمدة دقيقتين. تخلص من وسط الاستزراع وأضف PBS إلى الأنابيب ، ثم قم بالطرد المركزي مرة أخرى ، وقم بإزالة PBS.
  5. أعد تعليق حبيبات الخلية في PBS ونقلها إلى أنبوب طرد مركزي دقيق شفاف سعة 1.5 مل.
  6. قم بإعداد تخفيف PFA بنسبة 3.7٪ في PBS من محلول المخزون 37٪.
  7. أعد تعليق حبيبات الخلية في 0.5 مل من 3.7٪ PFA واحتضان لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة على دوار الأنبوب.
  8. جهاز طرد مركزي عند 600 × جم لمدة 1 دقيقة حتى تتشكل حبيبات مرئية. تخلص من محلول PFA في حاوية النفايات الخاصة المخصصة.
  9. أعد تعليق الحبيبات في 1 مل من 50 ملي جلايسين في برنامج تلفزيوني. احتضان لمدة 5-10 دقائق على دوار أنبوبي.
  10. جهاز طرد مركزي عند 600 × جم لمدة 1 دقيقة. قم بإزالة المادة الطافية وأضف 0.8 مل من 1x PBS. اختياريا ، اغسل مرة أخرى باستخدام PBS.
    ملاحظة: في هذه المرحلة ، يمكن تخزين الخلايا عند 4 درجات مئوية ، إذا لزم الأمر.
  11. جهاز طرد مركزي عند 600 × جم لمدة 1 دقيقة ، قم بإزالة PBS ، وأضف 500 ميكرولتر من 0.5٪ Triton X-100 في PBS. احتضان لمدة 20 دقيقة على دوار الأنبوب.
  12. قم بالطرد المركزي حتى تصبح الحبيبات مرئية (1,000 × جم لمدة دقيقتين) ، وقم بإزالة محلول Triton X-100 ، وأعد تعليق الخلايا في PBS.
  13. قم بإعداد محلول BSA بنسبة 5٪ في PBS وفقا لحجم الأجسام المضادة المطلوبة.
  14. قم بإزالة غسول PBS من الخلايا وأضف 100 ميكرولتر من الجسم المضاد الأساسي المخفف في 5٪ BSA في PBS إلى الخلايا. اضبط وقت الحضانة وفقا للجسم المضاد المستخدم.
    ملاحظة: الحضانة لمدة ساعتين في درجة حرارة الغرفة كافية لمعظم الأجسام المضادة.
  15. جهاز طرد مركزي عند 600 × جم ، قم بإزالة تخفيف الجسم المضاد الأساسي ، واغسل الخلايا ب 500 ميكرولتر من PBS.
  16. أضف 100 ميكرولتر من الجسم المضاد الثانوي المخفف في 5٪ BSA في PBS. ضبط وقت الحضانة ؛ بشكل عام ، 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة كافية. قم بتغطية الأنبوب بورق الألمنيوم لحماية الفلوروفور من الضوء.
  17. يضاف 1 ميكرولتر من محلول DAPI (0.1 ملغم/مل) خلال آخر 10 دقائق من الحضانة مع الجسم المضاد الثانوي.
  18. جهاز طرد مركزي عند 600 × جم لمدة 1 دقيقة ، وقم بإزالة محلول التلوين ، واغسله مرتين باستخدام PBS. اترك 20 ميكرولتر من الغسيل الثاني في الأنبوب وأعد تعليق الخلايا.
  19. قم بتركيب 10 ميكرولتر على شريحة للفحص تحت المجهر.

4. التخصيب الانتقائي للبروتينات البيوتينيل

  1. احصد 1 × 106 خلايا في مرحلة النمو الصحيحة كما هو موضح في 3.4.
  2. أعد تعليق الحبيبات في 3 مل من المخزن المؤقت للتحلل.
  3. انقله إلى مجانس ارتداد وتحلل الخلايا ب 100 ضربة مدقة.
  4. انقل المحلل إلى أنبوبين دقيقين للطرد المركزي وجهاز طرد مركزي عند 21,000 × جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية.
  5. قم بموازنة الخرزات المغناطيسية المطلية بالستريبتافيدين عن طريق خلط 20 ميكرولتر (لكل عينة) من ملاط الخرزة المعلق بالدوامة النبضية مع 1 مل من المخزن المؤقت للتحلل في أنبوب الطرد المركزي الدقيق والاحتضان لمدة دقيقتين.
  6. قم بإزالة المخزن المؤقت للتحلل من الخرز باستخدام حامل مغناطيسي وأعد تعليقه في المخزن المؤقت للتحلل.
  7. كرر الخطوة 4.6.
  8. قم بإزالة المخزن المؤقت للتحلل واخلط الخرزات المتكافئة مع المادة الطافية (المحللة المصفاة) من الخطوة 4.4.
    ملاحظة: قد تختلف تركيزات الملح المثلى والنسبة المئوية للمنظفات للارتباط بالخرزات وتحتاج إلى التحقق من صحتها تجريبيا. بالإضافة إلى ذلك ، من الممكن احتضان الحبيبات من 4.4 في 50 ميكرولتر من 2٪ SDS لمدة 10 دقائق عند 60 درجة مئوية لاستخراج البروتينات من الجزء غير القابل للذوبان ، متبوعا بالطرد المركزي عند 21 ، 000 × جم لمدة 10 دقائق. أضف هذا المستخلص إلى المحلل المصفاة والخرز.
  9. احتضان لمدة 1-2 ساعة في درجة حرارة الغرفة على دوار أنبوبي.
  10. قم بالطرد المركزي لفترة وجيزة (<1 ثانية) للأنبوب لاستعادة كل السائل إلى قاع الأنبوب ، وجمع الخرز على حامل مغناطيسي ، ثم استبدال المادة الطافية (المتدفقة) بمخزن مؤقت للغسيل 1.
  11. احتضن لمدة 5 دقائق على دوار الأنبوب ثم كرر كما في الخطوة 4.10 لغسيل ثان.
  12. استبدل المخزن المؤقت للغسيل 1 بمخزن الغسيل 2 لغسلتين إضافيتين (الغسيل 3 و 4).
  13. استبدل المخزن المؤقت للغسيل 2 بمخزن الغسيل 3 لغسلتين نهائيتين (الغسيل 5 و 6).
  14. بعد إزالة الغسيل النهائي ، قم بتخزين الخرزات في درجة حرارة -20 درجة مئوية قبل المعالجة النهائية.
    ملاحظة: يمكن مسح الخرزات باستخدام Laemmli buffer لتحليل اللطخة الغربية وتقديمها إلى خدمات قياس الطيف الكتلي لتحضير الببتيد على الخرزة لتحديد البروتين.

النتائج

يصف بروتوكولنا طريقة مبسطة لإدخال تعديل البيوتين التساهمي للبروتينات الموجودة بالقرب من البروتين المستهدف في Paramecium (الشكل 1 أ). يمكن بعد ذلك إثراء هذه البروتينات البيوتينيل بشكل أكبر باستخدام سحب الستربتافيدين وتحديدها باستخدام قياس الطيف الكتلي20. لإثبات حالة استخدام عملية للطريقة ، قمنا بتطبيق البروتوكول على بروتين Nowa1. هذا البروتين ضروري لعملية إعادة الترتيب الجيني وله تغييرات ديناميكية في توطينه12. في المراحل المبكرة ، يبقى في النواة الجسدية القديمة والشظايا ، ولكن لاحقا يقع في النواة النامية الجديدة. والجدير بالذكر أن محاولاتنا السابقة لإثراء البروتينات المتفاعلة بوساطة العلامة لم تنجح (نتائج غير منشورة). كان هذا على الأرجح بسبب التكرارات المعقدة التي تحمل تشابها مع بروتين البريون PrP27 الذي يمكن أن يتسبب في التجميع الذاتي في ظل ظروف غير مثالية أثناء إجراء السحب21. قمنا بتضخيم PCR منطقة ترميز Nowa1 جنبا إلى جنب مع منطقتها غير المشفرة التي تحتوي على المروج. ثم تم إدخال المنتج في الإطار بتسلسل ترميز turboID محسن للكودون (الشكل 1 ب). لتجنب الإسكات الناجم عن الجينات المعدلة وراثيا الناجم عن حقن الحمض النووي الدائري في Paramecium، تم خطية الناقل قبل الحقن. ثم تم حقن الحمض النووي الخطي والمنقي في النواة الجسدية (MAC) كما هو موضح في هذا البروتوكول. أصبحت قطرة متناثرة محصورة داخل المنطقة المظلمة من النواة الجسدية مرئية في بعض الحقن الناجحة (الشكل 1 ج). ثم تم التحقق من الحقن الناجح وتضخيم الحمض النووي بواسطة الخلايا أثناء انقسام الخلايا بواسطة تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR). كما هو متوقع ، كانت 40-50٪ من الخلايا إيجابية للحمض النووي المحقون لبناء Nowa1 (حجم المنتج المتوقع 685 نقطة أساس) (الشكل 2). كانت الخطوة التالية هي التحقق من وجود البروتين المشفر بواسطة الحمض النووي المحقون. نظرا لأن متجه المتلقي يحتوي على تسلسل turboID محاط بعلامة HA ثلاثية ، فقد استخدمنا تلطيخ التألق المناعي للكشف عن العلامة. سمح لنا ذلك بالتحقق مما إذا كانت الخلايا المحقونة تعبر عن بروتين الاندماج وما إذا كانت مترجمة بشكل صحيح. استخدمنا خلايا المرحلة المتأخرة التي أظهرت توطين بروتين الاندماج في النواتين الناميتين الجديدتين ، كما لوحظ سابقا لبروتين Nowa1 من النوع البري12. أظهرت خطوط الخلايا الفردية المحقونة مستويات مختلفة من بروتين الاندماج (الشكل 3). يمكن أن يكون مستوى التعبير المنخفض مفيدا للتطبيقات التي يكون فيها انخفاض الخلفية مرغوبا فيه ، ولكن في هذه الحالة ، اخترنا الإشارة القصوى وشرعنا في الاستنساخ 2 ، والذي أظهر أعلى تعبير. ثم جمعنا عينات خلال مراحل النمو المختلفة لتتبع توطين بروتين الاندماج. تم توطين البروتين في البداية في الأسطح المتكونة من النواة الجسدية القديمة وفي الأجزاء النووية المنفصلة خلال المراحل الأولى من الزواج الذاتي. عند ظهور الأنلاجين النووي ، انتقل بروتين الاندماج نحو هذه النوى النامية الجديدة (الشكل 4). لتعزيز البيوتينيل للبروتين القريب في المراحل المختلفة ، قمنا بتكمل المزرعة ب 500 ميكرومتر من البيوتين لمدة ساعتين قبل حصاد الخلايا ل IF. لقد تصورنا البروتينات المسماة بالبيوتين عبر تلطيخ IF باستخدام الستربتافيدين الموسوم بالفلورسنت. تتوافق الإشارة المرصودة مع توطين بروتين الاندماج الموسوم ب HA. الأهم من ذلك ، كان من الممكن الحصول على توطين البيوتينيل الخاص بمراحل النمو النووي المختلفة ، حيث أن الحضانة القصيرة مع البيوتين كافية لتحقيق بيوتينيل كبير (الشكل 4). بالإضافة إلى ذلك ، بدون إضافة البيوتين التكميلي ، كان من الممكن اكتشاف البيوتينيل الضئيل فقط في الخلايا المحقونة. في الخلايا من النوع البري ، تسببت إضافة البيوتين التكميلي في عدم اكتشاف البيوتينيل (الشكل 5 أ). والجدير بالذكر أن البيوتين لم يكن يتراكم فقط في النواة النامية ، لأنه حتى في ظروف تغيير طبيعة ، فإنه يظل مرتبطا بالبروتينات. (الشكل 5 ب). باستخدام الخرز المغناطيسي المطلي بالستريبتافيدين ، كان من الممكن إثراء البروتينات البيوتينيل بشكل انتقائي (الشكل 6). يمكن التعرف على البروتينات المخصبة باستخدام قياس الطيف الكتلي. في تجارب تحديد البروتين اللاحقة هذه ، يمكن استخدام الثقافة غير المكملة ، وكذلك الخلايا التي تعبر عن بروتين turboID غير المنصهر ، كمجموعات تحكم في الخلفية.

figure-results-1
الشكل 1: نظرة عامة على إجراء البيوتينيل القريب في P. رباعي الحالة. (أ) المخطط المعمم للبروتوكول. (ب) مبدأ الاستنساخ لمتجه مستلم turboID للتوصيل والتشغيل والبناء الناتج لبروتين الاندماج Nowa1. منطقة 3'UTR المستخدمة في هذا البلازميد مشتقة من CenH3a. (ج) قطرة منتشرة مرئية موجودة داخل المنطقة الداكنة المقابلة للنواة الجسدية (MAC) عند الحقن الناجح للحمض النووي. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-2
الشكل 2: اختبار تفاعل البوليميراز المتسلسل للحقن الناجح. تحليل هلام الاغاروز لتفاعل تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل لمنتج مع برايمر أمامي خاص بترميز منطقة المنبع لمقاومة الأمبيسلين (بدء الأمبير) وبرايمر عكسي مكمل ل Nowa1. يظهر رأس السهم حجم المنتج المتوقع. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-3
الشكل 3: تلطيخ التألق المناعي للتحقق من صحة التوطين الصحيح لبروتين الاندماج turboID. تلطيخ التألق المناعي باستخدام الأجسام المضادة الأولية للأرانب المضادة لحمض الهيالورونيك (1: 100) والأجسام المضادة الثانوية المترافقة من الماعز المضاد للأرانب Alexa Fluor 568 (1: 1000) من خطوط Paramecium أحادية النسيلة مع إشارة تفاعل البوليميراز المتسلسل الإيجابية للحمض النووي الذي يشفر بروتين اندماج Nowa1-HA-turboID. مقياس 20 ميكرومتر. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-4
الشكل 4: البيوتينيل الخاص ب Nowa1 في مراحل النمو المختلفة. تلطيخ التألق المناعي للخط أحادي النسيلة 2 في مراحل متقدمة أثناء تكوين النواة الجسدية الجديدة. تم استكمال وسط الاستزراع ب 500 ميكرومتر من البيوتين للحصول على نشاط turboID الأمثل. تم الكشف عن علامة HA كما في الشكل 3 ، وتم الكشف عن البيوتين باستخدام Streptavidin-FITC (1: 200). مقياس 20 ميكرومتر. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-5
الشكل 5: يتطلب وضع العلامات الفعالة على القرب بواسطة turboID البيوتين التكميلي في الثقافة. (أ) تلطيخ التألق المناعي للخلايا بالوزن والخلايا المحقونة في مرحلة النمو المتأخرة مما يدل على التعبير عن Nowa1-HA-turboID والبيوتينيل الملحوظ مع 500 ميكرومتر من البيوتين التكميلي. تم الكشف عن علامة HA والبيوتين كما في الشكل 4. مقياس 20 ميكرومتر. (ب) تحليل اللطخة الغربية للبيوتين باستخدام HRP-streptavidin لخلايا WT المزروعة بخلايا حقن 500 ميكرومتر من البيوتين والخلايا المحقونة TurboID مع البيوتين وبدونه. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-6
الشكل 6: إثراء البروتينات البيوتينيل بخرز الستربتافيدين المغناطيسي. تحليل اللطخة الغربية للبيوتين لعينات من تجربة منسدلة باستخدام حبات مغناطيسية مغلفة بالستريبتافيدين. العينات هي: Nowa1-HA-turboID خلية محللة (إدخال) ، والجزء غير المرتبط (التدفق) ، وخطوات الغسيل (الغسيل 1-6) ، والبروتينات المرتبطة بالخرز (الإخراج). الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

المناقشة

يصف البروتوكول المقدم هنا تقنية لربط جزء من البيوتين بالبروتينات بالقرب من البروتين محل الاهتمام. بناء على التقارب القوي للستريبتافيدين للبيوتين ، فإن هذا يسمح بإثراء سريع وفعال للبروتينات المعدلة. إلى جانب القدرة السريعة على التكيف مع البروتينات المختلفة ذات الأهمية ، يمكن للطريقة المقدمة أن تسهل دراسات التفاعلات متعددة البروتينات في Paramecium. هذا الكائن الحي النموذجي راسخ للبحث في تفاعلات الينقولات والمضيف أثناء التكاثر الانتصافي3. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن أن تقدم أدوات جزيئية جديدة لتحرير الجينوم بدقة حيث تقوم باستئصال أكثر من 45,000 تسلسل أثناء إعادة الترتيب الجينومية المبرمجة. يتم تنظيم العملية بواسطة آلية معقدة متعددة المكونات تسمح باستئصال دقيق موجه بالحمض النووي الريبي لشظايا الحمض النووي هذه مع موقع انقسام قابل للتكرار على مدار كل جيل. توفر الطريقة المعروضة هنا ميزتين رئيسيتين لدراسة هذه العملية. يبسط اكتشاف تفاعلات البروتين والبروتين العابرة. بالإضافة إلى ذلك ، يسمح ناقل متلقي التوصيل والتشغيل بالإنشاء السريع للعديد من بروتينات الاندماج الوظيفية. نظرا لأنه من المحتمل أن تكون هناك عوامل متعددة متورطة في العملية في مراحل مختلفة ، فإن القدرة على التكيف تسمح بالكشف عن تفاعلات العديد من البروتينات التي يمكن أن تكون جزءا من آلية الاستئصال. الأهم من ذلك ، يتم التعبير عن تركيبات الاندماج من محفز الجين الداخلي ، وبالتالي ، تتطابق بشكل ضيق مع المسار الزمني للتعبير الأصلي. علاوة على ذلك ، فإن الاستخدام الواضح للحقن المجهري لإيصال المادة الوراثية الخارجية إلى هذا الكائن الحي النموذجي يسمح بتوليد مجموعات وحيدة النسيلة متجانسة. تتيح هذه المجموعات بدء أكثر تزامن لعملية الزواج الذاتي ، حيث يتم تطوير نواة جسدية جديدة.

في حين أن الإجراء الموضح لإدخال تركيبات الاندماج turboID قوي ، فقد يكون التحسين المحدد ضروريا في بروتوكولات تخصيب البروتين النهائي ، بسبب آلية البوتينيل. نظرا لأن إنزيم turboID المنصهر يولد شقوق تفاعلية من البيوتين-AMP تنتشر بعيدا عن الإنزيم ، فمن المحتمل أن تتفاعل مع أي شق محبة للنواة في المنطقة المجاورة. وبالتالي ، فإن الخطوة الأساسية في هذه المنهجية هي تحديد شركاء التفاعل الحقيقيين من ضربات الخلفية ومن البروتينات الموضعية في المنطقة المجاورة العامة لبروتين الاندماج turboID ، والتي ليست شركاء التفاعل الفعليين. لتحقيق ذلك ، يمكن تعديل مجموعة متنوعة من المعلمات ، مثل مدة الحضانة مع البيوتين16. علاوة على ذلك ، يمكن أن يشير الإعداد التجريبي الذي يتضمن مجموعة تحكم بدون بيوتين تكميلي في الوسط إلى ربط الخلفية. كما هو موضح ، ستكون هذه المجموعة الضابطة متطابقة وراثيا مع التجربة الفعلية ، ولكن يتم تقليل البيوتينيل بواسطة turboID بشدة بسبب الوفرة المنخفضة للبيوتين. يمكن أن تشمل مجموعات التحكم المهمة الإضافية بروتين turboID غير المنصهر ، بالإضافة إلى مجموعة من النوع البري ، وكلاهما مزروع في الوسط المكمل بالبيوتين. بالإضافة إلى ذلك ، على الرغم من أن التقارب القوي للستريبتافيدين مع البيوتين هو ميزة كبيرة على عمليات السحب القائمة على الأجسام المضادة ، فمن المحتمل أن يكون لتركيزات الملح والمنظفات المختلفة تأثير على نقاء وكفاءة التخصيب.

يمكن أن تعزز الأساليب البروتينية المتفوقة فهمنا للآليات الجزيئية الفريدة ل Paramecium ، وربما الأهداب الأخرى. تبشر المكونات الجزيئية ذات الوظائف الجديدة بإعادة استخدامها كأدوات في البيولوجيا التركيبية ، وبالتالي يمكن أن تعزز تطورات التكنولوجيا الحيوية22،23. غالبا ما تتكون البروتينات الاصطناعية المصممة هندسيا من مجموعات من المجالات الوظيفية ذات الخصائص الجديدة التي تسمح بتطبيقات علاجية غير عملية سابقا. يمكن أن تستخدم البروتينات المهندسة أيضا في عمليات إنتاج الأدوية24. يعتبر نظام استئصال الجينوم الموجه بالحمض النووي الريبي من Paramecium ذا أهمية خاصة لمثل هذه التطورات. يحقق هذا النظام استئصالا معتمدا على الحمض النووي الريبي لآلاف شظايا الحمض النووي ، بدقة تصل إلى النيوكليوتيدات المفردة25. تجعل هذه المعلمات من المثير للاهتمام تحسين دقة تحرير الجينوم في الخلايا البشرية. يمكن استخدام طريقة البيوتينيل القريب المقدمة لتسريع وتعزيز اكتشاف مكونات البروتين الجديدة وتفاعلاتها داخل الآلات الجزيئية متعددة البروتينات.

الإفصاحات

يعلن المؤلفون عدم وجود تضارب في المصالح.

شكر وتقدير

تم تمويل هذا العمل من خلال منحة جامعة برن DigiK ومنحة المؤسسة الوطنية السويسرية للعلوم 229074 منحت إلى B.-A.S. ومنحة المؤسسة الوطنية السويسرية للعلوم 214853 إلى M.N.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
مجهر أكسيوفرت 40 CFL (عدسات 10x ، 40x)زييسنا
ب سيتوستيرولسيجما ألدريتش567152
ألبومين مصل البقر (BSA)سيجما ألدريتشأ 9647
زيت سيل ترامإبندورفنا
كودون محسن تسلسل الحمض النووي 3xHA-turboIDتويست العلوم البيولوجيةناGCTAGCTATCCATAcGAaGTTC
CTGATTATGCTATCCTTACGAT
GTTCCTGATTGCTTAT
GATGTACCTGATTACGCTGGATC
AAAAGATAATACTGTACCTCTTAA
ATTAATCGCTTTATTAGCTAATGG
TGAATTTCATTCTGGTGAACAACbr/ TGAATTTCATTCTGGTGAACAA TTGGTGAAACTTTAGGTATGTCA
AGAGCTGCTATATAAACACATT
CAAACTTTAAGAGATTGGGGT
TGATGTTTTTACTTCCCTGGTAA
AGGATATTCACTTCCTGAACCCAT
TCCTTTATTAAATGCTAAACAAT
TTTAGGTCAATTAGATGGAGGTT
CTGTTGCTGTTTTACCTGTTGTT
GACTCAACTAATCAATTTTTTAG
ATAGAATTGGTGAATTAAAGTCAG
GTGATGCTTGTTTGCTGAATACC
AACAAGCTGGTAGAGGTTCAAGA
GGTAGAAAATGGTTTTCTCCTTTT
GGTGCTAATTTATACCTTTCCATGT
TCTGGAGACTTAAAAGAGGTCCCG
CAGCTATTGGATTAGGTCCTGTCAT
TGGTATTGTTGGTGAAGCTCT
TAGAAAATTAGGTGCTGATAAGGT
TAGAGTTAAATGGCCTAATGATTTa< br/> TATCTTCAAGATAGAAAACTTGCT
GGTATACTTGTGTGAATTAGCTGGT
ATTACTGGTGGCCGCTCAAATT
GTTATCGGTGCTGGTATTAATGTTG
CTATGAGAAGAGTTGAAGAATCAG
TTGTTAATCAAGGTTGGATTACTCT
/ TCAAGAAGCTGGTAAATCTTGAT
AGAAACACTTTAGCTGCTCTCA
TTAGAGAACTTAGCTGCTTTA
ATTATTTGAACAAGAAGGTTTGGCT
CCTTATCTTCCTAGGATGGGAAAAAAT
TAGATAATTTCATTAATAGACCTGTTA
AATTAATTATTGGTGATAAAGAAATTT
TCGGTATTTCAAGAGGTATAGATAAAC
AAGGAGCTCTTTTTTATTAGAACAAGATG
GTGTTATCAAACCATGGGTGT
GAAATTTCATTGAGATCAGCTGAAAAA
GAAATGA
دابيسيجما ألدريتشد9542
إيدتافيشر العلميةAAA151610B
نصائح اللودر الصغير epT.I.P.S.إبندورف5242956003
ايثانولجروج كيمي1009832500
فيمتو جيت 4iإبندورفنا
الفيمتوبتيب الثانيكاليبر ساينتفيك5242957000
محلول الفورمالديهايدسيجما ألدريتشإف 8775
الجلايسينتطبيق كيم10021259
جسم مضاد IgG مضاد للأرانب ، أليكسا فلور 568ثيرمو فيشر العلميأ 11011
HA-tag (C29F4) أرنب mABأنظمة الخلايا3724
انجيكمان NI 2إبندورفنا
متوسط خفيفنانامحلول مسحوق عشب القمح 0.2x في 2.5 ملي Na 2 < / sub>HPO4< / sub>
الزيوت المعدنيةسيجما ألدريتشإم 8691
Na2HPO4سيجما ألدريتش71643
الفينول - الكلوروفورم - إيزوميل ألكوهولسيجما ألدريتش77617
الفوسفور محلول ملحي مخزن فيشر العلمية10722497
طقم البلازميد بالإضافة إلى midiprepكياجيني12945
وسط غنينانا1x محلول مسحوق عشب القمح في 2.5 ملي Na 2 < / sub>HPO4< / sub>
ستريبتافيدين-FITCثيرمو فيشر العلمي11-4317-87
مرشح الطرد المركزي Ultrafree-MC GV   ؛EMD MiliporeUFC30GV00
محلول الغسيلنانا0.1٪ BSA في مياه Volvic 
محلول مسحوق عشب القمحباينز الدوليةناقم بإعداد مخزون 20x من المسحوق كما هو موضح سابقا (0.5 جم / 10 مل)
ستريبتافيدين-HRPأبكامأب7403
Streptavidin المغلفة الخرز magnaticسيجما ألدريتشLSKMAGT02
المخزن المؤقت للتحلل للسحبنانا50 ملي تريس درجة الحموضة 8 ؛ 150 ملي كلوريد الصوديوم; 0.5٪ ديوكسيكولات الصوديوم. 1٪ تريتون X-100 ؛ 5 مللي مولار MgCl2; 2x مثبطات البروتياز cOmplete (روش) ؛  
مخزن الغسيل 1 للسحبنانا50 ملي تريس درجة الحموضة 8 ؛ 150 ملي كلوريد الصوديوم; 0.5٪ ديوكسيكولات الصوديوم. 1٪ تريتون X-100 ؛ 5 مللي مولار MgCl2;
مخزن مؤقت للغسل 2 للسحبنانا10 ملي تريس درجة الحموضة 7.4 ؛ 150 ملي كلوريد الصوديوم; 0.01 ٪ NP40; 1 ملي مللي كلوريد 2
عازلة الغسيل 3 للسحبنانا10 ملي تريس درجة الحموضة 7.4 ؛ 150 ملي كلوريد الصوديوم;

المراجع

  1. Stefanov, B. -A., Nowacki, M. Functions and mechanisms of eukaryotic RNA-guided programmed DNA elimination. Biochem Soc Trans. 53 (2), 473-485 (2025).
  2. Swart, E. C., et al. Genome-wide analysis of genetic and epigenetic control of programmed DNA deletion. Nucleic Acids Res. 42 (14), 8970-8983 (2014).
  3. Witzany, G. The Roles of transposable elements in transgenerational inheritance and genome evolution. Epigenetics in Biological Communication. Witzany, G. , Springer Cham. 369-385 (2024).
  4. Dubois, E., et al. Transposon invasion of the paramecium germline genome countered by a domesticated piggybac transposase and the NHEJ pathway. Int J Evol Biol. 2012, 436196(2012).
  5. Gruchota, J., Denby Wilkes, C., Arnaiz, O., Sperling, L., Nowak, J. K. A meiosis-specific Spt5 homolog involved in non-coding transcription. Nucleic Acids Res. 45 (8), 4722-4732 (2017).
  6. Sandoval, P. Y., Swart, E. C., Arambasic, M., Nowacki, M. Functional diversification of Dicer-like proteins and small RNAs required for genome sculpting. Dev Cell. 28 (2), 174-188 (2014).
  7. Furrer, D. I., Swart, E. C., Kraft, M. F., Sandoval, P. Y., Nowacki, M. Two sets of piwi proteins are involved in distinct sRNA pathways leading to elimination of germline-specific DNA. Cell Rep. 20 (2), 505-520 (2017).
  8. Lepère, G., Bétermier, M., Meyer, E., Duharcourt, S. Maternal noncoding transcripts antagonize the targeting of DNA elimination by scanRNAs in Paramecium tetraurelia. Genes Dev. 22 (11), 1501-1512 (2008).
  9. Garnier, O., Serrano, V., Duharcourt, S., Meyer, E. RNA-mediated programming of developmental genome rearrangements in Paramecium tetraurelia. Mol Cell Biol. 24 (17), 7370-7379 (2004).
  10. Khanduja, J. S., Calvo, I. A., Joh, R. I., Hill, I. T., Motamedi, M. Nuclear noncoding RNAs and genome stability. Mol Cell. 63 (1), 7-20 (2016).
  11. Yao, M. -C., Chao, J. -L., Cheng, C. -Y. Programmed genome rearrangements in Tetrahymena. Microbiol Spectr. 2 (6), (2014).
  12. Nowacki, M., Zagorski-Ostoja, W., Meyer, E. Nowa1p and Nowa2p: Novel putative RNA binding proteins involved in trans-nuclear crosstalk in Paramecium tetraurelia. Curr Biol. 15 (18), 1616-1628 (2005).
  13. Drews, F., et al. Two piwis with Ago-like functions silence somatic genes at the chromatin level. RNA Biol. 18 (sup2), 757-769 (2021).
  14. Singh, A., et al. ISWI1 complex proteins facilitate developmental genome editing in Paramecium. Genome Res. 35 (1), 93-108 (2025).
  15. Bernier, S. C., Cantin, L., Salesse, C. Systematic analysis of the expression, solubility, and purification of a passenger protein in fusion with different tags. Protein Expr Purif. 152, 92-106 (2018).
  16. Branon, T. C., et al. Efficient proximity labeling in living cells and organisms with TurboID. Nat Biotechnol. 36 (9), 880-887 (2018).
  17. Beisson, J., et al. Maintaining clonal Paramecium tetraurelia cell lines of controlled age through daily reisolation. Cold Spring Harb Protoc. 2010 (1), pdb.prot5361(2010).
  18. Berger, J. D., Rahemtullah, S. Commitment to autogamy in Paramecium blocks mating reactivity: implications for regulation of the sexual pathway and the breeding system. Exp Cell Res. 187 (1), 126-133 (1990).
  19. Stefanov, B. -A., et al. Genetically encoded protein thermometer enables precise electrothermal control of transgene expression. Adv Sci (Weinh). 8 (21), e2101813(2021).
  20. Shin, S., et al. Super-resolution proximity labeling with enhanced direct identification of biotinylation sites. Commun Biol. 7 (1), 554(2024).
  21. Leffers, K. -W., et al. Assembly of natural and recombinant prion protein into fibrils. Biol Chem. 386 (6), 569-580 (2005).
  22. Stefanov, B. -A., Ajuh, E., Allen, S., Nowacki, M. Eukaryotic release factor 1 from Euplotes promotes frameshifting at premature stop codons in human cells. iScience. 27 (4), 109413(2024).
  23. Stefanov, B. -A., Fussenegger, M. Biomarker-driven feedback control of synthetic biology systems for next-generation personalized medicine. Front Bioeng Biotechnol. 10, 986210(2022).
  24. Stefanov, B. -A., Mansouri, M., Charpin-El Hamri, G. -, Fussenegger, M. Sunlight-Controllable Biopharmaceutical Production for Remote Emergency Supply of Directly Injectable Therapeutic Proteins. Small. 18 (41), e2202566(2022).
  25. Rzeszutek, I., Maurer-Alcalá, X. X., Nowacki, M. Programmed genome rearrangements in ciliates. Cell Mol Life Sci. 77 (22), 4615-4629 (2020).

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

TurboID
في الجسم الحي البيوتينيل القرب لدراسات تفاعل البروتين في Paramecium tetraurelia
اتصل بنا
أوصِ بها للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

2026 © حقوق الطبع والنشر MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.