مقالة منهجية

توليد جينومات بكتيرية كاملة من العينات السريرية باستخدام سير عمل التخصيب المستهدف

DOI:

10.3791/68506

⸱

أغسطس 15, 2025

 ,  ,  ,  , 
1Institute of Medical Microbiology, University of Zürich, 2Facultad de Farmacia y Bioquímica, Cátedra de Microbiología Clínica, Universidad de Buenos Aires

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نقدم هنا بروتوكولا لتمكين تسلسل الجينوم الكامل للعدوى البكتيرية المنقولة جنسيا من العينات السريرية باستخدام التخصيب المستهدف. تتغلب هذه الطريقة الجديدة القائمة على الألواح المتلازمية على تحديات الحمض النووي البشري الوفيرة والأحمال البكتيرية المنخفضة ، مما يسهل المراقبة الجينومية للكتلاميديا الحثرية ، والنيسرية البنية ، واللولبية الشاحبة ، والميكوبلازما التناسلية.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعد الحصول على جينومات كاملة للعدوى البكتيرية المنقولة جنسيا (STIs) مباشرة من العينات السريرية أمرا صعبا بسبب وجود الحمض النووي البشري والميكروبات وأحمال مسببات الأمراض البكتيرية المنخفضة للغاية. غالبا ما لا تكون الثقافة خيارا ، لأن هذه الأنواع شديدة الحساسية ، ويتم أخذ معظم العينات في وسائط النقل التي تحلل الكائنات الحية الدقيقة ، مما يجعلها غير قابلة للاستزراع. لمعالجة هذه المشكلات ، استخدمنا لوحة مسبار مصممة عبر أربعة أنواع لتوليد تسلسل جينوم كامل من الأمراض المنقولة جنسيا البكتيرية وأجرينا عملية تهجين من يومين إلى ثلاثة أيام قبل تسلسل الجينوم. أنتجت نتائجنا الأولية بيانات جينومية ممتازة باستخدام عينات لم ينجح التسلسل المباشر لها. أثبت التخصيب المستهدف فعاليته العالية في تسلسل جينومات الأمراض المنقولة جنسيا البكتيرية ، خاصة عندما يكون حمل العامل الممرض مرتفعا (Ct < 30). غالبا ما تحتوي العينات المختبرة التي تحتوي على الميكوبلازما التناسلية على قيم Ct أعلى من 30 ، مما يؤدي إلى انخفاض معدلات نجاح استعادة الجينوم ؛ لوحظت تحسينات بعد تحسين درجة حرارة التهجين من 65 درجة مئوية إلى 62.5 درجة مئوية. بالإضافة إلى تمكين المراقبة الجينومية ، يمكن أن يوفر توافر الجينومات الكاملة رؤى قيمة حول مقاومة مضادات الميكروبات ، مثل تحديد محددات المقاومة المكتسبة المرتبطة بالنيسرية البنية وقد أدت هذه الطريقة بالفعل إلى تحديد سلالة جديدة من الكلاميديا الحثرية الليمفاوية الحبيبية التناسلية في بوينس آيرس، ompA-النمط الجيني L4، مما يسلط الضوء على إمكانات هذا النهج للكشف عن التنوع الجيني الجديد وتحسين ترصد الأمراض المنقولة جنسيا.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

أدى ظهور تقنيات التسلسل من الجيل التالي (NGS) إلى تسهيل تسلسل الجينوم البكتيري الكامل (WGS) ، مما يسمح بتسلسل العزلات السريرية داخل العديد من أنواع مسببات الأمراض البكتيرية البشرية. مكنت التكنولوجيا من إجراء العديد من الدراسات المقارنة من خلال توليد جينومات كاملة على نطاق غير مسبوق. كان لهذا تأثير كبير على علم الأحياء الدقيقة السريري والصحة العامة ، حيث يتيح الوصول إلى بيانات الجينوم من العينات السريرية من خلال WGS الكتابة والكشف عن جينات مقاومة مضادات الميكروبات. بالإضافة إلى ذلك ، تسمح الأساليب الميتاجينومية بالكشف المباشر لمسببات الأمراض المرتبطة بالمرض من العينات السريرية. تخلق هذه المعلومات فرصا جديدة لاستراتيجيات العلاج الشخصية للمرضى. بالإضافة إلى ذلك ، تعد WGS أداة قوية توفر رؤى حول تطور السلالات المنتشرة لمسببات الأمراض المحددة ، بالإضافة إلى أنماط انتقالها ، مما يمكن سلطات الصحة العامة من فهم تفشي مسببات الأمراض والاستجابة لهابشكل أفضل 1،2،3.

لتحقيق جودة تسلسل كافية ل WGS ، عادة ما تكون هناك حاجة إلى عزل البكتيريا من خلال الثقافة للحصول على كميات الحمض النووي الميكروبيةالمطلوبة 4،5،6. يمثل هذا عاملا مقيدا لتلك الكائنات الحية التي يصعب استزراعها ، أو تلك التي لا يمكن زراعتها بسبب معالجة العينات التشخيصية غير القابلة للتطبيق ، أو تلك التي تعرضت للمضادات الحيوية أثناء علاج المريض. تشمل الأمثلة على هذه الكائنات الحية الدقيقة التي يصعب استزراعها مسببات الأمراض البكتيرية المنقولة جنسيا ، مثل الكلاميديا الحثرية ، والنيسرية البنية ، واللولبية الشاحبة ، والميكوبلازما التناسلية7،8،9. هذه الأنواع تمثل تحديا للاستزراع بسبب عدة عوامل ، بما في ذلك طبيعتها داخل الخلايا ، وهشاشتها ، ومتطلبات النمو الشديدة ، ومعدلات التكاثر البطيئة. لهذه الأسباب ، يعد تطوير وتنفيذ التقنيات التي تمكن WGS على الرغم من انخفاض محتوى الحمض النووي - كما هو الحال غالبا في عينات المرضى - أمرا بالغ الأهمية لإجراء التحليلات الجينومية في البيئات السريرية.

التخصيب المستهدف هو الطريقة الواعدة لتسلسل الجينوم عندما يكون الحمض النووي الميكروبي نادرا10. على سبيل المثال ، في سياق مسببات الأمراض المسببة للعدوى المنقولة جنسيا (STIs) ، ينشأ جزء صغير فقط من الحمض النووي الموجود في عينة المريض من العامل الممرض. في حالة عدوى المطثية الحثرية ، وجد أن الحمض النووي لمسببات الأمراض يشتمل على ما يصل إلى 0.6٪ كحد أقصى من إجمالي الحمض النووي ، لكن القيم عادة ما تكون أقل بكثير11. تتكون طريقة التخصيب المستهدفة من التقاط الحمض النووي الميكروبي ذي الأهمية بشكل انتقائي قبل NGS. يتم تحقيق ذلك باستخدام مجسات الحمض النووي الريبي المصممة خصيصا والتي تحمل علامات البيوتين والتي تكمل الحمض النووي الميكروبي المستهدف. يتم إجراء ربط المحول لإنشاء مكتبة جينومية ، قبل التهجين ، حيث ترتبط هذه المجسات بالحمض النووي الميكروبي التكميلي. بعد ذلك ، يتم استخدام الخرز المغناطيسي المطلي بالستربتافيدين لالتقاط مجمعات الحمض النووي المسمى بالبيوتين ، مستغلة التفاعل القوي بين البيوتين والستربتافيدين. أخيرا ، يعمل تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) على تضخيم شظايا الحمض النووي المحددة. هذه الخطوات المفاهيمية الرئيسية ضرورية لفهم استراتيجية الإثراء المستهدفة. ومع ذلك، فإن الخطوات الإجرائية الإضافية، مثل الغسيل ومراقبة الجودة، تنطوي أيضا على البروتوكولالكامل 10، 12.

قبل بدء بروتوكول التسلسل ، من المهم تقييم كمية الحمض النووي للإدخال والتأكد من أن الظروف طوال سير العمل تحافظ على سلامتها. وفقا لتوصيات الشركة المصنعة ، يتطلب البروتوكول القياسي 10-200 نانوغرام من الحمض النووي بحجم 7 ميكرولتر ، وهو ما يتوافق مع نطاق تركيز يتراوح حوالي 1.4 إلى 28.6 نانوغرام / ميكرولتر. عندما يكون تركيز الحمض النووي أقل ، ينصح بإصدار معدل من البروتوكول باستخدام 17 ميكرولتر ، مما يسمح بتركيزات تتراوح بين 0.6 و 11.8 نانوغرام / ميكرولتر مع الحفاظ على كمية المدخلاتالمطلوبة 12. نظرا للتركيزات المنخفضة التي يتم الحصول عليها غالبا من العينات السريرية ، قمنا بشكل روتيني بتنفيذ متغير بروتوكول 17 ميكرولتر. يرتبط أداء التهجين والتسلسل بجودة الحمض النووي ، مما يؤكد أهمية ظروف تخزين ونقل العينات المناسبة للحفاظ على سلامة الحمض النووي. لذلك ، فإن ممارسات المناولة المناسبة مثل تثبيت وسائط التجميع ، والمعالجة السريعة ، والحفاظ على ظروف سلسلة التبريد ، وتقليل دورات التجميد والذوبان هي تدابير مهمة لتحسين جودة الحمض النووي. بالإضافة إلى تركيزات الحمض النووي المطلوبة ، يعد طول جزء الحمض النووي مؤشرا على السلامة. نوصي بتقليل تدهور الحمض النووي أثناء معالجة العينات وتخزينها للحصول على أجزاء أطول وتحسين نتائج التسلسل. هذا مهم بشكل خاص في الإعدادات السريرية ، حيث يكون التباين في طرق الجمع والوسيط والمناولة أمرا شائعا. لقد نجحنا في تطبيق هذا البروتوكول على الحمض النووي المستخرج من كل من وسيط 2-SP ووسائط نقل NAAT ، بمتوسط أطوال شظايا يصل إلى 1 كيلو بايت ، كما هو مفصل في النتائج التمثيلية. أخيرا ، تم تعريف التسلسل الناجح على أنه تحقيق تغطية جينوم تزيد عن 95٪ بمتوسط عمق قراءة يتجاوز 10 ×10.

حتى الآن ، تم تطبيق التخصيب المستهدف بنجاح من قبل مجموعات بحثية مختلفة على مجموعة واسعة من الكائنات الحية الدقيقة والفيروسات ، بما في ذلك مسببات الأمراض المسببة للعدوى المنقولة جنسيا ، وفيروسات نورو ، وفيروسات الماشية ، ومسببات الأمراض النباتية10،13،14،15،16. ومع ذلك ، حتى الآن ، اقتصر تصميم المسبار بشكل عام على مسببات الأمراض الفردية بدلا من لوحة تستهدف جينومات كاملة لمسببات الأمراض المتعددة المرتبطة متلازمة. الأهداف المثالية هي الكائنات الحية ذات الجينومات الصغيرة المحفوظة ، والتي تشمل بالفعل C. trachomatis و T. pallidum و M. genitalium. في حين أن N.gonorrhoeae يحتوي على جينوم أكثر تنوعا وجينوم أكبر ، إلا أنه لا يزال من الممكن ترشيد المجسات لتغطيته في تصميم مع البكتيريا الثلاثة الأخرى. هناك بعض الاختلاف في ٪ G + C عبر هذه البكتيريا ، وغيرها من البكتيريا التي قد تكون مرتبطة متلازميا ، مما يعني أن الظروف قد تحتاج إلى تحسين.

الهدف من هذا البروتوكول هو الحصول على جينومات كاملة مباشرة من العينات السريرية لتمكين التحليلات الوبائية والتطورية. نعرض استراتيجية جديدة وفعالة باستخدام لوحة مسبار مصممة خصيصا ل C. trachomatis و N. gonorrhoeae و T. pallidum و M. genitalium لاستعادة الجينومات الكاملة باستخدام الحمض النووي المستخرج من العينات السريرية مثل المسحات البولية التناسلية والمستقيمية. وقد ثبت أن هذا النهج ناجح وتم تطبيقه في توصيف فاشية الورم الحبيبي الليمفاوي التنسلي (LGV) في بوينس آيرس، مما مكن من وصف سلالة جديدة من المطثية الحثرية LGV10،13.

سيتم وصف إجراء التخصيب المستهدف ، بما في ذلك استخدام طريقة التقاط الحمض النووي المتاحة تجاريا مع تجميع ما بعد الالتقاط لتسلسل الجيل التالي (NGS) المستخدم للحصول على جينومات كاملة مباشرة من العينات السريرية من المرضى الذين تم تشخيص إصابتهم بالمطثية الحثرية ، و N. penorrhoeae ، و T. pallidum ، و / أو M. genitalium الالتهابات. لتحقيق النجاح الأمثل ، يوصى باختيار عينات ذات قيمة Ct أقل من 30 ، حيث تعكس قيم Ct الأعلى أحمالا أقل لمسببات الأمراض وتقل احتمالية إنتاج جينومات كاملة. يمكن الحصول على مستخلص الحمض النووي للطريقة من عينات سريرية من أنواع مختلفة من العينات ووسائط التجميع. يمكن إجراء إجراءات استخراج الحمض النووي إما يدويا أو باستخدام أنظمة آلية ، باستخدام مجموعات مصممة لعزل مسببات الأمراض أو الحمض النووي الفيروسي من عينات المسحات البشرية (انظر جدول المواد).

تم تصميم مجموعة المسبار المستخدمة في إجراء التخصيب المستهدف (انظر جدول المواد) خصيصا لالتقاط التنوع الجيني ل C. trachomatis و N. gonorrhoeae و T. pallidum و M. genitalium. تم إنشاء مجسات مخصصة باستخدام جينومات كاملة متعددة لكل نوع ، مما أدى إلى تحسين تغطية الجينومات المعروفة10. تضمنت معايير التصميم حدا أدنى من تماثل التسلسل بنسبة 90٪ للتسلسلات المرجعية وتردد تبليط 1x-2x لتعزيز كفاءة التقاط الهدف. لتحسين الفعالية من حيث التكلفة ، قللت الخوارزمية المستخدمة في تصميم المسبار من عدد المجسات مع الحفاظ على التمثيل الجيني الشامل. تألفت مجموعة المسبار النهائية من 242,000 مسبار للتصاميم المتعددة التي تستهدف C. trachomatis و N. gonorrhoeae و M. genitalium و T. pallidum. يمكن تنفيذ بروتوكول التخصيب المستهدف بالكامل في 2 أو 3 أيام. يتم توفير مؤشرات واضحة لنقاط التوقف لكل من خيارات سير العمل لمدة يومين وثلاثة أيام.

بيان الأخلاقيات
تقترح هذه الدراسة تحسينات منهجية بناء على البروتوكولات المنشورةسابقا 10،13. تتضمن الإجراءات الموصوفة عينات مجهولة الهوية فقط ولا تتضمن بيانات المريض. لذلك ، لم تكن هناك حاجة إلى موافقة أخلاقية محددة على الجوانب المنهجية. تم الحصول على النتائج التمثيلية من مجموعتين من العينات التي سبق دراستها: العينات الأرجنتينية التي تم جمعها بموجب البروتوكول المعتمد Detección de C. trachomatis en pacientes con rectitis infecciosa: prevalencia y tipificación (Gobierno de la Ciudad de Buenos Aires, approval no. 201723)، مع الحصول على موافقة خطية مستنيرة من جميع المشاركين. والعينات الفنلندية مجهولة المصدر ، والتي لم تكن هناك حاجة إلى موافقة أخلاقية محددة. قبل إرسال قاعدة البيانات لأي بيانات تسلسل ناتجة ، يجب إزالة القراءات البشرية.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ملاحظة: يجب تقسيم مساحة العمل إلى منطقة ما قبل PCR (مساحة عمل خالية من مكبرات الصوت) ومنطقة ما بعد PCR (مساحة عمل مناولة مكبر الصوت) لمنع التلوث. ما لم ينص صراحة على خلاف ذلك، يجب تنفيذ جميع الخطوات في إحدى مساحات العمل الخاضعة للرقابة. يجب إعداد جميع الخلطات الرئيسية وخلطات تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل في مساحة العمل الخالية من المضخم ، بينما يجب إجراء جميع الخطوات اللاحقة التي تنطوي على تضخيم الحمض النووي في مساحة عمل معالجة المضخم. يتم حساب جميع الكميات في هذا البروتوكول لمعالجة ثماني عينات.

1. تجزئة الحمض النووي

  1. قياس تركيز الحمض النووي لمستخلصات الحمض النووي من العينات السريرية التي تحتوي على الحمض النووي الممرض المستهدف (DNA) باستخدام طريقة حساسة ودقيقة قائمة على التألق (مقايسة الحمض النووي مزدوج الشريطة [dsDNA] ، باستخدام 1 ميكرولتر من العينة ، مع نطاق كشف يصل إلى 120 نانوغرام / ميكرولتر ؛ انظر جدول المواد). يتم استخدام طريقة القياس الكمي هذه باستمرار في جميع أنحاء البروتوكول كلما تم قياس تركيز الحمض النووي.
  2. قم بتخفيف كل عينة من الحمض النووي بتركيز 10-200 نانوغرام باستخدام ماء خال من النوكلياز ، مما يضمن حجما نهائيا يبلغ 17 ميكرولتر في كل شريط أنبوب PCR. لتحقيق نتائج التسلسل المثلى، استخدم أكبر قدر ممكن من الحمض النووي المدخل ضمن النطاق الموصى به.
    ملاحظة: في الحالات التي يكون فيها تركيز الحمض النووي الكلي أقل من الحد الأدنى الموصى به وهو 10 نانوغرام في 17 ميكرولتر، يمكن استخدام مكملات الحمض النووي الخلفي (على سبيل المثال، الحمض النووي الجيني البشري) لتلبية متطلبات المدخلات، على النحو الذي اقترحته الشركة المصنعة. يمكن أن يساعد ذلك في استقرار تفاعل تحضير المكتبة وتحسين أداء التسلسل في العينات السريرية منخفضة المدخلات.
  3. قم بإذابة المخزن المؤقت للتجزئة (5x) ، والدوامة ، وضعها على الجليد.
  4. قم ببرمجة جهاز التدوير الحراري وفقا للجدول 1. ابدأ البرنامج وتوقف مؤقتا على الفور.
    ملاحظة: قد تختلف مدة خطوة الحضانة 37 درجة مئوية اعتمادا على حجم جزء الحمض النووي الأولي وطول قراءة NGS المطلوب. بالنسبة لعينات الحمض النووي عالية الجودة ، يوصى بوقت حضانة 15 دقيقة للحصول على شظايا من 150 إلى 200 نقطة أساس مناسبة لقراءتين 100x ، و 10 دقائق للحصول على شظايا من 180 إلى 250 نقطة أساس لقراءتين 150x.
  5. استرجع القوارير المطلوبة لمزيج التجزئة الرئيسي من تخزين -20 درجة مئوية. قم بإعداد المزيج الرئيسي بناء على الجدول 2. أغلق الأنبوب والدوامة بسرعة عالية لمدة 5-10 ثوان. قم بالدوران لفترة وجيزة لإزالة الفقاعات والحفاظ على المزيج الرئيسي على الثلج.
  6. أضف 3 ميكرولتر من مزيج التجزئة الرئيسي إلى كل بئر يحتوي على 17 ميكرولتر من الحمض النووي المدخل. امزج عن طريق سحب العينات لأعلى ولأسفل 20 ضعفا ، وأغلق شريط أنبوب PCR ، وقم بالدوامة بسرعة عالية لمدة 5-10 ثوان ، ثم قم بالدوران لفترة وجيزة.
  7. ضع شريط أنبوب PCR في جهاز التدوير الحراري (انظر جدول المواد) واستأنف البرنامج الموضح في الجدول 1 في بداية الخطوة 1.
  8. بمجرد الوصول إلى خطوة التثبيت 4 درجات مئوية ، قم بإزالة شريط أنبوب PCR من جهاز التدوير الحراري وأضف 30 ميكرولتر من الماء الخالي من النوكلياز. ضع شريط أنبوب PCR على الثلج.

الجدول 1: برنامج التدوير الحراري للتجزئة الأنزيمية. الرجاء النقر هنا لتنزيل هذا الجدول.

الجدول 2: إعداد المزيج الرئيسي للتجزئة الرجاء النقر هنا لتنزيل هذا الجدول.

2. إعداد المكتبة

  1. تحضير مزيج الربط الرئيسي
    ملاحظة: يجب تحضير مزيج الربط الرئيسي في هذه المرحلة لأنه يحتاج إلى 30-45 دقيقة ليتوازن مع درجة حرارة الغرفة.
    1. استرجع المخزن المؤقت للربط من التخزين -20 درجة مئوية وذوبان الجليد. استرجع T4 DNA ligase من تخزين -20 درجة مئوية ، واخلطها عن طريق قلب القارورة ، واستمر في وضع الثلج.
    2. تحضير مزيج الربط الرئيسي وفقا للجدول 3. أغلق الأنبوب والدوامة بسرعة عالية لمدة 10-20 ثانية ، ثم قم بالدوران لفترة وجيزة ، واحتفظ بها في درجة حرارة الغرفة لمدة 30-45 دقيقة قبل الاستخدام.
  2. إصلاح نهاية وشظايا ذيل dA
    1. قم ببرمجة جهاز التدوير الحراري وفقا للجدول 4.
    2. استرجع المخزن المؤقت لمخلفات الإصلاح النهائي من تخزين -20 درجة مئوية وقم بإذابة الثلج على الجليد. بمجرد الذوبان ، الدوامة بسرعة عالية ، تدور لفترة وجيزة. استرجع الإصلاح النهائي - مزيج إنزيم المخلفات ، واخلطه عن طريق قلب القارورة ، واستمر في وضع الثلج.
    3. قم بإعداد المزيج الرئيسي للإصلاح النهائي / dA-tailing وفقا للجدول 5 (انظر جدول المواد). امزج عن طريق إغلاق الأنبوب والدوامة بإحكام بسرعة عالية لمدة 10-20 ثانية ، ثم قم بالدوران لفترة وجيزة ، واستمر في وضع الثلج.
    4. الماصة 20 ميكرولتر من المزيج الرئيسي للإصلاح النهائي / مخلفات dA في كل بئر يحتوي على 50 ميكرولتر من شظايا الحمض النووي (من الخطوات 1.1-1.8). أغلق شريط أنبوب PCR ، واخلطه جيدا عن طريق الدوامة بسرعة عالية لمدة 5-10 ثوان. قم بتدوير شريط أنبوب PCR لفترة وجيزة وضعه في الدراجة الحرارية. استأنف برنامج الجدول 4.
  3. ربط المحولات التي تحمل علامة MBC
    1. بمجرد أن يكمل البرنامج في الجدول 4 خطوته النهائية ، ضع شريط أنبوب PCR على الجليد. قم بإعداد جهاز التدوير الحراري وفقا للمعلمات الواردة في الجدول 6. ابدأ البرنامج وأوقفه مؤقتا على الفور.
    2. أضف 25 ميكرولتر من المزيج الرئيسي لربط درجة حرارة الغرفة إلى كل عينة محضرة في الخطوة 2.1. أغلق شريط أنبوب PCR ، دوامة لمدة 5-10 ثوان ، وقم بالدوران لفترة وجيزة.
    3. استرجع مزيج oligo المحول للمكتبات التي تحمل علامات MBC (انظر جدول المواد) من تخزين -20 درجة مئوية وقم بإذابة الثلج على الجليد. بمجرد إذابة الجليد ، دوامة بسرعة عالية لمدة 5-10 ثوان. تدور لفترة وجيزة واستمر في وضع الثلج.
    4. أضف 5 ميكرولتر من مزيج oligo للمحول للمكتبات التي تحمل علامة MBC إلى كل عينة. أغلق شريط أنبوب PCR والدوامة بسرعة عالية لمدة 5-10 ثوان ، ثم قم بالدوران لفترة وجيزة. ضع شريط أنبوب PCR على الفور في جهاز التدوير الحراري واستمر في تشغيل البرنامج كما هو محدد في الجدول 6.
  4. تنظيف الربط
    1. قم بتنقية الحمض النووي باستخدام الخرز المغناطيسي. استرجع الخرزات من تخزين 4 درجات مئوية واتركها تصل إلى درجة حرارة الغرفة قبل الاستخدام.
    2. تحضير 4 مل من 70٪ من الإيثانول باستخدام ماء خال من النوكلياز. يحفظ في درجة حرارة الغرفة.
      ملاحظة: يوصى بشدة بإعداد محلول إيثانول بنسبة 70٪ حديثا لاستخدامه في خطوات التنظيف لضمان الأداء الأمثل. لتحضير الإيثانول بنسبة 70٪ ، استخدم الماء الخالي من النوكلياز مباشرة قبل الاستخدام.
    3. دوامة تعليق الخرزة المغناطيسية جيدا حتى يصبح الخليط موحدا ، ويظهر اللون متسقا.
    4. عندما يصل البرنامج الوارد في الجدول 6 إلى خطوة التثبيت 4 درجات مئوية ، انقل شريط أنبوب PCR من جهاز التدوير الحراري إلى درجة حرارة الغرفة. أضف 80 ميكرولتر من تعليق الخرزة إلى كل بئر. أغلق شريط أنبوب PCR والدوامة لمدة 5-10 ثوان ، ثم قم بالدوران لفترة وجيزة.
    5. احتضن تعليق الخرز لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. انقل شريط أنبوب PCR إلى حامل مغناطيسي (انظر جدول المواد) وانتظر من 5 إلى 10 دقائق حتى يصبح المحلول واضحا.
    6. مع الاحتفاظ بشريط أنبوب PCR في الحامل المغناطيسي ، قم بإزالة المحلول الذي تم تطهيره بعناية والتخلص منه من كل بئر ، وتجنب ملامسة الخرز.
    7. مع وجود شريط أنبوب PCR في الحامل المغناطيسي ، قم بإجراء غسلتين باستخدام 70٪ من الإيثانول بالطريقة التالية: أضف 200 ميكرولتر من 70٪ إيثانول إلى كل عينة. انتظر 1 دقيقة وقم بإزالة 70٪ من الإيثانول. تجنب لمس الخرز أثناء إزالة المحلول.
    8. بعد الغسيل الثاني ، أغلق شريط أنبوب PCR وقم بتدوير العينات لفترة وجيزة لجمع الإيثانول المتبقي. ضع شريط أنبوب PCR في الحامل المغناطيسي لمدة 30 ثانية.
    9. قم بإزالة الإيثانول الذي تم جمعه مع تجنب لمس الخرز. لإزالة الإيثانول المتبقي ، قم بإزالة شريط أنبوب PCR من الحامل المغناطيسي واحتفظ به مفتوحا (من الناحية المثالية داخل الغطاء) لمدة تصل إلى 5 دقائق. تأكد من تجفيف الخرزات بالكامل ولكن لم تتشقق في المظهر ؛ هذا من شأنه أن يقلل من كفاءة عملية الشطف.
    10. قم بتخفيض الحمض النووي بإضافة 35 ميكرولتر من الماء الخالي من النوكلياز إلى كل عينة بئر. تخلط جيدا عن طريق سحب العينات لأعلى ولأسفل 10x-15x ، وإغلاق الأنابيب ، والدوامة لمدة 5-10 ثوان. تأكد من عدم وجود كتل مرئية. في حالة وجود أي منها ، دوامة حتى تذوب.
    11. احتضان العينات في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق. ضع شريط أنبوب PCR في حامل مغناطيسي وانتظر حوالي 5 دقائق حتى يختفي المحلول.
    12. قم بإزالة المادة الطافية التي تم تطهيرها بعناية (~ 34 ميكرولتر) من كل بئر ونقلها إلى بئر مقابل في شريط أنبوب PCR جديد. احتفظ بالعينات على الثلج وتخلص من الخرز.
      ملاحظة: بالنسبة لبروتوكول لمدة 3 أيام ، يمثل هذا نهاية اليوم 1. قم بتخزين العينات في درجة حرارة 4 درجات مئوية طوال الليل.
  5. التضخيم والمؤشر المزدوج
    ملاحظة: حدد زوج التمهيدي الفهرس المناسب لكل عينة لضمان التحديد الصحيح أثناء التسلسل. يتكون كل تسلسل فهرس من علامة 8 نقاط أساس مدمجة في البادئات المستخدمة لتضخيم مكتبات ما قبل الالتقاط.
    1. استرجع المخزن المؤقت لبوليميراز الحمض النووي عالي الدقة باستخدام dNTPs (5x) من تخزين -20 درجة مئوية وقم بإذابة الثلج على الجليد. استرجع بادئات التسلسل المفهرسة المحددة من تخزين -20 درجة مئوية واحتفظ بها على الجليد.
      ملاحظة: تأكد من تسجيل الرمز الشريطي المحدد المخصص لكل عينة لتحديد وإمكانية التتبع بدقة طوال عملية التسلسل.
    2. قم ببرمجة جهاز التدوير الحراري وفقا للجدول 7. ابدأ البرنامج وتوقف مؤقتا على الفور.
      ملاحظة: توصي الشركة المصنعة بإجراء 8 إلى 14 دورة PCR قبل الالتقاط اعتمادا على جودة وكمية الحمض النووي المدخل. في هذا البروتوكول ، تم تنفيذ 11 دورة وفقا لتوصيات الشركة المصنعة ، مما أدى إلى بيانات تسلسل عالية الجودة10،12.
    3. استرجع إنزيم الاندماج عالي الدقة لتضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل من تخزين -20 درجة مئوية. ماصة الإنزيم لأعلى ولأسفل للخلط مع تجنب التحريض المفرط ، ودوامة المخزن المؤقت لبوليميراز الحمض النووي عالي الدقة لضمان التجانس. قم بإعداد مزيج تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل قبل الالتقاط (كما هو موضح في الجدول 8). دوامة المزيج النهائي وتدور لفترة وجيزة ، واستمر على الجليد.
    4. قم بتوزيع 11 ميكرولتر من مزيج تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل قبل الالتقاط (المحضر كما هو موضح في الجدول 8) في كل عينة تحتوي على مكتبة الحمض النووي النقية. أضف 5 ميكرولتر من زوج التمهيدي المحدد للفهرس إلى كل تفاعل. أغلق شريط أنبوب PCR والدوامة لمدة 5 ثوان ، ثم قم بالدوران بسرعة.
    5. استأنف برنامج التدوير الحراري كما هو محدد في الجدول 7. بمجرد أن تصل درجة الحرارة إلى 98 درجة مئوية ، ضع شريط أنبوب PCR في جهاز التدوير الحراري وأغلق الغطاء بإحكام.
  6. تنظيف المكتبة
    1. اسمح للحبات المغناطيسية بالتوازن مع درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة على الأقل قبل الاستخدام. تحضير 4 مل من 70٪ من الإيثانول باستخدام ماء خال من النوكلياز. يحفظ في درجة حرارة الغرفة.
    2. دوامة تعليق الخرزة المغناطيسية جيدا حتى يصبح الخليط موحدا ، ويظهر اللون متسقا.
    3. عندما يصل البرنامج الوارد في الجدول 7 إلى خطوة التثبيت 4 درجات مئوية ، انقل شريط أنبوب PCR من جهاز التدوير الحراري إلى درجة حرارة الغرفة. أضف 50 ميكرولتر من تعليق الخرزة إلى كل عينة. أغلق شريط أنبوب PCR والدوامة لمدة 5-10 ثوان ، وقم بالدوران لفترة وجيزة (دون تكوير الخرز المغناطيسي).
    4. احتضن تعليق الخرز لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. انقل شريط أنبوب PCR إلى حامل مغناطيسي وانتظر 5-10 دقائق حتى يصبح المحلول واضحا.
    5. مع الاحتفاظ بشريط أنبوب PCR في الحامل المغناطيسي ، قم بإزالة المحلول الشفاف والتخلص منه بعناية من كل بئر. تجنب لمس الخرز أثناء إزالة المحلول.
    6. مع وجود شريط أنبوب PCR في الحامل المغناطيسي ، قم بإجراء غسلتين بنسبة 70٪ من الإيثانول بالطريقة التالية. أضف 200 ميكرولتر من 70٪ إيثانول إلى كل عينة. انتظر 1 دقيقة وقم بإزالة 70٪ من الإيثانول. تجنب لمس الخرز أثناء إزالة المحلول.
    7. بعد الغسيل الثاني ، أغلق شريط أنبوب PCR وقم بتدويره لفترة وجيزة لجمع الإيثانول المتبقي. ضع شريط أنبوب PCR في الحامل المغناطيسي لمدة 30 ثانية. قم بإزالة الإيثانول المتبقي مع تجنب لمس الخرز.
    8. لإزالة الإيثانول المتبقي ، قم بإزالة شريط أنبوب PCR من الحامل المغناطيسي واحتفظ به مفتوحا (من الناحية المثالية داخل الغطاء) لمدة تصل إلى 5 دقائق. تأكد من تجفيف الخرزات بالكامل ولكن غير متشققة في المظهر ، لأن ذلك من شأنه أن يقلل من كفاءة عملية الشطف.
    9. قم بإزالة الحمض النووي للمكتبة عن طريق إضافة 15 ميكرولتر من الماء الخالي من النوكلياز إلى كل أنبوب عينة. امزج جيدا عن طريق سحب العينات لأعلى ولأسفل 10x-15x ، وإغلاق شريط أنبوب PCR ، والدوامة لمدة 5-10 ثوان. تأكد من عدم وجود كتل مرئية. في حالة وجود أي منها ، دوامة حتى تذوب.
    10. احتضان العينات في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق. ضع شريط أنبوب PCR في حامل مغناطيسي وانتظر حوالي 5 دقائق حتى يختفي المحلول.
    11. قم بإزالة المادة الطافية التي تم تطهيرها بعناية (~ 15 ميكرولتر) من كل بئر ونقلها إلى بئر مقابل في شريط أنبوب PCR جديد. احتفظ بالعينات على الثلج وتخلص من الخرز.
  7. مراقبة الجودة
    1. قياس تركيز الحمض النووي للحمض النووي للمكتبة المنقى. نظرا للحساسية العالية ، استخدم طريقة قائمة على التألق لتحديد كمية الحمض النووي في 1 ميكرولتر.

الجدول 3: تحضير مزيج الربط الرئيسي. الرجاء النقر هنا لتنزيل هذا الجدول.

الجدول 4: برنامج التدوير الحراري للإصلاح النهائي / مخلفات dA. الرجاء النقر هنا لتنزيل هذا الجدول.

الجدول 5: تحضير الإصلاح النهائي / dA مزيج المخلفات الرئيسية. الرجاء النقر هنا لتنزيل هذا الجدول.

الجدول 6 برنامج التدوير الحراري للربط. الرجاء النقر هنا لتنزيل هذا الجدول.

الجدول 7: برنامج التدوير الحراري PCR قبل التقاط. الرجاء النقر هنا لتنزيل هذا الجدول.

الجدول 8: تحضير مزيج تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل قبل التقاط. الرجاء النقر هنا لتنزيل هذا الجدول.

3. عينة تهجين / التقاط

  1. مكتبات التهجين للتحقيق
    1. قم ببرمجة التدوير الحراري وفقا للجدول 9. ابدأ البرنامج وتوقف مؤقتا على الفور.
      ملاحظة: توصي الشركة المصنعة بدرجة حرارة تهجين تبلغ 65 درجة مئوية. تم تخفيض درجة الحرارة هذه إلى 62.5 درجة مئوية ، مما أدى إلى تحسين النتائج.
    2. استرجع المخزن المؤقت للتهجين من التخزين -20 درجة مئوية ، وقم بإذابة الثلج ، واحتفظ به في درجة حرارة الغرفة حتى الاستخدام. استرجع كل من مانع RNase ومزيج حاصرات قليل النوكليوتيدات من تخزين -20 درجة مئوية وذوبان الجليد. احتفظ بهذه القوارير على الثلج حتى الاستخدام.
    3. احسب الحجم المطلوب لكل عينة لاحتواء 500-1000 نانوغرام من مكتبة الحمض النووي ، بناء على تركيز الحمض النووي المقاس في الخطوة 2.7. انقل الحجم المحسوب إلى شريط أنبوب PCR جديد واضبط الحجم الإجمالي إلى 12 ميكرولتر بماء خال من النوكلياز.
    4. دوامة وتدور بسرعة مزيج حاصرات قليل النوكليوتيدات. أضف 5 ميكرولتر إلى كل أنبوب عينة. أغلق شريط أنبوب PCR وانقله إلى التدوير الحراري. استأنف برنامج التدوير الحراري الموضح في الجدول 9 وقم بتشغيله حتى الخطوة 3 ، حيث يجب إضافة كواشف إضافية مباشرة إلى آبار العينة في التدوير الحراري.
    5. تحضير محلول كتلة RNase بنسبة 25٪ وفقا للجدول 10. أغلق الأنبوب والدوامة بسرعة عالية لمدة 10-20 ثانية ، ثم قم بالدوران لفترة وجيزة ، واستمر في وضع الثلج حتى الاستخدام.
      ملاحظة: تجنب التعرض المطول للمحاليل المحتوية على المسبار لدرجة حرارة الغرفة. يحفظ في درجة حرارة الغرفة فقط أثناء خطوات التحضير.
    6. استرجع قارورة المسبار من التخزين -80 درجة مئوية واحتفظ بالقارورة في رف التبريد أثناء عدم الاستخدام. نقل إلى الثلج لإذابة الجليد. يوصى باستخدام المجسات على النحو المنصوص عليه ، ولكن يمكن تخفيفها إذا تم اختبارها10،13.
    7. بمجرد أن تصل جميع الكواشف المدرجة في الجدول 11 إلى درجة حرارة الغرفة ، اجمعها لتحضير مزيج تهجين المسبار. امزج المحلول عن طريق الدوامة بسرعة عالية لمدة 5 ثوان ، ثم قم بالدوران لفترة وجيزة ، وانتقل على الفور إلى الخطوة التالية.
    8. عندما يصل التدوير الحراري إلى الخطوة 3 من البرنامج الموضح في الجدول 9 ، أضف 13 ميكرولتر من مزيج تهجين مسبار درجة حرارة الغرفة إلى كل عينة جيدا ، مع الحفاظ على الأنابيب في التدوير الحراري طوال العملية. تخلط جيدا عن طريق سحب العينة لأعلى ولأسفل ببطء 8x-10x.
    9. أغلق شريط أنبوب PCR بإحكام ، وقم بدوامة لفترة وجيزة ، وقم بتدوير الأنابيب. تأكد من عدم وجود فقاعات ، ثم أعد أنابيب الشريط على الفور إلى الدراجة الحرارية. تحقق جيدا من أن الأنابيب محكمة الغلق بشكل مناسب.
    10. استأنف برنامج التدوير الحراري من أجل إجراء تهجين عينات الحمض النووي للمكتبة المعدة مع المجسات. يستمر التهجين بين عشية وضحاها
      ملاحظة: بالنسبة لبروتوكول لمدة يومين ، يمثل هذا نهاية اليوم 1. بالنسبة لبروتوكول مدته 3 أيام ، يمثل هذا نهاية اليوم 2.
  2. تحضير حبات الستربتافيدين
    1. استرجع الخرز المغناطيسي المطلي بالستربتافيدين (حبات الستربتافيدين) من تخزين 4 درجات مئوية. دوامة القارورة جيدا لضمان تعليق الخرز بالكامل. يجب أن يكون التعليق متجانسا.
    2. لكل عينة تهجين ، انقل 50 ميكرولتر من الخرزات المعلقة بالكامل إلى أنابيب فردية لشريط أنبوب PCR جديد.
    3. اغسل حبات الستربتافيدين بالطريقة التالية: أضف 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت المرتبط لكل أنبوب ، واخلطه عن طريق سحب العينات لأعلى ولأسفل. أغلق الأنابيب ، دوامة بسرعة عالية لمدة 5-10 ثوان ، ثم قم بالدوران لفترة وجيزة. ضع شريط أنبوب PCR في حامل مغناطيسي. اترك المحلول ينظف لمدة 5 دقائق ، ثم قم بإزالة المادة الطافية بعناية وتخلص منها. كرر الخطوات 2x ، لإكمال ما مجموعه ثلاث غسلات.
    4. أعد تعليق الخرزات في 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت للربط.
  3. التقاط المكتبات المهجنة
    1. بمجرد أن يكمل برنامج التهجين الحراري المشار إليه في الجدول 9 خطوته النهائية ، انقل شريط أنبوب PCR إلى درجة حرارة الغرفة.
    2. انقل الحجم بالكامل (~ 30 ميكرولتر) من كل أنبوب إلى الأنابيب المقابلة التي تحتوي على 200 ميكرولتر من حبات الستربتافيدين المغسولة مسبقا. امزج جيدا عن طريق سحب العينات لأعلى ولأسفل 5x-8x، ثم أغلق أنبوب الشريط بإحكام.
    3. ضع أنبوب الشريط على خلاط 96 بئرا واخلطه بقوة عند 1800 دورة في الدقيقة لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. تأكد من الخلط السليم للسائل داخل الآبار.
      ملاحظة: إذا كان خلاط الألواح سعة 96 بئرا غير متوفر أو إذا كانت العينات لا تختلط بشكل فعال ، ففكر في طرق بديلة مثل تثبيت الأنابيب الشريطية أفقيا على السطح العلوي للخلاط أو استخدام شاكر يتم التحكم في درجة حرارته (مع إيقاف تشغيل خيار التسخين) لضمان تحريض العينة بشكل شامل.
    4. خلال وقت الحضانة هذا ، قم بإعداد ستة حصص من 200 ميكرولتر من مخزن الغسيل عالي الحرارة لكل عينة (أي في هذه الحالة ، 6 × 8 أنابيب شريطية لكل منها 200 ميكرولتر). أغلق الأنابيب واحتضانها في جهاز التدوير الحراري المثبت عند 70 درجة مئوية لحين الحاجة.
    5. بمجرد اكتمال حضانة الالتقاط لمدة 30 دقيقة ، قم بتدوير شريط أنبوب PCR لفترة وجيزة لتجميع السائل. ضع شريط أنبوب PCR في حامل مغناطيسي لجمع الخرز. انتظر حتى يصبح المحلول واضحا (حوالي 2 دقيقة) ، ثم قم بإزالة المادة الطافية بعناية والتخلص منها مع تجنب لمس الخرز.
    6. بعد إزالة شريط أنبوب PCR من الحامل المغناطيسي ، أضف 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت للغسيل في درجة حرارة الغرفة. الماصة لأعلى ولأسفل حتى يتم تعليق حبات الستربتافيدين بالكامل (15x-20x).
    7. ضع شريط أنبوب PCR في الحامل المغناطيسي وانتظر حتى يزول التعليق (حوالي 1 دقيقة). ثم قم بإزالة المادة الطافية والتخلص منها.
      ملاحظة: لضمان خصوصية الالتقاط ، من الضروري الحفاظ على تعليق الخرزة عند 70 درجة مئوية طوال عملية الغسيل الموضحة أدناه. لذلك ، تحقق من تسخين مخزن الغسيل عالي الحرارة مسبقا إلى 70 درجة مئوية قبل الاستخدام.
    8. اغسل حبات الستربتافيدين 6 مرات باستخدام مخزن غسيل عالي الحرارة ودافئ مسبقا إلى 70 درجة مئوية كما هو موضح أدناه.
      1. قم بإزالة أنبوب شريط PCR الذي يحتوي على الخرز من الحامل المغناطيسي. أضف 200 ميكرولتر من 70 درجة مئوية مخزن غسيل عالي الحرارة مسخن مسبقا إلى كل أنبوب يحتوي على الخرز. الماصة لأعلى ولأسفل حتى يتم تعليق الخرزات بالكامل (15x-20x). أغلق شريط أنبوب PCR بعناية ، ودوامة بسرعة عالية لمدة 8 ثوان ، ثم قم بالدوران بسرعة دون تكوير الخرز.
      2. ضع أنبوب شريط العينة الذي يحتوي على الخرزات المعلقة في كتلة التدوير الحراري عند 70 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. انقل أنبوب الشريط من جهاز التدوير الحراري إلى الحامل المغناطيسي في درجة حرارة الغرفة.
      3. انتظر 1 دقيقة حتى يتم مسح الحل. ثم قم بإزالة المادة الطافية والتخلص منها. كرر 5 مرات ليصبح المجموع ست غسلات.
    9. تأكد من إزالة كل عازلة الغسيل بالكامل ، ثم أضف 25 ميكرولتر من الماء الخالي من النوكلياز إلى كل أنبوب عينة. قم بتعليق الخرزات ببطء عن طريق سحب الخرز لأعلى ولأسفل 8 مرات ، في محاولة لتجنب تكوين الفقاعات.
    10. احتفظ بشريط تفاعل البوليميراز المتسلسل الذي يحتوي على العينات على الثلج حتى تصبح جاهزة للاستخدام في تفاعلات تفاعل البوليميراز المتسلسل الموضحة أدناه.
  4. المكتبات الغنية بالتضخيم
    1. قم ببرمجة جهاز التدوير الحراري وفقا للجدول 12. ابدأ البرنامج وتوقف مؤقتا على الفور.
      ملاحظة: توصي الشركة المصنعة بإجراء 10 إلى 16 دورة PCR بعد الالتقاط اعتمادا على حجم تصميم المسبار. في هذا البروتوكول ، تم تنفيذ 22 دورة ، مما أدى إلى استعادة جينوم العامل الممرض بنجاح10،12.
    2. استرجع كل من المخزن المؤقت لبوليميراز الحمض النووي عالي الدقة باستخدام dNTPs (5x) ومزيج التمهيدي بعد الالتقاط (انظر جدول المواد) من -20 درجة مئوية للتخزين والذوبان والاحتفاظ به على الجليد. دوامة بسرعة عالية وتدور بسرعة قبل الاستخدام.
    3. استرجع إنزيم الاندماج عالي الدقة لتضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل (انظر جدول المواد) من تخزين -20 درجة مئوية. لخلط محلول الإنزيم بشكل صحيح ، قم بتحريك الماصة لأعلى ولأسفل السائل لتجنب التحريض المفرط. بعد ذلك ، قم بإعداد مزيج تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل بعد الالتقاط عن طريق الجمع بين جميع الكواشف وفقا للجدول 13. دوامة المزيج النهائي وتدور لفترة وجيزة ، واستمر على الجليد.
    4. أضف 25 ميكرولتر من مزيج تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل بعد الالتقاط إلى كل أنبوب عينة (يحتوي كل منهما على 25 ميكرولتر من الحمض النووي المخصب بالهدف المرتبط بالخرزة). الماصة لأعلى ولأسفل لخلط التفاعلات حتى يصبح تعليق الخرزة موحدا. أغلق شريط أنبوب PCR بإحكام. لا تقم بتدوير شريط أنبوب PCR في هذه المرحلة.
    5. ضع شريط أنبوب PCR في جهاز التدوير الحراري واستأنف برنامج التدوير الحراري كما هو محدد في الجدول 12. بمجرد أن يصل البرنامج إلى خطوته النهائية ، قم بتدوير شريط أنبوب PCR لفترة وجيزة. ضع شريط أنبوب PCR في الحامل المغناطيسي ، وانتظر حوالي 2 دقيقة حتى يتم مسح المحلول.
    6. انقل ما يقرب من 50 ميكرولتر من المادة الطافية من كل شريط أنبوب PCR إلى البئر المقابل لشريط أنبوب PCR جديد. يمكن التخلص من الأنبوب الشريطي الذي يحتوي على حبات الستربتافيدين.
  5. تنظيف المكتبات النهائية
    1. اسمح للحبات المغناطيسية بالتوازن مع درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة على الأقل قبل الاستخدام. تحضير 4 مل من 70٪ من الإيثانول باستخدام ماء خال من النوكلياز. يحفظ في درجة حرارة الغرفة.
    2. دوامة تعليق الخرزة المغناطيسية جيدا حتى يصبح الخليط موحدا ، ويظهر اللون متسقا.
    3. أضف 50 ميكرولتر من تعليق الخرزة إلى كل أنبوب عينة. أغلق الأنابيب والدوامة لمدة 5-10 ثوان ، وقم بالدوران لفترة وجيزة (دون تكوير الخرز المغناطيسي).
    4. احتضن تعليق الخرز لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. انقل شريط أنبوب PCR إلى حامل مغناطيسي وانتظر 5-10 دقائق حتى يصبح المحلول واضحا.
    5. مع الاحتفاظ بشريط أنبوب PCR في الحامل المغناطيسي ، قم بإزالة المحلول الشفاف والتخلص منه بعناية من كل بئر. تجنب لمس الخرز أثناء إزالة المحلول.
      1. مع وجود شريط أنبوب PCR في الحامل المغناطيسي ، قم بإجراء غسلتين باستخدام 70٪ من الإيثانول بالطريقة التالية: أضف 200 ميكرولتر من 70٪ إيثانول إلى كل عينة. انتظر 1 دقيقة للسماح للخرز المضطرب بالاستقرار وإزالة 70٪ من الإيثانول. تجنب لمس الخرز أثناء إزالة المحلول.
    6. بعد الغسيل الثاني ، أغلق الأنابيب وقم بتدوير شريط أنبوب PCR لفترة وجيزة لجمع الإيثانول المتبقي. ضع شريط أنبوب PCR على الحامل المغناطيسي لمدة 30 ثانية.
    7. لإزالة الإيثانول المتبقي ، قم بإزالة شريط أنبوب PCR من الحامل المغناطيسي واحتفظ به مفتوحا (من الناحية المثالية داخل غطاء المحرك) لمدة أقصاها 5 دقائق. تأكد من تجفيف الخرزات بالكامل ولكن لم تتشقق في المظهر ، فهذا من شأنه أن يقلل من كفاءة عملية الشطف.
    8. قم بإزالة الحمض النووي للمكتبة عن طريق إضافة 25 ميكرولتر من الماء الخالي من النوكلياز إلى كل أنبوب عينة. امزج جيدا عن طريق سحب العينات لأعلى ولأسفل 10x-15x ، وإغلاق شريط أنبوب PCR ، والدوامة لمدة 5-10 ثوان. تأكد من عدم وجود كتل مرئية.
    9. احتضان العينات في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق. ضع شريط أنبوب PCR في حامل مغناطيسي وانتظر حوالي 5 دقائق حتى يختفي المحلول.
    10. قم بإزالة المادة الطافية التي تم تطهيرها بعناية (حوالي 25 ميكرولتر) من كل بئر ونقلها إلى بئر مقابل في شريط أنبوب PCR جديد. احتفظ بالعينات على الثلج وتخلص من الخرز.
  6. مراقبة الجودة
    1. قياس تركيز الحمض النووي للحمض النووي للمكتبة المنقى. لتحقيق حساسية أفضل ، استخدم طريقة قائمة على التألق لتحديد كمية الحمض النووي في 1 ميكرولتر.
  7. تسلسل الجيل التالي
    ملاحظة: اعتمادا على سعة النظام الأساسي المستخدم وكمية بيانات التسلسل المطلوبة لكل عينة، يمكن تعدد إرسال المكتبات المفهرسة من عدة دفعات في تشغيل تسلسل واحد.
    1. قبل تجميع العينات ، اضبط تركيز الحمض النووي لكل عينة إلى 5 نانوغرام / ميكرولتر. قم بتجميع المكتبات بكميات متساوية المولار للحفاظ على تمثيل متوازن.
    2. تسلسل المكتبات المعدة باستخدام نظام تسلسل القراءة القصيرة عالي الإنتاجية مع ، على سبيل المثال ، تكوين قراءة مزدوج 150 نقطة أساس (انظر جدول المواد).

الجدول 9: برنامج التدوير الحراري للتهجين. الرجاء النقر هنا لتنزيل هذا الجدول.

الجدول 10: تحضير محلول كتلة RNase. الرجاء النقر هنا لتنزيل هذا الجدول.

الجدول 11: تحضير مزيج تهجين المسبار. الرجاء النقر هنا لتنزيل هذا الجدول.

الجدول 12: برنامج التدوير الحراري PCR بعد التقاط. الرجاء النقر هنا لتنزيل هذا الجدول.

الجدول 13: تحضير مزيج تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل بعد التقاط. الرجاء النقر هنا لتنزيل هذا الجدول.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

أظهرت دراسة أجريت على C. trachomatis LGV تفشي في بوينس آيرس ، الأرجنتين ، بعض السمات الجديدة في العينات ، وهي 10 بدائل للنيوكليوتيدات في جين ompA مقارنة بالنمط الجيني ompA L1 ، وتسلسل غير عادي متعدد المواقع (MLST) من النوع 217،18،19. كنا نهدف إلى التحقيق في الجينومات من هذه العينات السريرية ، ووضعها في سياق البيانات العالمية. لتحقيق ذلك ، قمنا بمقارنة أداء نهج التخصيب المستهدف مع التسلسل الميتاجينومي المباشر ل WGS للأمراض المنقولة جنسيا البكتيرية من العينات السريرية ، في محاولة للتغلب على التحديات التي تفرضها الأحمال البكتيرية المنخفضة والحمض النووي البشري والميكروبي الوفير.

كان الحمض النووي المستخدم إما من عينات مسحة المستقيم التي تم جمعها بين عامي 2017 و 2023 في بوينس آيرس ، الأرجنتين ، ووضعت في وسط 2-SP (وسط السكروز والفوسفات) مكملا بمصل ربلة الساق الجنينية بنسبة 2٪ (FCS) والمضادات الحيوية (جنتاميسين 25 ميكروغرام / مل ، فانكومايسين 0.5 مجم / مل ، والأمفوتريسين ب 2.5 ميكروغرام / مل) وتخزينها عند -80 درجة مئوية ، أو مجرى البول المجمعة ، الشرجية ، ومسحات البلعوم التي تم جمعها في مستشفى جامعة زيورخ (USZ) في NAATs (اختبارات تضخيم الحمض النووي) المخزن المؤقت. تم استخراج الحمض النووي من عينات بوينس آيرس باستخدام مجموعة أدوات استخراج يدوية قائمة على السيليكا ، بينما تم استخراج الحمض النووي من عينات USZ باستخدام نظام آلي قائم على الخرزة المغناطيسية.

تم تأكيد إيجابية جميع العينات السريرية المدرجة في هذه الدراسة من خلال اختبار تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الفعلي متعدد الإرسال المطور داخليا (انظر جدول المواد) مع قيم عتبة دورة qPCR (Ct) تتراوح على النحو التالي: C. trachomatis: 17-34 ، N. gonorrhoeaeae:  24-31 ، T. الشاحب: 27-36 ، و M. التناسلي:  30-37. تم قياس تركيز الحمض النووي باستخدام مقايسة فلورومترية عالية الحساسية قبل التسلسل لتوصيف مادة الإدخال للعينات السريرية (انظر جدول المواد).

لمقارنة التسلسل الميتاجينومي المباشر مع التخصيب المستهدف ، استخدمنا 32 عينة ، منها 29 عينة إيجابية ل C. trachomatis ، وتسع للنيسرية البنية ، وخمسة ل T. pallidum ، وثلاثة ل M. genitalium. لم ينتج عن التسلسل الميتاجينومي المباشر أي جينومات كاملة ، وفي الواقع بالكاد حقق البيانات المستهدفة فوق خط الأساس الذي شوهد في العينات السلبية. أدى التخصيب المستهدف بالتهجين عند 65 درجة مئوية إلى نتائج أفضل بكثير لكل ممرض ، وتم الحصول على جينومات ناجحة في كثير من الحالات من هذه الطريقة (الشكل 1).

لتقييم الاختيار الأمثل للعينة للتخصيب المستهدف ، قمنا بتقييم العلاقة بين قيم qPCR Ct التشخيصية وكفاءة استعادة الجينوم ، كما تم قياسها بالنسبة المئوية للقراءات المستهدفة (٪ OTR). يعكس هذا المقياس نسبة قراءات التسلسل التي يتم تعيينها إلى جينوم الكائن الحي المستهدف وتستخدم بشكل شائع لتقييم أداء التخصيب. تم العثور على علاقة ذات دلالة إحصائية بين حمل العامل الممرض ونجاح التسلسل ل C. trachomatis ، مع قطع Ct للنجاح حول Ct30. على الرغم من أن البيانات الخاصة بمسببات الأمراض المستهدفة الأخرى كانت محدودة ، فقد لوحظ اتجاه مماثل ، حيث حدث نجاح تسلسل الجينوم في الغالب في العينات ذات حمل العامل الممرض أقل من Ct30 (الشكل 2).

أعطت هذه التجربة بدرجة حرارة تهجين تبلغ 65 درجة مئوية معدلات نجاح تسلسل الجينوم مع إثراء مستهدف بنسبة 75٪ -80٪ ل C. trachomatis و N. gonorrhoeae و T. pallidum ، بناء على عينات ذات قيم Ct أقل من 30. العينات الثلاثة M. التناسلية الإيجابية لها قيم Ct من 30-37 وحققت تغطية جينوم أقل ومتوسط عمق القراءة. من أجل تحسين هذه النتائج ، جربنا تقليل درجة حرارة التهجين ، مما يحسن التهجين بسبب انخفاض محتوى G + C في M . genitalium الجينوم. باستخدام درجات حرارة تهجين منخفضة ، مثل درجة الحرارة الموصى بها الآن البالغة 62.5 درجة مئوية ، يمكننا تحسين استعادة جينومات M. genitalium دون المساس باستعادة الجينومات الأخرى (الشكل 3). توضح هذه النتائج أن التخصيب المستهدف هو نهج فعال للحصول على معلومات جينومية قيمة من العينات السريرية ويمكن تكييفه مع مجموعة واسعة من الجينومات ، أيضا عبر تصميم قائم على اللوحة.

أظهر تحليل النشوء والتطور ل C. trachomatis المخصبة بنجاح الجينوم أن غالبية العينات من بوينس آيرس تتجمع داخل كليد النمط الجيني ompA L2b ، مما يشير إلى سلالة ناجحة مع الدورة الدموية العالمية. كشف التحليل أيضا عن وجود سلالة جديدة ومتميزة في الأرجنتين ، مما تسبب في LGV. تختلف العينات من هذا الكليد بحوالي 600 SNPs من سلالات LGV الأخرى ، ويقترح هذا النسب على أنه النمط الجيني ompA L4 (الشكل 4). يتم توفير وصف مفصل للعينات المستخدمة في الشكل 1 والشكل 2 والشكل 4 في الجدول التكميلي 1.

تؤكد هذه النتائج على قيمة التخصيب المستهدف في دراسة تنوع مسببات الأمراض وتظهر درجة عالية من نجاح تسلسل الجينوم من العينات السريرية.

figure-results-1
الشكل 1: إثراء الجينومات باستخدام التخصيب المستهدف مقارنة بالتسلسل الميتاجينومي المباشر. تظهر النسبة المئوية للقراءات المستهدفة (٪ OTR) ، والتي يتم تعريفها على أنها النسبة المئوية لقراءات التسلسل التي يتم تعيينها إلى جينوم الكائن الحي المستهدف ، درجة التخصيب التي تم تحقيقها من خلال التخصيب المستهدف. يمثل الخط متوسط جميع نقاط البيانات ، ويشير المربع إلى النطاق الربيعي 50٪ (IQR). تتوافق ألوان نقطة البيانات مع مصدر العينة: الأزرق الباهت للأرجنتين والأحمر لسويسرا. يتم تمثيل نجاح تسلسل الجينوم ، الذي يعرف بأنه تغطية >95٪ ومتوسط عمق القراءة >10 ، بنقاط كبيرة ، بينما يشار إلى الفشل بنقاط صغيرة. لاحظ المقاييس المختلفة على المحور y. الاختصارات: CT = C. trachomatis ، NG = N. السيلان ، TP = T. الشاحب, MG = M. التناسلية. تم تعديل هذا الرقم من10. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-2
الشكل 2: ارتباط ٪OTR من التخصيب المستهدف مع قيم qPCR Ct التشخيصية. تمثل ألوان نقطة البيانات مصدر العينة: الأزرق الباهت للأرجنتين والأحمر لسويسرا. يشار إلى نجاح تسلسل الجينوم ، الذي يعرف بأنه تغطية >95٪ ومتوسط عمق القراءة >10 ، بنقاط كبيرة ، بينما يتم تمثيل الفشل بنقاط صغيرة. لاحظ المقاييس المختلفة على المحور y. الاختصارات: CT = C. trachomatis ، NG = N. السيلان ، TP = T. الشاحب, MG = M. التناسلية. تم تعديل هذا الرقم من10. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-3
الشكل 3: تأثير درجة حرارة التهجين على استعادة الجينومات الكاملة عبر جميع مسببات الأمراض البكتيرية المنقولة جنسيا في عشر عينات. تم رفع الحمض النووي البشري في نطاق ذلك في العينات السريرية بتركيزات معروفة من الحمض النووي البكتيري المستهدف بشكل منفصل (فردي) وأيضا تماما لتمثيل عينة بها التهابات متعددة (مجمعة). تم إجراء تجربتين ، كل منهما مع مسببات الأمراض / التركيبات الخمسة: 0.01٪ و 0.03٪ لتمثيل النسبة المئوية التقريبية للحمض النووي من كل كائن حي دقيق بالنسبة إلى الحمض النووي الكلي في العينة (الحمض النووي المتبقي يتوافق مع الحمض النووي البشري). يتم تحسين استعادة M. genitalium في درجات الحرارة المنخفضة. C. trachomatis تم رفع الحمض النووي بتركيز منخفض. تظهر تجارب أخرى أن درجات الحرارة لم تؤثر على استعادة C. trachomatis الجينوم (البيانات غير معروضة). الاختصارات: CT = C. trachomatis ، MG = M. genitalium ، NG = N. السيلان ، TP = T. الشاحب. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-4
الشكل 4: سلالة إعادة التركيب لسلالات LGV من الأرجنتين. يتضمن التحليل جميع جينومات LGV المتاحة مع البيانات المنشورة. تتضمن البيانات الوصفية المعروضة على يمين السلالة عينات مكررة من المرضى ، وتحليل بايز للهيكل السكاني (BAPS ؛ cluster = clade ، مع مجموعة BAPS متعددة الأنماط 6 التي تمثل التنوع الجيني للسكان) ، وطريقة تسلسل الجينوم (بيانات من هذه الدراسة) ، والنمط الجيني ompA ، والبلد ، والسنة ، كما هو موضح في المفتاح أعلى اليسار. تظهر البيانات المفقودة باللون الأبيض. يتم تمييز أسماء الجينوم من هذه الدراسة باللون الأزرق الفاتح للأرجنتين والأزرق الداكن لفنلندا (لم يتم الحصول عليها عن طريق التخصيب المستهدف). تستخدم هذه الألوان فقط لتمييز الجينومات المتولدة في هذه الدراسة. يتم عرض قيم Bootstrap من 1000 تمهيد فائق السرعة كنسب مئوية على الفروع الرئيسية. تم تعديل هذا الرقم من13. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الجدول التكميلي 1: وصف المواد والكواشف والأدوات والمعدات المستخدمة في الدراسة. يتضمن الجدول معلومات مفصلة عن الاسم التجاري والشركة المصنعة ورقم الفهرس للمكونات المستخدمة في استخراج الحمض النووي وإعداد المكتبة وإثراء الهدف والتسلسل. ويشمل أيضا العناصر المستخدمة في فحوصات qPCR الداخلية وإجراءات البيولوجيا الجزيئية العامة. ويمكن استخدام بدائل مكافئة للأصناف المميزة بعلامة النجمة (*). الرجاء النقر هنا لتنزيل هذا الجدول.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعد إنشاء بيانات الجينوم البكتيرية الكاملة من العينات السريرية أمرا صعبا بشكل خاص. ومع ذلك ، نحتاج إلى هذه البيانات للحصول على معلومات عن المستنسخة المنتشرة والتحقيق في ملامح مقاومة مضادات الميكروبات ، لا سيما في البكتيريا الحساسة والتي يصعب زراعتها. باستخدام طرق بديلة مثل التسلسل العميق أو التسلسل التكيفي باستخدام Oxford Nanopore Technologies ، لا يمكن الحصول على بيانات كافية لتحليل تسلسل الجينوم الكامل. في حالات مثل عينات الأمراض المنقولة جنسيا ، يكون التخصيب المستهدف هو الأسلوب الأمثل للوصول إلى الجينوم الكامل ، ويمكن استخدام هذه الطريقة عبر مجموعة من مسببات الأمراض المنقولة جنسيا البكتيرية. على الرغم من أنه ليس إجراء رخيصا ، إلا أنه لا يمكن الحصول على النتائج التي يمكن أن يقدمها بأي طريقةأخرى 10.

يجب اختيار العينات المناسبة بعناية ، من الناحية المثالية للإجابة على الأسئلة ذات الصلة والمهمة في التشخيص والبحث. لا تلعب الوسيط المستخدم للتجميع بالضرورة دورا مهما ، مع الحصول على تسلسلات ناجحة من كل من وسائط 2-SP و NAAT. تخزين العينات مهم ، بهدف الحفاظ على سلامة الحمض النووي. تم العثور على العامل الأكثر أهمية هو الحمل التشخيصي ، الذي يهدف إلى قيم Ct التقريبية تحت Ct30. بالنسبة للعينات التي تزيد قيمها عن 30 ، يكون نجاح تسلسل الجينوم الكامل أقل احتمالا ، لكن البيانات الجزئية قد توفر معلومات ذات صلة في بعض الحالات.

الإجراء ليس تافها ، حيث يتضمن العديد من الخطوات بما في ذلك دورات تفاعل البوليميراز المتسلسل ، والتهجين ، والعديد من عمليات غسل الخرز. مطلوب اهتمام دقيق بالإجراء للحصول على أفضل النتائج. تتطلب الخطوات الحاسمة للبروتوكول - تجزئة الحمض النووي ، والتهجين باستخدام مجسات الالتقاط ، والالتقاط القائم على الخرزة المغناطيسية مع الغسيل - تنفيذا دقيقا ومعالجة مناسبة. يمكن للباحثين والفنيين تعلم البروتوكول بعد بضع محاولات. في الجولات الأولى ، أثناء التعلم ، يمكن أن يكون بروتوكول 3 أيام ميزة. مع المستخدمين الأكثر خبرة ، يمكن لبروتوكول يومين تسريع النتائج. نظرا لأن الكواشف باهظة الثمن ، فقد يكون من المفيد إجراء اختبار بدون المكونات باهظة الثمن ، على سبيل المثال ، المجسات. بالنسبة لمجموعات الطعم البديلة ، يمكن تعديل درجة حرارة التهجين ، مما قد يحسن حساسية أو خصوصية التخصيب. إذا تم توليد بيانات كافية ، ولوحظت نسبة كبيرة من تكرارات تفاعل البوليميراز المتسلسل ، فيمكن أيضا تعديل عدد دورات تفاعل البوليميراز المتسلسل قبل الالتقاط وما بعده.

يمكن استخدام البيانات التي تم الحصول عليها من هذه التجارب للكتابة ، مع استخراج MLST والأهداف الأخرى ذات الصلة. يمكن تحليله بشكل أكبر في سياق وبائي ، عالميا أو محليا ، مقارنة بالجينومات ذات الصلة للرؤى المعاصرة. يستنتج إعادة التركيب وتحليل العناصر المتنقلة عبر الجينوم أيضا التغييرات بمرور الوقت وتحت الضغط الانتقائي ، والعدوى المشتركة المحتملة. مع البيانات الكافية والبيانات الوصفية المرتبطة بها ، يمكن إجراء حسابات زمنية ، واستنتاج أسلاف خصائص وسلالات محددة ، بالإضافة إلى طرق وآليات النقل المحتملة. كل هذه التطورات في معرفتنا بمجموعة مهمة من مسببات الأمراض يمكن أن تفيد استراتيجيات الصحة العمومية. يظهر بروتوكولنا ونتائجنا التمثيلية استخدام مجموعات المسبار المستهدفة للوحة المتلازمة ، والتي تكون فعالة في عينات الأمراض المنقولة جنسيا البكتيرية ويمكن توسيعها لتشمل أنواع عينات إضافية.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ويعلن المؤلفان أنه لا يوجد تضارب في المصالح.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نشكر بصدق جميع الذين ساهموا في هذا المشروع. من جامعة زيورخ ، نعرب عن تقديرنا للدكتورة فاني فيجنر ، وسرينيثي بوروشوثامان ، والدكتور فرانك إمكامب ، والدكتور تيم رولوف ، والدكتور دومينيك براون ، والبروفيسور الدكتور أدريان إيجلي لمشاركتهم في تطوير هذه التقنية وتحسينها. نعرب عن امتناننا لدانيال غاندر وفاليريا بيريس وأرينيتا أساني وستيفان أنتينر على مساعدتهم الفنية المتميزة في التسلسل. من جامعة بوينس آيرس ، نشكر الدكتورة أندريا كارولينا إنتروكاسي ، والدكتورة ماريا لوسيا جالو فوليت ، والدكتورة ديسي لوبيز أكينو ، والدكتورة لورا سفيدلر لوبيز ، والدكتورة لوسيانا لا روزا على مساهماتهم القيمة. أخيرا ، نحن ممتنون للدكتور إبراهيم كيساكيسن والدكتور أندرياس شرايبر من Agilent على دعمهما. تم دعم هذا العمل من قبل منحة STIDirect من Gottfried und Julia Bangerter-Rhyner-Stiftung ومن قبل STISeq Grant STWF-24-009 من Stiftung für wissenschaftliche Forschung an der Universität Zürich. تم تقديم أموال إضافية غير مقيدة من جامعة زيورخ.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
ماصة 8 قنوات 0.5-10 µ Lإيبندورف3125000010أبحاث Eppendorf   ؛ بالإضافة إلى 8 قنوات ، 0.5-10 & L ، رمادي متوسط ، حجم متغير.
ماصة 8 قنوات 10-100 µ Lإيبندورف3125000036أبحاث Eppendorf   ؛ بالإضافة إلى 8 قنوات ، 10-100 وميكرو ؛ L ، أصفر ، حجم متغير.
محول Oligo Mix للمكتبات ذات العلامات MBCأجيلينت تكنولوجيز5500-0147جزء من مجموعة إعداد مكتبة SureSelect XT HS2 ل ILM (ما قبل PCR).
نظام استخراج الحمض النووي الآلي باستخدام مجموعة استخراج الحمض النووي الفيروسي / الممرضكياجين937036 (مجموعة) / 9001297 (أداة)أداة QIAsymphony SP / AS المستخدمة مع QIAamp DSP Virus / Pathogen Kit لاستخراج الحمض النووي الآلي.
المخزن المؤقت للربطأجيلينت تكنولوجيز5190-9687جزء من مجموعة أدوات التخصيب المستهدف SureSelect ILM Hyb Module Box 1 (Post PCR).
طقم استخراج الحمض النووي وأداة آليةمؤسسة زيمو للأبحاثD3024 / D3025تستخدم مجموعة Quick-DNA Miniprep Kit لاستخراج الحمض النووي الكلي من العينات السريرية. متوافق مع سير العمل اليدوي أو الآلي.
إصلاح النهاية - مزيج إنزيم المخلفاتأجيلينت تكنولوجيز5500-0147جزء من مجموعة إعداد مكتبة SureSelect XT HS2 ل ILM (ما قبل PCR).
نهاية إصلاح مخلفات العازلةأجيلينت تكنولوجيز5500-0147جزء من مجموعة إعداد مكتبة SureSelect XT HS2 ل ILM (ما قبل PCR).
ايثانولVWR للكيماويات BDH20816.298الإيثانول المطلق &GE; 99.5٪ دكتوراه يورو ، USP
مقياس الفلور مع مقايسة dsDNA عالية الحساسية / طريقة قائمة على التألق لقياس الحمض النوويثيرمو فيشر العلمي (Invitrogen)س 33238 ، س 33231مقياس الفلور Qubit 4 مع طقم فحص 1X dsDNA عالي الحساسية (HS).
المخزن المؤقت للتجزئةأجيلينت تكنولوجيز5191-4080جزء من مجموعة التجزئة الإنزيمية SureSelect باسم "5X Fragmentation Buffer".
إنزيم التجزئةأجيلينت تكنولوجيز5191-4080جزء من مجموعة التجزئة الإنزيمية SureSelect.
مخزن بوليميراز الحمض النووي عالي الدقةأجيلينت تكنولوجيز5500-0147جزء من مجموعة إعداد مكتبة SureSelect XT HS2 ل ILM (Pre PCR) باسم "Herculase II Buffer".
مخزن مؤقت بوليميراز الحمض النووي عالي الدقة مع dNTPs (5X)أجيلينت تكنولوجيز5190-9687جزء من مجموعة أدوات التخصيب المستهدف SureSelect ILM Hyb Module Box 1 (Post PCR) باسم "Herculase II Buffer".
إنزيم اندماج عالي الدقة لتضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسلأجيلينت تكنولوجيز5191-5688جزء من مجموعة أدوات التخصيب المستهدف SureSelect ILM Hyb Module Box 1 (Post PCR) باسم "Herculase II".
عازلة غسيل بدرجة حرارة عاليةأجيلينت تكنولوجيز5190-9687جزء من مجموعة أدوات التخصيب المستهدف SureSelect ILM Hyb Module Box 1 (Post PCR) باسم "Wash buffer 2".
المخزن المؤقت للتهجين   ؛أجيلينت تكنولوجيز5500-0147جزء من مجموعة إعداد مكتبة SureSelect XT HS2 ل ILM (ما قبل PCR).
بادئات التسلسل المفهرسةأجيلينت تكنولوجيز5500-0147جزء من أزواج التمهيدي لمؤشر SureSelect XT HS2 من 1 إلى 96 ل ILM (ما قبل PCR).
مقايسة PCR في الوقت الحقيقي متعددة الإرسالتيب مولبيولغير متاحفحص داخلي مطور ومعتمد يعتمد على مجموعات Lightmix للكشف عن الأمراض المنقولة جنسيا
المخزن المؤقت للربطأجيلينت تكنولوجيز5500-0147جزء من مجموعة إعداد مكتبة SureSelect XT HS2 ل ILM (ما قبل PCR).
الخرز المغناطيسي للتنظيفأجيلينت تكنولوجيز5191-5740SureSelect DNA AMPure XP Beads.
حامل مغناطيسيPermagen LabwareMSRLV080.2 مل PCR 8 شريط فاصل مغناطيسي 5 µ ؛ L ~ 0.2 مل الحجم.
تسلسل الجيل التالي (NGS): نظام تسلسل القراءة القصيرة عالي الإنتاجية   ؛شركة Illumina، Inc.غير متاحتم إجراء تسلسل مقترن بقوة 150 نقطة أساس (PE150) على منصات Illumina NextSeq1000 و MiSeq.
مياه خالية من النوكليازBioConcept3-07F04-Hماء للبيولوجيا الجزيئية ، خالي من الحمض النووي / الحمض النووي / RNase ، معقم ، خالي من مثبطات تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR).
مزيج مانع قليل النوكليوتيد   ؛أجيلينت تكنولوجيز5500-0147جزء من مجموعة إعداد مكتبة SureSelect XT HS2 ل ILM (ما قبل PCR).
شريط أنبوب PCRأفانتور، يتم التسليم بواسطة VWR   732-3608شرائط أنبوب PCR مع أغطية مسطحة متصلة.
مزيج التمهيدي بعد الالتقاطأجيلينت تكنولوجيز5190-9687جزء من مجموعة أدوات التخصيب المستهدف SureSelect ILM Hyb Module Box 1 (Post PCR).
مسبار الحمض النووي الريبيأجيلينت تكنولوجيز5191-6916 SureSelect مسبار Custom Tier4 6Mb-11.9Mb ، على سبيل المثال معرف التصميم S3465164).
مانع RNaseأجيلينت تكنولوجيز5500-0147جزء من مجموعة إعداد مكتبة SureSelect XT HS2 ل ILM (ما قبل PCR).
عازلة غسيل بدرجة حرارة الغرفةأجيلينت تكنولوجيز5190-9687SureSelect مجموعة أدوات التخصيب المستهدف ILM Hyb Module Box 1 (Post PCR) باسم "Wash buffer 1".
حبات Streptavidinأجيلينت تكنولوجيز5191-5742SureSelect Streptavidin Beads.
T4 DNA Ligaseأجيلينت تكنولوجيز5500-0147جزء من مجموعة إعداد مكتبة SureSelect XT HS2 ل ILM (ما قبل PCR).
طريقة التخصيب المستهدف / طريقة التقاط الحمض النوويأجيلينت تكنولوجيزجي 9983-90000مجموعة SureSelect XT HS2 DNA مع إعداد المكتبة وإثراء هدف Hyb السريع وسير عمل تجميع ما بعد الالتقاط. إصدار البروتوكول F0 ، مايو 2023. لمنصة Illumina NGS
تم تعيين مسبار التخصيب المستهدف ل C. الحثري الترخيمي< / em> ، N. gonorrhoeae < / em> ، T. pallidum < / em> ، و M. genitalium< / em>Agilent Technologies / مختبر الأحياء الدقيقة الإثرائي (IMM ، UZH)معرف التصميم S3465164مجموعة مسبار مصممة خصيصا (~ 242,000 مسبار) لالتقاط تعدد الإرسال لأربعة مسببات الأمراض المنقولة جنسيا. تصميم يعتمد على جينومات مرجعية متعددة.
دورة حرارية[ثرموفيشر]4375305Veriti 96-Well Thermal Cycler.

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Lefterova, M. I., Suarez, C. J., Banaei, N., Pinsky, B. A. Next-generation sequencing for infectious disease diagnosis and management: a report of the Association for Molecular Pathology. J Mol Diagn. 17 (6), 623-634 (2015).
  2. Gwinn, M., Maccannell, D., Armstrong, G. L. Next generation sequencing of infectious pathogens. JAMA. 321 (9), 893-894 (2019).
  3. Hasman, H., et al. Rapid whole-genome sequencing for detection and characterization of microorganisms directly from clinical samples. J Clin Microbiol. 52 (1), 139-146 (2014).
  4. Gautam, S., KC, R., Leong, K. W. C., Mac Aogáin, M., O'Toole, R. F. A step-by-step beginner's protocol for whole genome sequencing of human bacterial pathogens. J Biol Methods. 6 (1), e110(2019).
  5. Baert, L., et al. Guidance document on the use of whole genome sequencing (WGS) for source tracking from a food industry perspective. Food Control. 130, 108148(2021).
  6. Didelot, X., et al. Transforming clinical microbiology with bacterial genome sequencing. Nat Rev Genet. 13 (9), 601-612 (2012).
  7. Scidmore, M. A. Cultivation and laboratory maintenance of Chlamydia trachomatis. Curr Protoc Microbiol. 11, (2006).
  8. Edmondson, D. G., Norris, S. J. In vitro cultivation of the syphilis spirochete Treponema pallidum. Curr Protoc. 1 (2), e44(2021).
  9. Pitt, R., et al. Challenges of in vitro propagation and antimicrobial susceptibility testing of Mycoplasma genitalium. J Antimicrob Chemother. 77 (11), 2901-2907 (2022).
  10. Büttner, K. A., et al. Evaluating methods for genome sequencing of Chlamydia trachomatis and other sexually transmitted bacteria directly from clinical swabs. Microb Genom. 11 (2), 001353(2025).
  11. Seth-Smith, H. M. B., et al. Whole-genome sequences of Chlamydia trachomatis directly from clinical samples without culture. Genome Res. 23 (5), 855-866 (2013).
  12. SureSelect XT HS2 DNA kits: library preparation (+/-MBC) / fast-Hyb target enrichment / post-capture pooling workflow for Illumina platform NGS. , Agilent Technologies. https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/public/G9983-90000.pdf (2023).
  13. Büttner, K. A., et al. Chlamydia trachomatis genomes from rectal samples: description of a new clade comprising ompA-genotype L4 from Argentina. Microb Genom. 11 (2), 001350(2025).
  14. Brown, J. R., et al. Norovirus whole-genome sequencing by SureSelect target enrichment: a robust and sensitive method. J Clin Microbiol. 54 (10), 2530-2537 (2016).
  15. Dao, T. D., et al. Application of the SureSelect target enrichment system for next-generation sequencing to obtain the complete genome sequence of bovine leukemia virus. Arch Virol. 163 (11), 3155-3159 (2018).
  16. Cai, W., et al. SureSelect targeted enrichment, a new cost effective method for the whole genome sequencing of Candidatus Liberibacterasiaticus. Sci Rep. 9 (1), 1-8 (2019).
  17. Büttner, K. A., et al. ompA sequencing and multilocus sequence typing of lymphogranuloma venereum cases in Buenos Aires reveal new Chlamydia trachomatis genotypes. Microorganisms. 12 (3), 587(2024).
  18. La Rosa, L., et al. Chlamydia trachomatis anorectal infections by LGV (L1, L2 and L2b) and non-LGV serotypes in symptomatic patients in Buenos Aires Argentina. Int J STD AIDS. 32 (14), 1270-1278 (2021).
  19. Rodríguez Fermepin, M., et al. More than L2b in rectal lymphogranuloma venereum. Lancet Microbe. 2 (2), e55(2021).

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

Chlamydia Trachomatis Neisseria Gonorrhoeae DNA PCR

مقالات ذات صلة