التصوير ثلاثي الأبعاد عالي الدقة وخالي من الملصقات وتحليل التعلم الآلي للعضيات المعوية عبر التصوير المجسم منخفض التماسك

العضيات هي نسخ مصغرة ثلاثية الأبعاد (ثلاثية الأبعاد) من الأعضاء المزروعة من الخلايا الجذعية ، قادرة على تلخيص السمات الهيكلية والوظيفية الرئيسية للأعضاء الحقيقية في المختبر¹. طور الباحثون أنظمة عضوية لمجموعة واسعة من الأنسجة - بما في ذلك الأمعاء والدماغ والرئة والكبد والكلى - كل منها يدل على البنية ذاتية التنظيم وتنوع نوع الخلية الذي يذكرنا بنظيره في الجسم الحي . من خلال عكس بنية الأعضاء الأصلية والتعقيد متعدد الخلايا ، تعمل العضيات كأنظمة نموذجية قوية لدراسة التطور البشري وتجديد الأنسجة وآليات^{المرض 1}. لقد أصبحت أدوات محورية لنمذجة الأمراض واكتشاف الأدوية ، مما يمكن الباحثين من استكشاف مسارات المرض واختبار علاجات جديدة على الأنسجة ثلاثية الأبعاد الخاصة بالمريض في المختبر². والجدير بالذكر أن العضيات تبشر أيضا بالخير في الطب^{التجديدي 3}: يمكن تطعيم الأنسجة المشتقة من العضوية في الجسم الحي لإصلاح التلف ، كما هو موضح في العضيات المعوية والكبدية ، مما يؤكد قدرتها على استعادة وظيفة^{الأعضاء 4}. هذا التنوع يجعل العضيات لا غنى عنها في البحوث الطبية الحيوية الحديثة والطب الشخصي.

نظرا لتكوينها متعدد الخلايا وتعقيدها الهيكلي ثلاثي الأبعاد ، فإن التقاط وتحليل الديناميكيات العضوية أمر بالغ الأهمية. ومع ذلك ، تواجه تقنيات التصوير التقليدية قيودا كبيرة في حل الهياكل العضوية والديناميكيات ، وغالبا ما تنتج لقطات ثنائية الأبعاد تفشل في تمثيل حالتها الفسيولوجية^{الكاملة 5}.

الفحص المجهري برايتفيلد هو طريقة غير جراحية مستخدمة على نطاق واسع لالتقاط العضيات. إنه يراقب النمو والتشكل بشكل ملائم ولكنه يوفر تباينا محدودا في عينات ثلاثية الأبعاد غير ملطخة. بالإضافة إلى ذلك ، فإنه يفتقر إلى التقسيم البصري ، مما يؤدي إلى ضعف دقة الهياكل الداخلية. تبدو العضيات شفافة إلى حد كبير ، مما يعيق اكتشاف الميزات الدقيقة تحت^{السطح 6}. يعزز تباين الطور الرؤية عن طريق تحويل تحولات الطور إلى اختلافات في الشدة ، مما يكشف عن الهندسة المعمارية العامة (على سبيل المثال ، التجويف المركزي) دون تلطيخ. على الرغم من فائدته للمراقبة في الوقت الفعلي ، إلا أن تباين الطور يعاني من قطع أثرية هالة ، ودقة منخفضة ، وعمق اختراق محدود ، مما يجعله أقل فعالية للعضيات^{السميكة 7}.

يستخدم التقسيم التسلسلي متبوعا بتلوين الهيماتوكسيلين والأيوزين (H & E) والتلوين المناعي القائم على الأجسام المضادة على نطاق واسع لتحليل البنية المجهرية العضوية والتركيب الخلوي⁸. تعمل تقنيات معالجة الأنسجة المحسنة ، مثل تضمين البارافين الثابت بالفورمالين (FFPE) والتقطيع بالتبريد ، على تعزيز الحفاظ على التشكل ، حيث يقدم FFPE نتائج فائقة⁹. يؤدي تضمين العضيات في الهلاميات المائية مثل الاغاروز والطرد المركزي إلى محاذاة عينات متعددة في قسم واحد ، مما يحسن كفاءة التحليل. تعكس الأقسام الملطخة ب H & E من عضيات الورم المشتقة من المريض أنسجة الورم الأصلية ، بينما يسلط تلطيخ التألق المناعي الضوء على علامات مثل CK8 لتحديد الخلايا¹⁰. ومع ذلك ، لا يمكن لهذه التقنيات مراقبة العضيات الحية وقد تقدم قطعا مثل تجعد الأنسجة أو تشوه أثناء التقطيع.

يستخدم الفحص المجهري الفلوري متحد البؤر على نطاق واسع للتصوير العضوي ، مما ينتج عنه أقسام بصرية عالية الدقة (دون ميكرومتر) تتيح التصور التفصيلي للهندسة العضوية والتركيب الخلوي^11،12. ومع ذلك ، فإن التصوير متحد البؤر للعضيات ثلاثية الأبعاد يقتصر عادة على الطبقات السطحية (حتى عمق 100 ميكرومتر) ويمكن أن يستغرق وقتا طويلا وساما للضوء بسبب إضاءة الليزر النقطية¹³. يتغلب المجهر المجهري الفلوري للصفائح الضوئية (LSFM) على بعض هذه القيود عن طريق إضاءة مستوى التصوير فقط ، وتحقيق تصوير حجمي سريع للعضيات بأكملها مع الحد الأدنى من التبييض الضوئي والسمية^{الضوئية 14،15} ؛ ومع ذلك ، غالبا ما تتطلب هذه التقنية تطهير الأنسجة للتصوير الأمثل للعينات السميكة. بالإضافة إلى ذلك ، يتم تقييد عمق تصوير LSFM من خلال عدم تطابق تشتت الضوء ومعامل الانكسار (RI) ، والتي يمكن تخفيفها من خلال البصريات التكيفية والتصوير متعدد الرؤى والأطوال الموجية المحسنة للإثارة¹⁶. يقدم تركيب العينات أيضا تشوهات هيكلية ، بينما تشكل مجموعات البيانات ثلاثية الأبعاد الكبيرة تحديات حسابية في التخزين والتحليل. تعالج التطورات الحديثة ، بما في ذلك تقنيات وضع العلامات الجينية المحسنة ، وكواشف المقاصة الجديدة ، والبصريات التكيفية ، وتحليل الصور المستند إلى الذكاء الاصطناعي ، هذه القيود ، مما يجعل LSFM ممكنا بشكل متزايد للأبحاث العضوية⁷.

على الرغم من هذه التطورات ، تشكل تقنيات التصوير الفلوري ثلاثي الأبعاد العديد من التحديات للمراقبة طويلة المدى للعضيات الحية. أولا ، يؤدي استخدام الملصقات الفلورية إلى تأثيرات سامة ضوئية ويزعج العمليات البيولوجية ، مما يشكل تحديات لدراسات التصوير الحي المطولة¹⁷. ثانيا ، يعاني وضع العلامات القائمة على الأجسام المضادة من اختراق محدود بسبب حواجز الانتشار داخل الهياكل العضوية الكثيفة ، مما يتطلب طرقا متقدمة للنفاذية وإزالة الأنسجة ، والتي تستغرق أكثر من 10 أيام من الحضانة لاستخدام الأجسام المضادة الأولى والثانوية¹⁸. ثالثا ، لا يزال التعبير عن البروتين الفلوري المستقر والتعبير المستقر في العضيات غير فعال ، حيث تكافح مناهج توصيل الجينات التقليدية مع البيئات ثلاثية الأبعاد¹⁹. رابعا ، غالبا ما تؤدي تقنيات المقاصة البصرية ، الضرورية للتصوير العميق ، إلى فقدان إشارة التألق وتشويه الأنسجة ، مما يستلزم بروتوكولات المقاصة المحسنة التي توازن بين الشفافية والحفاظ على التألق²⁰.

لمعالجة هذه القيود ، تم تقديم التصوير المجسم (HT) كتقنية لتصوير العضيات الحية غير المسماة بدقة عالية بمرور الوقت. يعرف HT أيضا باسم تصوير الطور الكمي ثلاثي الأبعاد ، وهو طريقة خالية من الملصقات وعالية الدقة تتيح التصور الكمي في الوقت الفعلي للعضيات مع الحفاظ على حالتها الفسيولوجية الأصلية. مبدأ HT مشابه للتصوير المقطعي المحوسب بالأشعة السينية. من خلال التقاط صور متعددة للمجال البصري ثنائي الأبعاد في ظل ظروف إضاءة مختلفة ، يتم إعادة بناء توزيع 3D RI لعينة غير مسماة من خلال معادلة الموجة العكسية التي تحل^21،22،23. تم تطبيق HT على نطاق واسع في مختلف المجالات البيولوجية ، بما في ذلك أمراض الدم^24،25 ، وتكثيف الطور في بيولوجيا الخلية²⁶ ، وعلم الأحياء الدقيقة²⁷ ، وعلم الأنسجة^{المرضي 28}. في الآونة الأخيرة ، تم استخدام قدرتها عالية الدقة والخالية من الملصقات على نحو متزايد لأبحاث العضوية^{21،22،23،29} ، مما يوفر نهجا غير جراحي لدراسة ديناميكياتها الهيكلية والوظيفية.

في هذه الدراسة ، نقدم بروتوكولا مفصلا لاستخدام HT منخفض التماسك في المراقبة طويلة المدى والخالية من الملصقات للعضيات المعوية الدقيقة للفأر (sIOs). تتيح هذه الطريقة التصور في الوقت الفعلي للنمو العضوي واستجابات الأدوية على مدار 24 ساعة مع توفير قياسات كمية للحجم العضوي وكثافة البروتين ومحتوى البروتين ، مما يسهل التحليل الدقيق المستند إلى البيانات للسلوك العضوي. للتحقيق في التغيرات المورفولوجية في العضيات ، عالجنا العينات بالسيسبلاتين ، وهو عامل علاج كيميائي قائم على البلاتين معروف بأنه يحفز موت الخلايا المبرمج عن طريق تكوين روابط متشابكة للحمض النووي وتثبيط التكاثر الخلوي³⁰. بينما يلتقط التصوير ثلاثي الأبعاد RI التفاصيل الهيكلية ، فإن التحليل المنهجي ضروري لقياس ديناميكيات العضوية. لتحقيق ذلك ، قمنا بدمج ilastik ، وهي مجموعة أدوات تجزئة قائمة على التعلم^{الآلي 31} للتمييز بين المناطق العضوية عن الخلفية. يحدد هذا البروتوكول سير العمل الكامل ، بما في ذلك إعداد الثقافة العضوية ، واكتساب HT ثلاثي الأبعاد ، والتجزئة القائمة على التعلم الآلي ، والتحليل الكمي من التصوير المقطعي RI. من خلال تقديم إطار تصوير قابل للتطوير وقابل للتكرار وغير جراحي ، يضع هذا النهج معيارا جديدا للأبحاث العضوية مع تطبيقات واسعة في نمذجة الأمراض والطب التجديدي وفحص الأدوية.

ملاحظة: التفاصيل المتعلقة بجميع المواد والأدوات والبرامج المستخدمة في هذا البروتوكول متوفرة في جدول المواد. يمكن استخدام المنتجات المكافئة من مختلف الشركات المصنعة كبدائل. يتم عرض عملية تخطيطية للبروتوكول بأكمله في الشكل 1.

1. تحضير العينة

1. تحضير وسيط ثقافة sIO
   1. قم بإعداد وسط الاستزراع المتاح تجاريا وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. قم بتعقيم وسط الاستزراع عن طريق تصفيته من خلال وحدة تصفية 0.22 ميكرومتر.
      ملاحظة: إذا تم تحضير الوسيط بالكامل في ظروف معقمة في غطاء مزرعة الخلية وتم تعقيم جميع المكونات مسبقا (على سبيل المثال ، يتم توفيرها في زجاجات وقوارير معقمة) ، فقد لا يكون الترشيح من خلال مرشح 0.22 ميكرومتر ضروريا للغاية.
   2. Aliquot 15 مل من الوسط المحضر في أنابيب تخزين معقمة. قم بتسخين المتوسط إلى درجة حرارة الغرفة (15 - 25 درجة مئوية) قبل استخدامه في الثقافة العضوية.
2. ذوبان مخزون sIO
   1. قم بإذابة المرق العضوي المجمد بسرعة في غضون دقيقتين باستخدام حمام مائي 37 درجة مئوية. انقل المعلق العضوي المذاب إلى أنبوب طرد مركزي دقيق وجهاز طرد مركزي عند 150 × جم لمدة 3 دقائق لحبيبات العضيات.
   2. قم بإزالة المادة الطافية بعناية لغسل DMSO ، مما يقلل من التأثيرات السامة للخلايا المحتملة.
   3. أضف الوسائط والمصفوفة خارج الخلية الجديدة (ECM) بنسبة 1:4 وقم بسحب الماصة برفق لضمان إعادة تعليق الحبيبات بشكل موحد. قم بتوزيع 15 ميكرولتر لكل قبة في كل بئر من صفيحة 48 بئرا. احتفظ بوحدة التحكم في المحرك على الجليد لمنع البلمرة المبكرة.
   4. ضع اللوحة رأسا على عقب في حاضنة 37 درجة مئوية ، 5٪ CO₂ لمدة 1 ساعة للسماح ببلمرة ECM. بعد البلمرة ، أضف بعناية 200 ميكرولتر من الوسائط الجديدة إلى كل بئر.
      ملاحظة: هذا البروتوكول متوافق مع العديد من أطباق التصوير التجارية وألواح الآبار. اضبط حجم الوسائط وفقا لنوع البئر للتأكد من أن قبة ECM مغمورة بالكامل.
3. مرور sIOs
   ملاحظة: تميل العضيات إلى الالتصاق بأطراف الماصة. لتقليل الالتصاق، قم بتغطية أطراف الماصة مسبقا بالوسط.
   1. شفط أنفق متوسط. أضف 200 ميكرولتر من محلول استعادة الخلايا إلى كل بئر واحتضنه عند 4 درجات مئوية لمدة 30 دقيقة لتسهيل تحلل ECM واسترجاع العضوية.
   2. اجمع المعلق العضوي عن طريق سحب العينة اللطيف وانقله إلى أنبوب الطرد المركزي الدقيق. جهاز طرد مركزي بوزن 150 × جم لمدة 3 دقائق ، ثم قم بإزالة المادة الطافية بعناية.
   3. (اختياري) للمرور كخلايا مفردة ، قم بتنفيذ إحدى طرق التفكك التالية:
      1. الطريقة الأنزيمية: أضف 100 ميكرولتر من محلول التفكك أحادي الخلية إلى الحبيبات واحتضانها عند 37 درجة مئوية ، حاضنة ثاني أكسيد الكربون_{5٪ لمدة} 1-2 دقيقة. أضف 150 ميكرولتر من الوسائط لتحييدها. قم بإجراء سحب العينات أو النقر اللطيف. جهاز طرد مركزي عند 150 × جم لمدة 3 دقائق وقم بإزالة المادة الطافية ، مع ترك الحبيبات فقط.
         ملاحظة: تجنب الإفراط في الحضانة ، لأن التعرض المطول يمكن أن يكون ضارا للغاية بالخلايا.
      2. التفكك الميكانيكي: أعد تعليق الحبيبات في 200 ميكرولتر من وسط الاستزراع. باستخدام ماصة P200، قم بتحريك الماصة لأعلى ولأسفل 20x-30x لفصل العضيات ميكانيكيا إلى شظايا أصغر أو خلايا مفردة. جهاز طرد مركزي عند 150 × جم لمدة 3 دقائق ، ثم استنشق المادة الطافية واحتفظ بالحبيبات.
   4. أضف الوسائط ووحدة التحكم في المحرك النظيفة الجديدة بنسبة 1:4 وقم بسحب الماصة برفق لضمان إعادة تعليق الحبيبات بشكل موحد. قم بتوزيع 15 ميكرولتر لكل قبة في كل بئر من صفيحة 48 بئرا.
   5. ضع اللوحة رأسا على عقب في حاضنة 37 درجة مئوية ، 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂ لمدة 1 ساعة للسماح ل ECM بالبلمرة.
   6. بعد البلمرة ، أضف 200 ميكرولتر من وسط الاستزراع الطازج إلى كل بئر واملأ الآبار الخارجية الفارغة ب PBS لمنع التبخر. استبدل وسط الاستزراع كل 2-3 أيام وقم بتمرير العضيات أسبوعيا. اضبط الفاصل الزمني للمرور وفقا للحجم العضوي المطلوب.
4. العلاج من تعاطي المخدرات
   1. تحضير محلول مخزون 10 ملي مولار من سيسبلاتين عن طريق إذابة 3.00 مجم من مسحوق سيسبلاتين (ميغاواط ≈ 300.05 جم / مول) في 1 مل من DMSO. دوامة لفترة وجيزة وحماية المحلول من الضوء باستخدام أنابيب العنبر أو عن طريق لفها بورق الألمنيوم.
   2. لتحضير وسط المعالجة ، قم بتخفيف مخزون السيسبلاتين 10 ملي مولار 1: 1,000 في وسط ثقافة sIO الكامل للحصول على تركيز نهائي يبلغ 10 ميكرومتر من سيسبلاتين و 0.1٪ DMSO.
   3. للتحكم في السيارة ، قم بإعداد 0.1٪ DMSO في وسط الاستزراع ليتناسب مع تركيز DMSO النهائي بدون سيسبلاتين.
   4. قم بإزالة الوسط المستهلك من مزارع sIO واستبدله برفق بوسيط يحتوي على سيسبلاتين 10 ميكرومتر أو وسيط تحكم DMSO فقط.
   5. بعد العلاج ، انقل العينات إلى حاضنة نظام التصوير.

2. التصوير المجسم منخفض التماسك باستخدام برنامج التشغيل

1. تحضير عينة للتصوير
   1. قم بتوزيع 15 ميكرولتر من قبة ECM العضوية على طبق التصوير السفلي # 1.5 باتباع الإجراء الموضح في الخطوات 1.3.1-1.3.4. ضع كل قبة في الطبق بالقرب من المركز قدر الإمكان للحصول على تصوير مثالي.
   2. قبل البلمرة ، احتضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 دقيقة للسماح للعضويات بالاستقرار في القاع.
   3. ضع اللوحة رأسا على عقب في حاضنة 37 درجة مئوية ، 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂ لمدة ساعة واحدة لبلمرة ECM. بعد ذلك ، أضف برفق ما يكفي من وسط الثقافة لغمر العضيات بالكامل.
      ملاحظة: اضبط الحجم المتوسط للتأكد من أن العضيات مغمورة بالكامل وفقا لحجم طبق التصوير ذو القاع الغطاء.
   4. بعد 5 أيام من المرور ، اغسل العينة 2x-3x باستخدام PBS مباشرة قبل التصوير لإزالة الحطام وتقليل القطع الأثرية البصرية.
2. إعداد التصوير
   1. قم بتشغيل وحدة التحكم البيئية للحفاظ على صلاحية العينة. تقوم وحدة التحكم في الغرفة تلقائيا بضبط درجة الحرارة إلى 37 درجة مئوية وتركيز ثاني أكسيد الكربون₂ إلى 5٪.
   2. اضغط على زر الباب في مقدمة الجهاز لفتح الباب. أضف الماء لتشكيل طبقة رقيقة داخل الحجرة جيدا لمنع جفاف وسائط الاستزراع.
   3. ضع طبق التصوير في حامل وعاء مناسب ، وأدخله في غرفة التصوير ، وثبته باستخدام دبوس لمنع الحركة. تأكد من أن الطبق متصل بإحكام بحامل الوعاء دون إمالة.
   4. أغلق باب الجهاز باستخدام زر الباب لمنع تداخل الضوء الخارجي.
   5. قم بتشغيل برنامج TomoStudio X وقم بتسجيل الدخول. انقر فوق ابدأ لفتح النافذة الرئيسية.
   6. انقر فوق إضافة مشروع في الزاوية العلوية اليسرى وقم بتعيين معلمات تجريبية (على سبيل المثال، اسم المشروع والنوع الوسيط ونوع العينة وما إلى ذلك). سيتم إنشاء لوحة العينة تلقائيا. تأكد من تعيين نوع الوسيط الصحيح لاستخدام RI المناسب في التجربة.
   7. انقر فوق البئر المطلوب في اللوحة وانقر فوق إنشاء في الجزء العلوي لتسجيل الآبار كعينات.
   8. انقر فوق إعداد عائد الاستثمار في الزاوية العلوية اليسرى لتحديد منطقة الاهتمام (ROI) في الطبق. بمجرد تعيين جميع المعلمات، انقر فوق تشغيل التجربة في الزاوية السفلية اليمنى لفتح نافذة الحصول على الصور.
   9. انقر فوق تحميل السفينة في الزاوية العلوية اليمنى. ستظهر صورة الحقل الساطع. اضبط موضع Z باستخدام الزرين + Z و -Z للتركيز.
   10. في علامة التبويب تصوير فردي، اضبط حجم عائد الاستثمار. التقط العضيات في مجال رؤية 160 ميكرومتر × 160 ميكرومتر واحصل على أكوام محورية يصل عمقها إلى 140 ميكرومتر. بالنسبة للعضيات الأكبر حجما، احصل على العديد من الصور المقطعية للمثبط المحجوز وصور الغرزة عن طريق تحديد خانة الاختيار تصوير البلاط في الأسفل.
   11. انتقل إلى علامة التبويب تصوير اللقطات المتتابعة لتكوين التصوير طويل المدى. اضبط المدة ووقت الفاصل الزمني حسب الحاجة. في هذه التجربة ، تم إجراء التصوير بفاصل زمني على فترات 10 دقائق على مدار 24 ساعة ، وتم إجراء التحليل على فترات ساعتين طوال نفس المدة.
   12. انقر فوق رمز المسح الضوئي لالتقاط موقع عائد الاستثمار الحالي. قم بتوسيط قبة ECM يدويا باستخدام تصوير المجال الساطع. انقر فوق BF زر لضبط قيم الشدة والتعريض الضوئي لتصوير المجال الساطع.
   13. حدد ROI عن طريق تحريك مربع ROI الذي يظهر في لوحة Preview. بمجرد العثور على عائد الاستثمار المطلوب ، انقر فوق إضافة نقطة في الأسفل. ستظهر قائمة نقاط التصوير.
   14. انقر فوق اكتساب لبدء التصوير. سيتم الحصول على بيانات الصورة الأولية.
3. الحصول على الصور
   ملاحظة: تقوم هذه العملية بإنشاء ملف Tomocube Common File (TCF) من بيانات الصورة الأولية. يجب معالجة بيانات الصورة الأولية في ملف TCF، والذي يحتوي على أنواع متعددة من الصور، مثل التصوير المقطعي RI وإسقاط الحد الأقصى للكثافة. يمثل التصوير المقطعي RI توزيع 3D RI للعينة ، ويظهر إسقاط الكثافة القصوى أعلى قيمة RI لكل موضع جانبي في المستوى XY.
   1. قم بسحب ملفات الصور الأولية وإفلاتها في خادم معالجة HTX. انقر فوق Process لإنشاء ملف TCF من ملف الصورة الأولية.
   2. لعرض مخططات RI المقطعية التي تم إنشاؤها في ملف TCF، استخدم TomoAnalysis Viewer أو MATLAB أو Python. لعرض ملف TCF في MATLAB، استخدم وظائف مثل h5info وh5read. وبالمثل ، في Python ، استخدم حزمة h5py لقراءة ملفات H5.

3. تحليل الصور

1. تجزئة الصور المستندة إلى التعلم الآلي
   1. تصدير ملف صورة الإطار الشفاف والشفافية والموافقة إلى تنسيق HDF5 (ملف الترميز التكميلي 1) للتأكد من أن البيانات بتنسيق متعدد الأبعاد متوافق مع ilastik.
   2. افتح ilastik وانتقل إلى File > New Project. حدد تصنيف البكسل ضمن قسم مهام سير عمل التجزئة. احفظ ملف المشروع في دليل معين.
   3. قم بتحميل ملف HDF5 بالانتقال إلى 1. علامة التبويب إدخال البيانات. انقر فوق Add New File (إضافة ملف جديد)، وحدد Suitable H5 Dataset، وتأكد من تعيين قنوات الصور الصحيحة.
   4. انتقل إلى 2. علامة التبويب تحديد الميزة لتحديد الميزات ذات الصلة (اللون/الكثافة، الحافة، الملمس) لتحسين التجزئة.
      ملاحظة: قد يختلف تحديد الميزة وفقا لمجموعة البيانات وخصائص الصورة. بالنسبة للتحليل الحالي ، تضمنت الميزات المحددة: اللون / الكثافة (σ = 1.60) ، والحافة (σ = 3.50) ، والنسيج (σ = 1.60). قد يكون التحسين القائم على نهج إرشادي مطلوبا اعتمادا على مدى تعقيد الصورة. بدلا من ذلك ، يمكن استخدام وظيفة اقتراح الميزات > تشغيل تحديد الميزة في ilastik لتحديد مجموعة مثالية من المعلمات.
   5. في 3. علامة تبويب التدريب ، قم بتسمية المناطق العضوية وغير العضوية من خلال تطبيق ضربات الفرشاة بألوان مميزة. لتحسين دقة التجزئة ، قم بإضافة تعليقات توضيحية بعناية إلى المناطق حول الحدود.
   6. انقر فوق التحديث المباشر لمعاينة نتائج التجزئة وإجراء التحسينات حسب الضرورة.
   7. انتقل إلى 4. تصدير التنبؤ. في تحديد المصدر، اختر تجزئة بسيطة لتصدير التنبؤات المسماة. انقر فوق تصدير الكل، مع التأكد من تعيين تنسيق الإخراج إلى .h5 أو .tiff، اعتمادا على متطلبات التحليل من الخادم.
2. تحليل الميزات الكمي
   ملاحظة: يتم تنفيذ خطوة البروتوكول هذه في MATLAB، مع تفصيل كل إجراء في ملف الترميز التكميلي 2.
   1. من خلال الجمع بين التصوير المقطعي RI مع صورة القناع ، قم بإنشاء صورة RI مقنعة تتضمن المنطقة العضوية فقط.
   2. باستخدام صورة RI المقنعة ، احسب المعلمات الكمية مثل الحجم العضوي وكثافة البروتين ومحتوى البروتين.
      1. الحجم: احسب الحجم الإجمالي للعشقية بضرب عدد وحدات البكسل في القناع المجزأ في دقة البكسل ل X و Y و Z. احسب عدد وحدات البكسل عن طريق حساب جميع قيم فوكسل في مصفوفة القناع المسمى عضويا، باستخدام دالة MATLAB المضمنة Sum.
         ملاحظة: يتم تحديد دقة البكسل بواسطة نظام التصوير ويمكن العثور عليها ضمن مجموعة سمات البيانات > 3D داخل بنية HDF5.
      2. كثافة البروتين: احسب كثافة البروتين عن طريق طرح قيمة RI المتوسطة من متوسط RI العضوي وقسمتها على زيادة معامل انكسار البروتين.
         1. RI متوسط: قم بقياس RI للوسط المحيط باستخدام مقياس الانكسار قبل التحليل.
         2. متوسط قيمة RI: حدد متوسط RI للعضوي عن طريق حساب متوسط قيم RI للفوكسل الموجودة داخل القناع العضوي.
         3. زيادة معامل انكسار البروتين (α): استخدم ثابتا تجريبيا تم الإبلاغ عنه سابقا مشتقا من دراسات زيادة معامل الانكسار.
      3. محتوى البروتين: احسب إجمالي محتوى البروتين بضرب الحجم المحدد في الخطوة 3.2.2.1 بكثافة البروتين التي تم الحصول عليها في الخطوة 3.2.2.2.

يوضح الشكل 1 سير العمل التخطيطي للتصوير رباعي الأبعاد والتحليل الكمي ل sIOs. يتيح هذا البروتوكول التصوير المباشر المستمر والتقييم الشامل ل sIOs من خلال عملية من أربع خطوات: الثقافة ، والتصوير رباعي الأبعاد ، ومعالجة الصور ، والتحليل الكمي (الشكل 1 د).

بعد فترة حضانة مدتها 5 أيام ، تم نقل sIOs الناضجة إلى أطباق التصوير ذات القاع المنزلي للتصور باستخدام التصوير المجسم منخفض التماسك (HT) (الشكل 1 أ). تعيد تقنية التصوير هذه بناء التصوير المقطعي RI من خلال خوارزمية إزالة الالتفاف (الشكل 1 ب) ، مما يتيح تصويرا عالي الدقة وخالي من الملصقات للعضيات الحية.

تم إجراء معالجة الصور لاحقا باستخدام نهج التجزئة بمساعدة التعلم الآلي ، مما يسهل التحديد الهيكلي الدقيق (الشكل 1 ج). أولا ، تم تحويل التصوير المقطعي RI الخام إلى تنسيق HDF5 للتوافق مع ilastik ، وهي أداة تجزئة تفاعلية قائمة على التعلم الآلي. داخل المرونة ، تم تدريب التصنيف على مستوى الفوكسل لتوليد أقنعة عضوية تحدد بشكل انتقائي. تم ضرب هذه الأقنعة في صور RI الأصلية لاستخراج صور RI المقنعة التي استبعدت الخلفية ، وعزل المنطقة العضوية فقط للتحليل.

من صور RI المقنعة هذه ، تم حساب الحجم العضوي عن طريق حساب عدد الفوكسل المصنفة على أنها عضوية وضربها في أبعاد الفوكسيل. تم حساب كثافة البروتين عن طريق طرح RI للوسط من متوسط RI للمنطقة العضوية والقسمة على ثابت زيادة البروتين RI (α = 0.185 مل / جم) 32،33. أخيرا ، تم الحصول على محتوى البروتين الكلي عن طريق ضرب كثافة البروتين في الحجم العضوي.

أتاح هذا النهج الكمي القائم على RI ، جنبا إلى جنب مع التجزئة المدفوعة بالتعلم الآلي ، المراقبة الديناميكية والخالية من الملصقات للمعلمات المورفولوجية والفيزيائية الحيوية مثل الحجم وكثافة البروتين والمحتوى بمرور الوقت (الشكل 1 د). كشفت هذه القياسات عن اختلافات واضحة بين sIOs المعالجة بالمركبات والسيسبلاتين ، مما يسلط الضوء على فائدة هذا الإطار لدراسة الاستجابات الهيكلية والوظيفية التي يسببها الدواء في العضيات الحية.

من خلال التقسيم البصري للتصوير المقطعي RI المعاد بناؤه ، نجحنا في تصور البنية الدقيقة الداخلية المعقدة ل sIOs ، وتحديد أنواع الخلايا الظهارية المميزة ، بما في ذلك خلايا بانيث ، وخلايا الكأس ، وخلايا الغدد الصم المعوية (الشكل 2A-D). قدمت شرائح XY عالية الدقة من التصوير المقطعي RI تمايزا واضحا لهذه الأنواع من الخلايا بناء على خصائص RI المميزة وخصائصها المورفولوجية.

يمكن التعرف على خلايا بانيث (الشكل 2 ب) من خلال قيم RI العالية والحبيبات الإفرازية المعبأة بكثافة ، والتي تتميز بوظيفتها المضادة للميكروبات داخل القبو المعوي34. أظهرت خلايا الكأس (الشكل 2 ج) مورفولوجيا ممدودة وتميزت بحويصلات مملوءة بالمخاط ، والتي تلعب دورا مهما في تكوين الطبقة المخاطية الواقية35. أظهرت خلايا الغدد الصماء المعوية (الشكل 2 د) هياكل مدمجة مع تباين RI مميز ، بما يتفق مع دورها في إفراز الهرمونات في ظهارة الأمعاء36،37،38. توضح هذه النتائج قدرة تصوير HT الخالي من الملصقات في حل التركيب الخلوي والهندسة المعمارية الدقيقة ل sIOs ذات الدقة دون الخلوية. يوفر نهج التصوير غير الجراحي وعالي الدقة هذا أداة متقدمة لدراسة التنظيم الهيكلي والخصائص الوظيفية للعضيات المعوية ، مما يسهل التقييم الكمي في الوقت الفعلي للتمايز الظهاري وعدم التجانس الخلوي.

لتقييم التغيرات المورفولوجية التي يسببها الدواء ، عولجت العضيات بالسيسبلاتين ، وهو عامل علاج كيميائي معروف بتحفيز موت الخلايا المبرمج والاضطراب الهيكلي30. أتاحت الصور المقطعية ثلاثية الأبعاد RI المعاد بناؤها تصورا عالي الدقة لتشكل العضوية ، مما يكشف عن اختلافات هيكلية مميزة بين sIOs المعالجة بالمركبة والسيسبلاتين في أعماق التقسيم البصري المتعددة (الشكل 3 أ ، ب).

لمزيد من القياس الكمي لهذه الاختلافات ، أجرينا تحليلا كميا شاملا للمعلمات العضوية الرئيسية ، بما في ذلك الحجم وكثافة البروتين ومحتوى البروتين الكلي. بالنظر إلى العلاقة الخطية بين RI وكثافة البروتين في العيناتالبيولوجية 39،40 ، قمنا بحساب كثافة البروتين داخل sIOs لتقييم التغييرات التركيبية المحتملة. من خلال دمج قياسات الحجم وكثافة البروتين ، نجحنا في تحديد محتوى البروتين الجاف في sIOs ، مما يوفر فهما أعمق لتكوين العضوية والاستجابة للعلاج الدوائي. أظهرت النتائج حجما عضويا أعلى ومحتوى بروتين إجمالي ، وكثافة بروتين أقل في sIOs المعالجة بالسيسبلاتين مقارنة بالمجموعة المعالجة بالمركبات بعد 10 دقائق من العلاج (الشكل 3C-E).

بينما كشف التصوير ثلاثي الأبعاد في نقطة زمنية واحدة عن اختلافات مورفولوجية بين المجموعتين ، سمح التصوير المباشر بفاصل زمني بالتتبع المستمر للتغيرات الخلوية الديناميكية ، مما يوفر رؤى أعمق للاستجابات التي يسببها الدواء. على مدار 24 ساعة ، تم الحصول على تصوير بفاصل زمني كل 10 دقائق (الفيديو التكميلي 1 ، الفيديو التكميلي 2) ، وتم أخذ القياسات الكمية بعد 10 دقائق من العلاج ثم على فترات ساعتين بعد ذلك. على مدار 24 ساعة ، حافظت sIOs المعالجة بالمركبات على السلامة الهيكلية وأظهرت نموا مستمرا (الشكل 4 أ) ، في حين خضعت sIOs المعالجة بالسيسبلاتين لتدهور هيكلي تدريجي (الشكل 4 ب). والجدير بالذكر أن العضيات المعالجة بالسيسبلاتين أظهرت انهيار القبو ، وزيادة تفكك الخلايا ، والانكماش التدريجي ، مما يشير إلى تأثير سام للخلايا يعتمد على الوقت.

قدم نهج التتبع الطولي هذا تقييما أكثر شمولا للتدهور الخلوي ، والتقاط التغييرات الديناميكية في الوقت الفعلي بدلا من الاعتماد على اللقطات المورفولوجية الثابتة. تعزز النتائج أهمية التصوير الحي في دراسة التأثيرات التي تسببها الأدوية ، لا سيما في تقييم تطور التلف الخلوي والتغيرات في بنية الأنسجة بمرور الوقت.

أكد التحليل الكمي هذه الاتجاهات. في المجموعة المعالجة بالمركبات ، أظهرت sIOs زيادة تدريجية في الحجم ومحتوى البروتين الكلي ، بما يتفق مع النمو الطبيعي والانتشار. في المقابل ، أظهرت sIOs المعالجة بالسيسبلاتين انخفاضا كبيرا في كلتا المعلمتين ، مما يشير إلى فقدان الخلايا التدريجي وتدهورها (الشكل 4C ، E). ظلت كثافة البروتين مستقرة نسبيا في sIOs المعالجة بالمركبات ، مما يشير إلى الحفاظ على التركيب الخلوي ، بينما في sIOs المعالجة بالسيسبلاتين ، انخفضت كثافة البروتين بمرور الوقت ، مما يشير إلى فقدان السلامة الخلوية وتراكم الفضاء خارج الخلية بسبب تقشير الخلايا (الشكل 4 د).

تسلط هذه النتائج الضوء على فعالية التصوير بتقنية HT في توفير رؤى كمية عالية الدقة للاستجابة التي يسببها الدواء في العضيات الحية. يعمل نهج التصوير الخالي من الملصقات وغير الجراحي كمنصة قوية لتحليل الاستجابة للأدوية في الوقت الفعلي ، مما يتيح تقييما دقيقا وديناميكيا للتكيفات الهيكلية والكيميائية الحيوية في النماذج العضوية.

الشكل 1: سير العمل للتصوير رباعي الأبعاد والتحليل الكمي للعضيات المعوية الدقيقة (sIOs). (أ) الثقافة العضوية - تم تمرير sIOs الناضجة إلى قباب ECM وزرعها في أطباق التصوير قبل خمسة أيام من التصوير. (ب) اكتساب التصوير رباعي الأبعاد - التصوير بفاصل زمني باستخدام التصوير المجسم منخفض التماسك. تلتقط الأبعاد المكانية الثلاثة (x ، y ، z) التفاصيل الهيكلية ، بينما يتيح البعد الرابع (الوقت ، t) تتبع العملية الديناميكية. (ج) معالجة الصور - تخضع الصور المكتسبة للتجزئة القائمة على التعلم الآلي ، مما يؤدي إلى إنشاء أقنعة للتقييم الكمي. (د) التحليل الكمي - يتم قياس المعلمات العضوية الرئيسية ، بما في ذلك الحجم وكثافة البروتين ومحتوى البروتين ، لتمكين المراقبة الطولية والتحليل المقارن. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2: تصور عالي الدقة للهياكل تحت الخلوية في sIOs. (أ) صورة مقطعية تمثيلية ل sIO ، مع تسليط الضوء على هياكلها تحت الخلوية. تحديد (ب) خلية بانيث ، (ج) خلية الكأس ، و (د) خلية الغدد الصم المعوية. شريط المقياس: 20 ميكرومتر. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الشكل 3: التحليل الهيكلي والكمي ثلاثي الأبعاد ل sIOs المعالجة بالمركبة أو السيسبلاتين. (أ ، ب) عمليات إعادة البناء والشرائح المحورية ثلاثية الأبعاد على أعماق مختلفة (z = 21 ميكرومتر ، 42 ميكرومتر ، 63 ميكرومتر) من sIOs المعالجة بالمركبات والمعالجة بالسيسبلاتين. (C-E) التحليل الكمي للمعلمات العضوية الرئيسية ، بما في ذلك (C) الحجم ، (D) كثافة البروتين ، و (E) محتوى البروتين ، sIOs المعالجة داخل السيارة والسيسبلاتين. شريط المقياس: 20 ميكرومتر. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الشكل 4: التحليل الكمي طويل المدى للاستجابة للأدوية في sIOs. (أ ، ب) التصوير بفاصل زمني لعمليات الإدخال المضادة للمركبات المعالجة بالمركبات والمعالجة بالسيسبلاتين ، والتقاط التغيرات المورفولوجية على مدى 24 ساعة. لوحظت اختلافات في السلامة الهيكلية والتنظيم الخلوي بين الحالتين. شريط المقياس: 50 ميكرومتر. مقتبس من المرجع 29. (CC BY 4.0). (C-E) التحليل الكمي طويل المدى لحجم (C) ، (D) كثافة البروتين ، و (E) محتوى البروتين بمرور الوقت. يتم رسم التغييرات النسبية في هذه المعلمات، بحيث يمثل الخط المنقط قيمة الخط الأساسي. تظهر sIOs المعالجة بالمركبات نموا مستداما واستقرارا هيكليا ، في حين أن sIOs المعالجة بالسيسبلاتين تظهر انخفاضا تدريجيا في الحجم ومحتوى البروتين ، مما يدل على التأثيرات السامة للخلايا التي يسببها الدواء. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

ملف الترميز التكميلي 1: المعالجة المسبقة للبيانات الأولية. الرجاء النقر هنا لتنزيل هذا الملف.

ملف الترميز التكميلي 2: التحليل الكمي. الرجاء النقر هنا لتنزيل هذا الملف.

ملف الفيديو التكميلي 1: فيديو بفاصل زمني للعضيات المعالجة بالمركبات. الرجاء النقر هنا لتنزيل هذا الملف.

ملف الفيديو التكميلي 2: فيديو بفاصل زمني للعضيات المعالجة بالسيسبلاتين. الرجاء النقر هنا لتنزيل هذا الملف.

M.J.L. و JHL و SML و YKKP لها مصالح مالية في شركة Tomocube Inc. ، وهي شركة تقوم بتسويق التصوير المجسم وأدوات التصوير الكمي.