Method Article

التصوير ثلاثي الأبعاد عالي الدقة وخالي من الملصقات وتحليل التعلم الآلي للعضيات المعوية عبر التصوير المجسم منخفض التماسك

DOI:

10.3791/68529

⸱

August 12th, 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Graduate School of Stem Cell and Regenerative Biology, Korea Advanced Institute of Science and Technology (KAIST), 2Division of Pulmonary and Allergy Medicine, Department of Internal Medicine, Chungnam National University Hospital, 3Department of Physics, KAIST, 4KAIST Institute for Health Science and Technology, KAIST, 5Tomocube Inc., 6Center for Genome Engineering, Institute for Basic Science

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نقدم بروتوكولا خطوة بخطوة للتصوير عالي الدقة وخالي من الملصقات وثلاثي الأبعاد للعضيات باستخدام التصوير المجسم منخفض التماسك. يوضح هذا البروتوكول بالتفصيل إعداد الثقافة العضوية ، واكتساب التصوير ، وتحليل الصور الحسابية ، مما يتيح التصور في الوقت الفعلي للديناميكيات الهيكلية واستجابات الأدوية في العضيات الحية.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعد التصوير الدقيق الخالي من الملصقات للعضيات المعوية أمرا بالغ الأهمية لدراسة مورفولوجيتها وديناميكيات نموها واستجاباتها للمنبهات البيئية. يوفر التصوير المجسم (HT) تصورا عالي الدقة وثلاثي الأبعاد (3D) للعضيات الحية دون الحاجة إلى علامات الفلورسنت ، وبالتالي تقليل السمية الضوئية والحفاظ على سلامة العينة. يسمح التصوير القائم على الطور في الوقت الفعلي بتتبع مستمر وخالي من الملصقات للتغييرات الهيكلية والوظيفية. باستخدام معامل الانكسار كتباين تصويري جوهري ، تتيح هذه الطريقة القياس الكمي للخصائص الفيزيائية الحيوية مثل الحجم وكثافة البروتين ومحتوى البروتين. تتم معالجة بيانات التصوير بشكل أكبر من خلال التجزئة المستندة إلى التعلم الآلي واستخراج الميزات لدعم التحليل المتسق عالي الإنتاجية. يوضح هذا البروتوكول تفاصيل سير العمل التجريبي الكامل لاستخدام HT منخفض التماسك في الأبحاث العضوية ، والذي يغطي إعداد العضوية ، واكتساب التصوير ، وتحليل البيانات القائم على التعلم الآلي. من خلال دمج التجزئة الحسابية والتقييمات الكمية ، يتيح هذا النهج تقييما غير متحيز للخصائص العضوية الرئيسية ، بما في ذلك الجدوى والتنظيم الهيكلي والاستجابة للأدوية. إن القدرة على التقاط التغييرات المورفولوجية في الوقت الفعلي بدقة تحت الخلوية تجعل هذا البروتوكول قابلا للتطبيق بشكل كبير على الدراسات القائمة على العضوية في الطب التجديدي ونمذجة الأمراض والفحص الصيدلاني. تسهل المنهجية خطوة بخطوة الموضحة هنا قابلية التكرار والتكيف الواسع عبر الأنظمة العضوية المختلفة.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

العضيات هي نسخ مصغرة ثلاثية الأبعاد (ثلاثية الأبعاد) من الأعضاء المزروعة من الخلايا الجذعية ، قادرة على تلخيص السمات الهيكلية والوظيفية الرئيسية للأعضاء الحقيقية في المختبر1. طور الباحثون أنظمة عضوية لمجموعة واسعة من الأنسجة - بما في ذلك الأمعاء والدماغ والرئة والكبد والكلى - كل منها يدل على البنية ذاتية التنظيم وتنوع نوع الخلية الذي يذكرنا بنظيره في الجسم الحي . من خلال عكس بنية الأعضاء الأصلية والتعقيد متعدد الخلايا ، تعمل العضيات كأنظمة نموذجية قوية لدراسة التطور البشري وتجديد الأنسجة وآلياتالمرض 1. لقد أصبحت أدوات محورية لنمذجة الأمراض واكتشاف الأدوية ، مما يمكن الباحثين من استكشاف مسارات المرض واختبار علاجات جديدة على الأنسجة ثلاثية الأبعاد الخاصة بالمريض في المختبر2. والجدير بالذكر أن العضيات تبشر أيضا بالخير في الطبالتجديدي 3: يمكن تطعيم الأنسجة المشتقة من العضوية في الجسم الحي لإصلاح التلف ، كما هو موضح في العضيات المعوية والكبدية ، مما يؤكد قدرتها على استعادة وظيفةالأعضاء 4. هذا التنوع يجعل العضيات لا غنى عنها في البحوث الطبية الحيوية الحديثة والطب الشخصي.

نظرا لتكوينها متعدد الخلايا وتعقيدها الهيكلي ثلاثي الأبعاد ، فإن التقاط وتحليل الديناميكيات العضوية أمر بالغ الأهمية. ومع ذلك ، تواجه تقنيات التصوير التقليدية قيودا كبيرة في حل الهياكل العضوية والديناميكيات ، وغالبا ما تنتج لقطات ثنائية الأبعاد تفشل في تمثيل حالتها الفسيولوجيةالكاملة 5.

الفحص المجهري برايتفيلد هو طريقة غير جراحية مستخدمة على نطاق واسع لالتقاط العضيات. إنه يراقب النمو والتشكل بشكل ملائم ولكنه يوفر تباينا محدودا في عينات ثلاثية الأبعاد غير ملطخة. بالإضافة إلى ذلك ، فإنه يفتقر إلى التقسيم البصري ، مما يؤدي إلى ضعف دقة الهياكل الداخلية. تبدو العضيات شفافة إلى حد كبير ، مما يعيق اكتشاف الميزات الدقيقة تحتالسطح 6. يعزز تباين الطور الرؤية عن طريق تحويل تحولات الطور إلى اختلافات في الشدة ، مما يكشف عن الهندسة المعمارية العامة (على سبيل المثال ، التجويف المركزي) دون تلطيخ. على الرغم من فائدته للمراقبة في الوقت الفعلي ، إلا أن تباين الطور يعاني من قطع أثرية هالة ، ودقة منخفضة ، وعمق اختراق محدود ، مما يجعله أقل فعالية للعضياتالسميكة 7.

يستخدم التقسيم التسلسلي متبوعا بتلوين الهيماتوكسيلين والأيوزين (H & E) والتلوين المناعي القائم على الأجسام المضادة على نطاق واسع لتحليل البنية المجهرية العضوية والتركيب الخلوي8. تعمل تقنيات معالجة الأنسجة المحسنة ، مثل تضمين البارافين الثابت بالفورمالين (FFPE) والتقطيع بالتبريد ، على تعزيز الحفاظ على التشكل ، حيث يقدم FFPE نتائج فائقة9. يؤدي تضمين العضيات في الهلاميات المائية مثل الاغاروز والطرد المركزي إلى محاذاة عينات متعددة في قسم واحد ، مما يحسن كفاءة التحليل. تعكس الأقسام الملطخة ب H & E من عضيات الورم المشتقة من المريض أنسجة الورم الأصلية ، بينما يسلط تلطيخ التألق المناعي الضوء على علامات مثل CK8 لتحديد الخلايا10. ومع ذلك ، لا يمكن لهذه التقنيات مراقبة العضيات الحية وقد تقدم قطعا مثل تجعد الأنسجة أو تشوه أثناء التقطيع.

يستخدم الفحص المجهري الفلوري متحد البؤر على نطاق واسع للتصوير العضوي ، مما ينتج عنه أقسام بصرية عالية الدقة (دون ميكرومتر) تتيح التصور التفصيلي للهندسة العضوية والتركيب الخلوي11،12. ومع ذلك ، فإن التصوير متحد البؤر للعضيات ثلاثية الأبعاد يقتصر عادة على الطبقات السطحية (حتى عمق 100 ميكرومتر) ويمكن أن يستغرق وقتا طويلا وساما للضوء بسبب إضاءة الليزر النقطية13. يتغلب المجهر المجهري الفلوري للصفائح الضوئية (LSFM) على بعض هذه القيود عن طريق إضاءة مستوى التصوير فقط ، وتحقيق تصوير حجمي سريع للعضيات بأكملها مع الحد الأدنى من التبييض الضوئي والسميةالضوئية 14،15 ؛ ومع ذلك ، غالبا ما تتطلب هذه التقنية تطهير الأنسجة للتصوير الأمثل للعينات السميكة. بالإضافة إلى ذلك ، يتم تقييد عمق تصوير LSFM من خلال عدم تطابق تشتت الضوء ومعامل الانكسار (RI) ، والتي يمكن تخفيفها من خلال البصريات التكيفية والتصوير متعدد الرؤى والأطوال الموجية المحسنة للإثارة16. يقدم تركيب العينات أيضا تشوهات هيكلية ، بينما تشكل مجموعات البيانات ثلاثية الأبعاد الكبيرة تحديات حسابية في التخزين والتحليل. تعالج التطورات الحديثة ، بما في ذلك تقنيات وضع العلامات الجينية المحسنة ، وكواشف المقاصة الجديدة ، والبصريات التكيفية ، وتحليل الصور المستند إلى الذكاء الاصطناعي ، هذه القيود ، مما يجعل LSFM ممكنا بشكل متزايد للأبحاث العضوية7.

على الرغم من هذه التطورات ، تشكل تقنيات التصوير الفلوري ثلاثي الأبعاد العديد من التحديات للمراقبة طويلة المدى للعضيات الحية. أولا ، يؤدي استخدام الملصقات الفلورية إلى تأثيرات سامة ضوئية ويزعج العمليات البيولوجية ، مما يشكل تحديات لدراسات التصوير الحي المطولة17. ثانيا ، يعاني وضع العلامات القائمة على الأجسام المضادة من اختراق محدود بسبب حواجز الانتشار داخل الهياكل العضوية الكثيفة ، مما يتطلب طرقا متقدمة للنفاذية وإزالة الأنسجة ، والتي تستغرق أكثر من 10 أيام من الحضانة لاستخدام الأجسام المضادة الأولى والثانوية18. ثالثا ، لا يزال التعبير عن البروتين الفلوري المستقر والتعبير المستقر في العضيات غير فعال ، حيث تكافح مناهج توصيل الجينات التقليدية مع البيئات ثلاثية الأبعاد19. رابعا ، غالبا ما تؤدي تقنيات المقاصة البصرية ، الضرورية للتصوير العميق ، إلى فقدان إشارة التألق وتشويه الأنسجة ، مما يستلزم بروتوكولات المقاصة المحسنة التي توازن بين الشفافية والحفاظ على التألق20.

لمعالجة هذه القيود ، تم تقديم التصوير المجسم (HT) كتقنية لتصوير العضيات الحية غير المسماة بدقة عالية بمرور الوقت. يعرف HT أيضا باسم تصوير الطور الكمي ثلاثي الأبعاد ، وهو طريقة خالية من الملصقات وعالية الدقة تتيح التصور الكمي في الوقت الفعلي للعضيات مع الحفاظ على حالتها الفسيولوجية الأصلية. مبدأ HT مشابه للتصوير المقطعي المحوسب بالأشعة السينية. من خلال التقاط صور متعددة للمجال البصري ثنائي الأبعاد في ظل ظروف إضاءة مختلفة ، يتم إعادة بناء توزيع 3D RI لعينة غير مسماة من خلال معادلة الموجة العكسية التي تحل21،22،23. تم تطبيق HT على نطاق واسع في مختلف المجالات البيولوجية ، بما في ذلك أمراض الدم24،25 ، وتكثيف الطور في بيولوجيا الخلية26 ، وعلم الأحياء الدقيقة27 ، وعلم الأنسجةالمرضي 28. في الآونة الأخيرة ، تم استخدام قدرتها عالية الدقة والخالية من الملصقات على نحو متزايد لأبحاث العضوية21،22،23،29 ، مما يوفر نهجا غير جراحي لدراسة ديناميكياتها الهيكلية والوظيفية.

في هذه الدراسة ، نقدم بروتوكولا مفصلا لاستخدام HT منخفض التماسك في المراقبة طويلة المدى والخالية من الملصقات للعضيات المعوية الدقيقة للفأر (sIOs). تتيح هذه الطريقة التصور في الوقت الفعلي للنمو العضوي واستجابات الأدوية على مدار 24 ساعة مع توفير قياسات كمية للحجم العضوي وكثافة البروتين ومحتوى البروتين ، مما يسهل التحليل الدقيق المستند إلى البيانات للسلوك العضوي. للتحقيق في التغيرات المورفولوجية في العضيات ، عالجنا العينات بالسيسبلاتين ، وهو عامل علاج كيميائي قائم على البلاتين معروف بأنه يحفز موت الخلايا المبرمج عن طريق تكوين روابط متشابكة للحمض النووي وتثبيط التكاثر الخلوي30. بينما يلتقط التصوير ثلاثي الأبعاد RI التفاصيل الهيكلية ، فإن التحليل المنهجي ضروري لقياس ديناميكيات العضوية. لتحقيق ذلك ، قمنا بدمج ilastik ، وهي مجموعة أدوات تجزئة قائمة على التعلمالآلي 31 للتمييز بين المناطق العضوية عن الخلفية. يحدد هذا البروتوكول سير العمل الكامل ، بما في ذلك إعداد الثقافة العضوية ، واكتساب HT ثلاثي الأبعاد ، والتجزئة القائمة على التعلم الآلي ، والتحليل الكمي من التصوير المقطعي RI. من خلال تقديم إطار تصوير قابل للتطوير وقابل للتكرار وغير جراحي ، يضع هذا النهج معيارا جديدا للأبحاث العضوية مع تطبيقات واسعة في نمذجة الأمراض والطب التجديدي وفحص الأدوية.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ملاحظة: التفاصيل المتعلقة بجميع المواد والأدوات والبرامج المستخدمة في هذا البروتوكول متوفرة في جدول المواد. يمكن استخدام المنتجات المكافئة من مختلف الشركات المصنعة كبدائل. يتم عرض عملية تخطيطية للبروتوكول بأكمله في الشكل 1.

1. تحضير العينة

  1. تحضير وسيط ثقافة sIO
    1. قم بإعداد وسط الاستزراع المتاح تجاريا وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. قم بتعقيم وسط الاستزراع عن طريق تصفيته من خلال وحدة تصفية 0.22 ميكرومتر.
      ملاحظة: إذا تم تحضير الوسيط بالكامل في ظروف معقمة في غطاء مزرعة الخلية وتم تعقيم جميع المكونات مسبقا (على سبيل المثال ، يتم توفيرها في زجاجات وقوارير معقمة) ، فقد لا يكون الترشيح من خلال مرشح 0.22 ميكرومتر ضروريا للغاية.
    2. Aliquot 15 مل من الوسط المحضر في أنابيب تخزين معقمة. قم بتسخين المتوسط إلى درجة حرارة الغرفة (15 - 25 درجة مئوية) قبل استخدامه في الثقافة العضوية.
  2. ذوبان مخزون sIO
    1. قم بإذابة المرق العضوي المجمد بسرعة في غضون دقيقتين باستخدام حمام مائي 37 درجة مئوية. انقل المعلق العضوي المذاب إلى أنبوب طرد مركزي دقيق وجهاز طرد مركزي عند 150 × جم لمدة 3 دقائق لحبيبات العضيات.
    2. قم بإزالة المادة الطافية بعناية لغسل DMSO ، مما يقلل من التأثيرات السامة للخلايا المحتملة.
    3. أضف الوسائط والمصفوفة خارج الخلية الجديدة (ECM) بنسبة 1:4 وقم بسحب الماصة برفق لضمان إعادة تعليق الحبيبات بشكل موحد. قم بتوزيع 15 ميكرولتر لكل قبة في كل بئر من صفيحة 48 بئرا. احتفظ بوحدة التحكم في المحرك على الجليد لمنع البلمرة المبكرة.
    4. ضع اللوحة رأسا على عقب في حاضنة 37 درجة مئوية ، 5٪ CO2 لمدة 1 ساعة للسماح ببلمرة ECM. بعد البلمرة ، أضف بعناية 200 ميكرولتر من الوسائط الجديدة إلى كل بئر.
      ملاحظة: هذا البروتوكول متوافق مع العديد من أطباق التصوير التجارية وألواح الآبار. اضبط حجم الوسائط وفقا لنوع البئر للتأكد من أن قبة ECM مغمورة بالكامل.
  3. مرور sIOs
    ملاحظة: تميل العضيات إلى الالتصاق بأطراف الماصة. لتقليل الالتصاق، قم بتغطية أطراف الماصة مسبقا بالوسط.
    1. شفط أنفق متوسط. أضف 200 ميكرولتر من محلول استعادة الخلايا إلى كل بئر واحتضنه عند 4 درجات مئوية لمدة 30 دقيقة لتسهيل تحلل ECM واسترجاع العضوية.
    2. اجمع المعلق العضوي عن طريق سحب العينة اللطيف وانقله إلى أنبوب الطرد المركزي الدقيق. جهاز طرد مركزي بوزن 150 × جم لمدة 3 دقائق ، ثم قم بإزالة المادة الطافية بعناية.
    3. (اختياري) للمرور كخلايا مفردة ، قم بتنفيذ إحدى طرق التفكك التالية:
      1. الطريقة الأنزيمية: أضف 100 ميكرولتر من محلول التفكك أحادي الخلية إلى الحبيبات واحتضانها عند 37 درجة مئوية ، حاضنة ثاني أكسيد الكربون5٪ لمدة 1-2 دقيقة. أضف 150 ميكرولتر من الوسائط لتحييدها. قم بإجراء سحب العينات أو النقر اللطيف. جهاز طرد مركزي عند 150 × جم لمدة 3 دقائق وقم بإزالة المادة الطافية ، مع ترك الحبيبات فقط.
        ملاحظة: تجنب الإفراط في الحضانة ، لأن التعرض المطول يمكن أن يكون ضارا للغاية بالخلايا.
      2. التفكك الميكانيكي: أعد تعليق الحبيبات في 200 ميكرولتر من وسط الاستزراع. باستخدام ماصة P200، قم بتحريك الماصة لأعلى ولأسفل 20x-30x لفصل العضيات ميكانيكيا إلى شظايا أصغر أو خلايا مفردة. جهاز طرد مركزي عند 150 × جم لمدة 3 دقائق ، ثم استنشق المادة الطافية واحتفظ بالحبيبات.
    4. أضف الوسائط ووحدة التحكم في المحرك النظيفة الجديدة بنسبة 1:4 وقم بسحب الماصة برفق لضمان إعادة تعليق الحبيبات بشكل موحد. قم بتوزيع 15 ميكرولتر لكل قبة في كل بئر من صفيحة 48 بئرا.
    5. ضع اللوحة رأسا على عقب في حاضنة 37 درجة مئوية ، 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 لمدة 1 ساعة للسماح ل ECM بالبلمرة.
    6. بعد البلمرة ، أضف 200 ميكرولتر من وسط الاستزراع الطازج إلى كل بئر واملأ الآبار الخارجية الفارغة ب PBS لمنع التبخر. استبدل وسط الاستزراع كل 2-3 أيام وقم بتمرير العضيات أسبوعيا. اضبط الفاصل الزمني للمرور وفقا للحجم العضوي المطلوب.
  4. العلاج من تعاطي المخدرات
    1. تحضير محلول مخزون 10 ملي مولار من سيسبلاتين عن طريق إذابة 3.00 مجم من مسحوق سيسبلاتين (ميغاواط ≈ 300.05 جم / مول) في 1 مل من DMSO. دوامة لفترة وجيزة وحماية المحلول من الضوء باستخدام أنابيب العنبر أو عن طريق لفها بورق الألمنيوم.
    2. لتحضير وسط المعالجة ، قم بتخفيف مخزون السيسبلاتين 10 ملي مولار 1: 1,000 في وسط ثقافة sIO الكامل للحصول على تركيز نهائي يبلغ 10 ميكرومتر من سيسبلاتين و 0.1٪ DMSO.
    3. للتحكم في السيارة ، قم بإعداد 0.1٪ DMSO في وسط الاستزراع ليتناسب مع تركيز DMSO النهائي بدون سيسبلاتين.
    4. قم بإزالة الوسط المستهلك من مزارع sIO واستبدله برفق بوسيط يحتوي على سيسبلاتين 10 ميكرومتر أو وسيط تحكم DMSO فقط.
    5. بعد العلاج ، انقل العينات إلى حاضنة نظام التصوير.

2. التصوير المجسم منخفض التماسك باستخدام برنامج التشغيل

  1. تحضير عينة للتصوير
    1. قم بتوزيع 15 ميكرولتر من قبة ECM العضوية على طبق التصوير السفلي # 1.5 باتباع الإجراء الموضح في الخطوات 1.3.1-1.3.4. ضع كل قبة في الطبق بالقرب من المركز قدر الإمكان للحصول على تصوير مثالي.
    2. قبل البلمرة ، احتضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 دقيقة للسماح للعضويات بالاستقرار في القاع.
    3. ضع اللوحة رأسا على عقب في حاضنة 37 درجة مئوية ، 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 لمدة ساعة واحدة لبلمرة ECM. بعد ذلك ، أضف برفق ما يكفي من وسط الثقافة لغمر العضيات بالكامل.
      ملاحظة: اضبط الحجم المتوسط للتأكد من أن العضيات مغمورة بالكامل وفقا لحجم طبق التصوير ذو القاع الغطاء.
    4. بعد 5 أيام من المرور ، اغسل العينة 2x-3x باستخدام PBS مباشرة قبل التصوير لإزالة الحطام وتقليل القطع الأثرية البصرية.
  2. إعداد التصوير
    1. قم بتشغيل وحدة التحكم البيئية للحفاظ على صلاحية العينة. تقوم وحدة التحكم في الغرفة تلقائيا بضبط درجة الحرارة إلى 37 درجة مئوية وتركيز ثاني أكسيد الكربون2 إلى 5٪.
    2. اضغط على زر الباب في مقدمة الجهاز لفتح الباب. أضف الماء لتشكيل طبقة رقيقة داخل الحجرة جيدا لمنع جفاف وسائط الاستزراع.
    3. ضع طبق التصوير في حامل وعاء مناسب ، وأدخله في غرفة التصوير ، وثبته باستخدام دبوس لمنع الحركة. تأكد من أن الطبق متصل بإحكام بحامل الوعاء دون إمالة.
    4. أغلق باب الجهاز باستخدام زر الباب لمنع تداخل الضوء الخارجي.
    5. قم بتشغيل برنامج TomoStudio X وقم بتسجيل الدخول. انقر فوق ابدأ لفتح النافذة الرئيسية.
    6. انقر فوق إضافة مشروع في الزاوية العلوية اليسرى وقم بتعيين معلمات تجريبية (على سبيل المثال، اسم المشروع والنوع الوسيط ونوع العينة وما إلى ذلك). سيتم إنشاء لوحة العينة تلقائيا. تأكد من تعيين نوع الوسيط الصحيح لاستخدام RI المناسب في التجربة.
    7. انقر فوق البئر المطلوب في اللوحة وانقر فوق إنشاء في الجزء العلوي لتسجيل الآبار كعينات.
    8. انقر فوق إعداد عائد الاستثمار في الزاوية العلوية اليسرى لتحديد منطقة الاهتمام (ROI) في الطبق. بمجرد تعيين جميع المعلمات، انقر فوق تشغيل التجربة في الزاوية السفلية اليمنى لفتح نافذة الحصول على الصور.
    9. انقر فوق تحميل السفينة في الزاوية العلوية اليمنى. ستظهر صورة الحقل الساطع. اضبط موضع Z باستخدام الزرين + Z و -Z للتركيز.
    10. في علامة التبويب تصوير فردي، اضبط حجم عائد الاستثمار. التقط العضيات في مجال رؤية 160 ميكرومتر × 160 ميكرومتر واحصل على أكوام محورية يصل عمقها إلى 140 ميكرومتر. بالنسبة للعضيات الأكبر حجما، احصل على العديد من الصور المقطعية للمثبط المحجوز وصور الغرزة عن طريق تحديد خانة الاختيار تصوير البلاط في الأسفل.
    11. انتقل إلى علامة التبويب تصوير اللقطات المتتابعة لتكوين التصوير طويل المدى. اضبط المدة ووقت الفاصل الزمني حسب الحاجة. في هذه التجربة ، تم إجراء التصوير بفاصل زمني على فترات 10 دقائق على مدار 24 ساعة ، وتم إجراء التحليل على فترات ساعتين طوال نفس المدة.
    12. انقر فوق رمز المسح الضوئي لالتقاط موقع عائد الاستثمار الحالي. قم بتوسيط قبة ECM يدويا باستخدام تصوير المجال الساطع. انقر فوق BF زر لضبط قيم الشدة والتعريض الضوئي لتصوير المجال الساطع.
    13. حدد ROI عن طريق تحريك مربع ROI الذي يظهر في لوحة Preview. بمجرد العثور على عائد الاستثمار المطلوب ، انقر فوق إضافة نقطة في الأسفل. ستظهر قائمة نقاط التصوير.
    14. انقر فوق اكتساب لبدء التصوير. سيتم الحصول على بيانات الصورة الأولية.
  3. الحصول على الصور
    ملاحظة: تقوم هذه العملية بإنشاء ملف Tomocube Common File (TCF) من بيانات الصورة الأولية. يجب معالجة بيانات الصورة الأولية في ملف TCF، والذي يحتوي على أنواع متعددة من الصور، مثل التصوير المقطعي RI وإسقاط الحد الأقصى للكثافة. يمثل التصوير المقطعي RI توزيع 3D RI للعينة ، ويظهر إسقاط الكثافة القصوى أعلى قيمة RI لكل موضع جانبي في المستوى XY.
    1. قم بسحب ملفات الصور الأولية وإفلاتها في خادم معالجة HTX. انقر فوق Process لإنشاء ملف TCF من ملف الصورة الأولية.
    2. لعرض مخططات RI المقطعية التي تم إنشاؤها في ملف TCF، استخدم TomoAnalysis Viewer أو MATLAB أو Python. لعرض ملف TCF في MATLAB، استخدم وظائف مثل h5info وh5read. وبالمثل ، في Python ، استخدم حزمة h5py لقراءة ملفات H5.

3. تحليل الصور

  1. تجزئة الصور المستندة إلى التعلم الآلي
    1. تصدير ملف صورة الإطار الشفاف والشفافية والموافقة إلى تنسيق HDF5 (ملف الترميز التكميلي 1) للتأكد من أن البيانات بتنسيق متعدد الأبعاد متوافق مع ilastik.
    2. افتح ilastik وانتقل إلى File > New Project. حدد تصنيف البكسل ضمن قسم مهام سير عمل التجزئة. احفظ ملف المشروع في دليل معين.
    3. قم بتحميل ملف HDF5 بالانتقال إلى 1. علامة التبويب إدخال البيانات. انقر فوق Add New File (إضافة ملف جديد)، وحدد Suitable H5 Dataset، وتأكد من تعيين قنوات الصور الصحيحة.
    4. انتقل إلى 2. علامة التبويب تحديد الميزة لتحديد الميزات ذات الصلة (اللون/الكثافة، الحافة، الملمس) لتحسين التجزئة.
      ملاحظة: قد يختلف تحديد الميزة وفقا لمجموعة البيانات وخصائص الصورة. بالنسبة للتحليل الحالي ، تضمنت الميزات المحددة: اللون / الكثافة (σ = 1.60) ، والحافة (σ = 3.50) ، والنسيج (σ = 1.60). قد يكون التحسين القائم على نهج إرشادي مطلوبا اعتمادا على مدى تعقيد الصورة. بدلا من ذلك ، يمكن استخدام وظيفة اقتراح الميزات > تشغيل تحديد الميزة في ilastik لتحديد مجموعة مثالية من المعلمات.
    5. في 3. علامة تبويب التدريب ، قم بتسمية المناطق العضوية وغير العضوية من خلال تطبيق ضربات الفرشاة بألوان مميزة. لتحسين دقة التجزئة ، قم بإضافة تعليقات توضيحية بعناية إلى المناطق حول الحدود.
    6. انقر فوق التحديث المباشر لمعاينة نتائج التجزئة وإجراء التحسينات حسب الضرورة.
    7. انتقل إلى 4. تصدير التنبؤ. في تحديد المصدر، اختر تجزئة بسيطة لتصدير التنبؤات المسماة. انقر فوق تصدير الكل، مع التأكد من تعيين تنسيق الإخراج إلى .h5 أو .tiff، اعتمادا على متطلبات التحليل من الخادم.
  2. تحليل الميزات الكمي
    ملاحظة: يتم تنفيذ خطوة البروتوكول هذه في MATLAB، مع تفصيل كل إجراء في ملف الترميز التكميلي 2.
    1. من خلال الجمع بين التصوير المقطعي RI مع صورة القناع ، قم بإنشاء صورة RI مقنعة تتضمن المنطقة العضوية فقط.
    2. باستخدام صورة RI المقنعة ، احسب المعلمات الكمية مثل الحجم العضوي وكثافة البروتين ومحتوى البروتين.
      1. الحجم: احسب الحجم الإجمالي للعشقية بضرب عدد وحدات البكسل في القناع المجزأ في دقة البكسل ل X و Y و Z. احسب عدد وحدات البكسل عن طريق حساب جميع قيم فوكسل في مصفوفة القناع المسمى عضويا، باستخدام دالة MATLAB المضمنة Sum.
        ملاحظة: يتم تحديد دقة البكسل بواسطة نظام التصوير ويمكن العثور عليها ضمن مجموعة سمات البيانات > 3D داخل بنية HDF5.
      2. كثافة البروتين: احسب كثافة البروتين عن طريق طرح قيمة RI المتوسطة من متوسط RI العضوي وقسمتها على زيادة معامل انكسار البروتين.
        1. RI متوسط: قم بقياس RI للوسط المحيط باستخدام مقياس الانكسار قبل التحليل.
        2. متوسط قيمة RI: حدد متوسط RI للعضوي عن طريق حساب متوسط قيم RI للفوكسل الموجودة داخل القناع العضوي.
        3. زيادة معامل انكسار البروتين (α): استخدم ثابتا تجريبيا تم الإبلاغ عنه سابقا مشتقا من دراسات زيادة معامل الانكسار.
      3. محتوى البروتين: احسب إجمالي محتوى البروتين بضرب الحجم المحدد في الخطوة 3.2.2.1 بكثافة البروتين التي تم الحصول عليها في الخطوة 3.2.2.2.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يوضح الشكل 1 سير العمل التخطيطي للتصوير رباعي الأبعاد والتحليل الكمي ل sIOs. يتيح هذا البروتوكول التصوير المباشر المستمر والتقييم الشامل ل sIOs من خلال عملية من أربع خطوات: الثقافة ، والتصوير رباعي الأبعاد ، ومعالجة الصور ، والتحليل الكمي (الشكل 1 د).

بعد فترة حضانة مدتها 5 أيام ، تم نقل sIOs الناضجة إلى أطباق التصوير ذات القاع المنزلي للتصور باستخدام التصوير المجسم منخفض التماسك (HT) (الشكل 1 أ). تعيد تق...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يقدم التصوير المجسم نهجا قويا للتصوير عالي الدقة الخالي من الملصقات للعضيات الحية ، والتغلب على العديد من التحديات المرتبطة بتقنيات التصوير التقليدية. في هذا البروتوكول ، نصف منهجية شاملة لتطبيق HT منخفض التماسك على أبحاث sIO ، مما يتيح التصور الكمي في الوقت الفعلي لمورفولوجيا العضوية ، وديناميكيات النمو ، والاستجابات للعلاج بالعقاقير. يعمل دمج التجزئة المستندة إلى التعلم الآلي والتحليل الكمي إلى تعزيز القدرة التحليلية لنهج التصوير هذا ، مما يوفر تقييمات غير متحيزة وقابلة للتكرار للسلوك ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

M.J.L. و JHL و SML و YKKP لها مصالح مالية في شركة Tomocube Inc. ، وهي شركة تقوم بتسويق التصوير المجسم وأدوات التصوير الكمي.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم دعم هذا العمل من خلال منحة المؤسسة الوطنية للبحوث الكورية بتمويل من الحكومة الكورية (RS-2024-00442348 ، RS-2024-00440577 ، 2022M3H4A1A02074314) ، المعهد الكوري للتقدم التكنولوجي (KIAT) من خلال برنامج البحث والتطوير التعاوني الدولي (P0028463) ، ومنحة الصندوق الكوري للطب التجديدي (KFRM) بتمويل من الحكومة الكورية (وزارة العلوم وتكنولوجيا المعلومات والاتصالات ووزارة الصحة والرفاهية) (21A0101L1-12). تم الحصول على البيانات من قبل M.J.L. و J.H.L. ، حيث كان JHL مسؤولا عن معالجة البيانات و JMC لتحليل البيانات. ساهم جميع المؤلفين في كتابة المخطوطة. نتقدم بالشكر إلى ChulMin Oh و Chungha Lee على المناقشات الفنية القيمة والمساعدة في إعداد الشكل.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
48 بئر لوحة   ؛كورنينج3548طبق ثقافة
حل استعادة الخلايا   ؛كورنينج354253تدهور المواد   ؛
سيسبلاتينسوبيلكوPHR1624غير متاح
ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO)سيجما ألدريتشD2650مركبة
أنبوب EppendorfكورنينجMCT-175-C-Sغير متاح
خادم معالجة HTXشركة Tomocube ، كورياغير متاحخادم معالجة البيانات
إتش تي-X1شركة Tomocube ، كورياغير متاحبرامج التشغيل
مطاطيغير متاحغير متاحمجموعة أدوات التجزئة المستندة إلى التعلم الآلي
حامل وعاء التصوير   ؛شركة Tomocube ، كورياغير متاححامل طبق التصوير
وسط النمو العضوي IntestiCult (الفأر)تقنيات الخلايا الجذعية#06005وسيط ثقافة مسبقة الصنع متاح تجاريا   ؛
ماتلابماث ووركسماتلاب 2024 أبرنامج لمعالجة الصور
ماتريجلكورنينج356231ECM للعضويات ثلاثية الأبعاد
Millipore  Steritop  فراغ زجاجة الفلتر العلويميركS2GPT05RE0.22 μ وحدة مرشح M للتعقيم المتوسط
العضيات المعوية للفأرتقنيات الخلايا الجذعية#70931غير متاح
انكسارأتاجوآر -5000حاسبة معامل الانكسار
توموديششركة Tomocube ، كوريا901002-02# 1.5 طبق تصوير ذو قاع منزلق
تومو ستوديو إكسشركة Tomocube ، كورياغير متاحبرنامج التصوير
التربيلجيبكو12604تفكك الخلية الواحدة

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kim, J., Koo, B. K., Knoblich, J. A. Human organoids: model systems for human biology and medicine. Nat Rev Mol Cell Biol. 21 (10), 571-584 (2020).
  2. Schwank, G., et al. Functional repair of CFTR by CRISPR/Cas9 in intestinal stem cell organoids of cystic fibrosis patients. Cell stem cell. 13 (6), 653-658 (2013).
  3. Arjmand, B., et al. Advancement of organoid technology in regenerative medicine. Regen Eng Transl Med. 9 (1), 83-96 (2023).
  4. Zhang, W., et al. Patch grafting of organoids of stem/progenitors into solid organs can correct genetic-based disease states. Biomaterials. 288, 121647(2022).
  5. Hofer, M., Lutolf, M. P. Engineering organoids. Nat Rev Mater. 6 (5), 402-420 (2021).
  6. Park, J., et al. Artificial intelligence-enabled quantitative phase imaging methods for life sciences. Nat Meth. 20 (11), 1645-1660 (2023).
  7. Fei, K., Zhang, J., Yuan, J., Xiao, P. Present application and perspectives of organoid imaging technology. Bioengineering. 9 (3), 121(2022).
  8. Fujii, E., et al. A simple method for histopathological evaluation of organoids. J Toxicol Pathol. 31 (1), 81-85 (2018).
  9. Yoshimoto, S., Taguchi, M., Sumi, S., Oka, K., Okamura, K. Establishment of a novel protocol for formalin-fixed paraffin-embedded organoids and spheroids. Biol Open. 12 (5), bio059882(2023).
  10. Badder, L. M., et al. 3D imaging of colorectal cancer organoids identifies responses to Tankyrase inhibitors. PLoS One. 15 (8), e0235319(2020).
  11. Lacin, M. E., Yildirim, M. Applications of multiphoton microscopy in imaging cerebral and retinal organoids. Front Neurosci. 18, 1360482(2024).
  12. Brémond Martin, C., Simon Chane, C., Clouchoux, C., Histace, A. Recent trends and perspectives in cerebral organoids imaging and analysis. Fronti Neurosci. 15, 629067(2021).
  13. Smits, L. M., Schwamborn, J. C. Midbrain organoids: a new tool to investigate Parkinson's disease. Front Cell Dev Biol. 8, 359(2020).
  14. Huisken, J., Swoger, J., Del Bene, F., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. Optical sectioning deep inside live embryos by selective plane illumination microscopy. Science. 305 (5686), 1007-1009 (2004).
  15. Delgado-Rodriguez, P., Brooks, C. J., Vaquero, J. J., Munoz-Barrutia, A. Innovations in ex vivo light sheet fluorescence microscopy. Prog Biophys Mol Biol. 168, 37-51 (2022).
  16. Masson, A., et al. High-resolution in-depth imaging of optically cleared thick samples using an adaptive SPIM. Sci Rep. 5 (1), 16898(2015).
  17. Kopper, O., et al. An organoid platform for ovarian cancer captures intra-and interpatient heterogeneity. Nat Med. 25 (5), 838-849 (2019).
  18. Renner, H., et al. A fully automated high-throughput workflow for 3D-based chemical screening in human midbrain organoids. elife. 9, e52904(2020).
  19. Laperrousaz, B., et al. Direct transfection of clonal organoids in Matrigel microbeads: a promising approach toward organoid-based genetic screens. Nucl Acids Res. 46 (12), e70-e70 (2018).
  20. Susaki, E., Takasato, M. Perspective: Extending the Utility of Three-Dimensional Organoids by Tissue Clearing Technologies. Front Cell Dev Biol. 9, 1-12 (2021).
  21. Park, Y., Depeursinge, C., Popescu, G. Quantitative phase imaging in biomedicine. Nat Photon. 12 (10), 578-589 (2018).
  22. Kim, G., et al. Holotomography. Nat Rev Meth Primers. 4 (1), 51(2024).
  23. Wolf, E. Three-dimensional structure determination of semi-transparent objects from holographic data. Optics Comm. 1 (4), 153-156 (1969).
  24. Kim, H., et al. Integrating holotomography and deep learning for rapid detection of NPM1 mutations in AML. Sci Rep. 14 (1), 23780(2024).
  25. Kim, S. Y., et al. Label-free imaging and evaluation of characteristic properties of asthma-derived eosinophils using optical diffraction tomography. Biochem BiophysRes Comm. 587, 42-48 (2022).
  26. Kim, T., et al. RNA-mediated demixing transition of low-density condensates. Nat Comm. 14 (1), 2425(2023).
  27. Kim, G., et al. Rapid species identification of pathogenic bacteria from a minute quantity exploiting three-dimensional quantitative phase imaging and artificial neural network. Light Sci Appl. 11 (1), 190(2022).
  28. Hugonnet, H., et al. Multiscale label-free volumetric holographic histopathology of thick-tissue slides with subcellular resolution. Adv Photon. 3 (2), 026004-026004 (2021).
  29. Lee, M. J., et al. Long-term three-dimensional high-resolution imaging of live unlabeled small intestinal organoids via low-coherence holotomography. Exp Mol Med. 56 (10), 2162-2170 (2024).
  30. Wang, D., Lippard, S. J. Cellular processing of platinum anticancer drugs. Nat Rev Drug Discov. 4 (4), 307-320 (2005).
  31. Berg, S., et al. Ilastik: interactive machine learning for (bio) image analysis. Nat Meth. 16 (12), 1226-1232 (2019).
  32. Sbrana, F., et al. Label-free three-dimensional imaging and quantitative analysis of living fibroblasts and myofibroblasts by holotomographic microscopy. Microscopy Res Tech. 87 (11), 2757-2773 (2024).
  33. Zhao, H., Brown, P. H., Schuck, P. On the distribution of protein refractive index increments. Biophys J. 100 (9), 2309-2317 (2011).
  34. Wallaeys, C., Garcia-Gonzalez, N., Libert, C. Paneth cells as the cornerstones of intestinal and organismal health: a primer. EMBO Mol Med. 15 (2), e16427(2023).
  35. Hooper, L. V. Epithelial cell contributions to intestinal immunity. Adv Immunol. 126, 129-172 (2015).
  36. Atanga, R., Singh, V., In, J. G. Intestinal enteroendocrine cells: present and future druggable targets. Int J Mol Sci. 24 (10), 8836(2023).
  37. Dicarlo, M., et al. Quercetin exposure suppresses the inflammatory pathway in intestinal organoids from winnie mice. Int J Mol Sci. 20 (22), 5771(2019).
  38. Miura, S., Suzuki, A. Generation of mouse and human organoid-forming intestinal progenitor cells by direct lineage reprogramming. Cell Stem Cell. 21 (4), 456-471.e5 (2017).
  39. Barer, R. Determination of dry mass, thickness, solid and water concentration in living cells. Nature. 172 (4389), 1097-1098 (1953).
  40. Popescu, G., et al. Optical imaging of cell mass and growth dynamics. Am J Physiol Cell Physiol. 295 (2), C538-C544 (2008).
  41. Shin, S., Kim, D., Kim, K., Park, Y. Super-resolution three-dimensional fluorescence and optical diffraction tomography of live cells using structured illumination generated by a digital micromirror device. Sci Rep. 8 (1), 9183(2018).
  42. Kim, Y. S., et al. Combining three-dimensional quantitative phase imaging and fluorescence microscopy for the study of cell pathophysiology. Yale Biol Med. 91 (3), 267(2018).
  43. Liu, C., et al. Simultaneous dual-contrast three-dimensional imaging in live cells via optical diffraction tomography and fluorescence. Photonics Res. 7 (9), 1042-1050 (2019).
  44. Schlüßler, R., et al. Combined fluorescence, optical diffraction tomography and Brillouin microscopy. bioRvix. , (2020).
  45. Chowdhury, S., Eldridge, W. J., Wax, A., Izatt, J. A. Structured illumination multimodal 3D-resolved quantitative phase and fluorescence sub-diffraction microscopy. Biomed Optics Exp. 8 (5), 2496-2518 (2017).
  46. Jo, Y., et al. Label-free multiplexed microtomography of endogenous subcellular dynamics using generalizable deep learning. Nat Cell Biol. 23 (12), 1329-1337 (2021).
  47. Oh, C., Hugonnet, H., Lee, M., Park, Y. Digital aberration correction for enhanced thick tissue imaging exploiting aberration matrix and tilt-tilt correlation from the optical memory effect. Nat Comm. 16 (1), 1685(2025).
  48. Yasuhiko, O., Takeuchi, K. In-silico clearing approach for deep refractive index tomography by partial reconstruction and wave-backpropagation. Light Sci Appl. 12 (1), 101(2023).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Holotomography ImagingIntestinal OrganoidsLabel Free Imaging3D Organoid ImagingMachine Learning SegmentationRefractive Index MappingOrganoid MorphologyProtein Density QuantificationDrug Response AnalysisTime Lapse Imaging

Related Articles