مقالة منهجية

التصوير المقطعي بالفحص المجهري الإلكتروني في علم الفيروسات: التصوير ثلاثي الأبعاد للعينات المجمدة عالية الضغط والاستبدال بالتجميد

DOI:

10.3791/68568

⸱

أغسطس 6, 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Boehringer Ingelheim Pharma GmbH & Co. KG, 2Central Facility for Electron Microscopy, Ulm University, 3Institute of Molecular Virology, Ulm University

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يوضح بروتوكول الفيديو هذا كيفية إجراء التصوير المقطعي المجهري الإلكتروني للعينات الفيروسية. للحصول على أفضل النتائج ، يتم تحضير العينات عن طريق التجميد بالضغط العالي واستبدال التجميد اللاحق.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

أصبح الفحص المجهري الإلكتروني (EM) وخاصة تقنيات EM ثلاثية الأبعاد (3D) طرقا راسخة في علم الفيروسات الهيكلي. يتطلب التحقيق في التغيير الناجم عن الفيروس في البنية التحتية الخلوية ، مثل مصانع النسخ المتماثل الناجم عن فيروس زيكا (ZIKV) أو عضيات تكرار فيروس كورونا ، تصويرا ثلاثي الأبعاد. يعد التصوير المقطعي المجهري الإلكتروني (TEM) طريقة مستخدمة على نطاق واسع ، على الرغم من حصرها على عينات يصل سمكها إلى 200 نانومتر. يمكن أن ينتج المجهر الإلكتروني للمسح الضوئي للشعاع الأيوني المركز (SEM) بيانات ثلاثية الأبعاد بأحجام أكبر ذات ممارسات متناحية، وإن كانت عادة أقل وضوحا. تستخدم التقنيات البديلة ، مثل المجهر الإلكتروني لمسح الوجه الكتلي (BF-SEM) ، أو التصوير المقطعي المصفوفة SEM ، أو التصوير TEM للأقسام التسلسلية لتصوير أحجام أكبر. ومع ذلك ، بالمقارنة مع التقنيات المذكورة سابقا ، تأتي هذه التقنيات على حساب دقة أقل بكثير على طول المحور Z للعينة. تقنية توفر معلومات ثلاثية الأبعاد لعينات يصل سمكها إلى 1 ميكرومتر بدقة متناحية، وهي المسح الضوئي للفحص المجهري الإلكتروني (STEM).

هنا ، نقدم بروتوكولا لإعداد العينات الفيروسية عالية الضغط المجمدة والمستبدلة بالتجميد والمضمنة في الراتنج وتحليلها باستخدام التصوير المقطعي STEM. يستفيد هذا البروتوكول من مزايا التصوير في درجة حرارة الغرفة مع الحفاظ على البنية التحتية البيولوجية في حالة شبه أصلية. نعرض مثالين تمثيليين للأسئلة التي يمكن الإجابة عليها باستخدام التصوير المقطعي STEM. أولا ، نطبق بروتوكول دراسة تشكل الفيروسات لفيروس التهاب الفم الحويصلي المؤتلف (VSV). تقدم التصوير المقطعي STEM معلومات عن تبرعم VSV المؤتلف الذي لا يمكن الوصول إليه عن طريق التصوير ثنائي الأبعاد. ثانيا ، نعرض الضوء المترابط والفحص المجهري الإلكتروني (CLEM) باستخدام تصوير نقل طاقة الرنين Foerster (FRET) والتصوير المقطعي STEM (FRET-3D-CLEM) للألياف النانوية لببتيد EF-C. تقدم هذه المجموعة المنشورة مؤخرا رؤى جديدة حول امتصاص وتفكيك ألياف الببتيد النانوية المعززة للعدوى ، لا سيما الاستفادة من الحجم الكبير الذي يمكن الوصول إليه عن طريق التصوير المقطعي STEM.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

figure-introduction-1
الشكل 1: مقارنة بين تقنيات الفحص المجهري ثلاثية الأبعاد المختلفة ، مع مراعاة الدقة والأجهزة ووقت الاستحواذ والجهد. يقع الحد الأقصى لحجم التقنيات بين التصوير المقطعي بالتبريد الذي يتطلب تقنيا والذي يوفر الدقة الجزيئية ، والفحص المجهري الضوئي ، حيث تكون الدقة محدودة بحد حيود الضوء. الاختصارات: TEM = الفحص المجهري الإلكتروني للإرسال. STEM = مسح TEM. SEM = مسح المجهر الإلكتروني ؛ FIB = شعاع أيوني مركز. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

تمتد الهياكل والأنظمة المتعلقة بالفيروسات على نطاق واسع من نظام الأنغستروم الفرعي (على سبيل المثال ، الجزيئات الصغيرة للعلاج الفيروسي ، والبروتينات الفيروسية المعزولة) إلى عدة أمتار (على سبيل المثال ، الكائنات الحية المصابة بأكملها). تتراوح الجسيمات الفيروسية بين 20-1,000 نانومتر ويتم فحصها بشكل أساسي في سياقها البيولوجي ، مثل الخلايا المضيفة وخطوط الخلايا المنتجة للفيروسات ، والتي تقع في نطاق ميكرومتر. وبالتالي فإن تصور هياكل محددة متعلقة بالفيروسات يعتمد على اختيار تقنية توفر مجال رؤية كاف ودقة مناسبة. تعتمد دراسة الخلايا المصابة بالفيروس وقطع الأنسجة على تقنيات الفحص المجهري (الشكل 1). بينما يمكن الحصول على صور عامة للخلايا والأنسجة باستخدام الفحص المجهري الضوئي الكلاسيكي ، غالبا ما تتم دراسة الهياكل داخل الخلايا المشاركة في تكاثر الفيروس باستخدام المجهر الإلكتروني (EM). على الرغم من استخدامه في الوقت الحاضر في الغالب في البحوث الفيروسية الأساسية ، إلا أن EM يستخدم أيضا في التشخيص1،2 وقد وجد طريقه أيضا إلى تطبيقات المستحضرات الصيدلانيةالحيوية 3.

في كثير من الأحيان ، لا يمكن لنهج 2D EM مثل المجهر الإلكتروني الكلاسيكي (TEM) الإجابة بشكل كاف على سؤال بيولوجي معين. في علم الفيروسات ، هذا هو الحال بشكل خاص عند دراسة تفاعلات الفيروس والخلايا المضيفة مثل ارتباط الفيروس ودخوله ، أو تكوين المصانع الفيروسية ، أو تشكل الفيروسات4،5،6،7،8،9. لذلك ، يتم استخدام التصوير المقطعي EM لتحليل البنية التحتية ثلاثية الأبعاد للعينات البيولوجية. من حيث المبدأ ، هناك طريقتان للحصول على مخطط مقطعي لعينة معينة: 1) التصوير التدريجي للشرائح التسلسلية التي يتم دمجها لاحقا في مكدس صور ثلاثي الأبعاد ، أو 2) الحصول على إسقاطات من زوايا عرض مختلفة للعينة متبوعا بإعادة بناء حسابية للمعلومات في مكدس صور افتراضي.

تشمل تقنيات النوع الأول تصوير الأقسام التسلسلية بواسطة TEM أو SEM (التصوير المقطعي المصفوفة SEM) ، والتصوير المقطعي لوجه الكتلة التسلسلية ، والتصوير المقطعي للحزمة الأيونية المركزة (FIB) - SEM. يفتقر تصوير SEM و TEM للأقسام التسلسلية إلى الدقة في z ، والتي تقتصر على سمك المقطع ، ولكنها توفر مجال رؤية كبيرا وتعتمد على المعدات المتوفرة بسهولة في معظم مختبرات EM4. يمكن أن ينتج عن التصوير المقطعي FIB-SEM دقة متناحية، ولكن تكاليف الجهاز والصيانة يمكن أن تكون صعبة، كما أن تصوير الخلايا الكاملة بدقة الخواص يستغرق وقتاطويلا 9,10.

يعتمد النوع الثاني من التصوير المقطعي حصريا على نقل شعاع الإلكترون عبر عينة. يمكن القيام بذلك باستخدام طريقتين مختلفتين للتصوير: TEM أو المجهر الإلكتروني لإرسال المسح الضوئي (STEM). في حين أن التصوير المقطعي TEM أكثر انتشارا وأسهل في التنفيذ ، فإن سمك القسم يقتصر على ~ 200 نانومتر. لذلك ، لا يمكن تصوير الهياكل الأكبر من سمك المقطع ، مثل الميتوكوندريا أو الحويصلات أو الفيروسات ، في صورة مقطعية واحدة. يوفر التصوير المقطعي STEM إمكانية تصوير عينات يصل سمكها إلى 1 ميكرومتر11،12. ومع ذلك ، فإنه يتطلب STEM بجهد تسارع عال (≥200 كيلو فولت) وإعداد يدعم زوايا إمالة عالية بالإضافة إلى زاوية شبه تقارب صغيرة13. على الرغم من أن التصوير STEM هو تقنية شائعة في علم المواد ، إلا أنه لا يزال تقنية نادرة في مختبرات EM البيولوجية.

هنا ، نقدم نهجا قائما على التطبيق لاستخدام التصوير المقطعي STEM للعينات الفيروسية. نظرا للتعقيد العالي والطبيعة كثيفة العمالة للتصوير المقطعي الكهرومغناطيسي ، يعد تحضير العينات عالي الجودة أمرا بالغ الأهمية. في حين أن TEM المبرد (التصوير المقطعي) هو بلا شك المعيار الذهبي للتحقيقات على المستوى الجزيئي ، فإن التصوير بدرجة حرارة الغرفة للخلايا المجمدة عالية الضغط والبديل بالتجميد يوفر الحفاظ على الوضوح القوي للبنية الفوقية الخلوية7،14. باختصار ، تزرع الخلايا الملتصقة على قرص من الياقوت وتصاب أو تعالج بطريقة أخرى حسب الرغبة. ثم يتم تجميد الخلايا عن طريق تجميدها تحت ضغط عال بمعدلات تبريد عالية جدا ، مما يؤدي إلى تزجيج الماء بداخلها. بعد ذلك ، يتم استبدال الماء بمذيب بينما يتم تباين العينات وإعادتها ببطء إلى درجة حرارة الغرفة. ثم يتم تضمين العينات تدريجيا في الراتنج.

هناك العديد من البروتوكولات للتجميد بالضغط العالي واستبدال التجميد ، والتي تختلف في الماكينة ونظام الناقل وتكوين العينة. تم نشر بروتوكولات مفصلة للتجميد بالضغط العالي ، بما في ذلك بروتوكول بواسطة Walther et al.15 ، وبروتوكول فيديو بواسطة Steyer et al.16 ، والذي يركز على تحضير الأنسجة ل FIB-SEM باستخدام تحسين التباين بمساعدة الميكروويف. للبحث الفيروسي ، نشر Read et al.17 و Romero-Brey18 بروتوكولات مفصلة لإعداد الخلايا المصابة بالفيروس عن طريق التجميد عالي الضغط باستخدام أقراص الياقوت والتحليل اللاحق باستخدام التصوير المقطعي الإلكتروني. كما تم وصف التقسيم الرقيق للغاية سابقا15،17. راجع الأدبيات المذكورة لمزيد من التفاصيل حول هذه الأساليب.

هنا ، نقدم سير عمل عبارة عن نسخة معدلة ومحدثة من البروتوكولات المنشورة سابقا15,17 المقترنة لأول مرة بدليل فيديو مفصل. يوفر البروتوكول سير عمل لإعداد العينة باستخدام التجميد بالضغط العالي واستبدال التجميد والتضمين في راتنجات الايبوكسي. يتم قطع الأقسام التي يتراوح سمكها بين 800 نانومتر و 1,000 نانومتر باستخدام ميكروتوم فائق الصغر. يتم الحصول على سلسلة إمالة ب 200 كيلو فولت STEM ، باستخدام أدوات EM البرمجية. تم تحسين هذا البروتوكول للخلايا الملتصقة ويوفر سير عمل شاملا مع السماح بإجراء تعديلات لأنواع العينات الأخرى ، مثل الأنسجة أو الخلايا المعلقة. بالنسبة للتصوير المقطعي STEM في ظل ظروف مبردة ، راجع عمل مجموعة مايكل إلباوم19،20.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. زراعة الخلايا

  1. تحضير أقراص الياقوت
    1. نظف أقراص الياقوت عن طريق غسل 3 مرات في الإيثانول بنسبة 100٪ لمدة 20 دقيقة. قم بإزالة الإيثانول المتبقي عن طريق سحب الأقراص فوق ورق ترشيح جاف. اترك الأقراص في حجرة تجفيف 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة على الأقل ، أو حتى تجف تماما.
      ملاحظة: في هذا البروتوكول ، يتم استخدام أقراص الياقوت التي يبلغ قطرها 3 مم وسمك 0.16 مم. بالنسبة للأنظمة الأخرى ، سير العمل المحسن للأنسجة أو الخلايا المعلقة ، راجع Walther et al.15. يتم توفير بعض "النصائح والحيل" للخلايا المستنبتة والأنظمة الأخرى بواسطة McDonald et al.21.
    2. قم بتغطية أقراص الياقوت بالكربون عن طريق وضع ما يقرب من 50 قرصا من الياقوت بشكل مسطح على زجاج ساعة نظيف وتغطيتها بطبقة كربونية بسمك 10-15 نانومتر باستخدام جهاز طلاء الكربون. اخبزي الأقراص طوال الليل على حرارة 120 درجة مئوية لتثبيت طبقة الكربون.
      ملاحظة: بالنسبة لمناهج EM المترابطة، أدخل نظام إحداثيات: ضع شبكة مكتشف أعلى أقراص الياقوت قبل طلاء الكربون، بحيث تكون الشبكة مرئية كسالب على القرص21.
    3. لتتمكن من تحديد الجانب المطلي بالكربون من قرص الياقوت لاحقا ، استخدم أداة حادة (على سبيل المثال ، طرف الملقط) لخدش علامة في الكربون لا يمكن قراءتها بشكل صحيح إلا من جانب واحد.
      ملاحظة: نوصي بالرقم "2" أو ما شابه ذلك (الشكل 2 أ ، ب). تخطي هذه الخطوة لأقراص الياقوت ذات نظام الإحداثيات المطلي.
    4. قم بتخزين أقراص الياقوت في حجرة تجفيف 37 درجة مئوية حتى الاستخدام الآخر.
      ملاحظة: لا ينصح بإعادة استخدام أقراص الياقوت لأن هذا يزيد من احتمالية كسرها أثناء التجميد بالضغط العالي.
  2. زراعة الخلايا
    1. قبل وقت قصير من وضعه في ثقافة الخلايا ، قم بتفريغ الجانب المطلي بالكربون من الأقراص بجهاز تفريغ التوهج لجعلها محبة للماء (على سبيل المثال ، 0.26 ملي بار بتيار 20 مللي أمبير لمدة 40 ثانية). ثم قم بتعقيم الأقراص عن طريق تعريضها للأشعة فوق البنفسجية لمدة 15 دقيقة.
      ملاحظة: قد يؤدي التعرض للأشعة فوق البنفسجية لأكثر من 30 دقيقة إلى إتلاف طلاء الكربون.
    2. استخدم ملاقط معقمة لوضع الأقراص في قاع طبق استزراع يحتوي على وسائط ، مع التأكد من عدم طفو الأقراص. بذر الخلايا بعناية في الأعلى. في حالة طفو أقراص الياقوت في وسط زراعة الخلية ، توهج التفريغ لفترة أطول عند تكرار التجربة.
      ملاحظة: من الأهمية بمكان أن يكون الحرف "2" موجها بشكل صحيح ، مما يعني أن الجانب المطلي بالكربون متجها لأعلى. مطلوب وجود طبقة أحادية للخلية على الأقراص مع التقاء نهائي ~ 80٪. قد يختلف نمو الخلايا على أقراص الياقوت عن ذلك الموجود في طبق الثقافة المحيط. تحقق من توزيع الخلايا وجودتها على الأقراص باستخدام مجهر ضوئي مقلوب قبل متابعة البروتوكول. يمكن تحسين توزيع الخلايا عن طريق هز الصفيحة برفق أثناء زرع الخلايا.
      بالنسبة لخلايا التعليق ، قم بتغطية أقراص الياقوت المطلية بالكربون ب poly-L-lysine أو استخدم الشعيرات الدموية ، كما هو موضح في15. لا تعرض الأقراص المغطاة ب poly-L-lysine للأشعة فوق البنفسجية ، لأن ذلك قد يؤدي إلى إتلاف طلاء poly-L-lysine.
    3. قم بإجراء أي علاج مرغوب فيه للخلايا (على سبيل المثال ، العدوى والعلاج الدوائي) مع الحفاظ على أقراص الياقوت في مكانها. تعامل مع الأقراص بعناية لتجنب انفصال الخلايا أو خدش طبقة الكربون. احتضان الخلايا وفقا لذلك. قم بإجراء التثبيت الكيميائي ، على سبيل المثال ، 2.5٪ جلوتارالديهايد ، 1٪ ساكاروز في محلول فوسفات 0.1 مولار (درجة الحموضة 7.3) ، أو 4٪ بارافورمالدهايد ، وفقا للوائح المحلية ، قبل نقل العينات إلى الفريزر عالي الضغط1،7،22.
      ملاحظة: قبل أن تغادر العينات المصابة مختبرات مستوى السلامة الأحيائية، يجب الامتثال لجميع لوائح السلامة البيولوجية المحلية المطبقة على النظام النموذجي.

figure-protocol-1
الشكل 2: التجميد عالي الضغط. (أ) أقراص الياقوت التي تظهر طبقة الكربون مع "2" (يسار) أو نظام إحداثيات للضوء المترابط والفحص المجهري الإلكتروني (يمين). (ب) تصوير تخطيطي لشطيرة SD-gold spacer-SD أثناء تحضيرها للتجميد بالضغط العالي. تواجه الخلايا المزروعة على الأقراص بعضها البعض وبالتالي فهي محمية في التجويف الضيق. (ج) حامل للتجميد عالي الضغط الذي يحتوي على شطيرة SD. (د) مواد وأجهزة تحميل حامل HPF: (1) لوحة تسخين ، (2) مجهر ستيريو ، (3) ورق ترشيح ، (4) أنبوب تفاعل يحتوي على 1-سداسي الدين ، (5) ملاقط ، (6) SDs غير مطلية ، (7) طبق بتري مع فواصل ذهبية ، (8) حامل HPF. (ه) إعداد نظام HPF: (1) صندوق LN لنقل العينات المجمدة (انظر أيضا F) ، (2) مجفف شعر لتسريع تسخين حامل HPF بعد التجميد ، (3) ديوار النيتروجين لإعادة ملء صندوق LN. (و) صندوق LN لحفظ العينات المجمدة بعد التجميد بالضغط العالي باستخدام حوض مركزي (مخطط منقط) يمكن فيه فتح حامل HPF ويمكن التعامل معها بأمان. المواد اللازمة مباشرة بعد التجميد بالضغط العالي: (1) حامل لما يصل إلى ست حاويات عينة ، (2) ملاقط معزولة ، (3) حاويات عينات بغطاء. تحتوي الحاويات على ثقوب صغيرة وأوزان صغيرة (على سبيل المثال ، برغي) بحيث تغمر في النيتروجين السائل. الاختصارات: SD = قرص الياقوت. HPF = فريزر عالي الضغط ؛ LN = النيتروجين السائل. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

2. تحضير العينة للفحص المجهري الإلكتروني

  1. تجميد الضغط العالي
    ملاحظة: يصف هذا البروتوكول التجميد بالضغط العالي باستخدام الفريزر عالي الضغط المشار إليه (HPF ، جدول المواد). يجب ألا تختلف الخطوات الموضحة كثيرا بالنسبة للآلات الأخرى ، لأنها تخدم نفس الغرض.
    1. اتبع تعليمات الشركة المصنعة لإعداد الفريزر عالي الضغط. تأكد من إمداد النيتروجين السائل الكافي (الشكل 2E) ، وقم بتشغيل الجهاز ، وقم بإجراء تشغيل تجريبي.
    2. قم بإعداد مساحة عمل لتحميل الأقراص في حامل HPF (الشكل 2 د). جهز العناصر التالية: لوحة تسخين (1) ، مجهر ستيريو (2) ، قطع ورق ترشيح (3) ، أنبوب تفاعل مع سداسي اديسين كحشو (4) ، ملاقط (5) ، أقراص ياقوت فارغة / غير مطلية لتجميد عدد فردي من SDs مع الخلايا (6) ، فواصل الذهب (7) ، وحامل HPF (8 ، التفاصيل في الشكل 2C).
    3. قم بإعداد مساحة عمل لمعالجة العينات المجمدة (الشكل 2E ، F). قبل البدء في التجميد بالضغط العالي ، قم بإعداد المعدات التالية:
      1. جهز صندوق LN وملأه بالنيتروجين السائل (الشكل 2E ، F) استعدادا لمعالجة ونقل أقراص الياقوت المجمدة من حامل HPF إلى كبسولات التخزين.
      2. جهز ديوار صغير (3 في الشكل 2 ه) واملأه بالنيتروجين السائل: كن مستعدا لإعادة ملء صندوق LN بالنيتروجين السائل عدة مرات أثناء عملية التجميد.
      3. احتفظ بالملاقط المعزولة (2 في الشكل 2F) جاهزة.
      4. قم بإعداد حاويات العينات التي ستحمل أقراص الياقوت بعد التجميد بالضغط العالي (كبسولات التخزين ، 3 في الشكل 2F). تأكد من أن لديهم غطاء وعدة ثقوب لصب النيتروجين السائل وأوزان صغيرة (على سبيل المثال ، مسامير صغيرة أو ما شابه ذلك) للتأكد من أنها لا تطفو. قم بتسمية الحاويات قبل الاستخدام وتبريدها مسبقا في صندوق LN.
        ملاحظة: نستخدم كبسولات BEEM ككبسولات تخزين.
    4. احتفظ بالعينات في حاضنة بالقرب من الفريزر عالي الضغط إذا لم تكن الخلايا مسبوقة ، أو إذا لم يكن ذلك ممكنا ، على طبق ساخن (1 في الشكل 2 د) ، للحفاظ على الظروف الفسيولوجية (37 درجة مئوية ، 5٪ ثاني أكسيدالكربون 2) لأطول فترة ممكنة.
    5. تأكد من وجود عدد كاف من الخلايا على أقراص الياقوت وجودة خلية جيدة قبل البدء في التجميد بالضغط العالي. للقيام بذلك ، افحص الأقراص باستخدام مجهر ضوئي مقلوب.
    6. أداء التجميد بالضغط العالي.
      1. خذ قرصا ياقوتا واحدا من طبق الاستزراع بالملاقط وضعه في حامل HPF (الشكل 2C) بحيث يكون الجانب المطلي بالكربون متجها لأعلى ("2" قابل للقراءة). قبل ذلك ، قم بإزالة الوسائط الزائدة عن طريق غمس القرص بسرعة على ورق الترشيح ولكن احرص على عدم ترك الخلايا تجف.
      2. اغمس فاصل ذهبي في سداسي الدسين وضعه بعناية فوق قرص الياقوت. خذ قرصا ثانيا من الياقوت وضعه فوق الفاصل الذهبي بحيث يكون الجانب المطلي بالكربون متجها لأسفل ، لتشكيل قرص ياقوتي - فاصل ذهبي - شطيرة قرص من الياقوت مع توجيه الخلايا إلى بعضها البعض. تأكد من عدم وجود هواء محاصر في تجويف الساندويتش.
      3. أغلق حامل HPF. قم بتنفيذ هذه الخطوة بعناية ولكن بسرعة لتقليل الضغط على العينة ، خاصة بالنسبة للخلايا الحية التي لم يتم تسبقها.
        ملاحظة: بالنسبة للعينات التي تحتوي على مواد مسببة للسرطان أو مطفرة أو سامة (CMR) ، مثل المثبتات الكيميائية ، قم بتحميل حامل HPF تحت غطاء الدخان لتقليل التعرض.
      4. ابدأ عملية التجميد. أدخل حامل HPF بسرعة في الفريزر عالي الضغط ، وقفله وفقا لتعليمات الشركة المصنعة ، وابدأ عملية التجميد.
    7. قم بإزالة العينات المزججة من حامل HPF. انقل بسرعة طرف حامل HPF الذي يحمل أقراص الياقوت المجمدة الآن إلى صندوق LN المبرد مسبقا. قم بإزالة الأقراص بعناية من حامل HPF إلى الحوض المركزي في صندوق LN (الخط المتقطع في الشكل 2F). بعد ذلك ، قم بتسخين حامل HPF وقم بإزالة أي إيثانول متبقي أو سداسيسين قبل البدء في تجميع الشطيرة التالية.
      ملاحظة: من الآن فصاعدا ، تأكد من أن كل شيء يلامس الأقراص مبرد مسبقا في النيتروجين السائل. قم بتنفيذ خطوات النقل بسرعة في جو من النيتروجين وقم بتخزين الأقراص في النيتروجين السائل لتجنب ذوبان العينة. تدرب على نقل الحامل من HPF إلى صندوق LN مسبقا لضمان انتقال سلس وسريع. يمكن تسريع عملية تسخين الحامل بعد التجميد باستخدام مجفف الشعر (2 في الشكل 2E).
    8. بعد إزالة أقراص الياقوت من الحامل ، ضعها في الحاويات الملصقة إما لنقلها إلى جهاز استبدال التجميد أو لتخزين النيتروجين السائل حتى مزيد من المعالجة. إذا كانت أقراص الياقوت مكدسة بإحكام معا بعد HPF ، فاستخدم مشرطا لفصل أقراص الياقوت قبل استبدال التجميد.
      ملاحظة: احرص على عدم كسر الأقراص وتجنب قوى القص. خطط لوقت كاف لهذه الخطوة.
  2. استبدال التجميد
    1. قم بإعداد جهاز استبدال التجميد باتباع تعليمات الشركة المصنعة. املأ النيتروجين السائل ديوار وابدأ البرنامج لتبريد غرفة العينة مسبقا إلى -90 درجة مئوية. تأكد من وجود ما يكفي من النيتروجين السائل لعملية الاستبدال بأكملها.
      ملاحظة: المواد الكيميائية المعنية خطرة. قم بتنفيذ جميع الخطوات تحت غطاء الدخان والامتثال لإرشادات البيئة والصحة والسلامة المحلية (EHS).
    2. تحضير محلول استبدال التجميد الذي يحتوي على 0.1٪ (وزن / حجم) أسيتات اليورانيل و 0.2٪ (وزن / حجم) رابع أكسيد الأوزميوم (OsO4) و 5٪ (حجم / حجم) في الأسيتون. لتحضير حجم 6 مل (يكفي لملء 24 مبردا ، وهو ما يعادل السعة القصوى لجهاز الاستبدال المستخدم هنا) ، اتبع الخطوات التالية:
      1. قم بوزن 6 ملغ من أسيتات اليورانيل في وعاء زجاجي بغطاء محكم.
      2. أضف 300 ميكرولتر من 4٪ (وزن / حجم) رابع أكسيد الأوزميوم في الماء.
      3. أغلق الوعاء وصوتي لمدة 5 دقائق لإذابة أسيتات اليورانيل.
      4. أضف 5.7 مل من الأسيتون ، واخلط المحلول وقسمه بالتساوي في مواد التبريد المتوافقة مع جهاز استبدال التجميد.
    3. ضع المبردات المغلقة التي تحتوي على محلول استبدال التجميد في جهاز استبدال التجميد المبرد مسبقا عند -90 درجة مئوية وانتظر حتى يبرد المحلول أيضا إلى -90 درجة مئوية (لمدة 20 دقيقة تقريبا).
    4. املأ صندوق LN بالنيتروجين السائل. لنقل أقراص الياقوت إلى جهاز استبدال التجميد ، ملاقط التبريد المسبق ، ومشرط ، وكماشة (أو ملاقط كبيرة) في النيتروجين السائل.
    5. استخدم الملقط الكبير المبرد مسبقا لنقل كبسولات التخزين مع العينات المجمدة عالية الضغط من خزان التخزين إلى صندوق LN.
      ملاحظة: اعمل بسرعة لمنع أي ذوبان للعينات. عند معالجة العينات مباشرة بعد التجميد بالضغط العالي ، يمكن تخطي هذه الخطوة.
    6. انقل العينات المجمدة عالية الضغط إلى جهاز استبدال التجميد. افصل أقراص الياقوت واحدة تلو الأخرى مع الاحتفاظ بها في النيتروجين السائل. انقل كل قرص بسرعة على حدة إلى محلول تبريد مع محلول استبدال التجميد ، مما يضمن غمر القرص بالكامل. أغلق المبرد وضعه على الفور مرة أخرى في جهاز استبدال التجميد.
      ملاحظة: أثناء النقل ، احتفظ بالتبريد في جو النيتروجين السائل لمنع محلول الاستبدال من التسخين ولكن ليس في النيتروجين السائل لمنعه من التجمد. أمسك القارورة بأصابعها بالقرب من الغطاء لتجنب ارتفاع درجة حرارة محلول الاستبدال. تعامل مع محلول الاستبدال بحذر ، لأنه يحتوي على مواد سامة.
    7. بمجرد نقل جميع الأقراص إلى جهاز الاستبدال ، ابدأ عملية استبدال التجميد. اضبط الجهاز على رفع درجة الحرارة تدريجيا خلال 16 ساعة من -90 درجة مئوية إلى 0 درجة مئوية ، مع خطوة حضانة لمدة ساعة واحدة عند 0 درجة مئوية ، تليها زيادة تدريجية إلى 20 درجة مئوية خلال 1 ساعة.
    8. بمجرد أن تصل العينات إلى 20 درجة مئوية ، استمر مباشرة في غسل العينات لمدة 3 × 30 دقيقة باستخدام الأسيتون بنسبة 100٪.
      ملاحظة: لا تدع الخلايا الموجودة على الأقراص تجف. قم بتنفيذ جميع الخطوات اللاحقة تحت غطاء الدخان. جمع جميع النفايات في حاوية مناسبة والتخلص منها وفقا للوائح البيئة والصحة والسلامة المحلية.
  3. تضمين
    1. تحضير راتنجات الايبوكسي حديثا وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
      ملاحظة: قم بتنفيذ جميع الخطوات باستخدام راتنجات الايبوكسي تحت غطاء الدخان. نوصي بإعداد راتنج جديد لكل إجراء تضمين بسبب انخفاض اللزوجة وبالتالي تسلل العينة بشكل أفضل.
    2. لتضمين العينات مسبقا ، احتضان العينات في محلول يحتوي على 1/3 راتنجات الايبوكسي و 2/3 أسيتون لمدة 1 ساعة. استبدل المحلول ب 2/3 راتنجات الايبوكسي و 1/3 الأسيتون واحتضنه لمدة 3 ساعات. استبدل المحلول براتنجات الايبوكسي بنسبة 100٪ واتركه يحتضن طوال الليل مع فتح غطاء القارورة للسماح للأسيتون المتبقي بالتبخر.
    3. في اليوم التالي ، انقل أقراص الياقوت إلى أنابيب تفاعل جديدة تحمل علامة مملوءة براتنجات الايبوكسي المحضرة حديثا. ضع الأقراص أفقيا ، مدعوما بجدار أنبوب التفاعل ، وتأكد من أن الجانب الذي يحتوي على الخلايا متجها لأعلى في أنبوب التفاعل (يمكن قراءة "2" تحت مجهر استريو). ضع أنابيب التفاعل مع الغطاء مفتوحا في فرن عند 60 درجة مئوية واترك راتنجات الايبوكسي تتبلمر لمدة 48 ساعة على الأقل.
      ملاحظة: إذا كان جزء من قرص الياقوت بحاجة إلى التضمين ، فقم بتضمينه بمساعدة طرف بلمر لكتلة راتينج لتجربة سابقة: ضع الطرف في أنبوب التفاعل ، واملأ الأنبوب بالراتنج الطازج ، ثم ضع القرص المكسور أعلى الطرف المبلمر.
      يجب وضع أي مواد استهلاكية تستخدم مرة واحدة ملوثة براتنجات الايبوكسي في فرن على درجة حرارة 60 درجة مئوية للسماح للراتنج بالبلمرة بالكامل قبل التخلص منها. يمكن مسح الملقط والعناصر الأخرى بالإيثانول مسبقا.
    4. اغمر طرف أنبوب التفاعل المغلق في النيتروجين السائل لمدة 10 ثوان تقريبا. بعد ذلك ، قم بإزالة كتلة الراتنج من أنبوب التفاعل عن طريق ضرب أنبوب التفاعل على الطاولة. ينفصل قرص الياقوت بسهولة عن طبقة الكربون التي تبقى أعلى الخلايا المدمجة.
      ملاحظة: تأكد من أن وسيط التضمين الخاص بك يتحمل التغيرات في درجات الحرارة الناتجة عن معالجة النيتروجين السائل.
  4. تحضير أقسام التصوير المقطعي STEM
    1. قم بإعداد أقسام أكثر سمكا من المقاطع فائقة النحافة لتصوير TEM ، عادة بين 800 نانومتر و 1 ميكرومتر.
      ملاحظة: يختلف تحضير أقسام التصوير المقطعي STEM اختلافا طفيفا عن الصغر الفائق الصغر التقليدي. للحصول على بروتوكول مفصل يصف إعداد أقسام التصوير المقطعي STEM ، راجع Walther et al.15 و Villinger et al.10.
      قبل المتابعة في إعداد أقسام التصوير المقطعي STEM ، تأكد من أن جودة الخلايا جيدة. لهذا ، قم بإجراء تقسيم رفيع للغاية (~ 70 نانومتر) وتحليل TEM (الشكل 3D ، E).
    2. اجمع الأقسام على شبكات نحاسية متوازية الشريط ، بحيث لا توجد أشرطة شبكية تحجب شعاع الإلكترون عند إمالة العينة إلى زوايا عالية. للحصول على مرفق أفضل للقسم ، عالج الشبكات باستخدام 0.01٪ بولي L-lysine: قم بإعداد كمية صغيرة من 0.01٪ بولي L-lysine من محلول مخزون 0.1٪ ، واغمس الشبكات في الاقتباس ، وجففها بعناية عن طريق سحب حافة الشبكة فوق ورق ترشيح. قم بتفريغ الشبكات المتوهجة واستخدامها لجمع الأقسام.
    3. عالج الأقسام بالذهب الغروي كعلامات ائتمانية لمحاذاة سلسلة الإمالة (انظر القسم 3).
    4. ضع طبقة كربونية على الأقسام لتثبيتها وجعلها أكثر توصيلا.

figure-protocol-2
الشكل 3: مراقبة الجودة من خلال المظاهر المختلفة للخلايا TEM بعد التضمين والتشذيب والتقسيم الرقيق. (أ) الخلايا المضمنة في راتنجات الايبوكسي بعد إزالة SD. تظل طبقة الكربون ذات الحرف "2" المخدوش على الخلايا المضمنة بالراتنج وهي مرئية بوضوح. يتم توزيع الخلايا شبه الشفافة بالتساوي عبر وجه الكتلة. (ب) وجه كتلة مشذب قبل الصغر المصغر. لا يزال جزء من 2 المخدوش مرئيا على سطح كتلة الراتنج. (ج) أقسام بسمك 70 نانومتر مثبتة على شبكة TEM. (د) نظرة عامة على TEM لقسم واحد كامل فائق النحافة. لاحظ الثقوب الموجودة في القسم (رؤوس الأسهم البيضاء) الناتجة عن تسلل الراتنج غير المكتمل وهي قطعة أثرية شائعة. (ه) عرض مكبر لخلية محددة مميزة بمستطيل أبيض في (D). على غرار (D) ، يظهر التضمين غير المكتمل في غشاء البلازما (رؤوس الأسهم البيضاء) ؛ ومع ذلك ، فإن بقية الخلية تظهر الحفاظ والتضمين الجيد. أشرطة المقياس = 100 ميكرومتر (D) ، 10 ميكرومتر (E). الاختصارات: SD = قرص الياقوت. TEM = الفحص المجهري الإلكتروني للإرسال. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

3. التصوير

  1. اقتناء سلسلة إمالة STEM
    1. قم بإعداد المجهر وفقا لإرشادات الشركة المصنعة. تأكد من محاذاة الشعاع المناسبة.
    2. املأ ديوار النيتروجين السائل بعناية في المجهر.
    3. حدد حامل التصوير المقطعي الصحيح في برنامج تشغيل المجهر.
    4. أدخل الشبكة في الحامل. انتبه إلى أن أشرطة الشبكة موجهة بشكل عمودي على محور الإمالة لمنع القضبان من حجب شعاع الإلكترون بزوايا إمالة عالية.
    5. أدخل الحامل في المجهر.
    6. قم بمحاذاة الحزمة عن طريق تنفيذ الخطوات التالية:
      1. قم بتحميل ملف المحاذاة المقدم من الشركة المصنعة. افتح صمام الشعاع واعمل في وضع TEM في الوقت الحالي. اضبط تكبيرا بمقدار 20,000 ضعف تقريبا واضبط التركيز البؤري القياسي بالضغط على STD Focus.
      2. ابحث عن ثقب في العينة. يكون هذا أسهل في وضع التكبير المنخفض (اضغط على LowMag).
      3. تأكد من عدم إدخال فتحة العدسة. اضبط حجم البقعة على 1 وألفا على 3. قم بتقليل الشعاع على شاشة العرض عن طريق تدوير زر السطوع عكس اتجاه عقارب الساعة وتوسيطه باستخدام أزرار إزاحة الحزمة.
      4. محاذاة البندقية الصحيحة: في لوحة المحاذاة الخاصة ببرنامج تشغيل المجهر، حدد Gun و Anod wobbler. اضبط تناسق الشعاع باستخدام أزرار DEF / STIG . تأكد من أن حركة الشعاع على شاشة الفلورسنت متجانسة. انقل النقطة الأكثر سطوعا إلى منتصف الشاشة باستخدام أزرار SHIFT ؛ قم بإلغاء تحديد الكل عند الانتهاء.
      5. تصحيح المنضمات المكثفة: في نفس لوحة المحاذاة ، حدد CLA و HT wobbler. اضبط باستخدام أزرار DEF / STIG لتحقيق حركة متجانسة.
      6. ضبط فتحة عدسة المكثف: قم بزيادة الشعاع على شاشة الفلورسنت إلى الحد الأقصى عن طريق تدوير زر السطوع في اتجاه عقارب الساعة. أدخل أصغر فتحة عدسة مكثف وتأكد من محاذاتها في الشعاع بشكل صحيح عن طريق تبديل السطوع. إذا كان الشعاع يتحرك بشكل غير متماثل على شاشة العرض، فاضبط فتحة العدسة يدويا باستخدام محركات الفتحة اليدوية. إذا بدت الفتحة مشوهة على شاشة الفلورسنت، فقم بتصحيح المدنات المكثفة CLA مرة أخرى باستخدام DEF/STIG (الخطوة السابقة 3.1.6.5).
      7. قم بالتبديل إلى وضع STEM (حدد ASID).
        ملاحظة: يمكنك مقاطعة حوار استرخاء العدسة بعد 5-10 ثوان.
      8. انقل المرحلة إلى منطقة رفيعة وغنية بالتباين من العينة. اضغط على STD Focus وقم بإزالة جميع فتحات العدس. قم بالتغيير إلى تكبير 25,000 بحجم موضعي 1.5 نانومتر، واضبط طول الكاميرا بين 80 و120 سم، وحدد الوضع الموضعي.
      9. قم بتغيير القيمة z لمقياس الزوايا حتى يصبح الفتحة الرونشيمية مرئية على شاشة العرض. قم بتغيير طول الكاميرا إذا كان الرمام القصبي باهتا. إذا لم تكن مستديرة ، فاستخدم زر COND Stig لضبطها.
      10. أدخل أصغر فتحة عدسة مكثف. استخدم محركات الفتحة اليدوية لتوسيط فتحة العدسة حول الفتحة الهوائية.
    7. أدخل الكاشف المناسب. بناء على سؤال البحث ، استخدم كاشف المجال الساطع و / أو كاشف المجال المظلم. قم بتنشيط وضع المسح واحصل على صورة اختبار أولى للعينة.
    8. حدد تكبير أكبر من التكبير المطلوب للتصوير المقطعي (أعلى من 800,000x). التركيز الصحيح والاستجماتيزم: قم بذلك بالقرب من منطقة الاهتمام (ROI) ولكن ليس مباشرة لمنع تلف الحزمة لمناطق العينة الحرجة.
      ملاحظة: يمكن للعلامات الائتمانية الذهبية أن تجعل هذه الخطوة أسهل.
    9. اضبط الارتفاع المركزي لضمان بقاء عائد الاستثمار متمركزا على نطاق الإمالة بأكمله (أي -72 درجة إلى 72 درجة). حدد ميزة بالقرب من عائد الاستثمار ، وقم بإحضارها إلى المركز ، والتركيز ، وتصحيح الاستجماتيزم ، وإمالة المرحلة خطوة إلى - 72 درجة. اضبط موضع z للحامل للحفاظ على الميزة في المنتصف وضبط التباين والسطوع إذا لزم الأمر. إذا لزم الأمر ، كرر ذلك عن طريق الإمالة خطوة بخطوة إلى +72 درجة.
    10. اختر مجال الرؤية من خلال الانتقال مرة أخرى إلى عائد الاستثمار والتركيز والحصول على صورة نظرة عامة (الشكل 4). اضبط التكبير المطلوب للحصول على سلسلة الإمالة.
    11. قم بإعداد الحصول على سلسلة الإمالة التلقائية للصور من -72 درجة إلى +72 درجة والصورة كل 1.5 درجة.
    12. لمواجهة التأثيرات الميكانيكية التي تحدث عند تبديل اتجاه إمالة المسرح ، ابدأ سلسلة الإمالة بزاوية أكبر من تلك التي لبدء التصوير بها. إذا كنت التصوير من -72 درجة إلى 72 درجة ، فابدأ بإمالة المسرح من 0 درجة إلى -74 درجة ثم ابدأ الحصول على الصورة في الطريق إلى + 72 درجة ، والحصول على الصورة الأولى عند -72 درجة.
    13. ابدأ الاستحواذ التلقائي على سلسلة الإمالة. تأكد من تمكين التركيز الديناميكي في برنامج الاستحواذ.
      ملاحظة: إذا تم إنهاء اكتساب سلسلة الإمالة قبل الأوان ، فقم بتصحيح الارتفاع المركزي. خاصة عند التكبير العالي ، يمكن أن يتسبب ذلك في حدوث مشكلات في اكتساب سلسلة الإمالة الآلي بسبب ترحيل عائد الاستثمار خارج مجال الرؤية.
      البرنامج الشائع الاستخدام للتصوير المقطعي STEM و TEM هو SerialEM. نشر Kirchweger et al.20 بروتوكول فيديو للتصوير المقطعي Cryo-STEM باستخدام SerialEM ، والذي يمكن تكييفه بسهولة مع التصوير المقطعي STEM بدرجة حرارة الغرفة.

figure-protocol-3
الشكل 4: اقتناء سلسلة الإمالة. (أ) 200 كيلو فولت STEM. (ب) نظرة عامة على STEM لخلية مجمدة عالية الضغط ومستبدلة بالتجميد مدمجة في راتنجات الايبوكسي. تم الحصول على سلسلة الإمالة الموضحة في (C-E) في الموضع المميز بالمستطيل الأبيض. (C-E) صور مختارة لسلسلة إمالة تم الحصول عليها من -72 درجة إلى +72 درجة. تستخدم الإيمدادات الذهبية على جانبي القسم لإعادة بناء المخطط المقطعي الحسابي. لا يمكن استخدام الإيماءات العنقودية مثل تلك المميزة بعلامات الحذف البيضاء لإعادة بناء التصوير المقطعي ولكن يمكن التعرف عليها جيدا في زوايا الميل العالية. هذه الهياكل أو الهياكل المماثلة خارج المنطقة ذات الأهمية مفيدة لتحديد الارتفاع eucenter. شريط المقياس = 1 ميكرومتر (ب). الاختصار: STEM = الفحص المجهري الإلكتروني للنقل. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

4. إعادة بناء التصوير المقطعي والتجزئة

  1. قم بإجراء إعادة بناء التصوير المقطعي (على سبيل المثال ، باستخدام برنامج Etomo لحزمة برامج IMOD23).
    1. قم بإجراء المحاذاة الأولى لسلسلة الإمالة وأعد بناء التصوير المقطعي باستخدام الإسقاط الخلفي المرجح.
      ملاحظة: يمكن العثور على بروتوكول مفصل على موقع IMOD الإلكتروني: دليل التصوير المقطعي IMOD (https://bio3d.colorado.edu/imod/doc/tomoguide.html). لمعالجة الصور التي تم الحصول عليها باستخدام كاشف المجال المظلم ، راجع العمل المنشورسابقا 11،13.
  2. تقسيم الهياكل الخلوية (على سبيل المثال ، باستخدام برامج مثل 3DMOD من حزمة IMOD أو الحلول القائمة على الذكاء الاصطناعي).

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يوفر التصوير المقطعي STEM إمكانية تصوير أقسام أكثر سمكا من التصوير المقطعي TEM بدقة متناحية، وبالمقارنة مع التصوير المقطعي FIB-SEM - يوفر سير عمل تصوير موفر للوقت نسبيا. في علم الفيروسات ، هذا مفيد بشكل خاص لأنه يسمح بتصوير عدد كبير من ميزات البنية التحتية للتحليل الإحصائي ثلاثي الأبعاد ، أو عند البحث عن أحداث نادرة. هنا ، نعرض نتيجتين تمثيليتين توضحان كيف يمكن استخدام التصوير المقطعي STEM فيما يتعلق بهذين الجانبين.

تصور فيريونات VSV المؤتلفة الناشئة

هناك مجموعة متنوعة من الفيروسات التي تشكل جزيئات بأشكال وأحجام مختلفة. لتحليل شكل الفيروسات في تعليق الفيروس ، غالبا ما تكون طريقة بسيطة مثل البقعة السلبية TEM كافية. يعد توصيف مورفولوجيا الفيروسات في السياق الخلوي أكثر صعوبة. هذا ينطبق بشكل خاص على الفيروسات التي تشكل جزيئات ذات مورفولوجيا متباينة الخواص ، مثل rhabdoviridae. VSV هو فيروس ربدو يشكل فيروسات على شكل رصاصة يبلغ طولها ~ 180 نانومتر. في الخلايا المعلقة ، يتم توجيه الفيروسات بشكل عشوائي ، مما يجعل من الصعب دائما تمييز شكل الرصاصة في الصور ثنائية الأبعاد (الشكل 5A-C). لتحديد شكل الرصاصة بشكل صحيح لجميع فيريونات VSV المؤتلفة في العينة ، هناك حاجة إلى طريقة ثلاثية الأبعاد ذات دقة متناحية-طريقة يمكنها أيضا توفير معلومات حجمية على مساحة عينة كبيرة بما فيه الكفاية. يمكن أن يتضمن التصوير المقطعي STEM العديد من الفيروسات الكاملة في مجموعة بيانات واحدة (الشكل 5D ، E). وبالتالي ، من الممكن تصوير عدد كبير من الفيروسات للتحليل الإحصائي ، حتى لو تم الحصول على مخطط مقطعي واحد فقط لكل خلية. بالمقارنة ، فإن التصوير المقطعي TEM لقسم بسمك 200 نانومتر لن يلتقط سوى عدد قليل من فيريونات VSV المؤتلفة الكاملة (كما هو موضح في الشكل 5E).

figure-results-1
الشكل 5: التصوير المقطعي STEM لمواقع تبرعم VSV المؤتلفة. (A-C) تظهر التفاصيل من قسم افتراضي من التصوير المقطعي STEM الذي تم الحصول عليه من قسم بسمك 800 نانومتر أن شكل الرصاصة لا يكون مرئيا دائما بسبب الاتجاهات المختلفة (A ، B) للفيريونات. (ج) فقط الفيروسات الموجهة بالتوازي مع مستوى الرؤية الموجودة كرصاصات محددة جيدا. (د) تشبه المواقع الناشئة لVSV المؤتلف مجموعات كبيرة من الفيروسات بدون اتجاه مفضل. (ه) يوضح المنظر الجانبي للتصوير المقطعي القدرة على التقاط العديد من فيريونات VSV المؤتلفة الكاملة في قسم واحد باستخدام التصوير المقطعي STEM. يبلغ سمك مكدس الصور الظاهري حوالي 600 نانومتر في هذا الموضع. تمثل الخطوط المتقطعة السماكة التقريبية لقسم التصوير المقطعي TEM (200 نانومتر) ، حيث سيتم تضمين عدد قليل فقط من الفيروسات الكاملة على شكل رصاصة. شريط المقياس = 500 نانومتر (D). الاختصارات: STEM = الفحص المجهري الإلكتروني للنقل الماسح. VSV = فيروس التهاب الفم الحويصلي. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

تحلل الألياف النانوية للببتيد EF-C

في سياق العلاج الجيني ، أصبحت ألياف الببتيد النانوية المعززة للنقل موضوعا مثيرا للاهتمام. في دراسة نشرتمؤخرا 24 ، تم استخدام التصوير المترابط باستخدام تصوير نقل طاقة الرنين Foerster (FRET) والتصوير المقطعي STEM (FRET-3D-CLEM) للتحقيق في امتصاص وتفكيك الألياف النانوية لببتيد EF-C. كفاءات FRET عالية ، تتوافق مع أزواج FRET القريبة من بعضها البعض ، تنبعث منها مضان أحمر يتوافق مع الألياف المجمعة. تنبعث من كفاءات FRET المنخفضة ، المقابلة لأزواج FRET البعيدة عن بعضها البعض ، مضان أخضر ، يمثل ألياف مفككة. تظهر كلتا الإشارتين في الخلايا عندما تكون في طور امتصاص وتحلل الألياف النانوية لببتيد EF-C. تظهر المناطق التي توجد فيها كفاءات FRET عالية ومنخفضة باللون الأصفر (الشكل 6 أ).

figure-results-2
الشكل 6: تصوير تحلل الألياف النانوية لببتيد EF-C عن طريق التصوير المتوافق FRET والتصوير المقطعي STEM (FRET-3D-CLEM). (أ) الفحص المجهري متحد البؤر لخلية محتضنة بألياف EF-C النانوية التي تم تصنيفها بزوج FRET. تتوافق الإشارات الخضراء مع الألياف المفترضة المفككة. الأحمر يتوافق مع الألياف السليمة المفترضة. يتوافق اللون الأصفر مع المناطق التي يتم فيها اكتشاف خليط من الإشارة الحمراء والخضراء. نواة نو. (ب) نظرة عامة على STEM لقسم بسمك 800 نانومتر من نفس الخلية. (ج) يشار إلى موضع التصوير المقطعي. الصورة عبارة عن مركب من صورتين تم الحصول عليهما في أقسام مختلفة ، لأن الخلية تم حظرها جزئيا بواسطة شبكة الشريط في أحد الأقسام. تم تصنيف النواة ب Nu في A و B و C. (ج) القسم الافتراضي من التصوير المقطعي. تشير رؤوس الأسهم الحمراء إلى المناطق المتداخلة مع إشارات التألق الأحمر. يؤكد التصوير المقطعي STEM وجود ألياف سليمة. يشير رأس السهم الأخضر إلى منطقة بها ألياف مفككة. (د) تجزئة التصوير المقطعي. يقوم الشريط الخلوي بالضغط على غشاء الحويصلة (السهم الأبيض). الحجم الكبير الذي يمكن فحصه باستخدام التصوير المقطعي STEM (هنا تقريبا: 7 ميكرومتر × 7 ميكرومتر × 550 نانومتر) يجعل من السهل ملاحظة مثل هذا الحدث النادر. (ه) الأقسام الافتراضية 19 و 24 و 29 من التصوير المقطعي. بحجم بكسل 6.8 نانومتر ، تفصل بين الأقسام 27.2 نانومتر. تم استنساخ الشكل من البيانات التي نشرها Rauch-Wirth et al.24 . أشرطة المقياس = 5 ميكرومتر (A) ، 1 ميكرومتر (C). الاختصارات: STEM = الفحص المجهري الإلكتروني للنقل الماسح. FRET = نقل طاقة الرنين Foerster. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

تم إجراء التصور من خلال هذا النهج المترابط لتأكيد أن ألياف EF-C تمتصها الخلية وتتحلل لاحقا. يتيح لنا الفحص المجهري الضوئي اختيار خلايا للفحص المجهري الإلكتروني التي توفر إشارات حمراء وخضراء ، لمقارنة المظهر فوق الهيكلي المرتبط بإشارات التألق المختلفة. تظهر الصور المقطعية STEM من نفس الخلية أن الإشارة الحمراء يمكن أن تنشأ إما من الألياف التي لا تزال خارج الخلية أو يبدو أنها داخلية حديثا بواسطة كثرة الخلايا الكبيرة (الشكل 6 ج). علاوة على ذلك ، تحقق CLEM من أن الإشارة الخضراء نشأت بالفعل من الألياف المتدهورة (الشكل 6 ب ، ج والتي يمكن العثور عليها في الجسيمات الحالة (الشكل 6 ج ، أكبر حويصلة). نظرا للحجم الكبير الذي يمكن الوصول إليه عن طريق التصوير المقطعي STEM والتصور ثلاثي الأبعاد للهياكل ، فمن الأسهل ربط الإشارة من الفحص المجهري الضوئي بميزات البنية التحتية وتفسيرها. علاوة على ذلك ، يمكن اكتشاف الأحداث النادرة ، مثل قرص الصخرة الخيطية داخل الليزوزوم (الشكل 6D ، E ، السهم الأبيض) باستخدام هذا النهج.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يوفر التصوير المقطعي STEM دقة مماثلة للتصوير المقطعي TEM جنبا إلى جنب مع القدرة على فحص الأحجام التي يصل سمكها إلى 1 ميكرومتر. لذلك نعتبره مثاليا لتصوير التغييرات التي يسببها الفيروس في الهياكل داخل الخلايا ، مثل إعادة تشكيل الغشاء4،6،25 ، أو تبرعم الفيروسات7 ، أو الالتقام الخلوي5. اعتمادا على سؤال البحث ، يمكن النظر في تقنيات VolumeEM الأخرى. للحصول على تقنية توفر مجال رؤية أكبر بدقة مماثلة ، نوصي بالتصوير المقطعي FIB-SEM. سيكون التصوير المقطعي FIB-SEM أبطأ من التصوير المقطعي STEM عند تصوير حجم مماثل بدقة مماثلة ، حيث يزداد وقت التصوير عندما تزداد الدقة. في كثير من الأحيان ، يتم قياس ذلك بعد ذلك عن طريق تصوير مجالات رؤية أصغر. علاوة على ذلك ، فإن دقة z البالغة 6.8 نانومتر (الشكل 6) ستكون صعبة من الناحية الفنية مع طحن الحزمة الأيونية. لذلك ، يعد FIB-SEM مثاليا لتصوير الهياكل الأكبر مثل الخلايا الكاملة والأنسجة9،10،26،27 ، وإن كان ذلك عادة بأحجام بكسل (متناحية) لعدة عشرات من النانومتر. علاوة على ذلك ، لا تظهر الصور المقطعية FIB-SEM أي تأثيرات "إسفين مفقودة" ، وهو أمر نموذجي للصور المقطعية المعاد بناؤها من سلسلة الإمالة. علاوة على ذلك ، مع تطوير آلات البلازما FIB ، يتم حاليا إدخال البدائل التي توفر طحنا أسرع ولا تزال دقيقة إلى هذا المجال.

إذا لم تكن الدقة العالية في z حاسمة ، فيمكن أن يكون تصوير TEM أو SEM للمقاطع التسلسلية بديلا يسمح بالتحقيق في مجال رؤية كبير جدا في وقتقصير 28،29 ، ومع ذلك ، عادة بدقة متباينة الخواص. في التصوير المقطعي TEM ، يمكن دمج الصور المقطعية المختلفة من المقاطع السميكة التسلسلية30،31. الشيء نفسه ممكن في التصوير المقطعي STEM. ومع ذلك ، نظرا لسمك الأقسام التي يمكن فحصها ، هناك حاجة أقل للجمع بين عدد من الصور المقطعية. في علم الفيروسات ، غالبا ما يستخدم التصوير المقطعي TEM لتوصيف إعادة تشكيل الغشاء الناجم عن الفيروس32،33،34،35. في حين أن التصوير المقطعي TEM نفسه يوفر رؤى قيمة في دورة النسخ المتماثل للفيروسات ، فإن معظم حالات الاستخدام ستستفيد من قدرة التصوير المقطعي STEM على تصوير أحجام أكثر سمكا. ينطبق هذا بشكل خاص على الفيروسات ذات التشكل متباين الخواص ، مثل rhabdoviridae ، حيث يمكن للتصوير المقطعي TEM التقاط عدد قليل من الفيروسات الكاملة في مخطط مقطعيواحد 35 أو لتصوير العديد من الفيروسات المغلفة في حجرة النسخ المتماثل بحجم مركب التجميع الفيروسي السيتوبلازمي (cVAC) للفيروس المضخم للخلايا البشرية (HCMV) 4.

يوفر التصوير المقطعي STEM في ظل الظروف المبردة مزيدا من الأفكار الوظيفية19 ويتوفر بروتوكول الفيديو20. يختلف بروتوكولنا في سير عمل تحضير العينة ، والذي ، بدلا من الحفاظ على العينة في الحالة الأصلية ، يوفر الحفاظ على البنية التحتية شبه الأصلية. في حين أن التصوير المقطعي STEM للعينات المجمدة عالية الضغط والاستبدال بالتجميد لا يمكنه تحقيق الحفاظ على البنية التحتية والدقة الذرية التي شوهدت في EM المبردة ، إلا أنها تستفيد من مزايا المعدات الأبسط والعينات الأكثر استقرارا والإنتاجية الأعلى.

الخطوات التالية ضرورية لنجاح الطريقة:

أولا ، هدف واضح لتجربة التصوير. نظرا لطبيعة هذه التقنية كثيفة العمالة ، هناك حاجة إلى تجربة جيدة التخطيط بهدف واضح للتصوير. يجب إنشاء معرفة مفصلة بالنظام النموذجي - خط الخلية والفيروسات - مسبقا باستخدام طرق أخرى أقل صعوبة في التنفيذ. لذلك ، نشجع تحسين معدلات العدوى في التجارب المسبقة القائمة على الفحص المجهري الضوئي وتعديل الظروف التجريبية لتناسب النظام البيولوجي. تتضمن معلمات التحسين عدد الخلايا وتعدد العدوى (MOI) والنقاط الزمنية بناء على الفيروس والحدث المراد تصويره. سيضمن ذلك نسبة عالية من الخلايا ذات القيمة في العينة.

ثانيا ، تحضير عينة عالية الجودة. نؤكد على أهمية جودة إعداد العينة. في الوقت الحاضر ، نعتبر التزجيج عن طريق التجميد بالضغط العالي هو المعيار الذهبي للعينات السميكة مثل الخلايا. يعد استبدال التجميد والتضمين والتصوير اللاحق في درجة حرارة الغرفة طريقة قوية للحصول على نتائج عالية الجودة عند دمجها مع التصوير المقطعي STEM. لذلك ، فإن إنشاء روتين مستقر لإعداد العينة أمر بالغ الأهمية. لهذا ، نود أن نسلط الضوء على الأدبيات حول التجميد عالي الضغط14،21. إذا كان سيتم استخدام محلول بديل للتجميد أقل سمية ، فإننا نوصي باستخدام برمنجنات البوتاسيوم كبديل لرابع أكسيد الأوزميوم ، كما هو موضح من قبل Schauflinger et al.36.

أخيرا ، يجب إنشاء سير عمل سلس للحصول على سلسلة الإمالة ، بما في ذلك المجهر المحاذاة جيدا ، وفقا لتعليمات المستخدم الخاصة ب STEM وسيختلف من مجهر إلى مجهر. يعتمد إنشاء سير عمل سلس أيضا على منشئ المسح وبرنامج الحصول على الصور.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

JGW و RH و EP و JSR و MD هم موظفون في Boehringer Ingelheim Pharma GmbH & Co.KG ، وهي شركة أدوية مهتمة بتطوير وإنتاج المنتجات القائمة على الفيروسات. لم يكن لهذا أي تأثير على تصميم الورقة. لذلك، لا نبلغ عن أي تضارب في المصالح.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هذا المنشور جزء من استراتيجية تكنولوجيا التنمية العالمية وتم دعمه من قبل إدارة التكنولوجيا العالمية في Boehringer Ingelheim Development CMC Biologicals. نشكر رينات كونز وجانا أبولوني على المساعدة الفنية الممتازة والمناقشة المفيدة فيما يتعلق بإعداد العينة. نشكر Reinhard Weih على المساعدة الممتازة في المشكلات الفنية والمتعلقة بصيانة الجهاز. نشكر Torsten Friedrich على المناقشة المفيدة والمساعدة في إعداد المجهر. تلقى عمل كلاريسا ريد وجوليا لاروش ويان مونش تمويلا من منحة مركز البحوث التعاونية التابع لمؤسسة الأبحاث الألمانية (SFB1279).

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
1-هيكساديسينميرك KGaA8220640500
شبكة نحاسية 200 مع قضبان متوازيةبلانو GmbHG2014C
37 & درجة؛ غرفة تجفيف Cشركة بيندر GmbH9010-0323
الأسيتونشركة VWR الدولية GmbH20066330
DDSAعلوم المجهر الإلكتروني13710
سكين الماسشركة دياتوم المحدودةhttps://www.diatomeknives.com/ultra-35
DMP-30علوم المجهر الإلكتروني13600
راتنج مدمج-812علوم المجهر الإلكتروني14900
أدوات EMTVIPS GmbHبرنامج TVIPS: EM-Tools؛ https://www.tvips.com/imaging-software/em-tools/
الإيثانول 100٪ميرك KGaA1.00983.2511
ورق الفلترشركة VWR الدولية GmbH516-0812
Flaschen mit Schnappdeckelglas 11 mLشركة VWR الدولية GmbH548-0625
فورمفارعلوم المجهر الإلكتروني15830-25
وحدة الاستبدال بالتجميد Leica EM AFS2شركة لايكا مايكروسيستمز GmbHhttps://www.leica-microsystems.com/products/sample-preparation-for-electron-microscopy/p/leica-em-afs2/
غلود سول 25 نانومتركواشف وذهب أوريون إيمينو الإكسسوارات425.011
حفرة صنوبر ذهبية وأوسلاش؛ 2000 و... mخدمات العلوم GmbHGA2000-Au
Graiticules Buchstaben-Netzchen Kupferبلانو GmbHNH6C
لوحة تسخينMEDAX GmbH و السرية KG12501
نظام التبخير عالي الفراغ BAF 300شركة بال-تيك
فريزر عالي الضغط وولويند HPF كومباكت 01مكتب الهندسة M. Wohlwend GmbHhttps://www.wohlwend-hpf.ch/index.html
خزان النيتروجين السائلH.Erben GmbH94500
النيتروجين (سائل)شركة VWR الدولية GmbH-
NMAعلوم المجهر الإلكتروني19000
رباعي أكسيد الأوزميومChemPur Feinchemikalien und Forschungsbedarf GmbH006051
الفرن 120 ودرجة مئوية؛ Cشركة بيندر GmbH9010-0194
PELCO easi-Glowشركة تيد بيلا، إنك.91000
بولي-إل-ليسين 0.1٪ مع الميكروفون الأكوادي. الحلشركة تيد بيلا، إنك.18026
أنابيب القفل الآمن 0.5 ملإبندورف جنوب شرق0030 121.023
حاويات العينات (كبسولات بيم)بلانو GmbHG360-1
قطر قرص الياقوت. 3 × 0.16 مممكتب الهندسة M. Wohlwend GmbH500
لايكا EM UC7 من ألترا ميكروتومشركة لايكا مايكروسيستمز GmbHhttps://www.leica-microsystems.com/de/produkte/em-probenvorbereitung/p/leica-em-uc7/
أسيتات يورانيلريدل دي ها&إيمل; ن AG31697
غرفة ضوء الأشعة فوق البنفسجيةالدنيزELG100S

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Laue, M. Chapter 1 electron microscopy of viruses. Methods Cell Biol. 96, 1-20 (2010).
  2. Goldsmith, C. S., et al. Cell culture and electron microscopy for identifying viruses in diseases of unknown cause. Emerg Infect Dis. 19 (6), 864-869 (2013).
  3. Guo, F. Application of electron microscopy in virus diagnosis and advanced therapeutic approaches. J Histotechnol. 47 (1), 1-4 (2024).
  4. Schauflinger, M., Villinger, C., Mertens, T., Walther, P., von Einem, J. Analysis of human cytomegalovirus secondary envelopment by advanced electron microscopy. Cell Microbiol. 15 (2), 305-314 (2013).
  5. Abdellatif, M. E. A., Sinzger, C., Walther, P. Investigating HCMV entry into host cells by STEM tomography. J Struct Biol. 204 (3), 406-419 (2018).
  6. Wieland, J., Frey, S., Rupp, U., Essbauer, S., Groß, R. Zika virus replication in glioblastoma cells: electron microscopic tomography shows 3D arrangement of endoplasmic reticulum, replication organelles, and viral ribonucleoproteins. Histochem Cell Biol. 156 (6), 527-538 (2021).
  7. Bergner, T., Zech, F., Hirschenberger, M., Stenger, S., Sparrer, K. M. J. Near-native visualization of SARS-CoV-2 induced membrane remodeling and virion morphogenesis. Viruses. 14 (12), 2786(2022).
  8. Romero-Brey, I., Bartenschlager, R. Viral infection at high magnification: 3D electron microscopy methods to analyze the architecture of infected cells. Viruses. 7 (12), 6316-6345 (2015).
  9. Baena, V., Conrad, R., Friday, P., Fitzgerald, E., Kim, T. FIB-SEM as a volume electron microscopy approach to study cellular architectures in SARS-CoV-2 and other viral infections: a practical primer for a virologist. Viruses. 13 (4), 611(2021).
  10. Villinger, C., Schauflinger, M., Gregorius, H., Kranz, C., Höhn, K. Electron microscopy, methods and protocols. Methods Mol Biol. 1117, 617-638 (2013).
  11. Hohmann-Marriott, M. F., Sousa, A. A., Azari, A., Glushakova, S., Zhang, G. Nanoscale 3D cellular imaging by axial scanning transmission electron tomography. Nat Methods. 6 (10), 729-731 (2009).
  12. Walther, P., Bauer, A., Wenske, N., Catanese, A., Garrido, D. STEM tomography of high-pressure frozen and freeze-substituted cells: a comparison of image stacks obtained at 200 kV or 300 kV. Histochem Cell Biol. 150 (5), 545-556 (2018).
  13. Rachel, R., Walther, P., Maaßen, C., Daberkow, I., Matsuoka, M. Dual-axis STEM tomography at 200 kV: setup, performance, limitations. J Struct Biol. 211 (3), 107551(2020).
  14. Mielanczyk, L., Matysiak, N., Michalski, M., Buldak, R., Wojnicz, R. Closer to the native state. Critical evaluation of cryo-techniques for transmission electron microscopy: preparation of biological samples. Folia Histochem Cytobiol. 52 (1), 1-17 (2014).
  15. Walther, P., Schmid, E., Höhn, K. Cell imaging techniques, methods and protocols. Methods Mol Biol. 931, 525-535 (2012).
  16. Steyer, A. M., Ruhwedel, T., Möbius, W. Biological sample preparation by high-pressure freezing, microwave-assisted contrast enhancement, and minimal resin embedding for volume imaging. J Vis Exp. (145), e59156(2019).
  17. Read, C., Walther, P., von Einem, J. Human cytomegaloviruses, methods and protocols. Methods Mol Biol. 2244, 265-289 (2021).
  18. Romero-Brey, I. Influenza virus, methods and protocols. Methods Mol Biol. 1836, 213-236 (2018).
  19. Elbaum, M., Seifer, S., Houben, L., Wolf, S. G., Rez, P. Toward compositional contrast by cryo-STEM. Acc Chem Res. 54 (19), 3621-3631 (2021).
  20. Kirchweger, P., Mullick, D., Wolf, S. G., Elbaum, M. Visualization of organelles in situ by cryo-STEM tomography. J Vis Exp. (196), (2023).
  21. McDonald, K., et al. Chapter 28 "tips and tricks" for high-pressure freezing of model systems. Methods Cell Biol. 96, 671-693 (2010).
  22. Sosinsky, G. E., Crum, J., Jones, Y. Z., Lanman, J., Smarr, B. The combination of chemical fixation procedures with high-pressure freezing and freeze substitution preserves highly labile tissue ultrastructure for electron tomography applications. J Struct Biol. 161 (3), 359-371 (2008).
  23. Kremer, J. R., Mastronarde, D. N., McIntosh, J. R. Computer visualization of three-dimensional image data using IMOD. J Struct Biol. 116 (1), 71-76 (1996).
  24. Rauch-Wirth, L., Schuetz, D., Groß, R., Rode, S., Glocker, B. Transduction enhancing EF-C peptide nanofibrils are endocytosed by macropinocytosis and subsequently degraded. Biomaterials. , 317(2025).
  25. Tonnemacher, S., Folly-Klan, M., Gazi, A. D., Schaefer, S., Pénard, E. Vaccinia virus H7-protein is required for the organization of the viral scaffold protein into hexamers. Sci Rep. 12 (1), 13007(2022).
  26. Villinger, C., Gregorius, H., Kranz, C., Hoehn, K., Münzberg, C. FIB/SEM tomography with TEM-like resolution for 3D imaging of high-pressure frozen cells. Histochem Cell Biol. 138 (4), 549-556 (2012).
  27. Hackstadt, T., Chiramel, A. I., Hoyt, F. H., Williamson, B. N., Dooley, C. A. Disruption of the Golgi apparatus and contribution of the endoplasmic reticulum to the SARS-CoV-2 replication complex. Viruses. 13 (9), 1798(2021).
  28. Horstmann, H., Körber, C., Sätzler, K., Aydin, D., Kuner, T. Serial section scanning electron microscopy (S3EM) on silicon wafers for ultra-structural volume imaging of cells and tissues. PLoS ONE. 7 (4), e35172(2012).
  29. Lewczuk, B., Szyryńska, N. Field-emission scanning electron microscope as a tool for large-area and large-volume ultrastructural studies. Animals. 11 (12), 3390(2021).
  30. Höög, J. L., Schwartz, C., Noon, A. T., O'Toole, E. T., Mastronarde, D. N. Organization of interphase microtubules in fission yeast analyzed by electron tomography. Dev Cell. 12 (3), 349-361 (2007).
  31. Jiang, Y., Lin, H., Fu, C. 3D mitochondrial ultrastructure of Drosophila indirect flight muscle revealed by serial-section electron tomography. J Vis Exp. (130), e56567(2017).
  32. Snijder, E. J., Limpens, R. W. A. L., de Wilde, A. H., de Jong, A. W. M., Zevenhoven-Dobbe, J. C. A unifying structural and functional model of the coronavirus replication organelle: tracking down RNA synthesis. PloS Biol. 18 (6), e3000715(2020).
  33. Welsch, S., Miller, S., Romero-Brey, I., Merz, A., Bleck, C. K. E. Composition and three-dimensional architecture of the dengue virus replication and assembly sites. Cell Host Microbe. 5 (4), 365-375 (2009).
  34. Cortese, M., Goellner, S., Acosta, E. G., Neufeldt, C. J. Ultrastructural characterization of Zika virus replication factories. Cell Rep. 18 (9), 2113-2123 (2017).
  35. Milrot, E., Lazar, S., Schuster, O., Makdasi, E., Schmaya, S. Insights from the infection cycle of VSV-ΔG-spike virus. Viruses. 14 (12), 2828(2022).
  36. Schauflinger, M., Bergner, T., Neusser, G., Kranz, C., Read, C. Potassium permanganate is an excellent alternative to osmium tetroxide in freeze-substitution. Histochem Cell Biol. 157 (4), 481-489 (2022).

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

مقالات ذات صلة