يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

ظهارة صبغة شبكية الفئران الأولية المنقولة بالحمض النووي الريبي: نموذج ذي صلة مرضية في المختبر للتنكس البقعي المرتبط بالعمر

558 مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/68570

⸱

أكتوبر 17, 2025

 ,  ,  ,  , 
1Shanghai Jiao Tong University School of Medicine, 2Department of Ophthalmology, Shanghai General Hospital, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine, 3National Clinical Research Center for Eye Diseases, 4Shanghai Key Laboratory of Ocular Fundus Diseases

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

في هذا البروتوكول ، نصف العملية الكاملة لإنشاء نموذج ذي صلة بعلم الأمراض للتنكس البقعي المرتبط بالعمر (AMD) في الخلايا الظهارية الصبغية الأولية لصبغة شبكية الفئران (RPE) باستخدام تعداء Alu RNA.

الملخص

يتطلب التنكس البقعي المرتبط بالعمر (AMD) ، وخاصة AMD غير النضحي ، نماذج تجريبية تكرر علم الأمراض البشري بشكل أفضل. تظل النماذج الحالية في الجسم الحي متطلبة تقنيا وتستغرق وقتا طويلا ، في حين أن الأنظمة التقليدية في المختبر تفشل في تلخيص المحفزات المرضية الخاصة بالمرض. هنا ، نقدم طريقة لإنشاء نموذج تنكس ظهاري للصبغة الشبكية (RPE) باستخدام خلايا RPE الأولية للفأر المنقولة باستخدام Alu RNA ، وهو ناقل رجعي متورط بشكل مباشر في أمراض الضمور الجغرافي.

يوضح هذا البروتوكول بالتفصيل العزل الأنزيمي لخلايا RPE الأولية للفأر ، متبوعا بتعداء Alu RNA للحث على تنكس RPE. يدمج التحقق من الصحة المورفولوجية (الهندسة السداسية) ، والوظيفية (فقدان القطبية واضطراب بروتين الفأر ZO-1) ، والتحليل الجزيئي (تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي). نتيجة لذلك ، لاحظنا تغيرات متعددة العوامل ناتجة عن تعداء Alu RNA: إفراز السيتوكين الالتهابي (جينات الفأر Ifn-β و Il-6 و Tnf-α ؛ ص < 0.05) والشيخوخة الخلوية (جينات الفأر p21 و p53 upregulation ؛ ص < 0.05). بالمقارنة مع نماذج الإجهاد الحاد التقليدية ، يلخص هذا النظام شلالات الالتهابات التنكسية المزمنة ل AMD من خلال تقنيات موحدة ، مما يضمن قابلية التكاثر. من خلال الجمع بين جوانب المقايسات المبسطة في المختبر والنماذج المعقدة في الجسم الحي ، يمكن أن يكون هذا النهج بمثابة منصة أولية لاستكشاف الآليات التي تحركها الترانسبوزون الرجعي وفحص المرشحين العلاجيين المحتملين.

المقدمة

التنكس البقعي المرتبط بالعمر (AMD) هو السبب السائد لضعف البصر العالمي. ومع ذلك ، تظل العلاجات الفعالة ل AMD غير النضحي محدودة. وبالتالي ، هناك حاجة ملحة لنماذج بحثية قابلة للتكرار وفعالة للكشف عن آليات المرض وتحديد الأهداف العلاجية1،2. من الأمور المركزية في هذا الجهد ظهارة صبغة الشبكية (RPE) ، وهي طبقة أحادية تقع بين غشاء بروخ (المشيمية) والمستقبلات الضوئية (شبكية العين) ، والتي تلعب دورا محوريا في الحفاظ على توازن الشبكية من خلال دعم وظيفة المستقبلات الضوئية ، وتنظيم حاجز شبكية العين الدموي ، وتسهيل إزالة النفايات3،4.

يعد الخلل الوظيفي أو فقدان خلايا RPE سمة بارزة للعديد من الأمراض التنكسية في الشبكية ، خاصة في AMD ، حيث يمثل الخلل الوظيفي RPE خطوة مبكرة وحاسمة في تقدمه2،4،5. والجدير بالذكر أنه في المرضى الذين يعانون من الضمور الجغرافي (GA) ، فإن المرحلة المتقدمة من AMD ، تؤدي المستويات المنخفضة من إنزيم معالجة الحمض النووي الريبي الصغير Dicer 1 ribonuclease III (DICER1) إلى تراكم سام ل Alu RNA ، وهو نسخة من الينقولة الرجعية مرتبطة ارتباطا مباشرا بانكس RPE ومتورطة في علم الأمراض البشري6.

تحتفظ النماذج التقليدية في الجسم الحي ، مثل نموذج يودات الصوديوم (NaIO3) ونموذج الأميلويد β (Aβ) ، بتعقيد المرض الجهازي ولكنها تواجه قيودا حرجة. يحفز نموذج NaIO3 بسرعة الإجهاد التأكسدي للشبكية وتلف RPE ، ومع ذلك ، فإن سميته الحادة تعطل كل من RPE والمستقبلات الضوئية ، وتفشل في تقليد التقدم المزمن المرتبط بالأمراض ل AMD وتحجب التقييم العلاجي للخلل الوظيفي الدقيق RPE7. وبالمثل ، يقدم نموذج Aβ ضغوطات خاصة بالمرض ولكنه يتطلب خبرة فنية واسعة وجداول زمنية طويلة مقارنة بنهج المختبر8،9. من ناحية أخرى ، تفتقر نماذج RPE التقليدية في المختبر ، مثل H2O2 ونماذج التعرض للهيدروكينون ، إلى الأهمية المرضية ، وتفشل في تلخيص الضغوطات الخاصة بالمرض مثل مجاميع البروتين السامة أو المحفزات الالتهابية1.

هنا ، نقدم بروتوكولا مفصلا لإنشاء نموذج تنكس RPE في خلايا RPE الأولية للفأر باستخدام Alu RNA ، وهو RNA غير مشفر مشتق من الترانقولية الرجعية متورط بشكل مباشر في التسبب في GA6. ينشط Alu RNA المسارات الالتهابية ويعرض سلامة حاجز RPEللخطر 10،11 ، وبالتالي يحاكي السمات المرضية المرتبطة ب AMD غير النضحي. تستخدم هذه الطريقة العزل الأنزيمي وزراعة خلايا RPE ، متبوعا بتحريض تنكس RPE باستخدام Alu RNA. بالإضافة إلى ذلك ، نقدم نظاما شاملا للتحقق من الصحة ، يجمع بين القراءات المورفولوجية (الهندسة السداسية) ، والوظيفية (سلامة الحاجز وفقدان القطبية) ، والجزيئية (علامات الالتهاب والشيخوخة) لتقييم نموذج الانحطاط هذا.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

تمت الموافقة على هذه الدراسة من قبل لجنة أخلاقيات في مستشفى شنغهاي العام التابعة لكلية الطب بجامعة شنغهاي جياو تونغ. يتبع هذا البروتوكول بدقة لوائح إدارة الشؤون المتعلقة بحيوانات التجارب (الصادرة عن لجنة العلوم والتكنولوجيا الحكومية) والمبادئ التوجيهية للاستخدام الأخلاقي للحيوانات في أبحاث طب العيون والرؤية التي أنشأتها جمعية أبحاث الرؤية وطب العيون (ARVO). راجع جدول المواد للحصول على مزيد من التفاصيل المتعلقة بالمواد المستخدمة في هذا البروتوكول.

1. عزل خلايا RPE للماوس الأساسية

  1. تحضير الألواح المطلية
    1. قم بتخفيف المواد بنسبة 150 ميكرولتر من Matrigel إلى 13 مل من DMEM / F12 (التركيز النهائي حوالي 1.14٪).
    2. قم بتغطية الجزء السفلي من اللوحة بالتساوي باستخدام Matrigel المخفف (حوالي 150 ميكرولتر للوحة مكونة من 48 بئرا). احتضن طوال الليل عند 37 درجة مئوية لتشكيل مادة هلامية.
  2. تحضير الحل
    1. قم بإعداد وسيط زراعة RPE الكامل باستخدام خليط النسر المعدل المتوسط / المغذيات F-12 (DMEM / F12) من Dulbecco المكمل ب 10٪ مصل الأبقار الجنينية (FBS) و 1٪ البنسلين / الستربتومايسين.
    2. قم بإعداد مزيج غراء عن طريق إضافة 4.5 مل من محلول الملح المتوازن من إيرل (EBSS) إلى قارورة غراء (100 وحدة / قارورة).
    3. قم بإعداد DNase I Mix عن طريق إضافة 500 ميكرولتر من EBSS إلى قارورة DNase I (1,000 وحدة / قارورة).
    4. قم بإعداد محلول هضم غراء عن طريق إضافة 250 ميكرولتر من DNase I Mix إلى 4.5 مل من مزيج غراء (اضبط البروتوكول المقدم من المورد لتحقيق تركيز نهائي لغراء يبلغ 22 وحدة دولية / مل) ، مما يجعل الحجم النهائي 4.75 مل.
  3. القتل الرحيم وجمع الأنسجة
    1. القتل الرحيم للفئران بعمر 2-3 أسابيع عن طريق الحقن داخل الصفاق من 5٪ بنتوباربيتال الصوديوم عند 150-200 مجم / كجم من وزن الجسم. تأكيد التخدير العميق والوفاة عن طريق التحقق من توقف ضربات القلب والتنفس.
    2. رش منطقة العين جيدا بنسبة 70٪ من الإيثانول قبل الاستئصال للتخلص من الملوثات السطحية12،13،14. اضغط برفق على الحافة المحيطة بالحجاج لبروز الكرة الأرضية. بعد ذلك ، استخدم الملقط لاستخراج مقلة العين ، مع الحفاظ على العصب البصري لتسهيل التشريح.
      ملاحظة: يتم تعقيم جميع الأدوات (مثل الملقط والمقص) ، ويتم تنفيذ الإجراءات تحت غطاء التدفق الرقائقي للحفاظ على العقم.
    3. اغمر مقل العيون على الفور في وسط مزرعة RPE كامل معقم مسخن مسبقا إلى 37 درجة مئوية.
  4. الهضم الأنزيمي
    ملاحظة: يجب تنفيذ جميع الخطوات ، بما في ذلك الهضم الأنزيمي والإجراءات اللاحقة ، تحت غطاء التدفق الرقائقي للحفاظ على العقم.
    1. انقل مقلة العين إلى طبق واستخدم الملقط للتخلص من النسيج الضام الملتصق والعضلات خارج العين المتبقية تحت المجهر الفراغي.
    2. اشطفي العينين برفق 2x باستخدام محلول ملحي مبرد بالفوسفات من دولبيكو (D-PBS؛ بدون Ca2+/Mg2+؛ عند 4 درجات مئوية).
      ملاحظة: قد يضر وسط ثقافة RPE الكامل المتبقي بالنشاط الأنزيمي الغراء.
    3. اغمر العينين بالكامل في 1 مل من محلول هضم غراء واحتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 45 دقيقة.
  5. فصل خلايا RPE
    1. بعد الهضم ، قم بتحييد النشاط الأنزيمي باستخدام وسط ثقافة RPE كامل.
    2. انقل مقلة العين إلى طبق ، وتحت المجهر الفراغي ، قم باستئصال القرنية والقزحية والعدسة ، والحفاظ على منظار العين الخلفي.
      ملاحظة: تم عزل خلايا RPE والحفاظ عليها كصفائح سليمة (بدلا من التفكك إلى خلايا مفردة) خلال العملية برمتها.
    3. افصل مركب شبكية العين-RPE عن المشيمية ، ثم قشر طبقة RPE بعيدا عن شبكية العين كصفائح مستمرة في وسط ثقافة RPE كامل. اجمع طبقات RPE المنفصلة بشكل موحد في وسط استزراع RPE كامل طازج كخليط ثم قم بزراعتها لاحقا على الأسطح المطلية ب Matrigel.
  6. ثقافة الخلية
    1. ضع الخليط في صفيحة 24 بئرا مطلية ب Matrigel (8-10 مقل عيون لكل بئر على غطاء ، للتلوين المناعي) ، أو صفيحة 48 بئر مطلية ب Matrigel (6-8 مقل عيون لكل بئر ، ل qPCR) ، أو صفيحة 96 بئرا مطلية ب Matrigel (5-6 مقل عيون لكل بئر).
    2. احتضان عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون2. قم بإجراء أول تغيير متوسط بعد 48 ساعة باستخدام وسيط ثقافة RPE كامل. قم بتغيير الوسيط كل 48 ساعة بعد التغيير الأول.
      ملاحظة: للحفاظ على قطبية خلايا RPE قدر الإمكان ، تجنب تمريرها كلما أمكن ذلك ، لأن الزراعة الفرعية المتكررة يمكن أن تؤدي إلى فقدان التمايز والسلامة الوظيفية.
  7. مراقبة مورفولوجيا الخلية
    1. اسمح للخلايا بتكوين طبقة أحادية ذات مورفولوجيا سداسية مميزة. مراقبة التشكل تحت مجهر زراعة الخلايا المقلوبة.

2. تحريض نموذج تنكس RPE

  1. توليف الحمض النووي الريبي ألو والتحقق منه
    1. تجميع Alu RNA باستخدام نظام النسخ في المختبر .
      ملاحظة: استند تخليق Alu RNA المستخدم في دراستنا إلى البروتوكول الموصوف من قبل Ambati Lab6.
    2. قم بتنقية الحمض النووي الريبي وتأكيد جودته باستخدام مقياس الطيف الضوئي الدقيق.
  2. تعداء Alu RNA
    ملاحظة: حددنا يوم بذر خلايا RPE الأولية على أنه اليوم 0. في اليوم 5 ، أظهرت خلايا RPE الأولية الملتصقة مورفولوجيا موحدة ووصلت إلى أكثر من 50٪ من التقاء خلوي ، وعند هذه النقطة تم إجراء تعداء Alu RNA باستخدام كاشف تعداء قائم على الدهون الموجبة ، وفقا لإرشادات الشركة المصنعة.
    تم تضمين مجموعتين من الضوابط للتحقق من صحة النتائج: أنا) عنصر تحكم سلبي (NC) ، حيث لم تتم إضافة Alu RNA ولا كاشف تعداء وتم استخدام وسط المصل المنخفض كبديل. ب) التحكم في الجسيمات الشحمية (LC) ، حيث تم حذف Alu RNA ولكن تم خلط نفس الكمية من كاشف التعداء مع وسط منخفض المصل وتطبيقه على الخلايا ، للتحكم في التأثيرات المرتبطة بالشفط الشحمي. توضح الخطوات التالية إجراء تعداء الحمض النووي الريبي Alu.
    1. استبدل الوسط الحالي ب 300 ميكرولتر من وسط زراعة RPE الكامل لكل بئر (لوحة 48 بئر) قبل إجراءات التعدي.
    2. قم بإعداد مجمعات تعداء باستخدام Alu RNA وكاشف دهني كاتيوني في وسط منخفض المصل.
      1. تحضير المزيج 1 مع 1.2 ميكرولتر من الكاشف القائم على الدهون الموجبة و 18.8 ميكرولتر من وسط المصل المنخفض. امزج برفق (لا تدوام) واحتضنه في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق.
      2. قم بإعداد المزيج 2 مع 6 ميكرولتر من الحمض النووي الريبي (100 ميكروغرام / مل) و 14 ميكرولتر من وسط المصل المنخفض.
      3. قم بإعداد مجمعات تعداء عن طريق إضافة 20 ميكرولتر من المزيج 2 بالتنقيط إلى 20 ميكرولتر من المزيج 1.
        ملاحظة: تم نقل Alu RNA بتركيز نهائي قدره 0.6 ميكروغرام لكل بئر باستخدام 1.2 ميكرولتر من الكاشف القائم على الدهون الموجبة لكل بئر (1.2 ميكرولتر من الكاشف: 0.6 ميكروغرام نسبة الحمض النووي الريبي).
      4. نفض الغبار برفق للمزج. ثم اتركه في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة.
    3. أضف 40 ميكرولتر / بئر من مجمعات التعداء إلى كل بئر من صفيحة 24 بئرا. ضع الطبق في حاضنة 37 درجة مئوية / 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 لمدة 48 ساعة.
    4. قم بإجراء qPCR ، والتلوين المناعي ، والإجراءات التجريبية الأخرى بعد 48 ساعة من تعديس.

3. التحقق من صحة نموذج الانحطاط

ملاحظة: تم إجراء تجارب شاملة للتحقق من صحة النموذج في اليوم 7.

  1. تلطيخ التألق المناعي لتقييم القطبية وسلامة الحاجز
    1. قم بإصلاح خلايا RPE المستزرعة بالفورمالديهايد الخالي من الميثانول بنسبة 4٪ لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. يغسل 3 × 10 دقائق مع 1x PBS.
    2. قم بمنع الارتباط غير المحدد مع ألبومين مصل البقر بنسبة 5٪ (BSA) في محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) لمدة ساعة واحدة.
    3. احتضان بالأجسام المضادة الأولية المضادة ل ZO1 (تخفيف 1: 1,000 في 3٪ BSA) و Phalloidin 488 (تخفيف 1: 1,000 في 3٪ BSA) طوال الليل عند 4 درجات مئوية ، مع تجنب الضوء.
    4. اغسل الخلايا 3 × 10 دقائق برفق باستخدام PBS.
    5. احتضان الأجسام المضادة الثانوية (تخفيف 1: 1,000 في 3٪ BSA) لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة.
    6. اغسل العينات 3 × 10 دقائق باستخدام 1x PBS.
    7. Counterstain مع DAPI (1: 1,000 تخفيف في PBS) لمدة 10 دقائق.
    8. اغسل العينات لمدة 3 × 10 دقائق باستخدام 1x PBS.
    9. قم بإزالة الغطاء بعناية من اللوحة المكونة من 24 بئرا وضعها على شريحة زجاجية محملة مسبقا بقطرة من وسط التثبيت. التقط صورا متحد البؤر باستخدام هدف 40x/0.95.
  2. تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي (qPCR) لعلامات الشيخوخة والالتهابات
    ملاحظة: تم استخدام نازعة هيدروجين الجلسرين ألديهايد -3-فوسفات (جين الفأر Gapdh) كجين مرجعي داخلي لتطبيع قيم دورة العتبة (Ct). تضمنت جميع تفاعلات تفاعلات تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي (qPCR) ثلاثة تكرارات بيولوجية لكل مجموعة تجريبية. يتم توفير تسلسلات التمهيدي في الجدول التكميلي S1.
    1. استخراج الحمض النووي الريبي
      1. أضف المخزن المؤقت للتحلل (مجموعة الحمض النووي الريبي الإجمالي) إلى لوحة الاستزراع (1 مل لكل مساحة سطح 10 سم مربع) واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق.
      2. جهاز طرد مركزي عند 13,400 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. انقل المادة الطافية إلى أنبوب جديد خال من RNase.
        ملاحظة: تخطي هذه الخطوة إذا كانت العينات خالية من الحطام (على سبيل المثال ، محللة الخلايا الصافية).
      3. أضف 200 ميكرولتر من الكلوروفورم إلى الطافق ، دوامة لمدة 15 ثانية ، واحتضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 3 دقائق.
      4. جهاز طرد مركزي عند 13,400 × جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية. انقل المرحلة المائية العلوية (~ 500 ميكرولتر) إلى أنبوب جديد.
      5. أضف 0.5 حجم من الإيثانول إلى المرحلة المائية. تخلط برفق عن طريق سحب العاصة.
      6. قم بتحميل الخليط على عمود غشاء السيليكا (مضمن في مجموعة الحمض النووي الريبي الكامل). جهاز طرد مركزي بوزن 13,400 × جم لمدة 30 ثانية. تجاهل التدفق.
      7. أضف 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت لإزالة البروتين (Total RNA Kit) إلى العمود. جهاز طرد مركزي بسعة 13,400 × جم لمدة 30 ثانية. تجاهل التدفق.
      8. أضف 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت للغسيل (Total RNA Kit) إلى العمود. جهاز طرد مركزي بوزن 13,400 × جم لمدة 30 ثانية. تجاهل التدفق.
      9. كرر الخطوة السابقة 3.2.
      10. قم بالطرد المركزي للعمود الفارغ عند 13,400 × جم لمدة دقيقتين لتجفيف الغشاء.
      11. قم بإزالة الحمض النووي الريبي بإضافة 30-100 ميكرولتر من الماء الخالي من RNase إلى الغشاء. احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 2 دقيقة. جهاز طرد مركزي عند 13,400 × جم لمدة دقيقتين.
    2. تخليق الحمض النووي التكميلي (cDNA)
      1. قم بقياس تركيز الحمض النووي الريبي باستخدام مقياس الطيف الضوئي عند 260 نانومتر و 280 نانومتر.
        ملاحظة: تعتبر نسبة A260 / A280 بين 1.8 و 2.0 مرتبطة بنقاء RNA مقبول.
      2. قم بإعداد مزيج التفاعل في أنبوب خال من RNase: قالب الحمض النووي الريبي (500-1,000 نانوغرام): X μL (مرتبط بتركيزه) ، 5x مخزن النسخ العكسي: 4 ميكرولتر ، ماء خال من RNase: إلى 20 ميكرولتر.
      3. احتضان مزيج التفاعل في دورة حرارية باستخدام البرنامج التالي: 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة ، و 85 درجة مئوية لمدة 5 ثوان ، وعقد إلى أجل غير مسمى عند 4 درجات مئوية.
    3. qPCR
      1. قم بإعداد المزيج الرئيسي qPCR لكل تفاعل (إجمالي 10 ميكرولتر): TB Green (مضمن في Premix Taq): 5 ميكرولتر ، صبغة ROX (مضمنة في Premix Taq): 0.2 ميكرولتر ، برايمر أمامي (1 ميكرومتر): 0.2 ميكرولتر ، برايمر عكسي (1 ميكرومتر): 0.2 ميكرولتر ، ماء خال من RNase: 3.4 ميكرولتر ، قالب (كدنا): 1 ميكرولتر.
      2. أضف 10 ميكرولتر من المزيج الرئيسي في كل بئر من طبق 96 بئر.
      3. أغلق اللوحة بغطاء بصري لاصق. جهاز طرد مركزي عند 300 × جم لمدة 1 دقيقة.
      4. قم بتشغيل البرنامج التالي على نظام PCR في الوقت الفعلي: المرحلة 1: 95 درجة مئوية لمدة 30 ثانية ؛ المرحلة 2: 40 دورة: 95 درجة مئوية لمدة 5 ثوان ، 60 درجة مئوية لمدة 30 ثانية ؛ المرحلة 3: تحليل منحنى الذوبان.
      5. احسب مستويات التعبير النسبية للرنا المرسال المستهدف باستخدام طريقة 2−ΔΔCt 15.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

خلايا RPE الأولية للماوس قبل تعداء Alu RNA
في اليوم 0 (الشكل 1) ، تم عزل خلايا RPE الأولية للفأر وأظهرت التشكل السداسي المميز ، وهو نموذجي لخلايا RPE السليمة. حافظت هذه الخلايا على طبقة أحادية جيدة التنظيم. تمت زراعة الخلايا للسماح بالتنظيم الهيكلي الأولي وتشكيل تقاطعات ضيقة ، كما يتضح من الشكل السداسي والحدود المحددة جيدا. كان هذا التشكل بمثابة خط الأساس للتحريض اللاحق لانحطاط RPE. تم الحفاظ أيضا على سلامة حاجز RPE في هذه المرحلة ، مما يضمن أن الخلايا كانت في حالة وظيفية...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

كان هدفنا هو إنشاء نموذج إصابة RPE قابل للتكرار ويمكن الوصول إليه يتيح التصوير عالي الدقة والتحليل الميكانيكي مع الحد الأدنى من قيود الموارد. قدم هذا النهج تصورا واضحا للاضطراب الهيكلي الناجم عن Alu RNA مقارنة بالمجموعة الضابطة ، بما في ذلك تجزئة الوصلة الضيقة القمية وعدم تنظيم الهيكل الخلوي القاعدي من خلال التصوير Z-stack متحد البؤر (حجم خطوة 0.5 ميكرومتر). تضمن خطوتان حاسمتان موثوقية النظام: الهضم الأنزيمي ونداء الحمض النووي الريبي الآلو. باستخدام العزل القائم على غراء (22 وحدة دولية /...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

ليس لدى المؤلفين تضارب في المصالح للإفصاح عنها.

شكر وتقدير

تم دعم هذا العمل جزئيا من قبل خطة عمل ابتكار العلوم والتكنولوجيا المشروع الخاص لأبحاث الابتكار الطبي (23Y11901300) ، والمؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (82171076) ، ولجنة التعليم البلدية في شنغهاي (2023ZKZD18). نشكر البروفيسور L.Z على الهدية الكريمة من Alu RNA.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
1300 سلسلة من الفئة الثانية ، خزانة السلامة البيولوجية من النوع A2ثيرمو ساينتفيك
37 ° حاضنة ثاني أكسيد الكربون / 5٪ ثاني أكسيد الكربون 2< / sub>ثيرمو ساينتفيك
4٪ بارافورمالديهايد (PFA)سيرفيسبيوجي 1101-500 مل
الحمض النووي الريبي البشريموهوب من L.Z.
الأجسام المضادة الثانوية المضادة للأرانب ، أليكسا فلور 568 (ماعز)إنفيتروجين ثيرمو ساينتفيكأ 11011
الغطاء البصري اللاصق MicroAmp Applied Biosystemsثيرمو فيشر العلمي
ألواح تفاعل MicroAmp البصرية 96 بئر من الأنظمة الحيوية التطبيقيةثيرمو فيشر العلمي
نظام PCR في الوقت الحقيقي Applied Biosystems ViiA 7ثيرمو فيشر العلمينظام تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الحقيقي لتحليل التعبير الجيني الكمي
مصل الأبقار الألبومين (BSA ، الكسر الخامس)بيوتينST023-50 جرام
كارل زايس بريموفرت مجهر زراعة الخلايا المقلوبةزييسلمراقبة مورفولوجيا الخلية
جهاز طرد مركزي 5424 Rإيبندورف
كلوروفورمسيغمافصل الطور في استخراج الحمض النووي الريبي.
مجهر المسح بالليزر متحد البؤر (LSM900 + اكتشاف الخلية 7)زييستصوير عالي الدقة لعلامات التألق المناعي (على سبيل المثال ، ZO-1 و F-actin).
كوستار 24/48/96 لوحة بئركورنينج
غطاءثيرمو فيشر العلميتستخدم على لوحة 24 بئرا للتصوير المناعي.
دابيالحراريه62248
حمام جاف رقميمولاب
دي إم إيم / إف 12جيبكووسائل الإعلام لتنمية خلايا RPE  
Dulbecco الفوسفات المخزنة (D-PBS)شير بيوSB-CR017
إيرل محلول الملح المتوازن (EBSS)جيبكومحلول ملح متوازن يستخدم لتخفيف غراء و DNase I أثناء عزل RPE.
الإيثانول (مطلق)سيغماترسيب الحمض النووي الريبي وغسل العمود.
مصل الأبقار الجنينية (FBS)سيغمالوسائط زراعة خلايا RPE كاملة
ملقطللتشريح
ليبوفيكتامين 3000 (كاشف تعداء دهني موجبة قائم على الدهون)ثيرمو فيشرL300015لنقل Alu RNA إلى خلايا RPE
مادةكورنينج356234مصفوفة (تخفيف 1.14٪) لألواح الطلاء لدعم التصاق RPE والاستقطاب.
الفورمالديهايد الخالي من الميثانولثيرمو ساينتفيكمثبت بديل (4٪) للحفاظ على الحلقات في التألق المناعي
ماصة دقيقةإيبندورف
مقياس الطيف الضوئي Nanodrop 2000ثيرمو ساينتفيكيقيس تركيز الحمض النووي الريبي ونقائه
نيكون ECLIPSE Ti-S مجهر مقلوب بالفلورسنتنيكونالتصوير الفلوري للعينات الملطخة
أوليمبوس SZX16 المجهر المجسمأوليمبوسلتشريح مقل عيون الماوس وعزل RPE
أوبتي ميمجيبكووسط منخفض المصل لتحضير مركب التعداء
نظام تفكك غراءورثينجتونLK003150لإنزيم العمل
البنسلين الستربتومايسين جيبكولوسائط زراعة خلايا RPE كاملة
ملح الصوديوم بنتوباربيتالسيغماعامل القتل الرحيم
Phalloidin 488 أبكام176753لتقييم القطبية
طقم كاشف PrimeScript RTتقراRR037 أمجموعة النسخ العكسي لتخليق (كدنا) (إعداد قالب qPCR)
RNAمجموعة RNA الإجمالية البسيطةتيانجنموانئ دبي 419لاستخراج الحمض النووي الريبي
TB Green  بريمكس Ex Taq  < / em> (Tli RNaseH Plus)تقراRR420Aل qPCR
ZO-1 الأجسام المضادة متعددة النسيلة للأرنببروتين تك21773للتقييم المورفولوجي

المراجع

  1. Malek, G., Busik, J., Grant, M. B., Choudhary, M. Models of retinal diseases and their applicability in drug discovery. Expert Opin Drug Discov. 13 (4), 359-377 (2018).
  2. Fleckenstein, M., Schmitz-Valckenberg, S., Chakravarthy, U. Age-related macular degeneration. JAMA. 331 (2), 141-157 (2024).
  3. Kaufmann, M., Han, Z. Rpe melanin and its influence on the progression of AMD. Ageing Res Rev. 99, 102358(2024).
  4. Du, J., Zhu, S., Lim, R. R., Chao, J. R. Proline metabolism and transport in retinal health and disease. Amino Acids. 53 (12), 1789-1806 (2021).
  5. Kaarniranta, K., et al. Mechanisms of mitochondrial dysfunction and their impact on age-related macular degeneration. Prog Retin Eye Res. 79, 100858(2020).
  6. Kaneko, H., et al. DICER1 deficit induces Alu RNA toxicity in age-related macular degeneration. Nature. 471 (7338), 325-330 (2011).
  7. Anderson, B. D., Lee, T. T., Bell, B. A., Wang, T., Dunaief, J. L. Optimizing the sodium iodate model: Effects of dose, gender, and age. Exp Eye Res. 239, 109772(2024).
  8. Qarawani, A., et al. PEDF-derived peptide protects against amyloid-β toxicity in vitro and prevents retinal dysfunction in rats. Exp Eye Res. 242, 109861(2024).
  9. Chen, S. -J., et al. Cytoprotective potential of fucoxanthin in oxidative stress-induced age-related macular degeneration and retinal pigment epithelial cell senescence in vivo and in vitro. Mar Drugs. 19 (2), 114(2021).
  10. Kerur, N., et al. cGAS drives noncanonical-inflammasome activation in age-related macular degeneration. Nat Med. 24 (1), 50-61 (2018).
  11. Kim, Y., et al. Dicer1/ Alu RNA dysmetabolism induces caspase-8-mediated cell death in age-related macular degeneration. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (45), 16082-16087 (2014).
  12. Fernandez-Godino, R., Garland, D. L., Pierce, E. A. Isolation, culture and characterization of primary mouse RPE cells. Nat Protoc. 11 (7), 1206-1218 (2016).
  13. Shang, P., et al. A novel method of mouse rpe explant culture and effective introduction of transgenes using adenoviral transduction for in vitro studies in AMD. Int J Mol Sci. 22 (21), 11979(2021).
  14. Sun, J., et al. ROS production and mitochondrial dysfunction driven by PU.1-regulated NOX4-p22phox activation in aβ-induced retinal pigment epithelial cell injury. Theranostics. 10 (25), 11637-11655 (2020).
  15. Rao, X., Huang, X., Zhou, Z., Lin, X. An improvement of the 2ˆ(-delta delta ct) method for quantitative real-time polymerase chain reaction data analysis. Biostat Bioinforma Biomath. 3 (3), 71-85 (2013).
  16. Shang, P., Stepicheva, N. A., Hose, S., Zigler, J. J. S., Sinha, D. Primary cell cultures from the mouse retinal pigment epithelium. J Vis Exp. (133), e56997(2018).
  17. Datta, S., Cano, M., Ebrahimi, K., Wang, L., Handa, J. T. The impact of oxidative stress and inflammation on RPE degeneration in non-neovascular AMD. Prog Retin Eye Res. 60, 201-218 (2017).
  18. Liu, X., et al. The novel triterpenoid RTA 408 protects human retinal pigment epithelial cells against H2O2-induced cell injury via NF-E2-related factor 2 (Nrf2) activation. Redox Biol. 8, 98-109 (2016).
  19. Bhattarai, N., et al. Resvega alleviates hydroquinone-induced oxidative stress in ARPE-19 cells. Int J Mol Sci. 21 (6), 2066(2020).
  20. Chen, C., et al. Role of unfolded protein response dysregulation in oxidative injury of retinal pigment epithelial cells. Antioxid Redox Signal. 20 (14), 2091-2106 (2014).
  21. Lin, C. -H., et al. Low-luminance blue light-enhanced phototoxicity in A2E-laden RPE cell cultures and rats. Int J Mol Sci. 20 (7), 1799(2019).
  22. Lewis Luján, L. M., et al. Nutraceuticals/drugs promoting mitophagy and mitochondrial biogenesis may combat the mitochondrial dysfunction driving progression of dry age-related macular degeneration. Nutrients. 14 (9), 1985(2022).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

تر transfection لـ Alu RNAخلايا ظهارة الشبكية الصبغية الأولية للفأرتنكس ظهارة الشبكية الصبغيةالعزل الإنزيميإفراز السيتوكينات الالتهابيةالشيخوخة الخلويةتفاعل البوليميراز المتسلسل الكميالالتهاب المزمن

تم نشر هذه المقالة

الفيديو قريباً

تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.