يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

التشريح المجهري متعدد المستويات والتنميط الوظيفي الهيكلي لفروع الشرايين الكلوية البشرية

1.1K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/68579

⸱

سبتمبر 5, 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Institute of Cardiovascular Sciences, School of Basic Medical Sciences, Peking University Health Science Center; State Key Laboratory of Vascular Homeostasis and Remodeling, Peking University, 2Beijing Key Laboratory of Cardiovascular Receptors Research, 3Department of Cardiology and Institute of Vascular Medicine, Peking University Third Hospital, Peking University, 4Department of Urology, Peking University First Hospital; Institute of Urology, Peking University; Beijing Key Laboratory of Urogenital Diseases (Male) Molecular Diagnosis and Treatment Center, National Urological Cancer Center, 5Institute of Cardiovascular Diseases, First Affiliated Hospital of Dalian Medical University, 6NHC Key Laboratory of Cardiovascular Molecular Biology and Regulatory Peptides, Peking University

في هذه المقالة

ملخص

تقدم هذه المقالة بروتوكولا خطوة بخطوة للعزل والتقييم الوظيفي لفروع الشرايين الكلوية البشرية ، مما يسهل الدراسات قبل السريرية للتطوير الصيدلاني.

الملخص

يلعب الخلل الوظيفي الوعائي الكلوي دورا مهما في التسبب في الحالات السريرية المتعددة ، بما في ذلك إصابة الكلى الحادة ونقص التروية الكلوي وارتفاع ضغط الدم ، مما يمثل تحديات كبيرة في الإدارة السريرية ويؤثر سلبا على نتائج المرضى. يعد عزل الشرايين الكلوية وتوصيفها الوظيفي أمرا بالغ الأهمية لتوضيح الآليات الكامنة وراء الخلل الوظيفي في الأوعية الدموية الكلوية ، لا سيما فيما يتعلق بإصابة الكلى ، وتوجيه التطوير العلاجي المستهدف. على الرغم من أهميتها السريرية ، إلا أن الأساليب الموحدة لعزل الشرايين الكلوية البشرية وتقييمها وظيفيا عبر مستويات التفرع المختلفة لا تزال متخلفة. يوفر هذا البروتوكول إطارا شاملا للعزل المنهجي والتقييم متعدد الوسائط لفروع الشرايين داخل الكلى ، بما في ذلك التقييمات الوظيفية والهيكلية في ظل كل من الظروف الفسيولوجية والمرضية. تشمل المنهجية ثلاثة مكونات رئيسية: (1) التحديد التشريحي الدقيق والتشريح المجهري للشرايين داخل الكلى من الكلى من المتبرع ، مصحوبا بتلطيخ الهيماتوكسيلين إيوزين (H & E) للتأكيد الهيكلي. (2) إجراءات التطبيع الصارمة في التصوير العضلي السلكي لتعزيز قابلية القياس والموثوقية ؛ و (3) التحليل الكمي للاستجابات الحركية الوعائية باستخدام تقنيات التصوير العضلي الأسلاكي الدقيقة. يعتمد التطبيع على علاقة طول العضلات وتوتر ، حيث يؤدي التمدد التدريجي للأجزاء الشريانية إلى إنشاء توتر مثالي للراحة لزيادة تداخل الأكتين والميوسين ، وبالتالي إثارة استجابات انقباضية ذروة. في تصوير العضل السلكي ، يتم تعليق أجزاء الأوعية المعزولة بين سلكين متوازيين ، مما يسمح بقياس دقيق لتوتر الأوعية الدموية. من خلال تطبيق بروتوكولات التطبيع الصارمة ، تتيح هذه التقنية القياس الكمي القابل للتكرار والموثوق به لتفاعل الأوعية الدموية عبر مختلف الحالات الفيزيولوجية المرضية والتدخلات الدوائية.

المقدمة

الكلى هي عضو حيوي مسؤول عن الحفاظ على التوازن البشري من خلال إزالة النفايات الأيضية وتوازن الكهارل وتنظيم السوائل - وهي وظائف تتطلب تدفقا عاليا للدم بشكل استثنائي. في ظل الظروف الفسيولوجية ، تتلقى الكلى ما يقرب من 25٪ من إجمالي حجم الدم الذي يضخه القلب كل دقيقة (النتاج القلبي) ، مما يؤكد دورها الكبير في تدفق الدم الجهازي والأهمية الحاسمة للتروية الكلوية في الحفاظ على التوازن الفسيولوجيالعام 1. ينظم الجهاز الشرياني الكلوي بدقة هذا التوصيل الهائل للدم للحفاظ على معدل الترشيح الكبيبي مع التكيف مع التغيرات الديناميكية الدموية الجهازية. وبالتالي ، يمثل ضعف التروية الكلوية آلية مرضية حاسمة تساهم في تقليل معدل الترشيح الكبيبي (GFR) في حالات مثل إصابة الكلى الحادة ونقص تروية الكلى. بالإضافة إلى ذلك ، يحدث بشكل متكرر للاضطرابات الجهازية التي تضر بتدفق الدم الكلوي ، بما في ذلك الصدمة وضعف القلب والإنتان2،3،4،5. يخضع الشريان الكلوي لتفرع متسلسل داخل الكلى ، وينقسم أولا إلى شرايين بين الفصات تمر عبر الأعمدة الكلوية بين الأهرامات النخاعي. عند الوصول إلى التقاطع القشري الكريتيكومي ، تؤدي هذه الأوعية إلى ظهور شرايين مقوسة ، والتي تتقوس على طول الحدود بين القشرة والنخاع. من هذه الأوعية المنحنية تخرج الشرايين بين الفصيصات التي تخترق شعاعيا الحمة القشرية ، مما يؤدي في النهاية إلى توصيل الدم إلى الشعيرات الدموية الكبيبية عبر الشرايين الواردة لاختراق النيفرون الفردية1،6،7. تشكل الشرايين بين الفصصات والمقووسة والفصيصية الأوعية الدموية الرئيسية في الكلى ، وتعمل كمنظم أساسي لديناميكا الدم داخل الكلى والتحكم في الضغط1،8. يعد العزل الدقيق وتوصيف هذه الأوعية أمرا بالغ الأهمية لتوضيح الآليات الأساسية التي تحكم توازن التروية الكلوية9. علاوة على ذلك ، فإن تفاعل الأوعية الدموية غير المتجانسة في ظل ظروف الفيزيولوجيا المرضية المختلفة يوفر إطارا استراتيجيا لتطوير عوامل موسعة للأوعية الدموية ذات إمكانات حماية الكلى10،11.

حاليا ، تستخدم تقنيات التصوير السريري (مثل الموجات فوق الصوتية) بشكل روتيني لمراقبة تغيرات تدفق الدم الكلوي. ومع ذلك ، فإن المنهجيات التجريبية في البحث الأساسي للتقييم المباشر للتوتر الوعائي الكلوي ، وهو محدد رئيسي للتروية الكلوية ، لا تزال محدودة12،13،14،15. نظام التصوير العضلي السلكي عبارة عن منصة تجريبية راسخة تقيس تغيرات التوتر في الأنسجة البيولوجية الصغيرة في المختبر ، بما في ذلك الأوعية الدموية ، القصبة الهوائية16،17،18 ، بأقطار تتراوح من 50 ميكرومتر إلى 10 مم16،19،20. على الرغم من أن التصوير العضلي السلكي قد تم تطبيقه على نطاق واسع في الدراسات التي أجريت على ، إلا أن الاختلافات بين الأنواع في بنية الأوعية الدموية ووظيفتها تحد من المدى الذي يمكن أن تمثل فيه أوعية القوارض فسيولوجيا الأوعية الدموية البشرية21. لذلك ، يعد التحديد الدقيق للشرايين الكلوية البشرية وعزلها على مختلف المستويات التشريحية (بين الفصات ، والمقوس ، والفصيصي) أمرا بالغ الأهمية لتمكين إجراء تحقيقات شاملة في المختبر في خصائصها الفسيولوجية ، بالإضافة إلى التغيرات الوظيفية المرتبطة بالمرض وآليات الإصابة المرضية. عند دمجه مع التدخلات الدوائية باستخدام العديد من المركبات النشطة للأوعية ، يسمح هذا النظام بالتقييم الديناميكي والتسجيل الكمي لاستجابات تضيق الأوعية / توسع الأوعية في الحلقات الشريانية المعزولة ، مما يوفر أداة قوية للتحقيق في تفاعل الأوعية الدموية في ظل ظروف تجريبية خاضعة للرقابة19،22،23.

يوضح هذا البروتوكول بالتفصيل منهجية شاملة للتوطين التشريحي الدقيق والتشريح المجهري لفروع الشريان الداخلي البشري (الشرايين بين الفصص والمقوسة والفصيصية) ، متبوعا بالتوصيف الوظيفي باستخدام نظام مراقبة توتر الأوعية الدموية في المختبر لتقييم تفاعلها التفاضلي للأدوية النشطة للأوعية الدموية ، وبالتالي إنشاء فروق هيكلية ووظيفية بين هذه الأجزاء الوعائية. من خلال الجمع بين التوطين التشريحي والتنميط التفاعلي الدوائي والتحليل النسيجي المرضي ، نقوم بإنشاء منصة خارج الجسم الحي تتيح تقييما شاملا للاستجابات الوعائية الخاصة بالمنطقة للعوامل النشطة للأوعية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

تمت مراجعة البروتوكول والأمثلة الموضحة هنا والموافقة عليها من قبل قسم المسالك البولية في المستشفى الأول بجامعة بكين (الموافقة رقم 2023yan500-002) وتم إجراؤها وفقا لإعلان هلسنكي. قدم جميع المشاركين موافقة خطية مستنيرة قبل المشاركة.

1. إعداد الحل

  1. تحضير محلول كريبس رينجر (كريبس) يحتوي على 119.0 ملي كلوريد الصوديوم ، و 4.7 ملي كلوريد كلوريد ، و 2.5 ملي كلوريدالكالسيوم 2 ، و 1.0 ملي ملي كلوريدالملزوم 2 ، و 25.0 ملي هيدروكسيد الصوديوم3 ، و 1.2 ملي كيلو هيدروكسيون2PO4 ، و 11.0 ملي مولار من الجلوكوز عند درجة الحموضة 7.4.
  2. تحضير محلول ملح عالي البوتاسيوم (60 كلفن +) يحتوي على 64.0 ملي كلوريد الصوديوم ، 60 ملي كلوريد كلوريد ، 2.5 ملي كلوريدالملن 2 ، 1.0 ملي مللي كلوريدالمغنيد 2 ، 25.0 ملي هيدروكسيد الصوديوم3 ، 1.2 ملي كيلو هيدروكسيوم2PO4 ، و 11.0 ملي مولار د-جلوكوز عند درجة الحموضة 7.4.

2. إعداد الكاشف

ملاحظة: قم بتخزين الأدوية وفقا للتفاصيل الواردة في ورقة بيانات سلامة المواد (MSDS) فور استلامها.

  1. تحضير فينيليفرين (Phe ، 10-1 م في المخزون) عن طريق إذابة 167.21 مجم من فينيليفرين في 10 مل من ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO). قم بتخزين محلول المرق عند -80 درجة مئوية ، مخفف إلى 10-6 ، 10-5 ، 10-4 ، 10-3 ، 10-2 م كتركيز عمل في يوم الاستخدام.
  2. تحضير الأسيتيل كولين (ACh ، 10-2 م في المخزون) ، عن طريق إذابة 18.166 مجم من الأستيل كولين في 10 مل من ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO). قم بتخزين محلول المخزون عند -80 درجة مئوية ، مخفف إلى 10-5 ، 10-4 ، 10-3 ، 10-2 م كتركيز عمل في يوم الاستخدام.

3. جمع أنسجة الكلى وعزل الشريان الكلوي

  1. تجنيد المرضى البالغين الذين تم تشخيص إصابتهم بسرطان الخلايا الكلوية ، كما هو مؤكد نسيجيا من خلال خزعة الإبرة الأساسية قبل الجراحة أو القسم المجمد أثناء الجراحة.
    ملاحظة: يتم اختيار المرضى المقرر إجراؤهم لاستئصال الكلية الجذري على وجه التحديد لأن عيناتهم الجراحية توفر الوصول إلى الأجزاء الشريانية الكلوية السليمة الموجودة بعيدا عن هوامش الورم. يمكن تشريح هذه الأجزاء وعزلها بدقة ، مما يسمح بدراسة مفصلة لفسيولوجيا الأوعية الدموية الكلوية البشرية دون تدخل من الأنسجة الخبيثة. يضمن التأكيد النسيجي التحديد الدقيق للسرطان والتحديد الواضح لحدود الورم ، مما يسهل اختيار الأجزاء الشريانية الطبيعية الخالية من الورم للفحوصات التجريبية.
    1. استبعاد المرضى الذين يعانون من أمراض مصاحبة كبيرة (ارتفاع ضغط الدم أو داء السكري أو أمراض جهازية أخرى) لتجنب التأثيرات المربكة على وظيفة الأوعية الدموية ، وبالتالي تعزيز موثوقية وأهمية التقييمات الفسيولوجية.
      ملاحظة: تم جمع عينات هذه التجربة من المرضى المقرر إجراؤهم لاستئصال الكلية الجذري في مستشفى جامعة بكين الأول.
  2. أثناء استئصال الكلية الجذري ، اجمع عينات الكلى البشرية المستغرصة حديثا واغمرها على الفور في محلول كريبس المثلج للحفاظ على بقاء الأنسجة. يتم الاحتفاظ فقط بالمناطق ذات المظهر الطبيعي المجهري البعيدة عن هوامش الورم لتسلخ الشرايين (الشكل 1 أ).
    ملاحظة: من أجل العزل الأمثل للشريان الكلوي ، يجب حصاد الأنسجة السليمة المجاورة كإسفين كورتيكومدولاري كامل السماكة أثناء استئصال الكلية الجذري ، وبالتالي الحفاظ على شجرة الشرايين الكاملة من الأوعية الدموية القشرية إلى الأوعية الدموية النخاعي.
    1. قم بتخزين الأنسجة المستأصلة على الفور في 200 مل من محلول كريبس البارد. ضع الحاوية على الثلج وانقلها في كيس تبريد معزول إلى المختبر في غضون ساعتين من التجميع. تأكد من بقاء الأنسجة مغمورة بالكامل طوال فترة النقل للحفاظ على قابلية البقاء والسلامة الهيكلية للتشريح والتحليل الوظيفي اللاحق.
      ملاحظة: للحفاظ على بقاء الأنسجة والوظيفة الفسيولوجية ، يجب إكمال عملية العزل والتخزين اللاحق في محلول كريبس عند 4 درجات مئوية في غضون 6 ساعات24،25،26،27. يجب استبدال المحلول بانتظام أثناء الإجراءات للحفاظ على الأكسجين وصلاحية الأنسجة ، مع تسهيل إزالة مكونات الدم من تجويف الأوعية الدموية.
  3. حدد المستوى الإكليلي بصريا عن طريق تحديد موقع النقير الكلوي ومحاذاة الجرح ليمر عبر كل من الحوض الكلوي والحدود المحدبة الجانبية. باستخدام مشرط معقم ، قم بتقسيم الكلية إلى نصفين على طول المستوى الإكليلي لإنتاج نصفين متماثلين. يكشف هذا النهج عن الهندسة المعمارية الداخلية ، بما في ذلك الأهرامات والأعمدة الكلوية ، مما يسهل التحديد الدقيق والتشريح اللاحق للشرايين داخل الكلى (الشكل 1 أ).
    ملاحظة: من أجل تسهيل فصل الشرايين الكلوية ، يجب إزالة جزء من الحوض الكلوي والأهرامات الكلوية والدهون الموجودة على سطح المقطع العرضي أولا لكشف المزيد من الأوعية الدموية (الشكل 1 ب). احرص على عدم قطع الأوعية الدموية.
  4. تحت المجهر المجسم ، افصل بدقة الشرايين بين الفصصات والمقوسة والفصيصية باستخدام مقص التشريح الدقيق والملقط في طبق ثقافة أسود القاع مقاس 10 سم (الشكل 1 ج).
    ملاحظة: في الكلى البشرية ، يمر الشريان بين الفصيص عبر الأهرامات الكلوية ، ويتميز بجدار الأوعية الدموية السميك بين الفروع الشريانية الثلاثة1،8 ، بمتوسط قطر يبلغ حوالي 1-2 مم. عند التقاطع القشري ، ينتقل الشريان بين الفصات إلى الشريان المقوس ، مكونا قوسا نصف دائري على طول الحدود القشرية ، بمتوسط قطر يبلغ حوالي 500 ميكرومتر. تتفرع الأوعية الدموية أيضا إلى القشرة الكلوية ، وهي الشريان بين الفصيص ، مع أنحف جدار وعائي وأصغر قطر بين الثلاثة ، حوالي 200 ميكرومتر (الشكل 1 ج). علاوة على ذلك ، عند التمييز بين فروع الأوعية الدموية الثلاثة ، يوفر التوطين التشريحي معلومات أكثر أهمية من قياسات قطر الأوعية الدموية المطلقة1،8.
    1. قم بإزالة أي أنسجة ودهون محيطة برفق من الشرايين ، وتأكد من تنظيفها جيدا في طبق استزراع أسود القاع مقاس 10 سم (الشكل 1 ب).
  5. استخدم الشرايين الكلوية المعزولة (الشرايين بين الفصيصات والمقوسة وبين الفصيصات) للتجارب التالية:
    1. قم بإعداد الأجزاء الشريانية للمعالجة النسيجية عن طريق تقليم الأنسجة المعزولة بعناية بطول موحد يبلغ حوالي 3 مم ، وهو مناسب لتضمين البارافين والتقسيم النسيجي. قم بإصلاح كل عينة في 2 مل من 4٪ بارافورمالدهيد (PFA) في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة للحفاظ على مورفولوجيا الأنسجة. بعد التثبيت ، قم بالمعالجة باستخدام بروتوكولات التجفيف والتنظيف وتضمين البارافين القياسية لتلوين الهيماتوكسيلين والأيوزين (H & E) اللاحقة وفقا للبروتوكولات النسيجية المعمول بها (الشكل 2).
      ملاحظة: بالنسبة للتقييمات النسيجية المحتملة ، يمكن أن تخضع العينات لتلوين ماسون ثلاثي الألوان لتقييم ترسب الكولاجين أو تلطيخ Verhoeff-Van Gieson (EVG) لتصور الألياف المرنة ، وفقا للبروتوكولات النسيجية المعمولبها 28،29.
    2. لدراسات وظائف الأوعية الدموية ، قم بتخزين الحلقات داخل الكلى في محلول كريبس المثلج حتى الاختبار. يجب غمر الحلقات الشريانية بالكامل.
      ملاحظة: بالنسبة للمقايسات الجزيئية اللاحقة مثل اللطخة الغربية / qPCR ، قم على الفور بتجميد العينات الطازجة في النيتروجين السائل بعد التشريح ، ثم تخزينها في -80 درجة مئوية باتباع الإجراءات المنشورة مسبقا للحفاظ على سلامة الحمض النووي الريبي ومنع تدهور البروتين30،31.

4. تصاعد الحلقة الشريانية

  1. حدد الشريان بين الفصصات والمقوس والشريان الفصيصي من خلال مواقعه التشريحية المميزة (الشكل 1 ج) ونطاقات القطر (الشكل 2) ، ثم قم بتقسيمها بعناية إلى حلقات بطول 2 مم تقريبا باستخدام مقص التشريح المجهري لدراسات وظائف الأوعية الدموية (الشكل 3 أ).
    ملاحظة: قم على الفور بتخزين كل حلقة شريانية معزولة على حدة في 5 مل من محلول كريبس المثلج حتى الاختبار الوظيفي. للاختبار الوظيفي ، حدد حلقات الأوعية الدموية غير المتفرعة التي يتراوح طولها بين 1.5-2.0 مم مع قطع عمودية نظيفة. استبعد الحلقات التي تتجاوز 2.0 مم لمنع صعوبات التركيب أو الحلقات التي تقل عن 1.5 مم لتجنب تسجيلات التوتر غير المستقرة.
  2. قم بإعداد جميع الحلقات الشريانية (من الشرايين بين الفصصات والمقوسة والشرايين الفصيصية بشكل منفصل) كما هو مذكور في الخطوة 4.1 وإحضار كل من محاليل كريبس و 60 كيلو + إلى درجة حرارة الغرفة. ثم قم بتشغيل الكمبيوتر المتصل ، متبوعا بنظام التصوير العضلي السلكي ، مما يضمن تهيئة جميع المكونات بشكل صحيح قبل متابعة التجارب.
  3. قبل تركيب الحلقات الشريانية في غرف التصوير العضلي السلكية ، اشطف كل غرفة مرتين ب 5 مل من محلول كريبس لضمان النظافة والتخلص من المواد المتبقية ، ثم أضف 5 مل من محلول كريبس إلى كل حجرة.
    1. قم بتسخين المحلول إلى 37 درجة مئوية باستخدام نظام التحكم في درجة الحرارة المدمج في الميكروgraph. في الوقت نفسه ، قم بتهوية المحلول باستمرار بالغاز (خليط من 95٪ O2 و 5٪ CO2) عبر خط غاز متصل للحفاظ على توازن الأكسجين والأس الهيدروجيني المناسب أثناء التجربة.
  4. قم بإعداد سلكين توجيهيين بطول 3 سم بقطر 40 ميكرومتر لكل حلقة شريانية وانقل الحلقات الشريانية المعزولة بعناية إلى طبق ثقافة آخر ذو قاع أسود مقاس 10 سم يحتوي على محلول كريبس.
    ملاحظة: يجب اختيار أقطار مختلفة من أسلاك التوجيه للأوعية الدموية بأقطار مختلفة. بالنسبة للحلقة الشريانية التي يبلغ قطرها حوالي 100 ميكرومتر أو أقل ، يلزم وجود سلك توجيه 15 ميكرومتر ؛ إذا كان القطر بين 100 ميكرومتر و 200 ميكرومتر ، يتم استخدام سلك توجيه 25 ميكرومتر ؛ إذا كان القطر أكبر من 200 ميكرومتر ، فيمكن استخدام سلك توجيه 40 ميكرومتر. من أجل اتساق التجربة ، يوصى باستخدام نفس القطر لجميع الأوعية من نفس النوع في تجربة واحدة. 19.
  5. أدخل سلك التوجيه الأول بعناية في الحلقة الشريانية داخل الطبق ، وثني جانبا واحدا من سلك التوجيه 90 درجة ، ثم انقله إلى الغرفة لتثبيته على حامل العينة من نوع المشبك باستخدام البراغي المتخصصة المتوفرة بالأداة لتشديد المسمار في اتجاه عقارب الساعة (الشكل 3 ب).
    ملاحظة: يتم إدخال سلك التوجيه لتوفير الدعم الهيكلي أثناء نقل الحلقة الشريانية عند تركيبها على حامل العينة ، مما يقلل من الضرر أو التشويه الناجم عن المناولة.
  6. قبل تثبيت الحلقة الشريانية على الحامل ، سجل طول الوعاء وعرضه. ضع الحلقة الشريانية بين الحاملين (الشكل 3C) واقرأ مقياس الميكرومتر ، حيث يمثل المقياس 1 10 ميكرومتر. اطرح قيمة المقياس المقاسة عندما يلمس الحاملون بعضهم البعض بالكاد (الشكل 3D) لتحديد طول الحلقة الشريانية وعرضها.
  7. قم بربط سلك توجيه آخر عبر الأوعية الدموية وقم بإصلاحه أخيرا على الجانب الآخر. قم بلف سلك التوجيه في اتجاه عقارب الساعة حول مسامير التثبيت على كلا الجانبين وتأكد من توصيله بإحكام بسطح حامل العينة.
    ملاحظة: أثناء عملية التثبيت بأكملها ، من الضروري تجنب سحب الأوعية الدموية أو خدش الجدار الداخلي للوعاء الدموي بسلك التوجيه لتجنب إتلاف بطانة الأوعية الدموية. يجب لف سلك التوجيه حول برغي التثبيت في طبقة واحدة دون تداخل. يجب أن يكون سلكان التوجيه على نفس المستوى الأفقي ، متوازيا مع بعضهما البعض ، ولا يتقاطعان مع بعضهما البعض. بالإضافة إلى ذلك ، بعد تثبيت سلك التوجيه ، اضبط حامل العينة على كلا الجانبين عن قرب ؛ ومع ذلك ، يجب أن تكون قريبة من بعضها البعض دون الاتصال فعليا ، وذلك لتجنب القوة ، كما هو موضح في الشكل 3E والشكل 3F.
  8. قم بتثبيت الغرفة مرة أخرى في نظام التصوير العضلي السلكي. ثم قم بتغطية الغطاء وتهوية الغاز. قم بتوصيل المستشعر وافتح برنامج الحصول على البيانات لاختبار توتر الأوعية الدموية.

5. التطبيع الخاص بالسفينة لتحديد التوتر الأولي الأمثل

ملاحظة: يعد إنشاء ظروف خط الأساس المستقرة، التي تعرف بأنها توتر الراحة الأمثل لأقصى استجابة انقباضية، أمرا بالغ الأهمية للقياسات الوظيفية القابلة للتكرار. ومع ذلك ، نظرا للاختلافات الفسيولوجية المتأصلة بين الأفراد ، تظهر الأوعية الدموية البشرية تباينا أكبر في الخصائص الميكانيكية الأساسية مقارنة بالأوعية الدموية الحيوانية32،33،34،35،36. هذه العوامل ، جنبا إلى جنب مع عدم تجانس الأوعية الدموية الجوهرية (على سبيل المثال ، التفاوتات الهيكلية والوظيفية في القطر ، وسمك الجدار ، وخصائص الانقباض) ، تؤدي مجتمعة إلى اختلافات كبيرة في التوتر الأساسي. لذلك ، لضمان التكاثر التجريبي ، يوصى بتطبيع كل وعاء دموي على حدة. يشتمل نظام التصوير العضلي السلكي على وحدة تطبيع مخصصة ، والتي تتيح التحديد الدقيق للتوتر الأساسي لكل سفينة.

  1. قم بتركيب الحلقات الشريانية في الغرفة كما هو موضح في الخطوات من 4.1 إلى 4.8. ابدأ تسجيل الرسم البياني ، وقم بتصفير القناة (الشكل 4 أ) ، واسمح بالتثبيت لمدة 30 دقيقة على الأقل ، ثم أعد تصفير القناة مرة أخرى قبل متابعة التطبيع.
  2. حدد إعدادات التطبيع من قائمة DMT (الشكل 4 ب) وقم بإعداد المعلمات على النحو التالي (الشكل 4 ج):
    1. معايرة العدسة (مم / شعبة): 1 ؛ الضغط المستهدف (كيلو باسكال): 13.3 ؛ IC1 / IC100: 0.9 ؛ متوسط الوقت عبر الإنترنت (بالثواني): 3 ؛ وقت التأخير (بالثواني): 60.
      ملاحظة: يشير IC1 إلى محيط الوعاء الداخلي عند أقصى إنتاج للقوة النشطة ، بينما يمثل IC100 المحيط المقابل للضغط الانتقالي 100 مم زئبق. تظهر الشرايين الكلوية البشرية تباينا كبيرا بين العينات ، مما يتطلب التوحيد القياسي ، على عكس النماذج الحيوانية التي لها خصائص وعائية متسقة للتحديد التجريبي وإعادة استخدام نسب IC1 / IC100. نظرا للاختلافات الكبيرة في قطر الوعاء وسمك الجدار والخصائص الميكانيكية بين العينات البشرية الفردية ، يجب أن تخضع كل سفينة لتطبيع مستقل لتحديد خصائصها الأساسية الفريدة. لذلك تم تحديد نسبة 0.9 كعنصر نائب لتهيئة البروتوكول هنا ولم يتم استخدامها في الممارسة العملية في هذا البروتوكول.
  3. حدد القناة المقابلة للشريان المستهدف وافتح شاشة التطبيع من قائمة DMT (الشكل 4C) ، واملأها بالبيانات المناسبة:
    1. نقاط نهاية الأنسجة: يجب أن يكون a1 0 ، يجب أن يكون a2 بطول الوعاء (بالمليمتر) ؛ قطر السلك: 40 ميكرومتر (أدخل قطر السلك المستخدم) ؛ قراءة الميكرومتر: القيمة من مقياس الميكرومتر، انقر فوق إضافة نقطة لتسجيل النقطة.
  4. عندما تكون جاهزا، انقر فوق إضافة نقطة لتسجيل النقطة الأولى وبدء إجراء التطبيع.
  5. قم بتطبيق التمدد السلبي ، وانتظر لمدة 3 دقائق ، وأدخل قراءة الميكرومتر كنقطة تالية ، ثم أضف 5 مل من 60 كلفن + لاستنباط تقلص الأوعية بوساطة البوتاسيوم (الشكل 5).
  6. انتظر حتى يصل الانكماش إلى هضبة. بعد ذلك ، اغسل محلول 60 كلفن + ب 5 مل من محلول كريبس 3 مرات ، واحسب بيانات القوة النشطة من التتبع عن طريق طرح القوة السلبية في كل امتداد من القوة المنشطة بالبوتاسيوم (الشكل 5).
  7. كرر الخطوات من 5.5 إلى 5.6 (خطوات "Stretch-60K + stimulation-Wash") حتى تصل القوة النشطة إلى الحد الأقصى لها ، ثم حدد التوتر الأساسي الأمثل الذي يكون فيه إنتاج القوة النشطة للسفينة أقصى حد (الشكل 5).
  8. قم بموازنة الحلقة الشريانية في الغرفة لمدة 10 دقائق قبل الانتقال إلى الخطوات التالية من التجربة.

6. الكشف عن تفاعل حلقة الشريان الكلوي

  1. تأكد من أن حجم كريبس في كل غرفة هو 5 مل قبل بدء التجربة.
  2. لتقييم الانكماش المعتمد على التركيز الناجم عن الفينيل إيفرين ، قم بتطبيق Phe التراكمي بزيادات نصف لوغاريتمية (10-9 إلى 10-4 م)37.
  3. ابدأ بأقل تركيز PHE (10-9 م). أضف 5 ميكرولتر من مخزون Phe (10-6 M) إلى الغرفة التي تحتوي على 5 مل من المخزن المؤقت Krebs ، وراقب باستمرار وانتظر حتى يستقر الانكماش (2-3 دقائق من التوتر دون تغيير) ، ضع علامة على النقطة ، ثم أضف التركيز التالي بزيادة نصف لوغاريتم. كرر حتى تصل إلى التركيز النهائي (10-4 م) ، مع الحفاظ على مراقبة متسقة طوال الوقت (الشكل 6).
  4. لاختبار المخدرات الإضافي ، اغسل الغرفة ب 5 مل دافئ من محلول كريبس 5 مرات على الأقل حتى يعود التوتر إلى خط الأساس ويظل مستقرا لمدة 10 دقائق على الأقل.
  5. لتقييم توسع الأوعية المعتمد على التركيز الناجم عن الأسيتيل كولين ، قم بتطبيق ACh التراكمي بزيادات نصف لوغاريتمية (10-8 إلى 10-5.5 م).
    ملاحظة: في الأوعية الدموية العادية ، تعمل الاستجابة للأستيل كولين (ACh) كمؤشر وظيفي لسلامة البطانة37،38. تعكس الاستجابة الموسعة للأوعية الرحم وظيفة البطانة من خلال الاسترخاء بدون وسيط في الأوعية السليمة. ومع ذلك ، في ظل الظروف المرضية ، قد يتم تخفيف هذه الاستجابة أو إلغاؤها بسبب ضعف التوافر البيولوجي لأكسيد النيتريك (NO) و / أو مسارات إشارات المستقبلات المتغيرة.
  6. قم بالتعاقد المسبق على السفن التي تحتوي على 10-4 M Phe ، أضف 5 ميكرولتر من مخزون Phe (10-1 M) إلى الغرفة التي تحتوي على 5 مل من Kraebs buffer ، واحتضانها لمدة 15 دقيقة. بدءا من أدنى تركيز ACh ، أضف 5 ميكرولتر من مخزون Ach (10-5 M) إلى الغرفة التي تحتوي على 5 مل من Kraebs buffer ، وراقب باستمرار وانتظر استجابة توسع الأوعية (التي تم تأكيدها من خلال الكشف عن التتبع المستمر) ، وحدد النقطة ، ثم انتقل إلى التركيز التالي. كرر حتى يتم اختبار الجميع (الشكل 7).
  7. أكمل التجربة عن طريق حفظ الملف وإزالة الحلقات الشريانية. نظف الغرفة جيدا عن طريق احتضانها ب 10 مل من محلول حمض الأسيتيك 8٪ لمدة 3 دقائق ، ثم اشطفها ب 10 مل من الماء 3 مرات. بعد ذلك ، احتضن 10 مل من الإيثانول بنسبة 95٪ لمدة 3 دقائق ثم اشطفه مرة أخرى ب 10 مل من الماء 3 مرات. أخيرا ، قم بإيقاف تشغيل كل من السخان والغاز ، مع التأكد من إزالة كل السائل قبل إيقاف تشغيل الغاز.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

في الكلى البشرية ، يمتد الشريان بين الفصيصات بين الأهرامات الكلوية بطول الوريد المقابل. يتميز هذا الشريان بجدار وعائي سميك نسبيا وغلاف كبير للأنسجة الدهنية ، ويتطلب تشريحا دقيقا بشكل خاص. يجب إزالة الأنسجة الدهنية المحيطة بدقة لتجنب استخدام القوة المفرطة أثناء إجراء العزل (الشكل 1 ج).

يتم وضع الشريان المقوس تشريحيا عند التقاطع القشري ، ويشكل قوسا نصف دائري مميزا على طول الهامش الخارجي للأهرامات الكلوية. بالمقارنة مع الشريان بين الفصصات ، فإنه يمتلك جدارا وعائيا أر...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

يعمل استقرار التروية الكلوية كهدف علاجي حاسم ونافذة على الفيزيولوجيا المرضية الديناميكيةالدموية 39،40. نقدم بروتوكولا للعزل الهرمي والتقييم الوظيفي للشرايين الكلوية البشرية من عينات استئصال الكلية الطازجة ، ومعالجة الثغرات الكبيرة في المنهجيات الحالية. على عكس الأساليب الحالية التي تقتصر على عينات الجثث أو النماذج الحيوانية ، تتيح تقنيتنا عزلا موثوقا به للشرايين الكلوية القابلة للحياة (بين الفصيصات إلى الفصيصية) مع الحفاظ على الس...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

المؤلفون ليس لديهم ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

يود المؤلفون أن يشكروا المتطوعين على مشاركتهم في هذه الدراسة ، ويشكرون أيضا الطاقم الجراحي في قسم المسالك البولية في مستشفى بكين الأول بجامعة بكين على توفير أنسجة الكلى. ودعمت هذا العمل مؤسسة بلدية بيجين للعلوم الطبيعية (F251013 إلى ي. ز. ، 7232096 إلى ي. ل.) المؤسسة الوطنية للعلوم في الصين (82325004 ، 92168114 إلى Y. Z. ، 82170422 إلى Y. L.) ؛ البرنامج الوطني للبحث والتطوير الرئيسي في الصين (2021YFF0501401 ، 2018YFA0800501 إلى YZ ، 2021YFF0501404 إلى YL ، 2023YFC2415500 إلى L.Y.) ؛ مشروع بحثي لمستشفى جامعة بكين الثالث في مختبر الولاية الرئيسي لتوازن الأوعية الدموية وإعادة تشكيلها (جامعة بكين ؛ 2024-VHR-SY-07 إلى YZ) ؛ 2023 لجنة الصحة ببلدية بكين العاصمة ، والعلوم الطبية والتكنولوجيا ، والابتكار ، والإنجاز ، والتحول ، ومشروع برنامج الترويج الممتاز (من YC202301QX0162 إلى L.Y.) ؛ تمويل البحوث السريرية الوطنية عالية المستوى للمستشفيات (مشروع صندوق توجيه حضانة الإنجازات العلمية والتكنولوجية لمستشفى جامعة بكين الأول ، 2024CX24 إلى L.Y.).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
كلوريد أستيلسيجما ألدريتش ، ميرك ، دارمشتات ، ألمانياط6625
طبق ثقافة أسود القاعتكنولوجيا ميو الدنماركية ، آرهوس ، الدنمارك300412
CaCl2سانغون للتكنولوجيا الحيوية المحدودة ، شنغهاي ، الصينA501330
د جلوكوزسانغون للتكنولوجيا الحيوية المحدودة ، شنغهاي ، الصينA610219
ملقط دومونتكنولوجيا ميو الدنماركية ، آرهوس ، الدنمارك300413
مقص تشريح Geuderتكنولوجيا ميو الدنماركية ، آرهوس ، الدنمارك400431
سلك التوجيهتكنولوجيا ميو الدنماركية ، آرهوس ، الدنمارك400447قطر 40 µ m
KClسانغون للتكنولوجيا الحيوية المحدودة ، شنغهاي ، الصينA100395
KH2PO4سانغون للتكنولوجيا الحيوية المحدودة ، شنغهاي ، الصينA100781
LabChart Professional الإصدار 8.3 ADnstruments ، أستراليا-
MgCl2· 6H2Oسانغون للتكنولوجيا الحيوية المحدودة ، شنغهاي ، الصينA100288
نظام تخطيط عضلة متعددة  تكنولوجيا ميو الدنماركية ، آرهوس ، الدنمارك620 مليون
كلوريد الصوديومسانغون للتكنولوجيا الحيوية المحدودة ، شنغهاي ، الصينA100241
NaHCO3سانغون للتكنولوجيا الحيوية المحدودة ، شنغهاي ، الصينA100865
فينيليفرينسيجما ألدريتش ، ميرك ، دارمشتات ، ألمانياص 6126

المراجع

  1. Molema, G., Aird, W. C. Vascular heterogeneity in the kidney. Semin Nephrol. 32 (2), 145-155 (2012).
  2. Jentzer, J. C., et al. Contemporary management of severe acute kidney injury and refractory cardiorenal syndrome: Jacc council perspectives. J Am Coll Cardiol. 76 (9), 1084-1101 (2020).
  3. Kanji, H. D., et al. Difference between preoperative and cardiopulmonary bypass mean arterial pressure is independently associated with early cardiac surgeryassociated acute kidney injury. J Cardiothorac Surg. 5 (1), 71(2010).
  4. Kwiatkowska, E., Kwiatkowski, S., Dziedziejko, V., Tomasiewicz, I., Domanski, L. Renal microcirculation injury as the main cause of ischemic acute kidney injury development. Biology (Basel). 12 (2), 327(2023).
  5. Ruilope, L. M. Hypertension in 2010:Blood pressure and the kidney. Nat Rev Nephrol. 7 (2), 73-74 (2011).
  6. Barger, A. C., Herd, J. A. The renal circulation. N Engl J Med. 284 (9), 482-490 (1971).
  7. Beloncle, F., Piquilloud, L., Asfar, P. Critical care nephrology. , third edition, Elsevier. Philadelphia. (2019).
  8. MompeóCorredera, B., HernándezMorera, P., CastañoGonzález, I., QuintanaMontesdeoca, M. D. P., MederosReal, N. Regions of the human renal artery:Histomorphometric analysis. Anat Cell Biol. 55 (3), 330-340 (2022).
  9. Evans, R. G., Smith, D. W., Lee, C. J., Ngo, J. P., Gardiner, B. S. What makes the kidney susceptible to hypoxia. Anat Rec (Hoboken). 303 (10), 2544-2552 (2020).
  10. Hwa, J. J., Ghibaudi, L., Williams, P., Chatterjee, M. Comparison of acetylcholinedependent relaxation in large and small arteries of rat mesenteric vascular bed. Am J Physiol. 266 (3 Pt 2), H952-H958 (1994).
  11. Buus, N. H., Van Bavel, E., Mulvany, M. J. Differences in sensitivity of rat mesenteric small arteries to agonists when studied as ring preparations or as cannulated preparations. Br J Pharmacol. 112 (2), 579-587 (1994).
  12. Barone, R., et al. Renal arterial and venous doppler in cardiorenal syndrome: Pathophysiological and clinical insights. Biomedicines. 12 (6), 1166(2024).
  13. Cuttone, G., et al. Exploring the utility of renal resistive index in critical care: Insights into ARDS and cardiac failure. Biomedicines. 13 (2), 519(2025).
  14. Li, Y., et al. Clinical practice report of contrastenhanced ultrasound in renal artery disease. J Ultrasound Med. 43 (1), 117-125 (2023).
  15. Andersen, F. T., et al. Continuous assessment of tissue perfusion using quantitative indocyanine green fluorescence imaging during controlled hypo and reperfusion. Surg Endosc. 39 (10), 6512-6521 (2025).
  16. Schubert, R., Gaynullina, D., Shvetsova, A., Tarasova, O. S. Myography of isolated blood vessels:Considerations for experimental design and combination with supplementary techniques. Front Physiol. 14 (8), 1176748(2023).
  17. Wang, Z., et al. Mir1865p carried by M2 macrophagederived exosomes downregulates TRPP2 expression in airway smooth muscle to alleviate asthma progression. Int Immunopharmacol. 148 (1), 114107(2025).
  18. Ikeda, M., Nakada, A., Abukawa, H., Yamazaki, T., Maruyama, I. Vibegron inhibits enhanced spontaneous contractions induced by anoxia/reoxygenation in isolated whole bladder from rats. Eur J Pharmacol. 926 (1), 175017(2022).
  19. Wenceslau, C. F., et al. Guidelines for the measurement of vascular function and structure in isolated arteries and veins. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 321 (1), H77-H111 (2021).
  20. Bayliss, W. M. On the local reactions of the arterial wall to changes of internal pressure. J Physiol. 28 (3), 220-231 (1902).
  21. Darmon, M., Schnell, D., Schneider, A. Monitoring of renal perfusion. Intensive Care Med. 48 (10), 1505-1507 (2022).
  22. Offenhäuser, C., et al. EphA2 regulates vascular permeability and prostate cancer metastasis via modulation of cell junction protein phosphorylation. Oncogene. 44 (4), 208-227 (2025).
  23. Vitverova, B., et al. Soluble endoglin and hypercholesterolemia aggravate endothelial and vessel wall dysfunction in mouse aorta. Atherosclerosis. 271, 15-25 (2018).
  24. Maathuis, M. H. J., De Groot, M., Ploeg, R. J., Leuvenink, H. G. D. Deterioration of endothelial and smooth muscle cell function in DCD kidneys after static cold storage in IGL1 or UW. J Surg Res. 152 (2), 231-237 (2009).
  25. Ingemansson, R., Budrikis, A., Bolys, R., Sjoberg, T., Steen, S. Effect of temperature in longterm preservation of vascular endothelial and smooth muscle function. Ann Thorac Surg. 61 (5), 1413-1417 (1996).
  26. McIntyre, C. A., Williams, B. C., Lindsay, R. M., McKnight, J. A., Hadoke, P. W. Preservation of vascular function in rat mesenteric resistance arteries following cold storage, studied by small vessel myography. Br J Pharmacol. 123 (8), 1555-1560 (1998).
  27. Ingemansson, R., Sjoberg, T., Massa, G., Steen, S. Longterm preservation of vascular endothelium and smooth muscle. Ann Thorac Surg. 59 (5), 1177-1181 (1995).
  28. Zheng, Y., et al. HMGB2 promotes smooth muscle cell proliferation through PPARγ/PGC1α pathwaymediated glucose changes in aortic dissection. Atherosclerosis. 399, 119044(2024).
  29. Zhang, B., Zhang, Y., Deng, F., Fang, S. Ligustrazine prevents basilar artery remodeling in twokidneytwoclip renovascular hypertension rats via suppressing PI3K/AKT signaling. Microvasc Res. 128, 103938(2020).
  30. Somiari, S. B., et al. Assessing the quality of RNA isolated from human breast tissue after ambient room temperature exposure. PLoS One. 17 (1), e0262654(2022).
  31. Srinivasan, M., Sedmak, D., Jewell, S. Effect of fixatives and tissue processing on the content and integrity of nucleic acids. Am J Pathol. 161 (6), 1961-1971 (2002).
  32. Potente, M., Makinen, T. Vascular heterogeneity and specialization in development and disease. Nat Rev Mol Cell Biol. 18 (8), 477-494 (2017).
  33. Lake, B. B., et al. An atlas of healthy and injured cell states and niches in the human kidney. Nature. 619 (7970), 585-594 (2023).
  34. Greenbaum, S., et al. A spatially resolved timeline of the human maternal-fetal interface. Nature. 619 (7970), 595-605 (2023).
  35. The Tabula Sapiens Consortium. The Tabula Sapiens: A multipleorgan, singlecell transcriptomic atlas of humans. Science. 376 (6594), eabl4896(2022).
  36. Barnett, S. N., et al. An organotypic atlas of human vascular cells. Nat Med. 30 (12), 3468-3481 (2024).
  37. Shen, Y., et al. Targeting cytokinelike protein FAM3D lowers blood pressure in hypertension. Cell Rep Med. 4 (6), 101072(2023).
  38. Zhao, L., et al. Restoration of autophagic flux improves endothelial function in diabetes through lowering mitochondrial ROSmediated eNOS monomerization. Diabetes. 71 (5), 1099-1114 (2022).
  39. Ergin, B., Akin, S., Ince, C. Kidney microcirculation as a target for innovative therapies in AKI. J Clin Med. 10 (18), (2021).
  40. Deferrari, G., Cipriani, A., La Porta, E. Renal dysfunction in cardiovascular diseases and its consequences. J Nephrol. 34 (1), 137-153 (2021).
  41. Owen, M. K., et al. Perivascular adipose tissue potentiates contraction of coronary vascular smooth muscle: Influence of obesity. Circulation. 128 (1), 9-18 (2013).
  42. AyalaLopez, N., et al. Perivascular adipose tissue contains functional catecholamines. Pharmacol Res Perspect. 2 (3), e00041(2014).
  43. AyalaLopez, N., Thompson, J. M., Watts, S. W. Perivascular adipose tissue's impact on norepinephrineinduced contraction of mesenteric resistance arteries. Front Physiol. 8, 37(2017).
  44. Ahmad, M. F., et al. Perivascular adipocytes store norepinephrine by vesicular transport. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 39 (2), 188-199 (2019).
  45. Ya-Jing, W., et al. Adipose tissue-derived cytokines, CTRPs as biomarkers and therapeutic targets in metabolism and the cardiovascular system. Vessel Plus. (1), 202-212 (2017).
  46. Osol, G., Brekke, J. F., McElroyYaggy, K., Gokina, N. I. Myogenic tone, reactivity, and forced dilatation: A threephase model of in vitro arterial myogenic behavior. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 283 (6), H2260-H2267 (2002).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

تقنية التشريح الدقيققياس تقلص الأوعية الدموية بالسلكالخلل الوظيفي الوعائيعزل الشريان داخل الكلويةالاستجابات الوعائية الحركيةعلاقة الطول والتوتر العضليةتلوين الهيماتوكسيلين والإيوسينانقباض الفينيل-إيفرينتطبيع الشرايين
التشريح المجهري متعدد المستويات والتنميط الوظيفي الهيكلي لفروع الشرايين الكلوية البشرية
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.