يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

تصميم وتطبيق الببتيد المثبط للتنظيم السريع في المختبر لمستويات التعديلات اللاحقة للترجمة في موقع معين

714 مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/68581

⸱

يونيو 20, 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1State Key Lab of Reproductive Medicine and Offspring Health, Nanjing Medical University, 2Department of Gynaecology and Obstetrics, the First Affiliated Hospital of Anhui Medical University, 3Animal Experiment Center of Research Department, the First Affiliated Hospital of Anhui Medical University, 4Hefei Cancer Hospital, Chinese Academy of Sciences

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

هنا ، نقدم بروتوكولا يحدد مواصفات التصميم ومعايير مراقبة الجودة ونظام التحقق الوظيفي ل TAT-PIP ، وهو ببتيد مثبط للتعديل بعد الترجمة.

الملخص

البروتينات هي المنفذة الأساسية لأنشطة الحياة ويتم تنظيمها على مستويات النسخ والترجمة وما بعد الترجمة (PTM). علاوة على ذلك ، يمثل PTM آلية أكثر تعقيدا لتنظيم أنشطة البروتين حيث يحتوي البروتين بشكل عام على أنواع مختلفة من PTMs ومواقع متعددة ل PTM معين. يمكن استخدام تعداء البلازميد أو الفيروس العدسي والفيروس الغدي في الفحص الأولي لموقع PTM المهم وظيفيا بين جميع المواقع المحددة. ومع ذلك ، تواجه هذه الأساليب دائما تحديات مثل انخفاض الكفاءة في دخول الخلايا والأنسجة ، واستهلاك الوقت والتكاليف المرتفعة ، ورد الفعل المناعي المحتمل ، وما إلى ذلك. لمعالجة هذا الأمر ، قمنا مؤخرا بتطوير وتوظيف نوع من الببتيد المعاد تجميعه يسمى TAT-PIP ، الببتيد المثبط PTM المترافق TAT. يتكون TAT-PIP من وحدة TAT التي تسهل دخول الخلايا والأنسجة ووحدة PIP التي تقلل من تنظيم PTM على وجه التحديد في المواقع المستهدفة من خلال الربط التنافسي. هنا ، نقدم بروتوكولا يحدد مواصفات التصميم ومعايير مراقبة الجودة ونظام التحقق الوظيفي ل TAT-PIP. في قسم التصميم ، نصف الاتساق والطول الاختياري والخصوصية والحفظ ل TAT-PIP. بعد ذلك ، نقدم متطلبات اختبار الجودة الخاصة ب TAT-PIP ، والتي تضمن فعاليتها وسلامتها. في تطبيق جزء TAT-PIP ، قدمنا اختبار تدرج تركيز TAT-PIP ، وعملية حضانة الخلايا المختبرة ، والكشف الظاهري اللاحق. باختصار ، نصف طريقة فعالة لفحص مواقع PTM عن طريق هدم موقع معين بشكل انتقائي ومراقبة النمط الظاهري الناتج لاستنتاج وظيفته. نظرا لتكلفتها الاصطناعية المنخفضة وكفاءتها العالية ، تتغلب هذه الطريقة على قيود التقنيات الحالية ، مثل تعداء البلازميد.

المقدمة

البروتينات هي المنفذين الأساسيين لأنشطة الحياة ، وتتضمن عملياتها التنظيمية البيولوجية جانبين أساسيين لتنظيم التعبير الجيني - نسخ الجينات وترجمة mRNA. ومع ذلك ، خلال العقود الماضية ، أصبح التعديل اللاحق للترجمة (PTM) آلية أخرى لا غنى عنها لتنظيم الوظائف الخلوية1. تلعب الفسفرة ، وهي أكثر أنواع PTM شهرة للباحثين ، دورا مهما بشكل خاص في الوظائف الفسيولوجية. على سبيل المثال ، بعد فسفرة كيناز المنظم للإشارة خارج الخلية (ERK) بواسطة كيناز MEK في مواقع Thr202 و Tyr204 ، يتغير شكله ، مما يعرض الموقع النشط ، الذي ينشط البروتينات المستهدفة في اتجاه مجرى النهر ، مثل عوامل النسخ2. في المقابل ، عندما يتم فسفرة Ser9 من GSK-3β بواسطة Akt / PKB kinase ، يتم حظر جيبه المرتبط بالركيزة ، مما يؤدي إلى فقدان نشاط الكيناز3. يعد كل مكان PTM مهما آخر ينظم العمليات الخلوية المختلفة من خلال الارتباط التساهمي لجزيئات اليوبيكويتين ببروتينات الركيزة. يحتوي Ubiquitin على 7 بقايا ليسين (K6 ، K11 ، K27 ، K29 ، K33 ، K48 ، K63) وميثيونين N-terminal (M1). إن ربط سلاسل اليوبيكويتين في مواقع مختلفة يضفي مصائر مختلفة على بروتينات الركيزة. تتمثل الوظيفة الأساسية للانتشار في كل مكان مرتبط ب K48 في تمييز بروتينات الركيزة للتحلل بواسطة البروتيازوم4. على العكس من ذلك ، فإن الوظيفة الأساسية للانتشار في كل مكان مرتبط ب K63 هي الانخراط في نقل إشارة غير متدهور ، مثل إصلاح تلف الحمض النووي ، والاستجابات الالتهابية ، والالتقام الخلوي5. في السنوات الأخيرة ، مع التقدم السريع لتقنيات البروتينات ، تم اكتشاف عدد متزايد من PTMs الجديدة. بالإضافة إلى الأستلة الكلاسيكية ، تم تحديد الأسيلات الجديدة مثل البروبيونيل والكروتونيل والجلوتاريلاسیون6. في مجال تعديلات الهيستون ، يتداخل لبنة هيستون مع تعديل الحمض النووي الريبي م6أ وتوازن البيئة المكروية المناعية7. في مجال التعديلات غير الهيستونية ، يعد الحد من كروتونيل ATP5O عاملا ضارا رئيسيا في تقليل تنظيم استقلاب الدهونالفوسفورية 8.

يتطلب إجراء البحوث حول PTM تطوير تحليل PTM proteome9 بشكل منهجي. يشمل هذا المجال اتجاهين بحثيين رئيسيين: تحليل ملفات تعريف PTM على مستوى البروتين بالكامل والتحديد الشامل لمواقع PTM لبروتين معين. على الرغم من أن قياس الطيف الكتلي الحديث يمكنه تحديد أنواع مختلفة من PTMs والمواقع المحددة بشكل فعال ، إلا أن فحص المواقع الوظيفية الرئيسية والتحقق من صحتها يظل تحديا علميا أساسيا يقيد تقدم البحث. يعد إنشاء استراتيجيات فعالة لفحص المواقع الخطوة الأولى نحو حل وظيفة المواقع التنظيمية الرئيسية. تتضمن الطرق التقليدية بناء بلازميدات طافرة لمواقع محددة (تعطيل الطفرات ، وتنشيط الطفرات) ، وإدخالها في الخلايا المستهدفة من خلال تقنيات التعدي في المختبر ، والتقييم المنهجي للتغيرات في مؤشرات النمط الظاهري مثل تكاثر الخلايا ، وموت الخلايا المبرمج ، والإجهاد التأكسدي. ومع ذلك ، تواجه هذه الاستراتيجية عقبات تقنية كبيرة في نماذج الخلايا الصامتة النسخ مثل البويضات وأنظمة زراعة الأنسجة الأولية. على الرغم من أن نظام نقل الفيروسات العدسية أو الفيروس الغدي يمكن أن يتغلب جزئيا على مشكلة كفاءة التعدي ، إلا أن تطبيقه يواجه تحديات مزدوجة: التكاليف الاقتصادية المرتفعة وكفاءة الاختراق المنخفضة للجزيئات الفيروسية في نماذج الأنسجة المختبرية . في حين أن استراتيجية بناء الفئران المتحولة طويلة الأمد ومكلفة للغاية. بشكل عام ، من الملح وضع استراتيجيات اقتصادية وفعالة للفحص الأولي لمواقع PTM المهمة وظيفيا.

في السنوات الأخيرة ، نجح فريقنا في تطوير واستخدام تقنية تقليل تنظيم PTM السريعة تسمى TAT-PIP ، الببتيد المثبط PTM المترافق TAT ، بناء على التثبيط التنافسي للببتيد. وتتمثل ميزته الأساسية في عالميته وكفاءته العالية لإجراء الفحص الأولي لمواقع PTM المهمة وظيفيا، مما يوفر أساسا حاسما للتحليلات المتعمقة للآليات الجزيئية لمواقع PTM الرئيسية. توضح هذه الدراسة بشكل منهجي الإطار الرئيسي وعملية تنفيذ TAT-PIP ، وتوضح فعاليتها في تنظيم مستوى PTM في موقع معين من خلال بيانات تجريبية تمثيلية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

1. تصميم تسلسل TAT-PIP

ملاحظة: يتكون TAT-PIP من جزأين من الببتيدات (الشكل 1): الجزء الطرفي N هو TAT ، CYGRKKRRQRRR ، والذي يظل دون تغيير لكل TAT-PIP ويمكن أن يساعد في الدخول بكفاءة في الخلايا المستنبتة في المختبر أو في الأنسجة في الجسم الحي . الجزء الطرفي C عبارة عن تسلسل متعدد الببتيد حول موقع PTM المحدد (الشكل 1 ، عادة ما يكون ليسين في الرمز "K" ، أحمر مميز) لبروتين الكائن. يبلغ طول PIP حوالي 10-15 بقايا AA (إذا كانت أطول ، تزداد التكلفة ؛ إذا كانت أقصر ، تنخفض الخصوصية بشكل كبير).

  1. تحسين تسلسل PIP من خلال تحليل الانفجار (الشكل 2).
    1. قم بتسجيل الدخول إلى https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/ ، وانقر فوق البحث عن تسلسل البروتين.
    2. انسخ تسلسل البروتين المستهدف في نافذة إدخال تسلسل الاستعلام .
    3. في اختيار بحث، حدد خيار قواعد البيانات القياسية . حدد خيار blastp (بروتين بروتين BLAST) في اختيار البرنامج. أخيرا ، انقر فوق الزر BLAST (الشكل 2 ب).
    4. حدد مقاطع الببتيد ذات الخصوصية القصوى كنقاط مرشحة.
  2. قم بإجراء مقارنة تماثل بين البشر والفئران من أجل PIP النهائي.
    1. قم بتسجيل الدخول إلى https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/ ، وانقر فوق البحث عن تسلسل البروتين.
    2. انسخ تسلسلات البروتين من كل من الأنواع البشرية والفئران والصقه في مربع تسلسل الإدخال.
    3. انقر فوق الزر إرسال للحصول على النتائج.
    4. حدد PIP مع تماثل 100٪ بين الإنسان والفأر (الشكل 2 ج).
  3. تحديد تكوين TAT-PIP ، والذي يتكون من TAT الطرفي N و C-terminal PIP.

2. التوليف والتحقق من جودة TAT-PIP

  1. اختر شركة تتمتع بخبرة واسعة في المشروع لضمان نقاء الببتيد بما لا يقل عن 98٪ مع قياس الطيف الكتلي ، وتجنب الشوائب التي يمكن أن تؤثر على التجارب اللاحقة.
    ملاحظة: يجب أن يكون مستوى السموم الداخلية للعديد الببتيد ≤10 ، ويجب أن يكون خاليا من مسببات الأمراض.

3. تطبيق TAT-PIP

  1. استخدم الماء فائق النقاء الخالي من مسببات الأمراض لإذابة TAT-PIP لتحقيق تركيز مخزون يبلغ 10 مجم / مل. قم بتوزيع المخزون في أنابيب صغيرة لتجنب دورات التجميد والذوبان المتكررة ، مما يؤدي إلى التمسخ الجزئي.
    ملاحظة: ستساعد إضافة 1٪ من ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO) على حماية بنية TAT-PIP.
  2. عالج الخلايا باستخدام TAT-PIP.
    1. زراعة خلايا الكلى الجنينية البشرية 293T في وسط النسر المعدل من Dulbecco المكملة بمصل بقري الجنين 10٪ و 1٪ بنسلين / ستربتومايسين في ظل ظروف الاستزراع القياسية (37 درجة مئوية ، 5٪ ثاني أكسيدالكربون 2).
      ملاحظة: بعد البذر ، تمت زراعة الخلايا لمدة 12 ساعة تقريبا ، وتم إجراء علاج TAT-PIP عندما وصل التقاء إلى حوالي 70٪.
    2. قم بتخفيف TAT المذاب إلى 1 مجم / مل باستخدام PBS ، ثم يضاف مباشرة إلى وسط زراعة الخلية بالجرعة المناسبة (التركيز النهائي الموصى به لوسط الاستزراع: 0.05 مجم / مل ، 0.1 مجم / مل ، 0.2 مجم / مل ، 0.4 مجم / مل) لمدة 24 ساعة.
    3. اغسل الخلايا بوسط الثقافة الأصلي 3 مرات.
    4. قم بإجراء تحليل اللطخة الغربية للتحقق من مدى تقليل تنظيم PTM.
      ملاحظة: بناء على التجربة والنتائج التجريبية اللاحقة ، فإن التركيز النهائي الأمثل ل TAT-PIP هو 0.1 مجم / مل.

4. اللطخة الغربية

  1. تحضير عينات بروتين الخلية.
    1. اغسل الخلايا بمحلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) 3 مرات ، وأضف 200 ميكرولتر من محلول تحلل مقايسة الترسيب المناعي الإشعاعي القوي (RIPA) (مع إضافة مثبط فينيل ميثيل سلفونيل فلوريد [PMSF] - البروتياز المضافة) إلى حبيبات الخلية ، واحتضانها لمدة 5 دقائق للتحلل الأولي ، واكشطها باستخدام مكشطة الخلية.
    2. قم بتقطيع الخليط باستخدام كسارة بالموجات فوق الصوتية بكثافة طاقة 12٪ لمدة 5 ثوان.
    3. قم بتبريد الخلية المحللة على الثلج لمدة 30 دقيقة وجهاز الطرد المركزي عند 13400 جم عند 4 درجات مئوية لمدة 10 دقائق.
    4. انقل المادة الطافية المحتوية على البروتينات إلى أنبوب طرد مركزي مبرد مسبقا سعة 1.5 مل. أضف 1/4 حجم من 5x عينة عازلة إلى المادة الطافية (التركيز النهائي 1x).
    5. قم بتدوير الخليط ، وقم بتسخينه على حرارة 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق في ترموستات جاف ، واتركه يبرد على الثلج لمدة دقيقتين.
    6. قم بقياس تركيز البروتين الكلي باستخدام اختبار برادفورد على Nanodrop.
  2. إجراء الرحلان الكهربائي لجل دوديسيل كبريتات الصوديوم بولي أكريلاميد (SDS-PAGE).
    1. استخدم جل قابل للحل بنسبة 12٪ وجل تكديس بنسبة 4٪ ل SDS-PAGE.
    2. ماصة عينات البروتين في الآبار وفقا للحجم المحدد.
    3. قم بتشغيل جهاز الرحلان الكهربائي وقم بتشغيله أولا عند 80 فولت ، 300 مللي أمبير لمدة 30 دقيقة لمحاذاة النطاقات في الواجهة بين المواد الهلامية للتكديس والحل. ثم قم بتشغيل 120 فولت ، 300 مللي أمبير لمدة 45 دقيقة لحل البروتينات.
    4. انقل البروتينات من الجل إلى غشاء فلوريد البولي فينيلدين (PVDF) باستخدام جهاز نقل سريع.
  3. إجراء الحجب وحضانة الأجسام المضادة والتصور.
    1. سد غشاء PVDF في 5٪ حليب خالي الدسم في محلول ملحي مخزن ثلاثي يحتوي على 0.1٪ توين 20 (TBST) واحتضانه في درجة حرارة الغرفة (RT) لمدة 1 ساعة.
    2. احتضان الغشاء بالجسم المضاد الأساسي المخفف 1: 1000 في 5٪ حليب خالي الدسم / PBST طوال الليل عند 4 درجات مئوية على المدور.
    3. اغسل الغشاء ثلاث مرات باستخدام TBST (10 دقائق لكل منهما).
    4. احتضان الغشاء بالجسم المضاد الثانوي المخفف 1: 1000 في 5٪ حليب خالي الدسم / TBST في RT لمدة 1 ساعة.
    5. اغسل الغشاء ثلاث مرات باستخدام TBST (10 دقائق لكل منهما).
    6. كشف الغشاء في سلسلة زمنية (5 ثوان ، 10 ثوان ، 20 ثانية ، 30 ثانية ، 60 ثانية ، 120 ثانية) للحصول على الصورة المثلى تحت جهاز التلألؤ الكيميائي المولد كهربائيا (ECL).

5. التحقق الوظيفي من TAT-PIP في الخلايا المزروعة في المختبر

  1. الكشف عن مستويات أنواع الأكسجين التفاعلية الخلوية (ROS).
    1. لوحة 293T الخلايا بكثافة مثالية تبلغ 1 × 105 خلايا / بئر في صفيحة استزراع 24 بئرا.
    2. عالج الخلايا باستخدام الببتيد المثبط للكروتونيل (THCIP) (0.1 مجم / مل) المترافق ب TAT ، ثم اغسل الخلايا باستخدام PBS.
    3. احتضان الخلايا ب 10 ميكرومتر ثنائي كلورو ثنائي هيدرو فلورسين ثنائي الأسيتات (DCFH-DA) في DMEM الخالي من المصل عند 37 درجة مئوية في الظلام لمدة 20 دقيقة.
    4. التقط الصور باستخدام مجهر مضان مقلوب، وقم بقياس شدة التألق باستخدام وظيفة القياس في ImageJ.
      ملاحظة: تم استخدام مجموعة مرشحات FITC ، مع مرشح انبعاث 465-495 نانومتر ، ومرآة ثنائية اللون 505A ، ومرشح انبعاث ثان من 512-550 نانومتر.
  2. مقايسة تكاثر الخلايا
    1. بذور خلايا 293T بكثافة مثالية تبلغ 1 × 105 خلايا لكل بئر في صفيحة استزراع 24 بئر.
    2. أضف 10 ميكرولتر من كاشف CCK-8 إلى كل بئر.
    3. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية لمدة ساعتين.
    4. سجل الامتصاص عند 450 نانومتر باستخدام قارئ صفيحة دقيقة واطرح إشارة الخلفية من الآبار الفارغة (متوسطة + CCK-8).
    5. تطبيع البيانات لحساب صلاحية الخلية.
  3. الكشف عن مستويات ATP الخلوية
    1. قم بتحليل الخلايا باستخدام عازلة التحلل. جهاز الطرد المركزي للمحللة عند 12,000 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. اجمع المادة الطافية لتحليلها لاحقا.
    2. قم بتخفيف محلول ATP القياسي باستخدام المخزن المؤقت للتحلل لإنشاء تدرج تركيز يبلغ 0.5 ميكرومتر ، و 1 ميكرومتر ، و 2 ميكرومتر ، و 3 ميكرومتر ، و 4 ميكرومتر ، و 5 ميكرومتر.
    3. أضف 20 ميكرولتر من محلول الكشف عن ATP إلى كل بئر يحتوي إما على مادة طافية للخلية أو معيار ATP.
    4. قم بقياس إشارة الإنارة على الفور باستخدام قارئ صفيحة دقيقة.
      1. انقر فوق تخطيط اللوحة، وحدد قالب اللوحة المقابل في تغيير قالب اللوحة لإعداد العينات (المعايير والعينات).
      2. ثم انقر فوق البروتوكول على اليسار ، واختر الزر Chemiluminescence ، ثم انقر فوق ابدأ لبدء الاكتشاف.
    5. قم بإنشاء منحنى قياسي من الإشارات المضيئة لمعايير ATP واستخدمه لتحديد تركيز ATP في طاف الخلية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

تصف هذه الدراسة استراتيجية تستخدم TAT-PIP لتقليل تنظيم مستوى PTM للبروتين المستهدف في موقع معين بناء على التثبيط التنافسي. في مثال نموذجي ، تمت إعادة تسمية TAT-PIP هنا على وجه التحديد باسم THCIP. وهو يتألف من وحدتين وظيفيتين: (1) ، الببتيد المخترق للخلية N (CYGRKKRRQRRRRRR) ، والذي يسمح ل THCIP باختراق الخلايا ؛ (2) التسلسل الطرفي C حول K116 من H3 ، AIHAKRVTIMPKD ، والذي يتنافس على وجه التحديد مع H3 الداخلي ليتم كروتونيل في K116 (الشكل 2 أ). يطلق على الجسم المضاد المحدد ضد هذا الموقع اسم H3c...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

في هذا البروتوكول ، تعتبر الخطوات التالية بالغة الأهمية. أولا ، يعالج تصميم TAT-PIP خصوصية الببتيد. ثانيا ، تحسين التطبيق والتركيز النهائي ؛ يجب اختبار التركيز الأمثل بعناية لتحقيق ضربة قاضية فعالة وسريعة. ثالثا ، للتحقق من تأثير TAT-PIP ، يوصى بإجراء تجارب متعددة بدلا من الاعتماد على تجربة واحدة لتأكيد آثارها الإضافية.

بمقارنة الطرق الحالية ، توضح هذه الطريقة بشكل أساسي ثلاث مزايا: أولا ، بالمقارنة مع تعداء البلازميد وعدوى الفيروسات العدسية أو الفيروسات الغدي...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

يعلن أصحاب البلاغ أنه ليس لديهم ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

نشكر جميع أعضاء المختبر على مساعدتهم الكريمة. تم دعم هذا البحث ماليا من قبل البرنامج الوطني للبحث والتطوير الرئيسي في الصين إلى Dong Zhang (رقم المنحة: 2022YFC2702202).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
نظام التصوير الأوتوماتيكي متعدد الوظائفTanon4600يحدد مقياس التعرض نطاقات البروتين المستهدفة ويصورها عن طريق اكتشاف إشارات التألق أو التلألؤ الكيميائي على الغشاء بعد معالجة التطوير.
مجموعة عد الخلايا -8GLPBIOGK10001بناء على العلاقة بين قابلية التمثيل الغذائي للخلية وعدد الخلايا ، تقوم هذه الطريقة بتقييم القدرة التكاثرية للخلايا عن طريق قياس قدرة الخلايا على الاختزال إلى كواشف CCK-8
Dulbecco s النسر المعدل s متوسط (DMEM)جيبكو11995065النسر المعدل من Dulbecco (DMEM) هو وسيط قاعدي يستخدم على نطاق واسع لدعم نمو مجموعة واسعة من خلايا الثدييات.
الركيزة الكيميائية ECLBiosharpBL520BECL إشارات ضوئية من خلال تفاعلات التلألؤ الكيميائي التي تتيح اكتشاف بروتينات معينة أو أحماض نووية.
جهاز الرحلان الكهربائيTanonEPS600يتمثل الدور الرئيسي لجهاز الرحلان الكهربائي في فصل وتحليل الجزيئات الكبيرة البيولوجية &zwnj.
مجموعة فحص ATP المحسنةBeyotimeS0027يمكن للمجموعة الكشف بشكل فعال عن مستوى ATP للعينات
مصل الأبقار الجنيني (FBS)يوفر مصل الأبقار الجنيني Gibco16000-044(FBS) العناصر الغذائية الأساسية وعوامل النمو للحفاظ على الخلايا ونموها.
GenScript eBlotL1GenScriptL00686الجهاز ذو كفاءة عالية وقادر على تحقيق نقل البروتين بسرعة من هلام بولي أكريلاميد إلى غشاء PVDF في غضون 15 دقيقة
مجهر مضان مقلوبOlympus CorporationIX73الأشعة فوق البنفسجية كمصدر للضوء لإشعاع الكائن الذي تم فحصه لجعله ينبعث منه مضان ، ثم مراقبة شكل وموقع الكائن تحت مجهر.
مقياس الطيف الضوئي للأشعة فوق البنفسجية NanoDrop2000 microvolume UV-VisThermo Scientific2000NanoDrop لتحديد تركيز الحمض النووي أو الحمض النووي الريبي
PVDF غشاءBioRAD1620177هذا النوع من أغشية PVDF لديه مقاومة كيميائية ممتازة وقدرة عالية على ربط البروتين
مجموعة فحص ROSBeyotimeS0033Sيمكن للمجموعة اكتشاف مستوى أنواع الأكسجين التفاعلية في الخلايا بدقة
TAT-conjugater H3K16 الببتيد المثبط للكروتونيلنانجينغ تاوبو التكنولوجيا الحيوية المحدودةCN218107533Uيمكن أن تتنافس على وجه التحديد مع H3 الذاتي ليتم كروتونيل في K16 & nbsp ؛
ل TBSTBiosharpBL602ATBST تنظيف المواد غير ذات الصلة على الغشاء ، وتقليل الأخطاء التجريبية ، وضمان دقة النتائج التجريبية ؛
كسارة بالموجات فوق الصوتيةLICHENLC-AUD-150Pتشمل الوظائف الرئيسية للجهاز تجزئة الخلايا وتشتت الجسيمات والاستحلاب
Varioskan LUXThermo FisherVL0000D0Microplate تحقيق تحليل كمي عالي الإنتاجية للعينات البيولوجية عن طريق الكشف عن الإشارات الضوئية (مثل الامتصاص أو التألق أو التلألؤ) للعينات في الصفائح الدقيقة
وسط تولد ركائز يستخدم المجهر الفلوري تم استخدام يمكن يمكن لقارئات

المراجع

  1. Krishna, R. G., Wold, F. Post-translational modification of proteins. Adv Enzymol Relat Areas Mol Biol. 67, 265-298 (1993).
  2. Li, R., et al. Metal-dependent protein phosphatase 1A functions as an extracellular signal-regulated kinase phosphatase. FEBS J. 280 (11), 2700-2711 (2013).
  3. Blankesteijn, W. M., van de Schans, V. A., ter Horst, P., Smits, J. F. The Wnt/frizzled/GSK-3 beta pathway: a novel therapeutic target for cardiac hypertrophy. Trends Pharmacol Sci. 29 (4), 175-180 (2008).
  4. Sui, B., Zheng, J., Fu, Z., Zhao, L., Zhou, M. TRIM72 restricts lyssavirus infection by inducing K48-linked ubiquitination and proteasome degradation of the matrix protein. PLoS Pathog. 20 (2), e1011718(2024).
  5. Martínez-Férriz, A., Ferrando, A., Fathinajafabadi, A., Farràs, R. Ubiquitin-mediated mechanisms of translational control. Semin Cell Dev Biol. 132, 146-154 (2022).
  6. Li, X., Yu, T., Li, X., He, X., Zhang, B., Yang, Y. Role of novel protein acylation modifications in immunity and its related diseases. Immunology. 173 (1), 53-75 (2024).
  7. Zhao, S. S., Liu, J., Wu, Q. C., Zhou, X. L. Role of histone lactylation interference RNA m6A modification and immune microenvironment homeostasis in pulmonary arterial hypertension. Front Cell Dev Biol. 11, 1268646(2023).
  8. Chen, L. J., et al. ATP5O hypo-crotonylation caused by HDAC2 hyper-phosphorylation is a primary detrimental factor for downregulated phospholipid metabolism under chronic stress. Research (Wash D C). 2022, 9834963(2022).
  9. Fan, S., Kong, C., Zhou, R., Zheng, X., Ren, D., Yin, Z. Protein post-translational modifications based on proteomics: a potential regulatory role in animal science. J Agric Food Chem. 72 (12), 6077-6088 (2024).
  10. Li, C. R., et al. BIN2 inhibition suppress ovarian cancer progression meanwhile protect ovarian function through downregulating HDAC1 and RPS6 phosphorylation respectively. Clin Transl Med. 14 (10), e70051(2024).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

الببتيد المثبط لتعديلات ما بعد الترجمة (PTM Inhibitory Peptide)TAT-PIPتنظيم البروتينالتثبيط النوعي للموقعتصميم الببتيدالكشف المظهرياختبار تدرج التركيزببتيد دخول الخلاياالتحقق الوظيفي

تم نشر هذه المقالة

الفيديو قريباً

تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.