يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

وظيفة الشريان الكلوي وعلم الأنسجة المرضي المرتبط بالبلازما ومستقلبات البراز في مرضى قصور القلب

539 مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/68583

⸱

سبتمبر 9, 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Cardiology and Institute of Vascular Medicine, Peking University Third Hospital, State Key Laboratory of Vascular Homeostasis and Remodeling, Peking University, 2Institute of Cardiovascular Sciences, School of Basic Medical Sciences, Peking University Health Science Center; State Key Laboratory of Vascular Homeostasis and Remodeling, Peking University, 3Beijing Key Laboratory of Cardiovascular Receptors Research, 4Research Unit of Medical Science Research Management/Basic and Clinical Research of Metabolic Cardiovascular Diseases, Chinese Academy of Medical Sciences, Haihe Laboratory of Cell Ecosystem, 5Department of Cardiology, State Key Laboratory of Complex Severe and Rare Diseases, Peking Union Medical College Hospital, Chinese Academy of Medical Sciences & Peking Union Medical College, 6Department of Urology, Peking University First Hospital; Institute of Urology, Peking University; Beijing Key Laboratory of Urogenital Diseases (Male) Molecular Diagnosis and Treatment Center, National Urological Cancer Center, 7Institute of Cardiovascular Diseases, First Affiliated Hospital of Dalian Medical University, 8Research Center for Cardiopulmonary Rehabilitation, University of Health and Rehabilitation Sciences Qingdao Hospital (Qingdao Municipal Hospital), School of Health and Life Sciences, University of Health and Rehabilitation Sciences

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

هنا ، نقدم بروتوكولا لتطوير منصة متعددة الوسائط لتوضيح الخلل الوظيفي الوظيفي للأوعية الدموية الكلوية المدفوعة بالمستقلب القلبي في متلازمة القلب والكلوية.

الملخص

يتم التعرف بشكل متزايد على ميكروبات الأمعاء والمستقلبات المشتركة للميكروبات المضيفة المرتبطة بها كمنظمين رئيسيين للتوازن الأيضي الجهازي والمحور القلبي الكلوي ، لا سيما في سياق متلازمة القلب والكلى. على الرغم من أن الأدلة السريرية تشير إلى أن الخلل الوظيفي القلبي قد يبدأ أو يؤدي إلى تفاقم التغيرات المرضية الكلوية ، إلا أن جزيئات الإشارات الأيضية الرئيسية التي تتوسط محور القلب والكلوي وآلياتها الأساسية تظل بعيدة المنال. تؤسس هذه الدراسة منصة بحثية منهجية جديدة تدمج توقيعات القلب والأيض مع تحليل وظائف الأوعية الدموية الكلوية ، والتي تشمل: (1) عزل واستخراج مستقلبات البلازما / البراز من مرضى قصور القلب. (2) عزل الأوعية الدموية الكلوية خارج الجسم الحي وتقنيات الثقافة الأولية ؛ (3) إطار تقييم متعدد الوسائط للتفاعلات الأيضية القلبية الكلوية ، بما في ذلك المقايسات الوظيفية للأوعية الدموية ، والاختبارات الكيميائية الحيوية الجزيئية لعلامات إصابة الأوعية الدموية الكلوية ، والتحليلات النسيجية المرضية. بالمقارنة مع الضوابط الصحية ، أدت المستقلبات من مرضى قصور القلب إلى ضعف وظائف الأوعية الدموية الكلوية واستجابات التهابية مستحثة ، مما يسلط الضوء على إمكاناتها كمؤشرات حيوية وظيفية في متلازمة القلب والكلى. لا تركز هذه الدراسة على مستقلب معين; لذلك ، ستكون هناك حاجة إلى مزيد من التحديد والتحقق من صحة الأنواع المحددة من المستقلبات التي تمارس تأثيرات مسببة للأمراض في الدراسات المستقبلية باستخدام تقنيات تحليلية مثل LC-MS / MS و NMR. كشف تطبيق هذه المنصة أن المستقلبات المرتبطة بأمراض القلب تضعف وظيفة الأوعية الدموية الكلوية والتوازن. توفر هذه النتائج نظرة ميكانيكية لمحركات التمثيل الغذائي للتفاعلات القلبية الكلوية وتوفر أداة متعدية لتحديد المؤشرات الحيوية الجديدة والأهداف العلاجية.

المقدمة

متلازمة القلب والكلوي (CRS) هي حالة مرضية معقدة تتميز بتلف ثنائي الاتجاه بين القلب والكلى. تم وصف الترابط المعقد بين هذين العضوين لأول مرة من قبل روبرت برايت في عام 1836 ، الذي وثق بشكل منهجي تغيرات هيكلية كبيرة في القلب المرتبطة بأمراض الكلى المتقدمة1. يرتبط انتشار CRS ارتباطا وثيقا بالتعايش بين أمراض القلب والأوعية الدموية (CVD) وأمراض الكلى المزمنة (CKD). تشير الدراسات إلى أن ما يقرب من 30٪ من مرضى قصور القلب يعانون أيضا من مرض الكلى المزمن ، في حين أن 44٪ -51٪ من الوفيات لدى مرضى مرض الكلى المزمن تعزى مباشرة إلى أحداث القلب والأوعيةالدموية 2.

تمثل إدارة معيار الإبلاغ المشترك العديد من التحديات الكبيرة. أولا ، لا تزال الرعاية السريرية مجزأة ، مع نقص التنسيق متعدد التخصصات وآليات الإنذار المبكر ، مما يؤدي غالبا إلى تأخير التدخلات خلال المرحلة3 من إلغاء التعويض. ثانيا ، تواجه استراتيجيات العلاج الحالية معضلة متناقضة. يمكن للعلاجات التقليدية ، مثل مدرات البول ومثبطات نظام الرينين والأنجيوتنسين والألدوستيرون (RAAS) ، أن تخفف من أعراض قصور القلب4 ؛ ومع ذلك ، فإن استخدامها لفترات طويلة أو جرعة عالية قد ينشط RAAS والجهاز العصبي الودي (SNS) ، مما يؤدي إلى تفاقم نقص الأكسجة الكلوية والتليف ، مما يساهم في النهاية في مقاومة مدر للبول وتدهور وظائف الكلى5. وبالمثل ، في حين أن مثبطات الإنزيم المحول للأنجيوتنسين (ACEIs) وحاصرات مستقبلات الأنجيوتنسين (ARBs) يمكن أن تخفف من تلف القلب والكلى ، فإن استخدامها السريري غالبا ما يكون محدودا بسبب المخاوف بشأن ارتفاع الكرياتينين في الدم أو فرط بوتاسيوم الدم ، حيث يمكن ل 30٪ -40٪ فقط من المرضى تحمل العلاج طويل الأمد6.

بالنظر إلى هذه التحديات ، هناك حاجة ملحة لتحديد المؤشرات الحيوية المبكرة الفعالة وتحقيق فهم أعمق للتسبب في CRS لتسهيل اكتشاف أهداف علاجية جديدة. ومع ذلك ، فإن القيود الحالية في تحديد الوسطاء القابلين للتنفيذ للحديث القلبي الكلوي - خاصة المستقلبات الخاصة بالأمراض التي تربط بشكل مباشر ضعف القلب بإصابة الأوعية الدموية الكلوية - تعيق التقدم في حل هذه الاحتياجات السريرية غير الملباة. تشير الأدلة الناشئة إلى أن المستقلبات المرتبطة بأمراض القلب قد تكون بمثابة مؤشرات حيوية تشخيصية ومحركات ميكانيكية ل CRS عن طريق إعادة برمجة توازن الأوعية الدموية الكلوية ، ومع ذلك لا تزال أدوارها الزمانية المكانية في بدء أو تضخيم الإصابة الكلوية سيئة الخصائص7،8،9. أظهرت الدراسات الحديثة أن المستقلبات الداخلية مثل السيراميد يمكن أن تؤدي بنشاط إلى تفاقم التهاب الأوعية الدموية وإعادة تشكيلها ، لا سيما في ظل ظروف القلب والكلى ، مما يسلط الضوء على الأهمية الأوسع لاستشعار المستقلب في أمراض الأوعية الدموية10.

من بين المقصورات الكلوية المصابة ب CRS ، يتم التعرف بشكل متزايد على الأوعية الدموية كهدف أساسي ومبكر للإصابة. يساهم الخلل البطاني في دوران الأوعية الدقيقة الكلوية - الذي يتميز بضعف التوافر البيولوجي لأكسيد النيتريك ، والإجهاد التأكسدي ، والتعبير المرتفع عن الوسطاء المؤيدين للالتهابات والخثرات - في تندرات الأوعية الدموية الدقيقة ، وزيادة نفاذية الأوعية الدموية ، ونقص الأكسجة الإقليمي11. في موازاة ذلك ، فإن خلايا العضلات الملساء الوعائية (VSMCs) ، الضرورية لتنظيم قوة الشرايين والامتثال ، معرضة أيضا لخلل التنظيم الأيضي في CRS. تشير الأدلة المتراكمة إلى أن المستقلبات المرتبطة بالأمراض يمكن أن تعطل انقباض VSMC ، وتعزز إعادة التشكيل غير القادرة على التكيف ، وتساهم في زيادة تصلب الأوعية الدموية وضعف التروية الكلوية. على الرغم من دورها الأساسي ، إلا أن آليات ضعف الأوعية الدموية التي تحركها العضلات الملساء لا تزال غير مستكشفة في نماذج CRS الحالية8،12. لا تؤدي هذه التغيرات الفيزيولوجية المرضية إلى تفاقم تلف الكلى فحسب ، بل تعزز أيضا التنشيط العصبي الهرموني غير التكيف واضطرابات الديناميكا الدموية الجهازية ، مما يزيد من ضعف وظائف القلب ويديم تقدم CRS13. وبالتالي ، فإن استهداف إصابة الأوعية الدموية الكلوية يوفر نافذة إعلامية ميكانيكيا على التسبب المبكر في CRS ويوفر تركيزا عقلانيا للتحقيق في تفاعلات التمثيل الغذائي بين القلب والكلى.

لمعالجة هذه الفجوات ، تعطي دراستنا الأولوية للتحديد المنهجي والتحقق الوظيفي من المستقلبات المرتبطة بفشل القلب كمنظمات مركزية لتطور CRS. يسد هذا العمل الانفصال الحاسم بين اكتشاف المؤشرات الحيوية القائمة على الملاحظة وأبحاث التسبب في الأمراض الميكانيكية من خلال تحديد كيفية تسبب هذه المستقلبات في حدوث خلل في الأوعية الدموية الكلوية ، وتنشيط الشلالات الالتهابية ، والمساس بآليات إصلاح الأنسجة. النماذج التقليدية المستخدمة لدراسة CRS - بما في ذلك النماذج الحيوانية ، ومزارع الخلايا في المختبر ، والخلايا الجذعية المستحثة (iPSC) - لكل منها قيود14. تعاني النماذج الحيوانية من اختلافات بين الأنواع تحد من الأهمية السريرية. تفتقر الثقافات في المختبر إلى التكامل على مستوى الأعضاء ، في حين أن العضيات المشتقة من iPSC - على الرغم من قدرتها على نمذجة تفاعلات الخلايا الظهارية الأنبوبية لخلايا عضلة القلب - تظل غير ناضجة وظيفيا وتقتصر على مراحل النمو المبكرة15. علاوة على ذلك ، تتكون الأنظمة العسية الوعائية الحالية بشكل أساسي من طبقات أحادية بطانية أو أوعية دقيقة بدائية ، تفتقر إلى طبقة العضلات الملساء الانقباضية والقراءات الوظيفية اللازمة لتقييم الاستجابات على مستوى الوعاء لإصابة التمثيل الغذائي16.

في المقابل ، تستخدم منصتنا نواتج القلب المشتقة من الإنسان والأوعية الدموية الكلوية البشرية خارج الجسم الحي ، مما يسمح بالشرايين الكلوية البشرية ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية والسليمة هيكليا ، مما يتيح التحليل الفسيولوجي والغني بالمعلومات ميكانيكيا للتفاعلات الأيضية القلبية الكلوية في واجهة الأوعية الدموية. يوفر هذا ميزة فريدة في نمذجة الاتصال الأيضي بين الأعضاء الذي يكمن وراء تطور متلازمة القلب والكلى. تجمع منصة أبحاث القلب والكلى المتكاملة الرائدة لدينا بين ثلاثة ابتكارات أساسية: التنميط الأيضي لمستقلبات البلازما / البراز المشتقة من قصور القلب ، وأنظمة العزل / الاستزراع الوعائي الوعائي خارج الجسم الحي ، والتقييم الوظيفي الجزيئي والنسيجي المرضي متعدد الوسائط. تم تحسين كل مكون من مكونات هذه المنصة من أجل التكاثر والملاءمة الانتقالية ، بما في ذلك استخدام 200 ميكرولتر من البلازما أو 0.1 جرام من مادة البراز لكل عينة ، وحضانة أجزاء من الشريان الكلوي البشري 2 مم عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 لمدة تصل إلى 24 ساعة ، والكشف الكمي عن تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الفعلي (qRT-PCR) لعلامات إصابة الأوعية الدموية. لا يقوم هذا النظام بفك تشفير الإمكانات التشخيصية لتوقيعات الأيض فحسب ، بل يربط أيضا بشكل مباشر مساهماتها السببية بأمراض CRS ، مما يتيح تحديد الهدف العلاجي من خلال رسم الخرائط على المستوى الجزيئي لخلل التمثيل الغذائي بين الأعضاء. من خلال سد الاكتشاف الميكانيكي بالترجمة السريرية ، يحول هذا النموذج المزدوج التركيز إدارة CRS من التحكم في الأعراض التفاعلية إلى التدخلات الاستباقية التي تعتمد على المؤشرات الحيوية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

تمت الموافقة على البروتوكولات التجريبية ومنهجيات الحالة المستخدمة في هذه الدراسة أخلاقيا من قبل قسم المسالك البولية في مستشفى جامعة بكين الأول (قانون المراجعة الأخلاقية: 2023yan500-002) ومستشفى كلية الطب في اتحاد بكين (رقم الموافقة I-23PJ585) ، مع الالتزام الصارم بالمبادئ الموضحة في إعلان هلسنكي. في هذه الدراسة ، قمنا بتجنيد المرضى الذكور أو الإناث في مستشفى كلية الطب في بكين يونيون (PUMCH) اعتبارا من يوليو 2019 ، وتم تشخيصهم بقصور القلب (HF) من قبل اثنين على الأقل من أطباء القلب ذوي الخبرة. تم تضمين ما مجموعه أربعة مرضى HF (HF1-HF4) لاستخراج المستقلب في البلازما والبراز. تم الحصول على موافقة خطية مستنيرة من جميع الأشخاص قبل إدراجهم في البحث. يتم عرض الجهاز والكواشف التجريبية في جدول المواد.

1. معالجة عينات البلازما والبراز - استخراج المستقلب القطبي

  1. جمع العينات
    1. اجمع جميع عينات البلازما والبراز في أنابيب تجميع معقمة ومبردة مسبقا وقم بتجميدها على الفور في جمع النيتروجين السائل بعد التجميع. قم بتخزين العينات في درجة حرارة -80 درجة مئوية حتى المعالجة.
    2. لضمان استقرار المستقلب ، قم بمعالجة جميع العينات خلال دورة تجميد وذوبان واحدة ، ولا تدع الفاصل الزمني بين جمع العينات واستخراجها يتجاوز أسبوعين.
      ملاحظة: تم اتخاذ هذه التدابير لتقليل تحلل المستقلب وضمان قابلية التكاثر في تحليلات التمثيل الغذائي النهائية.
    3. استخراج المستقلبات من عينات البراز والبلازما باتباع خطوات البروتوكول 1.3 أو 1.4 على التوالي.
  2. مجتمع الدراسة
    1. خذ قياسات ضغط الدم الأساسية وسجل تاريخ الأدوية لجميع المشاركين.
    2. جمع عينات المرضى قبل أي تدهور سريري حاد ، باستثناء الأفراد الذين يعانون من أمراض استقلابية مصاحبة رئيسية (مثل مرض السكري وارتفاع ضغط الدم الأولي) لتقليل العوامل المربكة في تحليل التمثيل الغذائي (الجدول التكميلي S1).
    3. الحصول على معلومات سريرية لكل موضوع باستخدام الإجراءات القياسية.
  3. استخراج البلازما
    1. مصل الطرد المركزي الخام في 14,000 × جم لمدة 10 دقائق (4-8 درجة مئوية). اجمع المادة الطافية في أنابيب طرد مركزي دقيقة جديدة سعة 1.5 مل.
    2. أضف الميثانول المبرد (-80 درجة مئوية) من الدرجة HPLC لتحقيق تركيز الميثانول بنسبة 80٪ (حجم/حجم). تخلط برفق عن طريق الانعكاس وتحتضن عند -80 درجة مئوية لمدة 6-8 ساعات.
    3. جهاز طرد مركزي عند 14,000 × جم لمدة 10 دقائق (4-8 درجات مئوية). انقل المادة الطافية الميثانولية إلى أنابيب جديدة لتحديد ملامح التمثيل الغذائي.
      ملاحظة: ضع عينات البلازما بعد جمعها في ثلاجة -80 درجة مئوية في غضون ساعتين ، وقلل من دورات التجميد والذوبان لضمان استقرار المستقلب.
  4. استخراج البراز
    1. أضف 500 ميكرولتر من الميثانول من فئة HPLC (مبرد مسبقا إلى -80 درجة مئوية) إلى عينات البراز الطازجة أو المجمدة في أنابيب الطرد المركزي الدقيقة سعة 1.5 مل. قم بالتجانس باستخدام مدقة دقيقة / مجانس الأنسجة على الثلج الجاف لمدة 1-2 دقيقة ، متبوعا بالدوامة (1 دقيقة عند 4-8 درجة مئوية) والحضانة عند -80 درجة مئوية لمدة 4 ساعات.
    2. جهاز طرد مركزي عند 14,000 × جم لمدة 10 دقائق (4-8 درجات مئوية) باستخدام جهاز طرد مركزي مبرد. نقل المادة الطافية إلى أنابيب الطرد المركزي الدقيقة الجديدة سعة 1.5 مل ؛ يحفظ في درجة حرارة -80 درجة مئوية حتى الخطوة 1.4.4.
    3. أعد تعليق الحبيبات مع 400 ميكرولتر من الميثانول المبرد مسبقا (-80 درجة مئوية) من الدرجة HPLC. دوامة جيدا (1 دقيقة عند 4-8 درجة مئوية) واحتضان عند -80 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
    4. كرر الطرد المركزي (14,000 × جم ، 10 دقائق ، 4-8 درجة مئوية). اجمع بين المواد الطافية من مرحلتي الاستخراج.
    5. قم بإجراء طرد مركزي توضيحي نهائي (14,000 × جم ، 10 دقائق ، 4-8 درجات مئوية). انقل المادة الطافية المنقاة إلى أنابيب معقمة سعة 1.5 مل لتحليل المصب.
      ملاحظة: ضع عينات البراز بعد جمعها في ثلاجة -80 درجة مئوية في غضون ساعتين ، وقلل من دورات التجميد والذوبان لضمان استقرار المستقلب.

2. عزل الشريان الكلوي

  1. اختيار المشاركين وجمع الأنسجة
    1. فحص المرضى الذين يخضعون لاستئصال الكلية الجذري لسرطان الخلايا الكلوية. قم بتضمين الأشخاص الذين تتراوح أعمارهم بين ≥ 18 عاما الذين لا يعانون من أمراض استقلابية مصاحبة (على سبيل المثال ، ارتفاع ضغط الدم الأولي وداء السكري). أثناء الجراحة ، اجمع الحمة الكلوية الطبيعية نسيجيا وتقع على بعد 3 سم على الأقل من هوامش الورم.
    2. اغمر العينات المحصودة على الفور في مخزن مؤقت كريبس هينسليت المؤكسج (4 درجات مئوية ، درجة الحموضة 7.4 ؛ التركيب بالملليمولار: 119.0 كلوريد الصوديوم ، 4.7 كيلو كلتر ، 2.5 كلور الكالسيوم2 ، 1.0 ملغ كلوريدالصوديوم 2 ، 25.0 هيدروكلور هيدروكسيد الصوديوم3 ، 1.2 كيلو ساعة2PO4 ، 11.0 جلوكوز). أكمل إجراءات العزل في غضون 6 ساعات من الجراحة.
  2. تحضير الأنسجة الكلوية
    1. قم بإجراء التقسيم الإكليلي في مخزن مؤقت كريبس 4 درجات مئوية للحصول على عينات نصف الكلى تحتوي على هياكل نقيرية سليمة. إجراء التشريح المجهري باستخدام نظام مجهري مجسم (تكبير 40x) لفضح فروع الشريان الكلوي المقوس وتحديد الشرايين المقوسة.
  3. تسلخ الأوعية الدموية الدقيقة
    1. تحقيق عزل دقيق للأجزاء الشريانية من خلال الإزالة المتسلسلة للأنسجة العرضية المحيطة بالأوعية الدموية باستخدام مقص القرنية الدقيق.
    2. حافظ على الأجزاء الشريانية التي يبلغ قطرها حوالي 500 ميكرومتر.
    3. تقليل إجهاد القص البطاني من خلال التلاعب الخالي من التوتر باستخدام الملقط الدقيق. قم بإجراء التشريح في ظروف انخفاض حرارة الحرارة (4 درجات مئوية) مع تجديد مخزن كريبس المؤقت كل 15 دقيقة للحفاظ على درجة الحموضة الفسيولوجية والتوازن الأيوني.
      ملاحظة: يضمن القياس الكمي الصريح لأبعاد الشرايين وتكوين المخزن المؤقت ، وسير العمل المنظم حراريا من الشراء (4 درجات مئوية) إلى المعالجة (4 درجات مئوية) ، وتشريح الأوعية الدموية الدقيقة الكامل في غضون 6 ساعات بعد جمع العينات قابلية الأنسجة المثلى للبقاء والسلامة الوظيفية.

3. حضانة الشريان الكلوي مع مستقلبات إصابات القلب

  1. تحضير الأنسجة الوعائية: تشريح الشرايين الكلوية بالجراحة المجهرية في ظروف معقمة ، وإزالة النسيج الضام المحيط بالأوعية الدموية الملتصق بدقة باستخدام ملقط العيون الناعم. قسم الشرايين الكلوية المعزولة إلى أجزاء 2 مم باستخدام مقص معقم لثقافة النمط العضوي اللاحقة.
  2. إزالة التلوث بالمضادات الحيوية: اغسل أجزاء الأوعية الدموية لمدة 3 × 5 دقائق باستخدام محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) مكمل بكوكتيل مضاد حيوي / مضاد للفطريات ثلاثي لتقليل التلوث الميكروبي وضمان العقم قبل التعرض للمستقلب.
  3. التجميع التجريبي: قم بتعيين أجزاء الأوعية الدموية بشكل عشوائي لأربع مجموعات تجريبية ونقلها إلى صفائح زراعة 24 بئرا تحتوي على 500 ميكرولتر من وسط النسر المعدل من Dulbecco لكل بئر.
  4. تدخل المستقلب
    1. إضافة نواتج الأيض من المجموعات التالية: 1) المستقلبات المشتقة من البلازما التحكم الصحي (HC-P); 2) نواتج الأيض المشتقة من البلازما لمرضى قصور القلب (HF-P) ؛ 3) المستقلبات المشتقة من البراز للتحكم الصحي (HC-F) ؛ 4) نواتج الأيض المشتقة من البراز لمرضى قصور القلب (HF-F).
    2. إعادة تشكيل مستخلصات المستقلب في الميثانول (درجة HPLC) وإدارة 10 ميكرولتر من كل مستخلص في البئر المقابل للوحة الاستزراع المكونة من 24 بئرا ، والتي تحتوي على 500 ميكرولتر من قطاعات الشريان الكلوي والمتوسطة النسر المعدل من دولبيكو (تركيز المذيب النهائي بنسبة 2٪ (حجم/حجم)). أضف كميات مكافئة من المركبات (خليط الميثانول / PBS) إلى آبار التحكم.
  5. ظروف الاستزراع: احتضان مجموعات الألواح في ظل ظروف زراعة الخلايا القياسية (37 درجة مئوية ، 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 ، 95٪ رطوبة) لمدة 24 ساعة باستخدام حاضنة مرطبة.

4. فحص حلقة الشريان الكلوي

  1. تعليق الحلقة الشريانية الكلوية وتثبيتها
    1. تحضير الأسلاك: قم بربط سلكين متوازيين من الفولاذ المقاوم للصدأ مقاس 2 سم (متوازن مسبقا في كريبس ، 95٪ O2/5٪ ثاني أكسيد الكربون2) من خلال التجويف الشرياني تحت الفحص المجهري الضوئي ، مما يضمن نتوءا متساويا للأسلاك في كلا الطرفين.
    2. تركيب التصوير العضلي: قم بتشغيل نظام التدفئة والغاز للحفاظ على درجة الحرارة الفسيولوجية والأكسجين. قم بتأمين الأسلاك أفقيا في حمام عضلة سلكي يتم التحكم في درجة حرارته (كريبس ، 95٪ O2/5٪ ثاني أكسيد الكربون2). اضبط المقابض اللولبية للحفاظ على استرخاء الأوعية الطبيعية.
  2. تحديد التوتر الأولي الأمثل مع التطبيع الخاص بالوعاء
    ملاحظة: تم تعديل توتر الراحة باستخدام إجراء التطبيع لتوحيد الظروف الأساسية ، وتحسين استجابة الوعاء ، وضمان قابلية التكاثر. قم بالتوازن لمدة 30 دقيقة قبل الشروع في التطبيع.
    1. حدد إعدادات التطبيع من قائمة DMT ، باستخدام المعلمات التالية: معايرة العدسة: 1 مم / div ؛ الضغط المستهدف: 13.3 كيلو باسكال ؛ نسبة IC1 / IC100: 0.9 درجة مئوية ؛ متوسط عبر الإنترنت: 3 ثوان ؛ وقت التأخير: 60 ثانية.
      ملاحظة: يتم توفير تفاصيل إضافية عن الخلفية وتكوين النظام في الورقة المشار إليها17.
    2. لتطبيع السفينة ، حدد القناة ذات الاهتمام واملأ شاشة التسوية بالبيانات. اضبط نقاط نهاية الأنسجة بناء على قراءة الميكرومتر وقطر السلك البالغ 40 ميكرومتر.
    3. ضع التمدد السلبي وانتظر لمدة 3 دقائق. قم بتطبيق 60 كلفن + للحث على تقلص بوساطة البوتاسيوم وانتظر حتى يصل الانكماش إلى هضبة. اشطف المستحضر 3 × 5 دقائق بمحلول كريبس لغسل 60 كلفن +. احسب القوة النشطة عن طريق طرح القوة السلبية عند كل مستوى تمدد من القوة التي يسببها البوتاسيوم المسجلة على التتبع.
    4. كرر الخطوة 4.2.3 حتى يتم الوصول إلى الحد الأقصى للقوة النشطة. حدد توتر الراحة الأمثل على أنه المستوى الذي ينتج عنه أقصى توتر نشط في كل شريان ، مع استجابات الذروة لارتفاع K + تستخدم كمقلصات مرجعية.
    5. قم بموازنة الحلقة الشريانية لمدة 10 دقائق قبل إجراء المزيد من التجارب.
      ملاحظة: نظرا للتباين الكبير بين الأفراد في درجات الأوعية الدموية وسمكها وأصولها ، قم بتطبيع كل وعاء دموي على حدة لضمان قابلية التكاثر. استخدم وحدة التطبيع لنظام تصوير العضلة السلكية لتحديد توتر خط الأساس المناسب بناء على القطر السلبي لكل وعاء وخصائصه الميكانيكية. قم بتطبيق الإجراء باستمرار على جميع العينات قبل الاختبار الوظيفي.
  3. الكشف عن تفاعل حلقات الشريان الكلوي
    1. للتحقيق في آثار المستقلبات المختلفة على انقباض الأوعية الدموية ، قم بإجراء اختبارات وظيفة تقلص الأوعية الدموية باستخدام الشرايين الكلوية المحتضنة بالبلازما المستخرجة ومستقلبات البراز من متطوعين أصحاء ومرضى HF لمدة 12 ساعة. للحصول على تفاصيل محددة ، راجع القسم 3.
    2. استخدم 60 كلفن + لاستنباط تقلص بوساطة البوتاسيوم. تأكد من أن كل غرفة تحتوي على محلول كريبس سعة 5 مل.
    3. لتحديد الانقباضات الناجمة عن فينيل إيفرين (Phe) والمعتمدة على التركيز في حلقات الشريان ، أضف Phe بزيادات نصف لوغاريتمية من 10-9 إلى 10-4 M. ابدأ بأقل تركيز Phe ، وأدخله في الغرفة ، وانتظر انكماشا ثابتا.
    4. حدد المكان الذي يتم عنده الوصول إلى انكماش ثابت (أي تسجيل قيمة التوتر عند الهضبة) ، ثم انتقل إلى التركيز التالي. كرر حتى يتم إضافة التركيز النهائي بنجاح.
    5. بعد الانتهاء من التجربة ، احفظ ملف البيانات وقم بإزالة حلقات الشريان. نظف الغرفة جيدا بمحلول حمض الأسيتيك بنسبة 8٪ ، ثم احتضنها لمدة 3 دقائق.
    6. قم بإيقاف تشغيل نظام التدفئة والغاز ، وتأكد من إزالة كل السوائل قبل إيقاف تشغيل الغاز.

5. الفحص النسيجي المرضي للشريان الكلوي: تلطيخ الهيماتوكسيلين يوزين

ملاحظة: التخلص من الكواشف الخطرة والنفايات البيولوجية وفقا لبروتوكولات السلامة الحيوية والنظافة الكيميائية المؤسسية. وعلى وجه التحديد، ينبغي جمع الزيلين والبارافورمالديهايد في حاويات نفايات كيميائية قابلة للغلق وقابلة للغلق وتخزينها في منطقة مخصصة لغطاء الدخان قبل التخلص منها من قبل مناولة النفايات الخطرة المعتمدة. يجب تحييد حمض الخليك المستخدم في تنظيف غرفة قياس العضلة والتخلص منه من الإجراءات القياسية التالية للتخلص من النفايات الحمضية. لا تقم بتفريغ أي من هذه الكواشف في أحواض المختبر.

  1. اغسل الشرايين في PBS البارد وقم بتثبيته في 4٪ بارافورمالديهايد (درجة الحموضة 7.4) طوال الليل. قطع المقاطع التسلسلية عند 4 ميكرومتر ومعالجة الأنسجة.
  2. احتضان أقسام الأنسجة المثبتة على شرائح زجاجية في مجفف منزلق عند 60 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة ، ثم انقله على الفور إلى الزيلين. اغمر الأقسام في الزيلين (3 × 5 دقائق).
  3. إخضاع الأقسام لترطيب الإيثانول المتدرج: 100٪ إيثانول (2 × 5 دقائق) ، 95٪ إيثانول (1 × 5 دقائق) ، 90٪ إيثانول (1 × 5 دقائق) ، 80٪ إيثانول (1 × 5 دقائق) ، 70٪ إيثانول (1 × 5 دقائق) ، اشطفها بالماء فائق النقاء (1 × 5 دقائق).
  4. وصمة عار مع الهيماتوكسيلين (0.5٪ وزن / حجم) لمدة 5 دقائق ؛ ثم اشطفها تحت الماء الجاري.
  5. يفرق مع 1٪ كحول حمضي (حمض الهيدروكلوريك - الإيثانول) لمدة 5-10 ثوان ويشطف تحت الماء الجاري.
  6. قم بإزالة الأقسام باللون الأزرق في 0.6٪ ماء الأمونيا وشطفها تحت الماء الجاري.
  7. اغمر الأقسام في محلول الإيوزين (1٪ وزن / حجم) لمدة 2 دقيقة.
  8. قم بتجفيف وتنظيف الأقسام في 95٪ إيثانول (2 × 5 دقائق) ، 100٪ إيثانول (2 × 5 دقائق) ، والزيلين (2 × 5 دقائق).
  9. جفف في الهواء لفترة وجيزة حتى تتحقق الشفافية البصرية ، وقم بتثبيته في وسط التثبيت ، وقم بتغطيته بأغطية ، وختم الأغطية بوسط تثبيت محايد.
  10. إجراء تصوير المجال الساطع والتقييم النسيجي.

6. الكشف عن المؤشرات الحيوية الجزيئية المرتبطة بالإصابة الكلوية

  1. استخراج الرنا المرسال للشريان الكلوي
    1. أضف أنسجة الأوعية الدموية المحفوظة بالتبريد في النيتروجين السائل إلى 1 مل من كاشف استخراج الحمض النووي الريبي ونقلها إلى مجانس الأنسجة المبرد مسبقا من أجل التجانس الشامل.
    2. أضف 250 ميكرولتر من الكلوروفورم لكل 100 ميكرولتر من كاشف الاستخراج ، دوامة بقوة لمدة 30 ثانية ، واحتضان لمدة 10 دقائق عند 25 درجة مئوية.
    3. جهاز طرد مركزي عند 12,000 × جم (10 دقائق ، 4 درجات مئوية) ونقل المرحلة المائية إلى أنبوب جديد.
    4. أضف 500 ميكرولتر من الأيزوبروبانول إلى المرحلة المائية ، واخلطه عن طريق الانعكاس ، واحتضنه لمدة 20 دقيقة عند 25 درجة مئوية.
    5. جهاز طرد مركزي عند 12,000 × جم (10 دقائق ، 4 درجات مئوية) وتخلص من المادة الطافية.
    6. اغسل الحبيبات ب 1 مل من 75٪ الإيثانول (2 × 5 دقائق), جفف حبيبات الحمض النووي الريبي بالهواء, وأعد تعليقها في DEPC-H2O (0.1٪ حجم/حجم).
      ملاحظة: تحقق من نقاء الحمض النووي الريبي (OD260/OD280 = 1.9-2.0) وتأكد من سلامة نطاقات الحمض النووي الريبي 28S/18S rRNA.
  2. تخليق (كدنا)
    1. امزج 2 ميكروغرام من mRNA + 1 ميكرولتر من أوليجو (dT) ، اضبطه على 8 ميكرولتر مع DEPC-H2O (0.1٪ v / v) ، وقم بالتسخين عند 70 درجة مئوية لمدة 5 دقائق ، واتركه يبرد على الثلج لمدة 5 دقائق.
    2. قم بإعداد المزيج الرئيسي للنسخ العكسي في 10 ميكرولتر من مزيج تفاعل 2x TS ، و 1 ميكرولتر من مزيج إنزيم RT / RI ، و 1 ميكرولتر من مزيل gDNA. أضف 12 ميكرولتر من المزيج الرئيسي إلى 8 ميكرولتر من خليط الحمض النووي الريبي/التمهيدي من الخطوة 6.2.1 لتحقيق حجم تفاعل إجمالي قدره 20 ميكرولتر.
    3. سخني الخليط من الخطوة 6.2.2. عند 42 درجة مئوية لمدة 60 دقيقة وإنهاء العملية بالتسخين عند 85 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
    4. قم بتخفيف 20 ميكرولتر من تفاعل النسخ العكسي بإضافة 80 ميكرولتر من H2O الخالي من النوكلياز ، مما ينتج عنه حجم نهائي قدره 100 ميكرولتر (تخفيف 4x). استخدم (كدنا) المخفف كقالب لتفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي.
  3. التحليل الكمي PCR
    1. قم بإعداد التفاعل عن طريق خلط 2.0 ميكرولتر من قالب (كدنا) ، و 0.5 ميكرولتر من البرايمر الأمامي (10 ميكرومتر) ، و 0.5 ميكرولتر من التمهيدي العكسي (10 ميكرومتر) ، و 10 ميكرولتر من المزيج الرئيسي الأخضر من SYBR (2x) ، و 7 ميكرولتر من ddH2O.
    2. قم بإجراء تفاعل البوليميراز المتسلسل باستخدام الإعدادات التالية: التمسخ الأولي: 95 درجة مئوية / 3 دقائق ؛ 40 دورة: 95 درجة مئوية/30 ثانية; Tm-5 °C / 30 ثانية ؛ 72 درجة مئوية/30 ثانية؛ منحنى الذوبان: 65-95 درجة مئوية (+0.5 درجة مئوية / 5 ثوان).
    3. تحليل التعبير الجيني بطريقة 2-ΔΔct. يتم عرض تسلسلات التمهيدي في الجدول التكميلي S2.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

تألفت المجموعة من أنثى وذكرين ، بفئة عمرية تتراوح بين 46 و 73 عاما (متوسط العمر: 64.0 سنة). أظهرت قياسات ضغط الدم الأساسية أن ضغط الدم الانقباضي يتراوح من 109 إلى 168 ملم زئبق والضغط الانبساطي من 68 إلى 115 ملم زئبق. سجل جميع مرضى HF تاريخا للأدوية ، بما في ذلك العوامل الشائعة الواقية من القلب مثل حاصرات بيتا ، والستاتينات ، والأدوية المضادة للصفيحات ، مع اختلافات فردية في مثبطات نظام الرينين والأنجيوتنسين ومدرات البول. بالنسبة للضوابط ، قمنا بتجنيد أربعة أشخاص دون أي أمراض قلبية أو أي أعراض أو علامات متعلقة ب HF ، كما أ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

حددت الأبحاث الحديثة في CRS إعادة برمجة التمثيل الغذائي كآلية مرضية رئيسية ، حيث تنظم المستقلبات توازن الأوعية الدموية الكلوية7،8،9. بينما تلعب VSMCs دورا مهما في تنظيم قوة الأوعية الدموية والامتثال في CRS ، فإن دراستنا تقدم دليلا مباشرا على أن المستقلبات المرتبطة بإصابات القلب تضعف انقباض العضلات الملساء للأوعية الدموية والسلامة الهيكلية. على وجه التحديد ، تظهر النتائج التي توصلنا إليها أن المس...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

ليس لدى المؤلفين تضارب في المصالح للإفصاح عنها.

شكر وتقدير

تم دعم هذا العمل بمنح من البرنامج الوطني للبحث والتطوير الرئيسي في الصين (2021YFF0501401 ، 2018YFA0800501 إلى YZ ، 2021YFF0501404 إلى YL.) ، المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (82325004 و 92168114 إلى YZ ، 82300286 إلى JZ ، 92168113 إلى E.D. ، 82170422 إلى YL.) ، مختبر Haihe لصندوق ابتكار النظام البيئي الخلوي (رقم. HH22KYZX0047 إلى إي دي) ، مؤسسة علوم ما بعد الدكتوراه الصينية (BX20220023 ، 2022M720288 إلى JZ) ، مؤسسة العلوم الطبيعية في بكين (7252157 إلى جي زي). مؤسسة العلوم الطبيعية لبلدية بكين (7232096 إلى YL) ، مشروع بحثي لمستشفى جامعة بكين الثالث في مختبر الدولة الرئيسي لتوازن الأوعية الدموية وإعادة تشكيلها (جامعة بكين ؛ 2024-VHR-SY-07 إلى Y.Z.). تم إنشاء الشكل 1 باستخدام Biorender.com مع تراخيص معتمدة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
DMEM ارتفاع الجلوكوزجيبكوالقط # 06-1055-57-1-ACS
برنامج تلفزيونيسولاربيوالقط # P1010
البنسلين-ستربتومايسين-أمفوتريسين بثيرمو فيشر العلميالقط # 15240062
فينيليفرينMCEالقط # HY-B0769
نظام النسخ العكسيبروميجاالقط # A5001
نظام مجهري مجسملايكاإم 80
SYBR جرين ماستر ميكسثيرمو فيشر العلميالقط # 4309155
نظام قياس توتر الأوعية الدمويةدايميثيل620 مليون

المراجع

  1. Cases and observations illustrative of renal disease, accompanied with the secretion of albuminous urine. Med Chir Rev. 25 (49), 23-35 (1836).
  2. Schefold, J. C., Filippatos, G., Hasenfuss, G., Anker, S. D., von Haehling, S. Heart failure and kidney dysfunction: epidemiology, mechanisms and management. Nat Rev Nephrol. 12 (10), 610-623 (2016).
  3. KDIGO 2020 clinical practice guideline for diabetes management in chronic kidney disease. Kidney Int. 98 (4S), S1-S115 (2020).
  4. Amatruda, J. G., et al. Reninangiotensinaldosterone system activation and diuretic response in ambulatory patients with heart failure. Kidney Med. 4 (6), 100465(2022).
  5. Valente, M. A., et al. Diuretic response in acute heart failure: clinical characteristics and prognostic significance. Eur Heart J. 35 (19), 1284-1293 (2014).
  6. Damman, K., et al. Renal effects and associated outcomes during angiotensinneprilysin inhibition in heart failure. JACC Heart Fail. 6 (6), 489-498 (2018).
  7. Curaj, A., et al. Cardiovascular consequences of uremic metabolites: an overview of the involved signaling pathways. Circ Res. 134 (5), 592-613 (2024).
  8. Wang, J., et al. New insights into the pathophysiological mechanisms underlying cardiorenal syndrome. Aging (Albany NY). 12 (12), 12422-12431 (2020).
  9. Zou, D., Li, Y., Sun, G. Attenuation of circulating trimethylamine Noxide prevents the progression of cardiac and renal dysfunction in a rat model of chronic cardiorenal syndrome. Front Pharmacol. 12, 751380(2021).
  10. Zhang, S., et al. Sensing ceramides by CYSLTR2 and P2RY6 to aggravate atherosclerosis. Nature. 641 (8062), 476-485 (2025).
  11. Zhang, J., Bottiglieri, T., McCullough, P. A. The central role of endothelial dysfunction in cardiorenal syndrome. Cardiorenal Med. 7 (2), 104-117 (2017).
  12. Guo, J., et al. Vasculopathy in the setting of cardiorenal syndrome: roles of proteinbound uremic toxins. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 313 (1), H1-H13 (2017).
  13. Khandait, H., Sodhi, S. S., Khandekar, N., Bhattad, V. B. Cardiorenal syndrome in heart failure with preserved ejection fraction: insights into pathophysiology and recent advances. Cardiorenal Med. 15 (1), 41-60 (2025).
  14. Gabbin, B., et al. Toward human models of cardiorenal syndrome in vitro. Front Cardiovasc Med. 9, 889553(2022).
  15. Gabbin, B., et al. Heart and kidney organoids maintain organspecific function in a microfluidic system. Materials Today Bio. 23, 100818(2023).
  16. Wimmer, R. A., et al. Human blood vessel organoids as a model of diabetic vasculopathy. Nature. 565 (7740), 505-510 (2019).
  17. Guo, P., et al. Standardized rat coronary ring preparation and realtime recording of dynamic tension changes along vessel diameter. J Vis Exp. (184), e64121(2022).
  18. Lai, Y., et al. Gut microbiotaderived metabolites: potential targets for cardiorenal syndrome. Pharmacol Res. 214, 107672(2025).
  19. Brunt, V. E., et al. TrimethylamineNoxide promotes agerelated vascular oxidative stress and endothelial dysfunction in mice and healthy humans. Hypertension. 76 (1), 101-112 (2020).
  20. Wang, B., Qiu, J., Lian, J., Yang, X., Zhou, J. Gut metabolite trimethylamineNoxide in atherosclerosis: from mechanism to therapy. Front Cardiovasc Med. 8, 723886(2021).
  21. Seldin, M. M., et al. Trimethylamine Noxide promotes vascular inflammation through signaling of mitogenactivated protein kinase and nuclear factorκB. J Am Heart Assoc. 5 (2), 002767(2016).
  22. Watanabe, H., et al. pCresyl sulfate, a uremic toxin, causes vascular endothelial and smooth muscle cell damages by inducing oxidative stress. Pharmacol Res Perspect. 3 (1), e00092(2015).
  23. Muteliefu, G., et al. Indoxyl sulfate promotes vascular smooth muscle cell senescence with upregulation of p53, p21, and prelamin A through oxidative stress. Am J Physiol Cell Physiol. 303 (2), C126-C134 (2012).
  24. Kotlyarov, S., et al. Immunology of atherosclerosis: problems and prospects of immunotherapy. Vessel Plus. , (2025).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

اتصل بنا
أوصِ بها للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

2026 © حقوق الطبع والنشر MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.