مقالة منهجية

مقايسة نفاذية غشاء الجسيمات الشحمية للتحقيق في آثار مجموعات فوسفات فوسفاتيديلينوسيتول على عمل membranotropic للسم PLA2

821 مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/68594

⸱

سبتمبر 26, 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Advanced STEM Research Center, Beijing Chaoyang KaiWen Academy, 2Shemyakin-Ovchinnikov Institute of Bioorganic Chemistry, Russian Academy of Sciences, 3Department of Pharmacology, University of Nevada Reno, 4Belozersky Institute of Physico-Chemical Biology, M. V. Lomonosov Moscow State University

في هذه المقالة

ملخص

نقدم طريقة فعالة من حيث التكلفة لتقييم نفاذية الغشاء الشحمي بحساسية ودقة فائقة على التقنيات التقليدية. باستخدام تفاعل استبدال الترابط المغلف الجديد ، تكتشف هذه التقنية التغيرات المستحثة عن الفوسفوليباز A2 في أغشية النموذج. يتكامل هذا النهج الذي يمكن الوصول إليه بسهولة مع التحليلات القياسية ، ويعزز الدقة لدراسة الفيزياء الحيوية للغشاء وتفاعلات السموم.

الملخص

قمنا بتطوير اختبار جديد وفعال من حيث التكلفة وحساس للغاية لتقييم نفاذية الغشاء الشحمي بناء على تفاعلات استبدال الترابط التي تتضمن روابط مغلفة في الحجم الداخلي للجسيمات الشحمية ، والتي قمنا بدمجها مع مقايسة النشاط التحلل المائي (باستخدام الإنزيم المساعد أ) ومحاكاة النمذجة الجزيئية للتحقيق فيما إذا كان فوسفات حلقة الإينوزيتول في الفوسفاتيديلينوسيتول يحمي الأغشية من الآثار الضارة للإنزيمات المعبر عنها بشكل شاذ. يؤدي التعبير الشاذ عن الفوسفوليباز A2 (PLA2) إلى إزالة الميالين من المحاور التي تؤدي إلى تطور التصلب المتعدد ومرض الزهايمر. لتقليد تأثيرات PLA₂ المعبر عنها بشكل شاذ ، استخدمنا الوحدة الفرعية الأساسية لسم الأفعى PLA₂ ، HDP-2P. تم اختبار HDP-2P على الجسيمات الشحمية الفوسفاتيديل كولين (PC) المخصب بالفوسفاتيديلينوسيتول أو الفوسفاتيديلينوسيتول -4-فوسفات (PI-4-P) أو فوسفاتيديلينوسيتول -4،5-ثنائي فوسفات (PI-4،5-P2). في حين أن HDP-2P أظهر الحد الأدنى من النشاط المائي وزيادة نفاذية طفيفة فقط في الجسيمات الشحمية PC ، فإن إثراء الجسيمات الشحمية PC باستخدام PI عزز كل من التحلل المائي والنفاذية. من اللافت للنظر أن PI-4-P و PI-4،5-P₂ أعاقت بشكل كبير نشاط التحلل المائي ل HDP-2P وقللوا تماما من النفاذية. كشفت محاكاة النمذجة الجزيئية أن الفوسفات من حلقة الإينوزيتول في فوسفاتيديلينوسيتول يمنع سعادة الوصول إلى الفوسفوليبيد إلى الموقع النشط ل HDP-2P, منع التحلل المائي. تشير كل من البيانات في المختبر وفي السيليكو إلى أن الفوسفاتيديلينوسيتولات الفسفرية مرتبطة بانخفاض نشاط PLA₂ ، مما يشير إلى آلية محتملة للتخفيف من النشاط المفرط لجيش التحرير الشعبىالصينى 2 - على الأرجح كوسيلة لحماية أغشية الخلايا من التنكس.

المقدمة

فوسفاتيديلينوسيتول (PI) هو فوسفوليبيد أنيوني يتكون من العمود الفقري حمض الفوسفاتيديك المرتبطة بالإينوزيتول, حلقة سداسي هيدروكسي ستة الكربون, عن طريق مجموعة الفوسفات. الإينوزيتول يمكن تحويلها عكسيا إلى فوسفوينوسيتيدات عن طريق الفسفرة في 2, 3, 4, 5, و 6 مواقع الكربون1. تم العثور على PI و phosphoinositides في أغشية البلازما والعضيات لخلايا مختلفة عبر والنباتات والكائنات الحية الدقيقة. بعد سبعين عاما من اكتشافها بواسطة Mable و Lowell Hokin2،3،4 ، لا تزال PI والفوسفوينوزيدات موضوعا لبحث مكثف يهدف إلى فهم آلياتها الجزيئية وأهميتها لصحة الإنسان5،6،7.

بصرف النظر عن أنسجة المخ ، توجد الفوسفوينوسيتيدات عادة بتركيزات منخفضة ، حيث تمثل حوالي 0.5 إلى 1٪ من إجمالي الدهون في النشرة الداخلية لغشاء البلازما. تشير البيانات المنشورة إلى أنه من غير المرجح أن يؤدي PI دورا هيكليا رئيسيا في ظل الظروف الفسيولوجية1. ومع ذلك ، أثناء حالات المرض ، تزداد مستويات PI و phosphoinositides ، وتقلب إلى النشرة الخارجية لغشاء البلازما ، مما يشير إلى أن هذه الدهون الفوسفورية قد تكون مرتبطة بمقاومة الأمراض1. على الرغم من أنه كان يعتقد منذ فترة طويلة أن PI يلعب دورا فسيولوجيا أقل أهمية مقارنة بالفوسفوينوسيتيدات ، إلا أن الأدلة الناشئة تسلط الضوء على أهمية PI-4-P و PI-4،5-P2 في العمليات الفسيولوجية المختلفة1. تشمل هذه العمليات الإشارات داخل الخلايا ، ونقل الإشارات بين الخلايا8،9،10 ، وتهريب الغشاء11،12،13 ، وتعديل التعبير الجيني1 ، بالإضافة إلى تكاثر الخلايا14 والبقاء على قيد الحياة1. على الرغم من ذلك ، فإن الآليات الجزيئية التي تقود بها PI و phosphoinositides هذه العمليات لا تزال غير مفهومة جيدا.

PI و phosphoinositides وفيرة في خلايا أنسجة المخ ، حيث يشكلان ما يقرب من 10٪ من إجمالي الدهون الفوسفورية ، على الرغم من أن مستوياتها قد تزداد بشكل عابر في المراحل المبكرة من أمراض الدماغ مما يشير إلى أن الفوسفوينوزيتيدات قد تقاوم تطور الأمراض العصبية1 مثل التصلب المتعدد ومرض الزهايمر الناجم عن إزالة الميالين المحوري الناجم عن نشاط PLA2S الشاذ15 ، 16،17. تنتمي هذه الإنزيمات إلى فئات ومجموعات مختلفة بما في ذلك المجموعة IIA الفوسفوليباز الإفرازي A2 (sPLA2) 15. تم العثور على مستويات مرتفعة من هذه المجموعة من الإنزيمات في السائل النخاعي لمرضى التصلب المتعدد ومرض الزهايمر ، حيث تساهم في انهيار أغشية المايلين ، مما يؤدي إلى إزالة الميالين15. تم الإبلاغ أيضا عن أن sPLA2s من سموم الثعابين تمنع الانتقال في نقاط الاشتباك العصبي العضلي18،19 ، مما يتسبب في اضطرابات الجهاز العصبي المركزي ويؤثر سلبا على الجهاز العصبي العضلي المحيطي20.

في هذه الدراسة ، قمنا بالتحقيق فيما إذا كان PI و phosphoinositides يمكن أن يحمي أغشية الفوسفوليبيد النموذجية من تأثيرات إنزيمات sPLA2 المعبر عنها بشكل شاذ. كانت الأغشية النموذجية مصنوعة من فوسفاتيديل كولين (PC) ، وهو الفوسفوليبيد الأكثر وفرة في جميع أغشية خلايا الثدييات21 ، المخصب بنسبة مولية 20٪ إما PI أو PI-4-P أو PI-4،5-P2. لتقليد تأثيرات إنزيمات sPLA2 المعبر عنها بشكل شاذ على أغشية النموذج ، استخدمنا الوحدة الفرعية الأساسية HDP-2Pمن إنزيم PLA 2 السام العصبي لسم الأفعى الإفرازية من المجموعة IIA، والتي تمت دراسة نشاطها المحلل المائي سابقا على أغشية المايلين النموذجية23.

لهذا العمل ، قمنا بتطوير نهج جديد للتحقيق في التغيرات في نفاذية الأغشية الشحمية المتأثرة ب HDP-2P. تعتمد الطريقة الجديدة على تفاعل استبدال الترابط في محلول CuSO4 خارج الجسيمات الشحمية ، بما في ذلك يجند NH3 محاصر داخل الجسيمات الشحمية. إذا سمحت نفاذية الغشاء التي يسببها HDP-2P بتسرب NH3 من الجسيمات الشحمية ، فإن الأمونيا المنبعثة ستحل محل أربعة جزيئات ماء كميا في أيونات النحاس المائية عبر التفاعل: [Cu (H2O) 6] 2+ (aq) + 4NH3 (aq) figure-introduction-1 [Cu (H2O) 2 (NH3) 4] 2+ (aq) + 4H2س (ل). ينتج عن تبادل الترابط هذا زيادة مميزة في الكثافة البصرية للمحلول التي يمكن قياسها بواسطة قياس الطيف الضوئي (λ = 600 نانومتر) ، وهو بمثابة قراءتنا الكمية لتغيرات نفاذية الغشاء. يوضح نهجنا القائم على استبدال الترابط حساسية فائقة لتقييم نفاذية الغشاء مقارنة بالتقنيات التقليدية مثل 1H-NMR23،24،25،26،27،28 ومقايسات نقل الأيونات29 ، مع تقديم ميزة إضافية تتمثل في عدم الحاجة إلى أجهزة باهظة الثمن. هذه الطريقة البسيطة والفعالة من حيث التكلفة ، المطبقة جنبا إلى جنب مع قياسات النشاط التحلل المائي HDP-2P والمحاكاة في السيليكو ل PI و PI-4-P و PI-4،5-P 2 المرتبطة بالسطح الجزيئي ل HDP-2P ، سمحت لنا باستنتاج أن فوسفات حلقة الإينوزيتول في PI تلغي الآثار التخريبية ل HDP-2P على أغشية الكمبيوتر المخصب ب PI-4-P أو PI-4 ، 5-ف2. يجب تأكيد هذه النتيجة في مزيد من الدراسات, قدرة فوسفات حلقة الإينوزيتول في PI على الحماية من الآثار الضارة للبروتينات الخلوية التي تعمل بشكل غير طبيعي, قد تسهم في استقرار الغشاء في ظروف المرض التي تنطوي على نشاط البروتين الشاذ, قد تمهد الطريق لتطوير المستحضرات الصيدلانية الجديدة لعلاج الاضطرابات العصبية مثل مرض الزهايمر والتصلب المتعدد.

البروتوكول

1. في محاكاة السيليكو لتفاعل HDP-2P مع PI والفوسفوينوسيتيدات باستخدام برنامج النمذجة الجزيئية

  1. تثبيت البرامج وإعدادها
    1. قم بتثبيت محرر الرسم الكيميائي المشار إليه لبناء جزيئات الترابط كما هو موضح في الملف التكميلي 1 - الشكل التكميلي S1A.
    2. قم بتثبيت برنامج النمذجة الجزيئية للالتحام الجزيئي لليجند إلى المستقبل.
    3. قم بتثبيت أدوات الإرساء التلقائية لإعداد الترابط والمستقبلات.
    4. نظرا لأن برنامج محاكاة النمذجة الجزيئية يعتمد على بيئة Python ، فقم بتثبيت Python.
  2. إعداد الترابط
    1. أولا ، استخدم محرر الرسم الكيميائي لبناء الإحداثيات الذرية للهياكل الجزيئية ل PI و PI-4-P و PI-4،5-P2 والكارديوليبين والفوسفاتيديل سيرين.
      ملاحظة: يصف بروتوكول المثال في الخطوات التالية لإعداد الترابط الخطوات الخاصة ب PI فقط.
    2. قم ببناء التركيب الجزيئي ل PI باستخدام محرر الرسم الكيميائي كما هو موضح في الملف التكميلي 1 - الشكل التكميلي S1B واحفظ الملف بتنسيق PDB كما هو موضح في الملف التكميلي 1 - الشكل التكميلي S2.
    3. افتح ملف PDB في برنامج أداة الإرساء التلقائي كما هو موضح في الملف التكميلي 1 - الشكل التكميلي S3A.
    4. أضف ذرات الهيدروجين كما هو موضح في الملف التكميلي 1 - الشكل التكميلي S3B وحدد إما ذرات الهيدروجين القطبية أو جميع ذرات الهيدروجين كما هو موضح في الملف التكميلي 1 - الشكل التكميلي S4A.
      ملاحظة: بعد الانتهاء من إرساء PI مع HDP-2P، حدد ذرات الهيدروجين القطبية فقط لتبسيط تصور الروابط القطبية أو الهيدروجينية.
    5. قم بتعيين جزيء PI كرابط لبرنامج أداة الإرساء الآلي كما هو موضح في الملف التكميلي 1 - الشكل التكميلي S4B.
    6. احفظ الترابط كملف PDBQT كما هو موضح في الملف التكميلي 1 - الشكل التكميلي S5A. تأكد من جعل جميع السندات قابلة للتدوير.
  3. تحضير المستقبلات
    1. قم بتنزيل ملف PDB من الفوسفوليباز A2 HDP-2 (رمز PDB 2I0U) ، الذي يتكون من اثنين من المونومرات ، أحدهما حمضي ، غير نشط إنزيميا ، A ، والآخر أساسي ونشط إنزيميا ، E. لحذف المونومر غير النشط إنزيميا A ، قم باستيراد ملف 2I0U إلى برنامج النمذجة الجزيئية (الملف التكميلي 1 - الشكل التكميلي S5B) ، وحدد جميع ذرات المونومر A (الملف التكميلي 1 - الشكل التكميلي S6A) ، ثم انتقل إلى تحرير وحذف جميع ذرات المونومر A (الملف التكميلي 1 - الشكل التكميلي S6B). احتفظ بمونومر E النشط إنزيميا ، والذي تم تعيينه الآن على أنه المستقبل.
    2. افتح ملف PDB لمستقبل HDP-2P في برنامج أداة الإرساء الآلي كما هو موضح في الملف التكميلي 1 - الشكل التكميلي S7.
    3. قم بإزالة جميع جزيئات الماء كما هو موضح في الملف التكميلي 1 - الشكل التكميلي S8A.
    4. أضف ذرات الهيدروجين كما هو موضح في الملف التكميلي 1 - الشكل التكميلي S8B. يرجى ملاحظة أنه بعد الانتهاء من إرساء HDP-2P مع PI ، يجب اختيار الهيدروجين القطبي فقط لتبسيط تصور الروابط القطبية والهيدروجينية.
    5. قم بتعيين HDP-2P كمستقبل ، كما هو موضح في الملف التكميلي 1 - الشكل التكميلي S9A ، واحفظه كملف PDBQT. تأكد من ضبط المستقبل بدون روابط قابلة للدوران.
  4. إعداد معلمة الإرساء
    1. افتح كل من ملفات PDBQT للرابط ومستقبل.
    2. أدخل واجهة إعداد مربع الشبكة ، كما هو موضح في الملف التكميلي 1 - الشكل التكميلي S9B ، وحدد حجم مربع الشبكة (الحجم x = 44.644 ؛ الحجم y = 74.939 ؛ الحجم z = 43.050) وإحداثيات المركز (المركز x = 25.626 ؛ المركز y = 9.582 ؛ المركز z = 41.825) ، والتي تحيط بالكامل بسطح جزيء المستقبل بالكامل كما هو موضح في الملف التكميلي 1 - الشكل التكميلي S10A.
    3. أغلق واجهة إعداد مربع الشبكة بالإعدادات الحالية كما هو موضح في الملف التكميلي 1 - الشكل التكميلي S10B واحفظ معلمات الإرساء في ملف config.txt كما هو موضح في الملف التكميلي 1 - الشكل التكميلي S11A.
  5. تشغيل برنامج الإرساء الجزيئي
    1. قم بتشغيل برنامج الإرساء الجزيئي باستخدام ملف config.txt كما هو موضح في الملف التكميلي 1 - الشكل التكميلي S11B.
    2. قم بتنفيذ حساب الإرساء (~ 30-90 دقيقة ؛ الملف التكميلي 1 - الشكل التكميلي S12).
    3. تحقق من ملف docking_log.txt لمراجعة درجات الإرساء (تقارب الإلزام).
    4. حدد نتيجة الإرساء بأقل تكوين للطاقة.
  6. تحليل بيانات الإرساء
    1. استخدم برنامج أداة الإرساء التلقائي لفتح ملف PDBQT لنتيجة الإرساء.
    2. تحليل مواقع ربط مستقبلات الترابط ، مع التركيز على المركز النشط للمستقبل والتفاعلات بين الجزيئات ، بما في ذلك تفاعلات الرابطة الأيونية والأيونية والقطبية والهيدروجينية. قم بعمل جدول ل PI و phosphoinositide ، اللذين يتفاعلان مع الموقع النشط للمستقبل ، لوصف صلات موقع الربط في الكيلو كالوري / مول ، والشقوق المشحونة والقطبية في الرأس القطبي PI / phosphoinositide ، وبقايا HDP-2P المشاركة في الترابط بين الجزيئات ، وأنواع الروابط كما هو موضح في الجدول 1 والجدول 2. كرر الإرساء لكل زوج من المستقبلات والترابط 3x للتأكد من عدم وجود انحراف في مواقع الربط ، وتقارب الربط ، والشقوق المشحونة والقطبية من PI / phosphoinositide وبقايا HDP-2P ، ونوع الروابط.

2. النشاط التحلل المائي ل HDP-2P في الجسيمات الشحمية PC المخصب ب PI أو PI-4-P أو PI-4،5-P2 أو PS أو CL التي تتم مراقبتها باستخدام الإنزيم المساعد A المليء بالأحماض الدهنية الحرة

ملاحظة: الكلوروفورم والميثانول و NH3 و CuSO4 خطرة. استخدم دائما قفازات النتريل والنظارات الواقية ومعطف المختبر. تعامل مع جميع البروتوكولات باستخدام هذه الكواشف تحت غطاء الدخان. قم بتخزين الكلوروفورم في زجاجة زجاجية كهرمانية. قم بتخزين الميثانول في خزانات قابلة للاشتعال بعيدا عن المؤكسدات. احتفظ بالميثانول بعيدا عن اللهب والشرر. قم بتسمية جميع حاويات النفايات لهذه الكواشف والتخلص منها وفقا للوائح التخلص من النفايات الخطرة المحلية.

  1. قم بإعداد 100 مل من المحلول العازل للتحلل المائي للفوسفوليبيد المحفز HDP-2P عن طريق إذابة 5.55 مجم من CaCl2 في 0.10 M Tris-HCl (الرقم الهيدروجيني 7.4).
  2. قم بإعداد 50 مل من محلول مخزون EDTA 1.0 M عن طريق إذابة 7.31 جم من EDTA في الماء المقطر منزوع الأيونات (ddH20).
  3. قم بإعداد محلول مخزون 0.54 ملي مولار HDP-2P في مخزن مؤقت 0.10 متر Tris-HCl (درجة الحموضة 7.4). الكتلة المولية ل HDP-2P هي 13.827 كيلو دالتون.
  4. قم بإعداد محاليل المخزون التالية من الدهون الفوسفورية بتركيز 10.0 M في خليط الكلوروفورم / الميثانول (2 إلى 1 من حيث الحجم): صفار البيض L-α-phosphatidylcholine (PC) ، قلب البقر cardiolipin (CL) ، دماغ البقر L-α-phosphatidyl-L-serine (PS) ، PI ، PI-4-P ، و PI-4،5-P2. الكتل المولية من PC و CL و PS و PI و PI-4-P و PI-4،5-P2 هي 768 Da و 1،466 Da و 792 Da و 867 Da و 962 Da و 1،057 Da ، على التوالي ، كما هو موضح أدناه.
  5. تحضير خمس عينات من الجسيمات الشحمية للكمبيوتر الشخصي. لتحضير عينة من الجسيمات الشحمية PC ، أضف 75 ميكرولتر من محلول مخزون الكلوروفورم / الميثانول من PC إلى أنبوب اختبار زجاجي وجفف الدهون عند 25 درجة مئوية تحت فراغ 10 باسكال لمدة ساعة واحدة حتى يتم تكوين طبقة دهنية. رطب طبقة الدهون لمدة ساعة واحدة مع 15 مل من محلول عازلة للتحلل المائي للفوسفوليبيد عند 25 درجة مئوية في منظم الحرارة. بعد ذلك ، أدخل مسدس التيتانيوم لموزع بالموجات فوق الصوتية 100-150 واط في تعليق الدهون في أنبوب الاختبار الزجاجي الموجود في حمام جليدي وقم بصوتنة التعليق بتردد 22 كيلو هرتز لمدة 10 دقائق ، بما لا يتجاوز 50٪ من الطاقة القصوى. لإزالة جزيئات "الغبار" من التيتانيوم ، قم بالطرد المركزي للجسيمات الشحمية عند 200 × جم (1,270 دورة في الدقيقة مع دوار 10 سم) لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
  6. قم بإعداد عينات من الجسيمات الشحمية PC المخصبة إما ب CL أو PS أو PI أو PI-4-P أو PI-4،5-P2 في الكمبيوتر الشخصي ونسبة الدهون المولية الأخرى من 4 إلى 1 عن طريق خلط محاليل مخزون الكلوروفورم / الميثانول الفوسفوليبيد - 60 ميكرولتر من الكمبيوتر الشخصي مع 15 ميكرولتر من CL أو PS أو PI أو PI-4-P أو PI-4،5-P2 في أنبوب زجاجي. ثم, جفف الدهون في فراغ 10 باسكال أو لمدة 3 ساعات في درجة حرارة الغرفة, ترطيب فيلم الدهون في محلول عازلة للتحلل المائي فوسفوليبيد, وصوتنة مع الموجات فوق الصوتية كما هو موضح أعلاه.
    ملاحظة: لكل نوع من الجسيمات الشحمية ، قم بإعداد خمس عينات.
  7. ضع 1.0 مل من خمس عينات من كل نوع من الجسيمات الشحمية الموصوفة أعلاه لفصل الأنابيب وأضف 10 ميكرولتر من محلول الإنزيم المساعد عديم اللون من مجموعة NEFA إلى كل أنبوب ثم أضف 0.00 أو 0.93 أو 1.86 أو 2.79 أو 3.72 ميكرولتر من محلول مخزون 0.54 ملي مولار HDP-2P لأنابيب منفصلة للحصول في عينات الجسيمات الشحمية على النسب المولية HDP-2P / phospholipid البالغة 0.000 ، 0.001 و 0.002 و 0.003 و 0.004 على التوالي.
  8. مباشرة بعد إضافة HDP-2P إلى الجسيمات الشحمية ، احتضن عينات الجسيمات الشحمية لمدة 15 دقيقة عند 37 درجة مئوية في منظم الحرارة ، ثم أوقف التحلل المائي للفوسفوليبيد الناجم عن HDP-2P عن طريق إضافة 100 ميكرولتر من محلول EDTA للمخزون. بعد ذلك ، دوامة العينات لمدة 1 دقيقة.
  9. حدد النشاط التحلل المائي ل HDP-2P عن طريق قياس الكثافة الضوئية للعينات الشحمية عند 550 نانومتر باستخدام مقياس الطيف الضوئي ، والذي من شأنه أن يقيس مدى تحول محلول الإنزيم المساعد عديم اللون إلى اللون الأرجواني عندما يصبح أسيل مع الأحماض الدهنية الحرة.
  10. كرر الإجراء أعلاه مرتين أخريين بحيث يتم اشتقاق متوسط قيم الكثافة الضوئية من ثلاث تجارب مستقلة.
    ملاحظة: كل نقطة بيانات تم الحصول عليها في هذه التجربة التجريبية هي متوسط قيمة الكثافة البصرية. من الناحية المثالية ، يجب أن يكون الانحراف المعياري لنقاط البيانات التجريبية في حدود ±5٪ من المتوسط.

3. تأثيرات HDP-2P على نفاذية الأغشية الشحمية PC المخصبة ب PI أو PI-4-P أو PI-4،5-P2 أو PS أو CL المقاسة عن طريق تفاعل استبدال الترابط في محلول CuSO4 الذي يتضمن رابطة NH3 المحاصرة داخل الجسيمات الشحمية

ملاحظة: الكلوروفورم والميثانول و NH3 و CuSO4 خطرة. استخدم دائما قفازات النتريل والنظارات الواقية ومعطف المختبر. تعامل مع جميع البروتوكولات باستخدام هذه الكواشف تحت غطاء الدخان. قم بتخزين الكلوروفورم في زجاجة زجاجية كهرمانية. قم بتخزين الميثانول في خزانات قابلة للاشتعال بعيدا عن المؤكسدات. احتفظ بالميثانول بعيدا عن اللهب أو الشرر. قم بتسمية جميع حاويات النفايات لهذه الكواشف والتخلص منها وفقا للوائح التخلص من النفايات الخطرة المحلية.

  1. قم بإعداد 20 مل من محاليل مخزون 0.03 متر لكل من الدهون الفوسفورية الستة - PC ، CL ، PS ، PI ، PI-4-P ، PI-4،5-P2- في الكلوروفورم / الميثانول (2 إلى 1 حجم). الكتل الجزيئية ل PC و CL و PS و PI و PI-4-P و PI-4،5-P2 هي 768 و 1466 و 792 و 867 و 962 و 1057 Da على التوالي.
  2. قم بإعداد 100 مل من 0.10 M Tris-HCl (الرقم الهيدروجيني 7.4) بتركيز نهائي قدره 0.05 M CuSO4.
  3. قم بإعداد 4 مل من مخزون 1.5 × 10-3 M HDP-2P في 0.05 M CuSO4 ، 0.10 M Tris-HCl (الرقم الهيدروجيني 7.4). الكتلة المولية ل HDP-2P هي 13.827 كيلو دالتون.
  4. لتحضير 100 مل من محلول 0.5 M NH3 ، استخدم محلول NH3 بنسبة 25٪ (الكثافة 905 جم / لتر30 ، أي ما يعادل 13.30 م [905 جم / لتر × 0.25 م ÷ 17.00 جم / لتر = 13.30 م]). وبالتالي ، لتحضير 100 مل من 0.5 M NH3 ، استخدم 3.76 مل من محلول NH3 بنسبة 25٪: (0.5 م × 1,000 مل ÷ 13.30 م) ÷ 10 = 3.76 مل من محلول 25٪ NH3 . ضع 3.76 مل من محلول NH3 بنسبة 25٪ في قارورة حجمية سعة 100 مل وارفع الحجم إلى 100 مل باستخدام مخزن مؤقت 0.10 M Tris-HCl (الرقم الهيدروجيني 7.4).
  5. لتحضير الجسيمات الشحمية مع NH3 في الحجم الداخلي للجسيمات الشحمية ، ضع 12.5 مل من محلول فوسفوليبيد 0.03 M في الكلوروفورم / الميثانول في أنبوب والفوسفوليبيدات الجافة في فراغ 10 باسكال أو لمدة 3 ساعات في درجة حرارة الغرفة. ترطيب فيلم الفوسفوليبيد لمدة ساعة واحدة مع 12.5 مل من 0.5 M NH3 ، 0.10 M Tris-HCl (الرقم الهيدروجيني 7.4) عند 25 درجة مئوية في منظم الحرارة ؛ ثم صوتنة تعليق الدهون عند تردد 22 كيلو هرتز كما هو موضح في الخطوة 2.5 لإنتاج الجسيمات الشحمية الصوتية.
    ملاحظة: في الحل مع الجسيمات الشحمية الصوتية ، يقع NH3 داخل وخارج الجسيمات الشحمية.
  6. للتخلص من NH3 خارج الجسيمات الشحمية ، قم بإزالة الجسيمات الشحمية باستخدام غشاء غسيل الكلى (قطع جزيئي 1.0 كيلو دالتون) لدرجة حرارة الغرفة 5 قبعات مقابل 0.10 M Tris-HCl (الرقم الهيدروجيني 7.4) باستخدام محرك مغناطيسي.
    ملاحظة: كان غسيل الكلى لمدة 5 ساعات كافيا لإزالة NH3 تماما ، حيث أن إضافة 0.5 مل من الجسيمات الشحمية المتحللة إلى 0.5 مل من 0.10 M Tris-HCl ، 0.05 M CuSO4 أسفر عن نفس الكثافة البصرية عند 600 نانومتر مثل تلك الموجودة في الجسيمات الشحمية المحضرة بدون NH3 ومختلطة مع نفس المخزن المؤقت.
  7. بعد غسيل الكلى ، قم بالطرد المركزي للجسيمات الشحمية عند 200 جم × لمدة 90 دقيقة كما هو موضح في الخطوة 2.5 لحبيبات الجسيمات الشحمية. تخلص من المادة الطافية وأعد تعليق الجسيمات الشحمية بسعة 5.0 مل من 0.10 M Tris-HCl ، و 0.05 M CuSO4 (الرقم الهيدروجيني 7.4) ، وقسم الجسيمات الشحمية المعلقة إلى خمس عينات من 1.0 مل لكل منها. أضف إلى هذه العينات الخمس سعة 1.0 مل بشكل منفصل 60 و 40 و 20 و 0 ميكرولتر من 0.10 M Tris-HCl و 0.05 M CuSO4 (الرقم الهيدروجيني 7.4) ثم 0 ، 20 ، 40 ، 60 ، 80 ميكرولتر من المخزن المؤقت HDP-2P لضبط النسب المولية HDP-2P / phospholipid في عينات الجسيمات الشحمية 0.000 ، 0.001 ، 0.002 ، 0.003 ، و 0.004 ، على التوالي.
  8. احتضان عينات الجسيمات الشحمية لمدة 30 دقيقة في ترموستات عند 37 درجة مئوية ؛ بعد ذلك ، قم بقياس الكثافة البصرية لعينات الجسيمات الشحمية عند 600 نانومتر باستخدام مقياس الطيف الضوئي. اتبع الخطوات الموضحة في القسم 3 لجميع عينات الجسيمات الشحمية الستة وكرر 3x لضمان قراءات ثلاثية للكثافة الضوئية لكل نقطة بيانات.
    ملاحظة: يجب أن يكون الانحراف المعياري لنقاط البيانات التجريبية دائما في حدود ±5٪ من المتوسط.

النتائج

محاكاة النمذجة الجزيئية لتفاعل HDP-2P مع PI والفوسفوينوسيتيدات
يحسب برنامج النمذجة الجزيئية أفضل تسعة مواقع ربط على السطح الجزيئي للمستقبل (جزيء أكبر) ، والذي يستهدفه يجند (جزيء أصغر). يتم تحديد هذه المواقع من خلال إطلاق أعلى تسعة محتوى انتثالبي ، والتي تحدد المواقع ذات أفضل صلات الربط. يتم التعبير عن صلات الربط كقيم سلبية ، مما يشير إلى أن الارتباط بين الجزيئات هو عملية طاردة للحرارة. في حالة تفاعل HDP-2P مع PI ، تنبأت المحاكاة بأربعة مواقع ربط (# 3 و # 6 و # 7 و # 8) ل PI على السطح الجزيئي ل HDP-2P داخل المركز النشط (الجدول 1). بالإضافة إلى ذلك ، تم العثور على مواقع الربط الخمسة ل PI خارج المركز النشط ل HDP-2P. يتم توضيح رموز الشقوق المشحونة والقطبية في الرأس القطبي ل PI في الشكل 1.

يتكون المركز النشط ل HDP-2P من خمسة بقايا رئيسية من الأحماض الأمينية: Gly30 و Gly32 و His48 و Asp49 و Lys69 ، والتي تسهل المحاذاة الصحيحة لركيزة الفوسفوليبيد في المركز النشط لضمان التحلل المائي التحفيزي. تظهر بعض الهياكل التمثيلية الراسية ارتباط PI ببعض بقايا الأحماض الأمينية للمركز النشط ، بينما في موقع الربط # 6 ، يتعامل PI مع جميع بقايا الأحماض الأمينية الخمسة الرئيسية للمركز النشط من خلال الروابط الأيونية والقطبية الأيونية والهيدروجينية (الجدول 1). يوضح الشكل 2 كيف يتفاعل PI مع جميع بقايا الأحماض الأمينية الخمسة الرئيسية في المركز النشط ل HDP-2P داخل موقع الربط # 6.

تنبأت محاكاة الإرساء للتفاعل بين HDP-2P و PI-4-P ، والتي تحتوي على مجموعة فوسفات في الموضع 4 من حلقة الإينوزيتول ، بموقع الربط # 1 فقط كموقع يرتبط فيه PI-4-P بالمركز النشط ل HDP-2P. على وجه التحديد ، في هذا الموقع ، يتفاعل PI-4-P مع ثلاثة بقايا رئيسية من الأحماض الأمينية للمركز النشط - Gly30 و Gly32 و Lys69 - عبر الروابط الأيونية والقطبية الأيونية والهيدروجينية (الجدول 2). يوضح الشكل 3 تفاعل PI-4-P مع المركز النشط ل HDP-2P. في مواقع الربط الثمانية المتبقية على السطح الجزيئي ل HDP-2P ، يرتبط PI-4-P بمواقع خارج المركز النشط.

كشفت محاكاة الإرساء الجزيئي لتفاعلات HDP-2P مع PI-4،5-P₂ (التي تحتوي على مجموعات الفوسفات في الموضعين 4 و 5 من حلقة الإينوزيتول) عن عدم وجود ارتباط بالمركز النشط للإنزيم عبر جميع مواقع الربط التسعة المتوقعة. بدلا من ذلك ، يرتبط PI-4،5-P₂ باستمرار بتجويف يشبه الأخدود بجوار المركز النشط (الشكل 4) ، مكونا روابط أيونية قطبية وهيدروجينية مع بقايا HDP-2P الثلاثة ، Trp31 و Gly33 و Gln34).

في حين أن ارتباط PI-4،5-P₂ بتجويف يشبه الأخدود بالقرب من المركز النشط للخلوية أو السم PLA2s لم يتم توثيقه مسبقا ، فإن الميزات المماثلة هيكليا راسخة في مجالات تماثل pleckstrin31 (PH) و epsin N-terminalالتماثل 32 (ENTH). تستخدم مجالات الإشارات هذه بنى أخدود كاتيوني كارهة للماء للاستماء للتعرف على PI-4،5-P2 31،32 ، على الرغم من طبيعتها غير الأنزيمية. يثير وجود شكل هيكلي مماثل في HDP-2P إمكانيات مثيرة للاهتمام إما للتقليد التطوري أو التطور المتقارب لتسهيل التعرف على مجال الغشاء بواسطة HDP-2P. إذا تم التحقق منها بطرق أخرى ، فقد تمثل هذه الدراسة أول حالة تم الإبلاغ عنها لسم PLA2 يستخدم مثل هذه الآلية للتعرف على الفوسفينوسيتيد.

ومن المثير للاهتمام ، أن محاكاة الإرساء الجزيئي ل CL و PS التي تتفاعل مع HDP-2P تنبأت بارتباط كل من الدهون الفوسفورية بالمركز النشط ل HDP-2P في ثمانية من أصل تسعة مواقع ربط ، في حين أن موقع الارتباط الوحيد ل CL و PS الخارجي بالمركز النشط لم يكن موجودا في التجويف الشبيه بالأخدود (البيانات غير معروضة). تجدر الإشارة أيضا إلى أنه ، مثل PI ، يرتبط الكمبيوتر الشخصي بالمركز النشط ل HDP-2P في أربعة من أصل تسعة مواقع ربط ، ولا يرتبط كل من PI و PC ، مثل CL و PS ، بالتجويف الشبيه بالأخدود (البيانات غير معروضة). تشير هذه النتائج إلى أن مجموعات الفوسفات على حلقة الإينوزيتول من PI لديها تقارب ربط عالية إلى التجويف الشبيه بالأخدود الموجود بجوار المركز النشط. حددت التحليلات الهيكلية تجاويف مماثلة تشبه الأخدود مع بقع سطحية كاتيونية كارهة للماء والقطبية بالقرب من المركز التحفيزي في كل من إنزيمات الخلوية33 والسم34 PLA2 . قد يؤدي ارتباط الفوسفوينوسيتيدات بهذه التجاويف إلى إحداث تغيرات توافقية مهمة من الناحية الفسيولوجية ، مما قد يثبط النشاط الأنزمي. والجدير بالذكر أنه من بين الفوسفوينوسيتيدات ، يوضح PI-4،5-P2 خصائص الركيزة السيئة بشكل خاص - تظهر الأشكال الإسوية لجيش التحرير الشعبى الصينى2 البشرية (الأنواع الخلوية والمستقلة عن الكالسيوم والإفراز) نشاطا مائي ضئيلا إلى غير قابل للكشف نحو PI-4،5-P235. يشير هذا إلى أن ارتباط فوسفينوسيتيد بهذه السمات الهيكلية المحفوظة قد يخدم وظيفة فسيولوجية مميزة (على سبيل المثال ، التثبيط الخيفي) بدلا من الوظائف التحفيزية عبر عائلة PLA2 الفائقة ، الأمر الذي يتطلب التحقق التجريبي في المستقبل.

النشاط التحلل المائي ل HDP-2P في الجسيمات الشحمية PC المخصب ب PI أو PI-4-P أو PI-4،5-P2 أو PS أو CL التي تتم مراقبتها باستخدام الإنزيم المساعد A المغطى بالأحماض الدهنية الحرة
تم تقييم النشاط التحلل المائي ل HDP-2P على العينات الشحمية باستخدام محلول الإنزيم المساعد A. محلول الإنزيم المساعد A عديم اللون ولكنه يتحول إلى اللون الأرجواني عند الارتباط بواسطة الأحماض الدهنية الحرة التي يتم إطلاقها أثناء التحلل المائي للفوسفوليبيد الذي يتم تحفيزه بواسطة HDP-2P. تم قياس الزيادة الناتجة في الكثافة البصرية ، المقابلة لمدى الإنزيم المساعد أ ، طيافيا ضوئيا عند 550 نانومتر. لذلك ، فإن الزيادة في الكثافة البصرية في العينات الشحمية المعالجة بالإنزيم المساعد A و HDP-2P تتناسب طرديا مع النشاط التحلل المائي ل HDP-2P.

يعرض الشكل 5 منحنيات النشاط التحلل المائي كدالة للنسبة المولية HDP-2P / phospholipid في عينات شحمية مختلفة. يتم التعبير عن النشاط التحلل المائي ل HDP-2P بوحدات عشوائية (a.u.) من الكثافة الضوئية (OD) المقاسة عند 550 نانومتر. لم نقم ببناء منحنى معايرة لربط قيم a.u. بالتركيزات المولية للأحماض الدهنية الحرة ، حيث أظهرت تجاربنا التجريبية أن الأحماض الدهنية في المذيبات العضوية ، عند إضافتها إلى المحاليل المائية التي تحتوي على الإنزيم المساعد A و acyl-coenzyme A synthetase ، لم تنتج أي تغيير OD يمكن اكتشافه عند 550 نانومتر. يشير هذا إلى أن هذه الأحماض الدهنية تشكل مذيلات بدلا من الارتباط بالإنزيم المساعد A. في المقابل ، ترتبط الأحماض الدهنية المتولدة عن الغشاء فقط (التي ينتجها نشاط PLA2) بالإنزيم المساعد A المرتبط بالغشاء ، مما يؤدي إلى تغيير OD قابل للقياس. إن الطبيعة البرمائية للإنزيم المساعد A - التي تحتوي على مناطق كارهة للماء ومحبة للماء على سطحه الجزيئي - تتوطينه بشكل تفضيلي في واجهة الغشاء والماء ، مما يسهل ارتباط الأحماض الدهنية التي ينتجها نشاط PLA2 بالإنزيم المساعد A. ومع ذلك ، في ظل ظروف الفحص هذه ، لا يمكن تحديد التركيز المولي للأحماض الدهنية. لهذا السبب ، يعبر الباحثون الذين يستخدمون مقايسة الإنزيم المساعد A عن النشاط التحلل المائي ل PLA2 في وحدات عشوائية من OD تقاس عند 550 نانومتر20.

لوحظت أعلى زيادة في الكثافة البصرية ، المقابلة لأكبر نشاط تحلل مائي ل HDP-2P ، في الجسيمات الشحمية PC المخصبة ب CL أو PS. تتوافق هذه النتيجة بشكل جيد مع أكبر عدد من مواقع الربط ل CL و PS في المركز النشط ل HDP-2P. كان النشاط التحلل المائي ل HDP-2P في الجسيمات الشحمية PC المخصب ب PI أقل بمقدار 3.0 و 2.5 مرة من الجسيمات الشحمية المخصبة ب CL أو PS ، على التوالي ، ولكنه أعلى من الجسيمات الشحمية PC النقية. يشير هذا إلى أن تقارب الارتباط بالمركز النشط ل HDP-2P من PI أعلى من تقارب الكمبيوتر الشخصي ، على الرغم من أن كلا الدهون لهما نفس عدد مواقع الربط في المركز النشط.

يمكن تفسير هذا التناقض الواضح من خلال الاختلافات الهيكلية في مجموعات الرأس القطبية ل PI و PC. في حين أن PC هو جزيء محايد ، فإن مجموعة ثلاثي ميثيل الأمونيوم الكاتيونية تمتد إلى الخارج في المحلول ، في حين أن مجموعة الفوسفات الأنيوني الخاصة به تقع بالقرب من المنطقة الكارهة للماء في الغشاء. قد يؤدي توزيع الشحنة هذا في مجموعة رأس الكمبيوتر الشخصي إلى إنشاء تنافر إلكتروستاتيكي ضد HDP-2P الأساسي ، مما يقلل من تقاربه الملزم. في المقابل ، فإن الطبيعة الحمضية ل PI تجعله نوعا من الدهون أكثر جاذبية للتفاعل مع HDP-2P الأساسي ، والذي يمكن أن يفسر نشاطه المحلل المائي العالي مقارنة بالجسيمات الشحمية النقية PC.

يشير النشاط التحللي المائي ل HDP-2P في الجسيمات الشحمية PC المخصب ب PI-4-P ، كما هو موضح في الشكل 5 ، إلى الحد الأدنى من التحلل المائي التحفيزي للدهون الفوسفورية. من اللافت للنظر أن منحنى الكثافة الضوئية الذي تم الحصول عليه من الجسيمات الشحمية PC المخصب ب PI-4،5-P يشير إلى الإلغاء الكامل للنشاط التحلل المائي بواسطة HDP-2P في عينة الجسيمات الشحمية هذه. تتوافق هذه النتائج بشكل جيد مع محاكاة الإرساء ، والتي تتنبأ بموقع ربط واحد ل PI-4-P في المركز النشط ل HDP-2P ، بينما لا يظهر PI-4،5-P2 أي تقارب ربط بالمركز النشط على الإطلاق. وهذا يشير إلى أن مجموعات الفوسفات المرتبطة بحلقة الإينوزيتول تعيق ربط فوسفوليبيد للمركز النشط من HDP-2P. نقترح أن تمتد مجموعات الفوسفات الموجودة على حلقة الإينوزيتول إلى الخارج في المحلول ، ومن خلال الارتباط ب HDP-2P عبر التفاعلات الأيونية والقطبية الأيونية بين الجزيئات ، فإنها تحافظ على HDP-2P على مسافة من سطح الغشاء ، وبالتالي حماية الغشاء من النشاط التحلل المائي ل HDP-2P. يتوافق هذا مع النتائج الحديثة التي كشفت أن إنزيمات PLA2 البشرية الخلوية والمستقلة عن الكالسيوم والإفراز أظهرت نشاطا تحلليا بالكاد يمكن اكتشافه أو معدوما تجاه ركائز PI-4-P و PI-4،5-P 2 35.

تغيرات النفاذية الناجمة عن HDP-2P في الأغشية الشحمية PC المخصبة ب PI أو PI-4-P أو PI-4،5-P2 أو PS أو CL: التقييم عبر تفاعل استبدال الترابط في محلول CuSO4 مع NH₃ المغلف

تم التحقيق في تأثير النشاط التحلل المائي HDP-2P على نفاذية غشاء الجسيمات الشحمية PC المخصبة ب PI أو PI-4-P أو PI-4،5-P2 أو PS أو CL باستخدام تفاعل استبدال الترابط في نظام أيوني معقد ، حيث تم تغليف الترابط البديل داخل الحجم الداخلي للجسيمات الشحمية. تعتمد هذه الطريقة البسيطة والموثوقة على إزاحة أربعة جزيئات ماء تعمل كروابط في الأيون المركب [Cu (H 2O) 6] 2+ بواسطة NH3

[النحاس (ح2س) 6]2+ (aq) + 4NH3 (aq) figure-results-1 [Cu(H2O)2(NH3)4]2+ (aq) + 4H2O (l)

أثناء عملية استبدال جزيئات الماء NH3 في الأيون المركب [Cu (H2O) 6] 2+ ، ينتقل اللون الأزرق الباهت ل [Cu (H 2O) 6] 2+ إلى اللون الأزرق الداكن ل [Cu (H2O) 2 (NH3) 4] 2+. في نظام يتم فيه تغليف NH3 داخل الحجم الداخلي للجسيمات الشحمية و [Cu (H2O) 6] 2+ موجود في المحلول الخارجي ، يشير هذا التغيير في اللون - الذي يتم مراقبته طيفيا ضوئيا - إلى زيادة نفاذية الغشاء الشحمي إلى NH3.

لإنشاء مثل هذا النظام ، قمنا بصوتنة تشتت الفوسفوليبيد في المخزن المؤقت Tris-HCl الذي يحتوي على NH3 ، وتشكيل الجسيمات الشحمية الصوتية مع NH₃ داخل وخارج الجسيمات الشحمية. تمت إزالة NH3 الخارجي عن طريق غسيل الكلى ، وبعد ذلك تمت إضافة محلول CuSO4 إلى عينة الجسيمات الشحمية التي تحتوي على NH3 في حجمها الداخلي. ثم عالجنا الجسيمات الشحمية باستخدام HDP-2P وراقبنا التغيرات في الكثافة الضوئية الطيفية.

لتحديد الطول الموجي الأمثل لقياس تغيرات الكثافة البصرية ، سجلنا أطياف الامتصاص ل [Cu (H2O) 2 (NH3) 4] 2+ في محلول 0.025 M CuSO4 و 0.100 M NH3 و [Cu (H 2O) 6] 2+ في محلول 0.025 M CuSO4 ، باستخدام الضوء المرئي في نطاق 500 نانومتر إلى 900 نانومتر. كما هو موضح في الشكل 6 ، أسفر التشعيع عند 600 نانومتر عن أقصى امتصاص ل [Cu (H2O) 2 (NH3) 4] 2+ والحد الأدنى من الامتصاص ل [Cu (H2O) 6] 2+ ، مما دفعنا إلى اختيار 600 نانومتر كطول موجي مثالي لتجارب نفاذية الغشاء لدينا.

يوضح الشكل 7 أن نفاذية الغشاء ل NH₃ هي الأعلى في الجسيمات الشحمية PC المخصب ب CL و PS الأنيوني. تتوافق هذه الملاحظة مع بياناتنا التي تم الإبلاغ عنها سابقا والتي تظهر أن HDP-2P ، وهي مجموعة IIA PLA2 ، تتفاعل بكفاءة مع بالميتويلويلويلويلويل-جليسروفوسفوجليسرين أنيوني ، مما يؤدي إلى التحلل المائي للركيزة - وهو تأثير لم يلاحظ مع بالميتويلويلويلجليسروفوسفوكولين المحايد36. بشكل عام ، تظهر معظم إنزيمات المجموعة IIA PLA2 نشاطا مائي أعلى بكثير تجاه الدهون الفوسفورية الأنيونية33،37،38. نفاذية الجسيمات الشحمية PC + PI أقل من تلك الموجودة في الجسيمات الشحمية PC + CL و PC + PS ولكنها تظل أعلى من تلك الموجودة في الجسيمات الشحمية PC النقية. تتوافق هذه النتائج بشكل جيد مع نتائج محاكاة الإرساء ومقايسات النشاط التحلل المائي HDP-2P. بمعنى آخر ، من المتوقع أن تكون العينات الليبوزومية التي تظهر نفاذية منخفضة مستقرة هيكليا بسبب عدم قدرة HDP-2P على تحلل الدهون الفوسفورية وبسبب تقارب أقل ل HDP-2 للارتباط ب PI و phosphoinositides ، كما هو متوقع في بيانات الإرساء الجزيئي (الشكل 2 ، الشكل 3 ، والشكل 4). لذلك ، يجب أن يكون نشاط الإنزيم المحلل المائي بواسطة HDP-2P (الشكل 5) ونفاذية الغشاء ، كما هو موضح في الشكل 7 ، مرتبطين بشكل إيجابي.

ومع ذلك ، في الجسيمات الشحمية PC + PI-4-P و PC + PI-4،5-P2 ، لم تزد النفاذية عند العلاج ب HDP-2P. في حين أن نتائج النفاذية ترتبط الجسيمات الشحمية PC + PI-4،5-P2 بشكل جيد مع محاكاة الإرساء وبيانات النشاط التحلل المائي HDP-2P لنفس الجسيمات الشحمية ، فإن عدم وجود نفاذية متزايدة في الجسيمات الشحمية PC + PI-4-P لا يتماشى تماما مع نتائج النشاط التحلل المائي ، حيث تم تسجيل درجة صغيرة من النشاط التحلل المائي في هذه الجسيمات الشحمية. تشير هذه النتائج إلى أن الزيادة الموضعية الطفيفة في النشاط التحلل المائي في الجسيمات الشحمية PC + PI-4-P لا تزعج تعبئة الطبقة ثنائية الطبقة من الدهون الفوسفورية إلى درجة من شأنها أن تغير نفاذية الغشاء إلى NH3.

figure-results-2
الشكل 1: رموز الشقوق المشحونة والقطبية للرأس القطبي للفوسفاتيديلينوسيتول. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

figure-results-3
الشكل 2: تفاعل PI مع المركز النشط ل HDP-2P المتوقع لموقع الربط # 6 بواسطة برنامج الإرساء الجزيئي. يتم إعطاء PI في تمثيل العصا ويتم إعطاء HDP-2P في تمثيلات الخط (الرسم البياني على اليسار) والسطح الجزيئي (الرسم البياني على اليمين). بالنسبة لتمثيلات العصا ، يمثل الزمرد الكربون ، والبرتقالي هو الفوسفور ، والأحمر هو الأكسجين ، والأبيض هو الهيدروجين. بالنسبة للسطح الجزيئي والخطوط ، يمثل اللون الأخضر الكربون ، والأزرق هو النيتروجين ، والأحمر هو الأكسجين ، والأبيض هو الهيدروجين ، والأصفر هو الكبريت. تحدد الخطوط الصفراء المكسورة الروابط بين الجزيئات. تشير الأسهم إلى بقايا الأحماض الأمينية في المركز النشط. الاختصارات: PI = فوسفاتيديلينوسيتول; HDP-2P = الوحدة الفرعية الأساسية لسم الأفعى فوسفوليباز. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-4
الشكل 3: تفاعل PI-4-P مع المركز النشط ل HDP-2P المتوقع لموقع الربط # 1 بواسطة برنامج الإرساء الجزيئي. يتم إعطاء PI-4-P في تمثيل العصا ويتم إعطاء HDP-2P في خطوط (رسم تخطيطي على اليسار) وتمثيلات السطح الجزيئي (الرسم البياني على اليمين). بالنسبة للعصي ، يمثل الزمرد الكربون ، والبرتقالي هو الفوسفور ، والأحمر هو الأكسجين ، والأبيض هو الهيدروجين. بالنسبة للسطح الجزيئي والخطوط ، يمثل اللون الأخضر الكربون ، والأزرق هو النيتروجين ، والأحمر هو الأكسجين ، والأبيض هو الهيدروجين ، والأصفر هو الكبريت. تحدد الخطوط الصفراء المكسورة الروابط بين الجزيئات. تشير الأسهم إلى بقايا الأحماض الأمينية في المركز النشط. الاختصارات: PI-4-P = فوسفاتيديلينوسيتول-4-فوسفات; HDP-2P = الوحدة الفرعية الأساسية لسم الأفعى فوسفوليباز. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-5
الشكل 4: تفاعل PI-4،5-P2 مع السطح الجزيئي ل HDP-2P المتوقع لموقع الربط # 6 بواسطة برنامج الإرساء الجزيئي. يرتبط PI-4،5-P2 بكهف يشبه الأخدود يقع أسفل المركز النشط ل HDP-2P. يتم إعطاء بقايا الأحماض الأمينية الخمسة الرئيسية في المركز النشط في التدوين المكون من ثلاثة أحرف. يتم إعطاء PI-4،5-P2 في تمثيل العصا ويتم إعطاء HDP-2P في الخط (الرسم البياني على اليسار) والسطح الجزيئي (الرسم البياني على اليمين). بالنسبة للعصي ، يمثل الزمرد الكربون ، والبرتقالي هو الفوسفور ، والأحمر هو الأكسجين ، والأبيض هو الهيدروجين. بالنسبة للسطح الجزيئي والخطوط ، يمثل اللون الأخضر الكربون ، والأزرق هو النيتروجين ، والأحمر هو الأكسجين ، والأبيض هو الهيدروجين ، والأصفر هو الكبريت. الاختصارات: PI-4،5-P2 = فوسفاتيديلينوسيتول-4،5-ثنائي الفوسفات. HDP-2P = الوحدة الفرعية الأساسية لسم الأفعى فوسفوليباز. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-6
الشكل 5: منحنيات النشاط التحلل المائي من عينات الجسيمات الشحمية بنسب مولارية مختلفة من HDP-2P / phospholipid. الجسيمات الشحمية مصنوعة من PC + CL (أخضر داكن) ، PC + PS (برتقالي) ، PC + PI (أزرق داكن) ، PC + PI-4-P (أزرق) ، PC + PI-4،5-P 2 (أخضر) ، والكمبيوتر الشخصي (أرجواني). تمثل قيم الكثافة الضوئية في الوحدات التعسفية وسائل القراءات الثلاثية عند 550 نانومتر. تشير أشرطة الخطأ إلى SD للقراءات الثلاثية. تم تقييم الدلالة الإحصائية للاختلافات في قيم الكثافة الضوئية بين عينات الجسيمات الشحمية باستخدام ANOVA ، حيث وجد أن جميع قيم p أقل بكثير من 0.05. الاختصارات: PC = فوسفاتيديل كولين; CL = كارديوليبين القلب البقري ; PS = فوسفاتيديل سيرين; PI = فوسفاتيديلينوسيتول; PI-4-P = فوسفاتيديلينوسيتول-4-فوسفات; PI-4،5-ف2 = فوسفاتيديلينوسيتول -4،5-ثنائي الفوسفات. a.u. = وحدات تعسفية ؛ HDP-2P = الوحدة الفرعية الأساسية لسم الأفعى فوسفوليباز. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-7
الشكل 6: أطياف الامتصاص للمحاليل المائية لمجمعات النحاس. مجمعات النحاس [Cu (H2O) 6] 2+ (خط برتقالي) و [Cu (H2O) 2 (NH3) 4] 2+ (خط أزرق) ، مشع بالضوء المرئي في النطاق من 500 نانومتر إلى 900 نانومتر. تم صنع مركب النحاس [Cu (H2O) 6] 2+ في محلول 0.025 M CuSO4 ومركب النحاس [Cu (H2O) 2 (NH3) 4] 2 + تم تصنيعه في محلول 0.025 M CuSO4 يحتوي على 0.100 M NH3. قيم الامتصاص في هذا الشكل لكل نقطة بيانات هي وسائل قراءات الامتصاص التي يتم إجراؤها في ثلاث نسخ. تمثل أشرطة الخطأ SD من القراءات الثلاثية. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-8
الشكل 7: منحنيات نفاذية الغشاء من عينات الجسيمات الشحمية. الجسيمات الشحمية مصنوعة من PC + CL (الأرجواني) ، PC + PS (الأزرق) ، PC + PI (الأزرق الداكن) ، PC + PI-4-P (الأخضر الداكن) ، PC + PI-4،5-P2 (البرتقالي) ، والكمبيوتر الشخصي (الأخضر) بنسب مولار مختلفة HDP-2P / phospholipid. يتم التعبير عن قيم نفاذية الغشاء كقيم كثافة بصرية في وحدات عشوائية (a.u.) مقاسة عند 600 نانومتر. تمثل كل نقطة بيانات متوسط القراءات الثلاثية. تشير أشرطة الخطأ إلى SD للقراءات الثلاثية. تم تقييم الدلالة الإحصائية للاختلافات في قيم الكثافة الضوئية بين عينات الجسيمات الشحمية باستخدام ANOVA ، حيث وجد أن جميع قيم p أقل بكثير من 0.05. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الجدول 1: طاقات ربط التقارب المتوقعة للمجمعات الجزيئية المرشحة ل HDP-2P مع PI. تم استخدام محاكاة النمذجة الجزيئية للتنبؤ بأنواع الروابط وصلات موقع الربط ، بالإضافة إلى الشقوق المشحونة والقطبية لكل من المجموعة الرئيسية للفوسفاتيديلينوسيتول وبقايا الأحماض الأمينية HDP2P التي تشارك في تفاعلاتها بين الجزيئات. يتم تمييز المجموعات المشحونة والقطبية من فوسفاتيديلينوسيتول في الشكل 1. لاحظ أن الرصاص في NHpbδ+ يشير إلى رابطة الببتيد. الاختصارات: PI = فوسفاتيديلينوسيتول; HDP-2P = الوحدة الفرعية الأساسية لسم الأفعى فوسفوليباز. الرجاء النقر هنا لتنزيل هذا الجدول.

الجدول 2: طاقات ربط التقارب المتوقعة للمجمعات الجزيئية المرشحة ل HDP-2P مع PI-4-P. تم استخدام محاكاة النمذجة الجزيئية للتنبؤ بأنواع الروابط وصلات موقع الربط ، بالإضافة إلى الشقوق المشحونة والقطبية لكل من المجموعة الرئيسية للفوسفاتيديل-إينوزيتول-4-فوسفات (PI-4-P) وبقايا الأحماض الأمينية HDP2P التي تشارك في تفاعلاتها بين الجزيئات. لاحظ أن الرصاص في NHpbδ+ يشير إلى رابطة الببتيد. الرجاء النقر هنا لتنزيل هذا الجدول.

الملف التكميلي 1: سير عمل الإرساء الجزيئي. نظرة عامة على إجراء الإرساء الجزيئي باستخدام AutoDock ، بما في ذلك بناء الترابط ، وإعداد المستقبلات ، وإعداد صندوق الشبكة ، وتنفيذ محاكاة الإرساء للتنبؤ بتفاعلات PI-HDP-2P. الرجاء النقر هنا لتنزيل هذا الملف.

المناقشة

في هذه الدراسة, حققنا فيما إذا كانت مجموعات الفوسفات مرتبطة تساهميا بحلقة الإينوزيتول في فوسفاتيديلينوسيتول (PI) يمكن أن تمنع تدهور أغشية الفوسفوليبيد بواسطة فوسفوليباز A2 (جيش التحريرالشعبى الصينى 2) إنزيم. لتقييم تطور تدهور غشاء الفوسفوليبيد الناجم عن النشاط المحلل المائي ل PLA2 ، قمنا بتصميم طريقة بسيطة ولكنها حساسة للغاية ودقيقة لقياس التغيرات في نفاذية الغشاء ، والتي يجب أن تزداد مع تقدم التدهور الهيكلي.

تعتمد الطريقة على تفاعل استبدال الترابط الذي يتضمن مركب سداسي النحاس (II) ، [Cu (H2O) 6] 2+ ، معلق في البيئة المائية خارج الجسيمات الشحمية الفوسفورية ، بينما يتم تغليف الأمونيا (NH3) داخل الجسيمات الشحمية. الأمونيا لها تقارب أعلى مع النحاس2+ من جزيئات الماء ، ولكن يجب أن تتخلل NH3 عبر الغشاء الشحمي للوصول إلى المرحلة المائية الخارجية ، حيث تحل محل جزيئات H2O في [Cu (H2O) 6] 2+. إذا تعرضت السلامة الهيكلية للغشاء الشحمي للخطر بسبب التحلل المائي للفوسفوليبيد المحفزPLA 2 ، فإن زيادة نفاذية الغشاء إلى NH3 ستسهل استبدال الترابط ، مما يؤدي إلى تغيير اللون من اللون الأزرق الباهت ل [Cu (H2O) 6] 2+ إلى الأزرق الداكن ل [Cu (H2O) 2 (NH3) 4] 2+. لقد راقبنا هذا التحول كميا من خلال استخدام قياس الطيف الضوئي لتسجيل التغير في الكثافة الضوئية عند 600 نانومتر.

لقد استخدمنا سابقا 1H-NMR مع أيون الحديد المغناطيسي ، [Fe (CN) 6] 3- ، لدراسة التغيرات في نفاذية الغشاء المتأثرة ب HDP-2P24 وسموم القلب من سم الكوبرا24،25،26،27،28،39. لقد استخدمنا أيضا مجموعة من مجسات الفلورسنت والفسفور لدراسة تأثيرات سموم القلب في سم الكوبرا على نفاذية الأغشية الشحمية20،23،40. ومع ذلك ، فإن مجسات الحديد والثروسنت / الفسفور هي كيانات جزيئية كبيرة غير فسيولوجية تخترق الأغشية الدهنية عندما تتضرر سلامة الغشاء بشكل كبير. في المقابل ، يستخدم اختبار استبدال الترابط الجديد NH₃ - وهو مستقلب خلوي صغير وطبيعي قادر على اختراق أغشية الدهون في اضطرابات دقيقة لتعبئة الدهون. تتجلى هذه الحساسية المعززة لطريقة نفاذية الغشاء الجديدة من خلال قدرتها على اكتشاف التغيرات في نفاذية الغشاء عند نسبة مولار HDP-2P / دهني تبلغ 0.001 ، مقارنة ب 0.004 المطلوبة للكشف عن ¹H-NMR / ferrocyanide23.

في نفس الدراسة ، استخدمنا تبريد فوسفور الإريثروزين بواسطة الفيروسين لفحص تأثيرات HDP-2P على تبادل الدهون بين الغشاء ، والتي تم تقييمها من خلال التغيير في نسبة عمر الإريثروزين في عينات الاختبار (τn) إلى تلك الموجودة في عينة التحكم (τ0) 23. عند نسبة مولار HDP-2P / دهني تبلغ 0.004 ، انخفضت قيمة τn / τ0 إلى 0.423 ، مما يشير إلى حالة من سيولة الغشاء القابلة للاختراق للكاتيونات ثنائية التكافؤ24. وبالتالي ، فإن مقايسة استبدال الترابط المستندة إلى NH₃ تكتشف نفاذية الغشاء عند نسبة مولار HDP-2P / دهني تبلغ 0.001 ، في حين أن المقايسات التقليدية (1H-NMR / ferrocyanide وتبريد مسبار الفسفور) تكتشف نفاذية الغشاء فقط عند نسبة مولية تبلغ 0.004. هذا يوضح أن مقايستنا المستندة إلى NH3 أكثر حساسية بأربع مرات من المقايسات التقليدية.

أسفرت الحساسية الاستثنائية للمقايسة المستندة إلى NH3 عن بيانات نفاذية ترتبط ارتباطا وثيقا بقياسات النشاط التحلل المائي ، مع وجود تناقض واضح واحد فقط: أظهرت الجسيمات الشحمية PC + PI-4-P تحلل مائي ضئيل دون تغييرات في النفاذية ، مما يشير إلى أن الحد الأدنى من إنتاج الأحماض الدهنية / الليزوفوسفوليبيد المحلي لا يؤثر على تعبئة الدهون العالمية ، والتي لا تؤثر على السلامة الهيكلية للغشاء ونفاذيته. وهكذا ، أظهرت هذه الدراسة أن تفاعل استبدال الترابط في نظام أيوني معقد ، والذي يتضمن رابطا مغلفا داخل الحجم الداخلي للجسيمات الشحمية ، أنتج نتائج تتماشى بشكل ممتاز مع بيانات النشاط التحلل المائي ل HDP-2P. كانت هذه النتائج ، بدورها ، متفقة بقوة مع الدراسات داخل السيليكو حول ارتباط PI والفوسفينوسيتيدات بالسطح الجزيئي ل HDP-2P.

بشكل عام ، كشفت محاكاة AutoDock في هذه الدراسة أن PI يرتبط بالمركز النشط في أربعة من أصل تسعة مواقع ربط محددة ، بينما يرتبط PI-4-P بالمركز النشط في موقع واحد فقط من المواقع التسعة المتوقعة. كان النشاط التحلل المائي ل HDP-2P في الجسيمات الشحمية PC + PI-4-P أقل بحوالي 5 مرات من الجسيمات الشحمية PC + PI. علاوة على ذلك ، توقعت الدراسات داخل السيليكو عدم ارتباط PI-4،5-P2 بالمركز النشط ل HDP-2P. باستمرار ، أظهرت تجارب فحوصات نشاط PLA2 وتفاعل استبدال الترابط أن PI-4،5-P2 يثبط تماما كل من التحلل المائي للفوسفوليبيد وزيادة نفاذية الغشاء ، بينما أظهر PI-4-P نشاطا مائي أقل وغير مهم ومنع تماما تغيرات نفاذية الغشاء. تتفق هذه الملاحظات بشكل جيد مع دراسات النشاط في المختبر لإنزيمات PLA 2 البشرية الخلوية والمستقلة عن الكالسيوم والإفرازات باتجاه PI و PI-4-P و PI-4،5-P235. أظهرت هذه الدراسات أنPLA 2 العصارة الخلوية من المجموعة IVA فقط أظهر نشاطا تحفيزيا عاليا نسبيا تجاه PI و PI-4-P ، في حين أن نشاطه نحو PI-4،5-P 2 كان بالكاد يمكن اكتشافه. أظهرت جميع إنزيمات PLA2 الأخرى التي تم اختبارها أي نشاط تجاه PI-4،5-P235. ويعزى هذا النقص في النشاط إلى مجموعات الفوسفات ماء للغاية على حلقة الإينوزيتول, التي تتداخل مع التفاعلات الإنتاجية بين سطح الغشاء وإنزيمات جيش التحرير الشعبىالصينى 2 35. نقترح أن الامتداد الخارجي لمجموعات الفوسفات على حلقة الإينوزيتول إلى المحلول وقدرتها على تكوين روابط أيونية قطبية وهيدروجينية مع بقايا التجويف الشبيه بالأخدود ل HDP-2P من المحتمل أن يمنع HDP-2P من الاقتراب من سطح الغشاء عن كثب بما يكفي لممارسة نشاطه المحلل المائي ، وبالتالي تثبيت الغشاء وتقليل تدهور أغشية الفوسفوليبيد بواسطة HDP-2P والتي يمكن أن تضر بالخلايا عن طريق تنشيط مسارات موت الخلايا. يبدو أن هذه الآلية تتماشى مع الدور الوقائي المحتمل للفوسفينوسيتيدات في الظروف المرضية التي تنطوي على نشاط إنزيم شاذ.

يسلط الارتباط القوي بين النتائج التي تم الحصول عليها من فحوصات نفاذية الغشاء ، وقياسات النشاط المحلل المائي ، وفي دراسات الإرساء الجزيئي السيليكو الضوء على موثوقية طريقة تفاعل استبدال الترابط. يثبت هذا النهج ، باستخدام رابط مغلف داخل الجسيمات الشحمية ، أنه أداة دقيقة وفعالة لتقييم تغيرات نفاذية الغشاء الناتجة عن الاضطرابات الهيكلية في التنظيم الثنائي المستقر للدهون الفوسفورية. بينما نعترف بأن دراسات الإرساء الجزيئي باستخدام AutoDock المعروضة في هذه الورقة لا توفر فهما شاملا لكيفية تفاعل الدهون الفوسفورية مع HDP-2P بطريقة ديناميكية وطولية ، يجب إجراء دراسات الديناميكيات الجزيئية في المستقبل لتحديد الآليات الجزيئية الإضافية لكيفية تخلل HDP-2 للطبقات الثنائية الفوسفوليبيد المكونة من دهون فوسفورية مختلفة. من المهم ملاحظة أن إجراء دراسات الديناميكيات الجزيئية يتطلب موارد حسابية عالية ، مثل أجهزة الكمبيوتر والمجموعات عالية الأداء ، والتي لا تتوفر في العديد من المؤسسات الأكاديمية التي لديها موارد محدودة وتمويل بحثي. أخيرا ، نقر باستخدام مستقبل صلب (HDP-2P) في ورقة التقنيات الحالية وعدم وجود بيئة مذيب / غشاء. ومع ذلك ، نريد أن نؤكد أن إجراء الإرساء الجزيئي ل HDP-2P مع العديد من الدهون الفوسفورية باستخدام مستقبلات صلبة هو النهج التقليدي لإجراء دراسات الإرساء الأولية لتحديد أول تمريرة للهياكل المرشحة الراسية والتي يمكن متابعتها في المستقبل باستخدام مستقبل مرن بمجرد تحديد بقايا الأحماض الأمينية الحرجة داخل الجانب التحفيزي التي ترتبط بالركائز للتركيز على المناطق الجزيئية التي يمكن جعلها مرنة في اتبع دراسات الإرساء الجزيئي وفي بيئة مذوبة. ومن ثم ، فإن الاستفادة من التعاون مع المؤسسات الأخرى التي لديها المزيد من الموارد يمكن أن تكون وسيلة للمساعدة في تأكيد بعض النتائج الأولية التي قدمها AutoDock وتحديد الآليات الجزيئية الإضافية لتفاعلات الركيزة والإنزيم.

في الختام ، توضح نتائج هذه الدراسة أن طريقة تفاعل استبدال الترابط ، باستخدام رابط مغلف داخل الجسيمات الشحمية ، يمكن تطبيقها بشكل فعال على دراسات نفاذية الغشاء في العمليات المختلفة بوساطة الغشاء. وتشمل هذه التفاعلات بين مستقبلات الترابط ، والتفاعلات البروتينية الدهنية ، والتبادل بين الغشاء ، واندماج الغشاء والانشطار ، والتقلصات العصبية العضلية ، من بين أمور أخرى. علاوة على ذلك ، فإن هذا النهج يحمل إمكانات كبيرة للتحقيق في المستحضرات الصيدلانية membranotropic. في الوقت نفسه ، ندرك أنه في حين أن الأساليب الجديدة في الأغشية النموذجية لا تقدر بثمن لتشريح آليات محددة لتفاعلات الغشاء ، فإن تبسيطها المتأصل يحد من قدرتها على تكرار التعقيد الهيكلي والتركيبي والوظيفي للأغشية البيولوجية في الجسم الحي. لذلك من الضروري تفسير البيانات من أنظمة النماذج بحذر والتحقق من صحة النتائج باستخدام النماذج الخلوية أو الكائنية حيثما أمكن ذلك.

الإفصاحات

ليس لدى المؤلفين تضارب في المصالح للإفصاح عنها.

شكر وتقدير

تم دعم الدراسات الواردة في هذه المقالة من خلال منحة بدء التشغيل من أكاديمية بكين تشاويانغ كاي وين (E.S.G.) وجائزة SEPA ، NIH 5R25MD019151-03 (R.K.D.). تم دعم العمل المتعلق بإعداد HDP-2 بمنحة من مؤسسة العلوم الروسية رقم 24-15-00280 (Y.N.U.). يتقدم المؤلفون بالشكر والشكر إلى الدكتورة مريم برانشمة في كتابة السيناريو وتطوير الفيديو حول تطبيق محاكاة الإرساء الجزيئي ، والذي تم إعداده بعد نشر هذا المقال البحثي.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
الوحدة الفرعية الأساسية HDP-2P من سم أفعى V. nikolskii PLA2، HDP-2، نقاء 98.5٪  معهد الكيمياء العضوية الحيوية، موسكوتم عزل HDP-2 وفقا للبوتوكول في PMID:18083205. تم تنقية HDP-2P من HDP-2 بواسطة DEAE Sephadex A-50   
كارديوليبين (القلب، البقر) (ملح الصوديوم)، >99٪ماكلينC916138
إنزيم أ، فوجي فيلم واكو' مجموعة NEFA ومجموعة NEFA;ليكسينغتون، ماساتشوستس، الولايات المتحدة الأمريكية
أنبوب الغسيل الكلوي وزن الغشية الجزيئي للوزن الجزيئي 1.0 كيلو دالتونشركة سيغما ألدريتش للتجارة المحدودة، شنغهاي، الصين  
منظم حرارة خزان المياه يتم التحكم فيه رقميا  شركة يونغغوانغ مينغ للأدوات الطبية المحدودة، بكين، الصين؛
التوازن التحليلي الإلكتروني عالي الدقة FA2004 شركة شنغهاي ماي المحدودة، الصين
مطياف الفوتومتري مدى الأشعة فوق البنفسجية مرئي JingHua 752 &nb;شركة شنغهاي جينغهوا للأدوات المحدودة، شنغهاي، الصين
L-α-فوسفاتيديل كولين (بيضة، دجاج)،≥ 95%ماكلينL799415
L-α-فوسفاتيديلينوسيتول (الكبد، الأبقار) (ملح الصوديوم),> 99%ماكلينL780292
L-α-فوسفاتيديلينوسيتول-4,5-بيسفوسفات (الدماغ، الخنزير) (ملح الأمونيوم),> 99%ماكلينL996223
L-α-فوسفاتيديلينوسيتول-4-فوسفات (الدماغ، الخنزير) (ملح الأمونيوم)، 99٪ماكلينL970250
L-α-فوسفاتيديلسيرين (الدماغ، الخنزير) (ملح الصوديوم),>99٪ماكلينL864755
مقلب مغناطيسي JB-3 شنغهاي ليسي JB-3
مقياس الرقم الهيدروجيني PHS-3C شركة شنغهاي إينسا للأدوات العلمية المحدودة، الصين
جهاز الطرد المركزي TGL-16B  شركة شنغهاي 3 أنتينغ، شنغهاي، الصين
موزع الموجات فوق الصوتية Yt-JY96-IIN شركة شنغهاي ييتو للتكنولوجيا، المحدودة، الصين
مضخة تفريغ TW-1Mشركة تينغوي المحدودة، وينلينغ، الصين

المراجع

  1. De Matteis, A., De Camilli, P. Phosphoinositides. Biochim Biophys Acta Lipids. 1851 (6), 697-918 (2015).
  2. Hokin, M. R., Hokin, L. E. Enzyme secretion and the incorporation of P32 into phospholipids of pancreas slices. J Biol Chem. 203 (2), 967-977 (1953).
  3. Hokin, L. E., Hokin, M. R. Effects of acetylcholine on the turnover of phosphoryl units in individual phospholipids of pancreas slices and brain cortex slices. Biochim Biophys Acta. 18, 102-110 (1955).
  4. Hokin, L. E., Hokin, M. R. Phosphoinositides and protein secretion in pancreas slices. J Biol Chem. 233, 805-810 (1958).
  5. Lolicato, F., Nickel, W., Haucke, V., Ebner, M. Phosphoinositide switches in cell physiology: from molecular mechanisms to disease. J Biol Chem. 300, 105757(2024).
  6. Powis, G., et al. Pleckstrin homology (PH) domain, structure, mechanism, and contribution to human disease. Biomed Pharmacother. 165, 115024(2023).
  7. Burke, J. E., Triscott, J., Emerling, B. M., Hammond, G. R. V. Beyond PI3Ks: targeting phosphoinositide kinases in disease. Nat Rev Drug Discov. 22, 357-386 (2023).
  8. Palamiuc, L., Ravi, A., Emerling, B. M. Phosphoinositides in autophagy: current roles and future insights. FEBS J. 287, 222-238 (2020).
  9. Calvillo-Robledo, A., Cervantes-Villagrana, R. D., Morales, P., Marichal-Cancino, B. A. The oncogenic lysophosphatidylinositol (LPI)/GPR55 signaling. Life Sci. 301, 120596(2022).
  10. Madsen, R. R., Vanhaesebroeck, B. Cracking the context-specific PI3K signaling code. Sci Signal. 13, eaay2940(2020).
  11. Wills, R. C., Hammond, G. R. V. PI(4,5)P2: signaling the plasma membrane. Biochem J. 479, 2311-2325 (2022).
  12. Epand, R. M. Features of the phosphatidylinositol cycle and its role in signal transduction. J Membr Biol. 250, 353-366 (2017).
  13. De Craene, J. O., Bertazzi, D. L., Bär, S., Friant, S. Phosphoinositides, major actors in membrane trafficking and lipid signaling pathways. Int J Mol Sci. 18, E634(2017).
  14. Ivanova, A., Atakpa-Adaji, P. Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate and calcium at ER-PM junctions: complex interplay of simple messengers. Biochim Biophys Acta Mol Cell Res. 1870, 119475(2023).
  15. Premrajan, P., Abhithaj, J. A., Variyar, E. J. PLA2: implications in neurological disorders as a prospective therapeutic target. Phospholipases in Physiology and Pathology. 2, Academic Press. 139-158 (2023).
  16. André, S., et al. Modulation of cytosolic phospholipase A2 as a potential therapeutic strategy for Alzheimer's disease. J Alzheimers Dis Rep. 7 (1), 1395-1426 (2023).
  17. Trotter, A., et al. The role of phospholipase A2 in multiple sclerosis: a systematic review and meta-analysis. Mult Scler Relat Disord. 27, 206-213 (2019).
  18. Schaloske, R. E., Dennis, E. A. The phospholipase A2 superfamily and its group numbering system. Biochim Biophys Acta. 1761 (11), 1246-1259 (2006).
  19. Petrovic, U., et al. Ammodytoxin, a neurotoxic secreted phospholipase A2 can act in the cytosol of the nerve cell. Biochem Biophys Res Commun. 324 (3), 981-985 (2004).
  20. Gasanov, S. E., Dagda, R. K., Rael, E. D. Snake venom cytotoxins, phospholipase A2s, and Zn-dependent metalloproteinases: mechanisms of action and pharmacological relevance. J Clin Toxicol. 4 (1), 1000181(2014).
  21. Harris, J. B., Scott-Davey, T. Secreted phospholipases A2 of snake venoms: effects on the peripheral neuromuscular system with comments on the role of phospholipases A2 in disorders of the CNS and their uses in industry. Toxins (Basel). 5 (12), 2533-2571 (2013).
  22. Ramazanova, A. S., et al. Heterodimeric neurotoxic phospholipases A2: the first proteins from venom of recently established species Vipera nikolskii: implication of venom composition in viper systematics. Toxicon. 51 (4), 524-537 (2008).
  23. Chaudary, A. S., et al. Sphingomyelin inhibits hydrolytic activity of heterodimeric PLA2 in model myelin membranes: pharmacological relevance. J Membr Biol. 258, 29-46 (2025).
  24. Li, M., Gasanoff, S. E. Cationic proteins rich in lysine residue trigger formation of non-bilayer lipid phases in model and biological membranes: biophysical methods of study. J Membr Biol. 256 (4-6), 373-391 (2023).
  25. Gasanoff, E. S., Dagda, R. K. Cobra venom cytotoxins as a tool for probing mechanisms of mitochondrial energetics and understanding mitochondrial membrane structure. Toxins. 16, 287(2024).
  26. Li, F., Shrivastava, I. H., Hanlon, P., Dagda, R. K., Gasanoff, E. S. Molecular mechanism by which cobra venom cardiotoxins interact with the outer mitochondrial membrane. Toxins. 12 (7), 425(2020).
  27. Zhang, B., et al. Naja mosambica mossambica cobra cardiotoxin targets mitochondria to disrupt mitochondrial membrane structure and function. Toxins. 11, 152(2019).
  28. Gasanov, S. E., et al. Naja naja oxiana cobra venom cytotoxins CTI and CTII disrupt mitochondrial membrane integrity: implications for basic three-fingered cytotoxins. PLoS One. 10 (6), 1-28 (2015).
  29. Akosah, Y., Yang, J., Pavlov, E. Inorganic polyphosphate and ion transport across biological membranes. Biochem Soc Trans. 52 (2), 671-679 (2024).
  30. Weast, R. C. CRC Handbook of Chemistry and Physics. , 62nd ed, CRC Press. (1982).
  31. Lemmon, M. A., Ferguson, K. M. Signal-dependent membrane targeting by pleckstrin homology (PH) domains. Biochem J. 350 (Pt 1), 1-18 (2000).
  32. Ford, M. G., et al. Curvature of clathrin-coated pits driven by epsin. Nature. 419 (6905), 361-366 (2002).
  33. Khan, S. A., Ilies, M. A. The phospholipase A2 superfamily: structure, isozymes, catalysis, physiologic and pathologic roles. Int J Mol Sci. 24 (2), 1353(2023).
  34. De Oliveira, A. L. N., Lacerda, M. T., Ramos, M. J., Pedro, A. F. Viper venom phospholipase A2 database: the structural and functional anatomy of a primary toxin in envenomation. Toxins. 16 (2), 71(2024).
  35. Hayashi, D., Dennis, E. A. Differentiating human phospholipase A2's activity toward phosphatidylinositol, phosphatidylinositol phosphate and phosphatidylinositol bisphosphate. Biochim Biophys Acta Mol Cell Biol Lipids. 1869, 159527(2024).
  36. Alekseeva, A. S., et al. Heterodimeric V. nikolskii phospholipases A2 induce aggregation of the lipid bilayer. Toxicon. 133, 169-179 (2017).
  37. Burke, J. E., Dennis, E. A. Phospholipase A2 structure/function, mechanism, and signaling. J Lipid Res. 50, S237-S242 (2009).
  38. Dennis, E. A., et al. Phospholipase A2 enzymes: physical structure, biological function, disease implication, chemical inhibition, and therapeutic intervention. Chem Rev. 111 (10), 6130-6185 (2011).
  39. Gasanov, S. E., Kim, A. A., Yaguzhinski, L. S., Dagda, R. K. Non-bilayer structures in mitochondrial membranes regulate ATP synthase activity. Biochim Biophys Acta Biomembr. 1860, 586-599 (2018).
  40. Aripov, T. F., Gasanov, S. E., Salakhutdinov, B. A., Rozenshtein, I. A., Kamaev, F. G. Central Asian cobra venom cytotoxins-induced aggregation, permeability and fusion of liposomes. Gen Physiol Biophys. 8, 459-474 (1989).

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

مقايسة نفاذية غشاء الجسيمات الشحمية للتحقيق في آثار مجموعات فوسفات فوسفاتيديلينوسيتول على عمل membranotropic للسم PLA2
اتصل بنا
أوصِ بها للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

2026 © حقوق الطبع والنشر MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.