الدور المحتمل لمحور إشارات PGE 2-EP4-Ca2+ في هشاشة العظام بعد الصدمة

ملخص

هنا ، نقدم بروتوكولا لتحديد طرق إنشاء وتقييم نماذج الفئران المصابة بهشاشة العظام بشكل منهجي ، من خلال المقارنة ، وتقديم أدلة علمية على التسبب في المرض المختلف بين الإصابة الميكانيكية الحادة الناجمة عن الإصابة والمزمنة الناجمة عن التمثيل الغذائي / البيئي الناجم عن هشاشة العظام. نموذج ACLT هو التركيز الرئيسي ، مع التركيز على التغييرات في مسار إشارات الخلل الوظيفي في EP4-Ca^{2 +} - الميتوكوندريا.

الملخص

هشاشة العظام بعد الصدمة (PTOA) هو مرض تنكسي في المفاصل ناتج عن الصدمة أو الإجهاد الميكانيكي الشديد ، مما يؤدي إلى تنكس غضروف المفاصل وضعف وظيفي. يساهم البروستاجلاندين E2 (PGE₂) بشكل كبير في تدهور الغضروف بعد الإصابة الميكانيكية عن طريق تنشيط مستقبله ، مستقبلات البروستاجلاندين E 4 (EP4) ، على أغشية الخلايا الغضروفية. يعتمد توازن الغضروف المفصلي بشكل أساسي على التوازن الديناميكي بين تدهور الغضروف وإصلاحه ، وهي عملية تنظمها الخلايا الغضروفية بدقة. ثبت أن مسار إشارات بروتين كيناز II المعتمد على Ca^{2 +} / Calmodulin (CAMKII) يلعب دورا مهما في التوسط في استعادة وظيفة الخلايا الغضروفية. في هذه الدراسة ، لاحظنا زيادة التعبير عن EP4 ، ومستقبلات الإينوزيتول 1،4،5-trisphosphate (IP3R) ، و CaMKII الفسفوري في إنترلوكين -1 بيتا (IL-1β) حفزت الخلايا الغضروفية ، مما يشير إلى وجود صلة محتملة بين إشارات EP4 وخلل تنظيم الكالسيوم. ومع ذلك ، لا تزال الأدلة المباشرة التي تؤكد تورط محور EP4-Ca^{2 +} / CaMKII في PTOA غير موجودة. هناك حاجة إلى مزيد من التحقيقات باستخدام التدخلات الجينية أو الدوائية لتوضيح هذه الآلية المحتملة. توفر هذه النتائج أساسا أوليا لاستكشاف توازن الكالسيوم وإشارات EP4 كأهداف لعلاج PTOA.

المقدمة

على الرغم من أن النشاط البدني يتم الترويج له على نطاق واسع لفوائده الصحية ، إلا أنه لا يزال سببا رئيسيا لإصابات العضلات والعظام في الأطراف السفلية ، والتي يمكن أن تؤدي إلى نتائج سلبية^{مختلفة 1}. من بين هؤلاء ، أصبح PTOA عبئا متزايدا على المراهقين والشباب الذين يعانون من إصابات المفاصل في سن^{مبكرة 2}. من المثير للقلق أن ما يقرب من 48-52٪ من الأفراد الذين يعانون من إصابات المفاصل المرتبطة بالرياضة يصابون ب PTOA في غضون 11-17 عاما^3،4. مفصل الركبة ، وهو أحد أكثر المفاصل إصابة في الرياضات والأنشطة الترفيهية للشباب ، ضعيف بشكل خاص في التقدم من إصابة المفاصل إلى PTOA. أفادت دراسة مستقبلية أن الأفراد الذين يعانون من إصابات في الركبة لديهم خطر أكبر بمقدار 10 أضعاف للإصابة بهشاشة العظام في الركبة المؤكدة إشعاعيا بعد 12-20 عاما من الإصابة مقارنة بالأفراد غير^{المصابين 5}. علاوة على ذلك ، في الشباب ، أظهرت التقييمات الشعاعية أن لاعبات كرة القدم المصابات بإصابات بقطع الرباط الصليبي الأمامي (ACLT) لديهن خطر بنسبة 51٪ للإصابة ب PTOA في غضون 12 عاما ، بينما يكون اللاعبون الذكور معرضين لخطر بنسبة 41٪ في غضون 14 عاما⁵. تسلط هذه النتائج الضوء على التأثير السلبي طويل المدى لإصابات المفاصل المرتبطة بالرياضة على صحة العضلات والعظام. لذلك ، فإن فهم الآليات المرضية التي لا رجعة فيها الكامنة وراء تطور PTOA أمر بالغ الأهمية لتحديد استراتيجيات التدخل المناسبة التي تهدف إلى التخفيف من تطور المرض.

يعد عدم التنظيم المبكر لتوازن Ca²⁺ أحد المؤشرات الرئيسية لبدء PTOA⁶. يرتبط Ca²⁺ بالكالمودولين (CaM) لتشكيل مركب Ca^{2 +} / CaM الذي يمكن أن يتفاعل مع CaMKII ، مما يخفف من تشكله المثبط الذاتي وينظم نشاط كيناز⁷. في كل من الزراعة العضوية البشرية والفئران ، يزداد التعبير عن CaMKII الفسفوري (الشكل المنشط ل CaMKII) ، بينما يمنع استخدام مثبطات CaMKII هذا الارتفاع في مستويات الفسفرة ، مما يؤدي إلى تدمير الغضروف المفصلي⁸ ، مما يدل على الدور التنظيمي المهم ل Ca^{2 +} / CaMKII في التوسط في توازن غضروف الزراعة العضوية. عادة ، تتأثر هذه التغييرات بشكل حاسم بتنشيط الآليات الالتهابية في تطور PTOA. تؤثر المستويات العالية من PGE₂ ، كوسيط رئيسي للألم المؤيد للالتهابات ، على تطور التهاب المفاصل عن طريق تنشيط مستقبل EP4. على وجه التحديد ، تعزز الضربة القاضية المشروطة ل EP4 في الغضروف المفصلي تكوين الغضروف والتمثيل الغذائي الابتنائي ، مع تثبيط تضخم الخلايا الغضروفية والتقويض ، وبالتالي تعزيز تجديد الغضروف المفصلي المستقر والناضج بدلا من الغضروف الليفي وتخفيف آلام^{المفاصل 9}. نظرا للدور الحاسم لمسار إشارات Ca^{2 +} / CaMKII في فسيولوجيا الخلايا الغضروفية والمشاركة المعترف بها لمستقبل EP4 في تطور هشاشة العظام ، تهدف هذه الدراسة إلى استكشاف ما إذا كان تنشيط EP4 مرتبطا بالتغيرات في إشارات الكالسيوم والخلل الوظيفي للميتوكوندريا أثناء تطور PTOA. على الرغم من أن العلاقة السببية بين EP4 وخلل التنظيم Ca²⁺ لا يزال يتعين تحديدها ، إلا أن البيانات هنا تشير إلى وجود رابط ميكانيكي محتمل يستدعي مزيدا من التحقيق.

تركز هذه الدراسة على الآليات المحتملة التي تربط تنشيط مستقبلات EP4 بإشارات Ca²⁺ والخلل الوظيفي في الميتوكوندريا أثناء تطور PTOA. بالمقارنة مع طرق التشخيص التقليدية ، مثل تقنيات التصوير التي تكتشف تطور PTOA ، والأساليب العلاجية الحالية ، مثل الأدوية غير الستيرويدية المضادة للالتهابات (NSAIDs) لتخفيف الأعراض ، يهدف نهجنا إلى الكشف عن اضطرابات الإشارات داخل الخلايا المبكرة في التسبب في PTOA. توفر هذه الرؤية الميكانيكية فهما أكثر دقة لظهور المرض وتطوره ، مما يوفر طرقا جديدة للتشخيص المبكر والتدخلات المستهدفة. لذلك ، أنشأت هذه الدراسة نموذجا للفئران PTOA ناتج عن قطع الرباط الصليبي الأمامي (ACLT) لتقليد الإصابات الميكانيكية التي تظهر عادة في الرياضيين الذين يعانون من ضعف التحكم الحركي أثناء النشاط البدني الحاد أو المزمن. يعمل هذا النموذج كتمثيل مثالي لتلف المفصل الميكانيكي التالي للصدمة ، حيث يوفر منصة قابلة للتكرار للتحقيق في كل من التغيرات النسيجية المرضية والآليات الجزيئية الأساسية. يعمل النظام الغذائي الغني بالدهون بالإضافة إلى مجموعة التعرض للبيئة الرطبة (FD) كعنصر تحكم إيجابي ، يهدف إلى محاكاة عوامل الخطر الأيضية والبيئية المرتبطة بهشاشة العظام المزمنة. الأول يمثل الإصابة الحادة الناجمة عن الصدمة الميكانيكية ، بينما يمثل الأخير نموذجا مرضيا طبيعيا ناتج عن اضطراب التمثيل الغذائي والعوامل البيئية ، على الرغم من أن التسبب النهائي في هذه المجموعة قد لا يتبع محور EP4-Ca²-الميتوكوندريا.

البروتوكول

تمت مراجعة جميع الإجراءات التجريبية التي تنطوي على والموافقة عليها من قبل لجنة أخلاقيات التابعة لمستشفى مقاطعة قوانغدونغ للطب الصيني (رقم الموافقة الأخلاقية: 2024014-2). أجريت الدراسة وفقا للوائح الاستخدام الأخلاقي لحيوانات المختبر المنصوص عليها من قبل مجلس الدولة لجمهورية الصين الشعبية.

1.

1. استخدم فئران Sprague-Dawley (SD) المتناثرة SPF لتقليل التأثيرات المربكة المحتملة المرتبطة بدورة الشبق. حدد ما مجموعه تسعة ذكور من الفئران SD ، تتراوح أعمارهم بين 4 أسابيع ويزن ما بين 90 جم و 100 جم ، لهذه التجربة.
   ملاحظة: تم الحصول على هذه الفئران من مورد مختبر مرخص في الصين (رقم الشهادة: 20240410Aaz0619000774).
2. الحفاظ على جميع في بيئة محددة خالية من مسببات الأمراض (SPF). حافظ على بيئة خاضعة للرقابة عند درجة حرارة 24 ± 2 درجة مئوية بمتوسط رطوبة 60 ± 1٪ ودورة إضاءة / ظلام لمدة 12 ساعة.
3. تأكد من أن الفئران لديها حرية الوصول إلى المياه المحمضة ونظام غذائي قياسي للقوارض.

2. بناء النموذج الحيواني والتدخل

1. تأقلم الفئران لمدة أسبوعين في مركز التغذية. قم بتعيين الفئران بشكل عشوائي إلى ثلاث مجموعات في عمر 6 أسابيع: المجموعة الضابطة ، ومجموعة PTOA ، ومجموعة FD ، مع ثلاثة فئران في كل مجموعة.
2. الحفاظ على مجموعة التحكم في ظل الظروف القياسية.
3. تخدير مجموعة PTOA بالأيزوفلوران (4٪ للحث و 1٪ -2٪ للصيانة).
4. تعريض مفاصل الركبة الثنائية جراحيا عن طريق شق جلدي طولي باستخدام نهج الباراباتيلار الإنسي.
5. قم بإجراء ACLT باستخدام مشرط ، وتأكد من القطع الكامل عن طريق إجراء اختبار درج أمامي إيجابي.
   ملاحظة: تم إجراء قطع الرباط الصليبي الأمامي الثنائي لضمان اتساق النموذج وتقليل التباين الفردي. تم حساب متوسط البيانات من كلتا الركبتين للحصول على قيمة واحدة لكل لتحليلها.
6. نقل الفئران بشكل دوري في مجموعات FD إلى غرفة يتم التحكم فيها بالمناخ ، وتقع في نفس المنشأة. أخضع هذه الفئران لنظام غذائي غني بالدهون.
   ملاحظة: يحتوي النظام الغذائي الغني بالدهون على 20٪ سكروز ، 15٪ شحم الخنزير ، 1.2٪ كوليسترول ، 0.2٪ كولات الصوديوم ، 10٪ كازين ، 0.6٪ فوسفات هيدروجين الكالسيوم ، 0.4٪ مسحوق الحجر الجيري ، 0.4٪ بريمكس ، و 52.2٪ علف قاعدي. كان ملف المغذيات للتغذية الضابطة على النحو التالي: 19٪ بروتين ، 31٪ دهون ، و 50٪ كربوهيدرات ، مع نسبة سعرات حرارية تبلغ 17٪ بروتين ، 37٪ دهون ، و 46٪ كربوهيدرات.
7. الحفاظ على الظروف البيئية داخل غرفة المناخ عند درجة حرارة 24 ± 2 درجة مئوية ، ومستوى رطوبة 90 ± 4٪ ، ودورة إضاءة يومية مدتها 12 ساعة.
   ملاحظة: نظرا لزيادة خطر نمو البكتيريا في مثل هذه البيئات ذات درجة الحرارة العالية والرطوبة العالية ، قم بتعقيم مياه الشرب والطعام وتجديدها يوميا لتقليل التلوث. كانت المدة الإجمالية للتدخل التجريبي 12 أسبوعا.

3. تحليل المشي (آثار الأقدام)

1. قم بإجراء تحليل البصمة بعد 12 أسبوعا من بدء العلاج في الفئران النموذجية ، باستخدام طريقة موضحة سابقا¹⁰.
2. قم بتغطية الأسطح البطنية للأقدام الخلفية للفئران بالحبر الأحمر ، وسمح لها بالسير على طول مسار بطول 100 سم وعرض 8 سم ، مغطى بورق أبيض.
3. لتشجيع الفئران على التحرك ، ضع غرفة مظلمة في نهاية المسار لتشجيع الحركة إلى الأمام.
4. قم بإجراء ثلاثة قياسات متسلسلة للحصول على متوسط القيم لكل معلمة ، بما في ذلك طول الخطوة وطول الخطوة ، والتي تم استخدامها لتقييم المخالفة.
5. حدد طول الخطوة (سم) عن طريق قياس المسافة التي يقطعها نفس المخلب الخلفي بين خطوتين متتاليتين.
6. حدد طول الخطوة (سم) على أنه المسافة الأفقية بين الكفوف الخلفية اليمنى واليسرى.
7. قم بقياس زاوية المخلب (°) كزاوية بين إصبع القدم الثاني والعقبي ، بالنسبة إلى الخط الأفقي¹¹.
8. قم بقياس طول الخطوة وطول الخطوة وزاوية المخلب مباشرة على صور البصمة الممسوحة ضوئيا باستخدام برنامج Image-Pro Plus (الإصدار 6.0) ، باستخدام أدوات قياس المسافة والزاوية المدمجة.
   ملاحظة: تعتبر معلمات المشي هذه ضرورية لتحديد الإعاقات الوظيفية الدقيقة في المراحل المبكرة من هشاشة العظام. قد يظهر المرضى انخفاضا في الخطوة وطول الخطوة لحماية المفاصل المؤلمة ، بينما تحدث زيادة زاوية إصبع القدم وعدم تناسق المشي غالبا كاستجابات تعويضية لعدم استقرار المفاصل الناجم عن الألم.

4. قياس قطر المفصل

1. قم بقياس قطر المفصل باستخدام ميكرومتر حلزوني معاير (مم) بعد النمذجة في كل مجموعة.
   ملاحظة: مع تقدم هشاشة العظام ، يعاني المرضى عادة من تورم وألم في المفاصل. قد تشير درجة أعلى من التورم إلى مرحلة أكثر حدة من المرض.

5. قياس قوة القبضة

1. قم بقياس قوة قبضة الطرف الخلفي باستخدام مقياس قوة قبضة رقمي مزود بشبكة جر ، ومقياس قوة مزود بشبكة جر (90 مم × 90 مم).
   1. أمسك الجرذ برفق من الذيل والجلد على مؤخرة الرقبة.
   2. اخفض حتى تمسك أطرافه الخلفية بالشبكة بإحكام ، ثم اسحب بثبات أفقيا على طول محور مستشعر القوة حتى يحرر قبضته.
   3. كرر الاختبار ثلاث مرات لكل. سجل أعلى قيمة كأقصى قوة قبضة.
      ملاحظة: أثناء اختبار قوة قبضة الطرف الخلفي، قم بتثبيت الأطراف الأمامية عن طريق لصقها على سطح من الورق المقوى لمنع الاشتباك العرضي للأطراف الأمامية بشبكة الجر. يدل انخفاض قوة القبضة على انخفاض الوظيفة العضلية والعجز الحركي المحتمل المرتبط بالألم المرتبط بتطور التهاب المفاصل العظمي.

6. عزل الخلايا الغضروفية الأولية والثقافة

1. عزل الخلايا الغضروفية الأولية من ذكور فئران Sprague-Dawley البالغة من العمر 6 أسابيع.
2. تشريح رؤوس الفخذ وهضاب الظنبوبة لجمع ما يقرب من 100-150 ملغ من أنسجة الغضروف.
3. اغسل الأنسجة مرتين باستخدام PBS الذي يحتوي على 1٪ بنسلين ستربتومايسين.
4. هضم الغضروف في 5 مل من 0.25٪ تريبسين EDTA عند 3 درجات مئوية لمدة 30 دقيقة.
5. قطع الغضروف إلى 1-2 مم³ قطع وهضم إضافي في 10 مل من 0.2٪ كولاجيناز II عند 37 درجة مئوية لمدة 4 ساعات على شاكر بدرجة حرارة ثابتة.
6. قم بتصفية معلق الخلية من خلال مصفاة خلية 70 ميكرومتر ، وجهاز طرد مركزي عند 300 × جم لمدة 5 دقائق ، وتخلص من المادة الطافية.
7. أعد تعليق حبيبات الخلية في وسط DMEM / F12 مكمل بمصل بقري جنيني 10٪ و 1٪ بنسلين ستربتومايسين.
8. احتضان الخلايا عند 3 درجات مئوية في جو مرطب مع 5٪ ثاني أكسيد_{الكربون 2}.

7. علاج الخلايا

1. عد الخلايا الغضروفية المعزولة باستخدام مقياس كثافة الدم.
2. زرع الخلايا الغضروفية في صفائح مكونة من 6 آبار بكثافة 2 × 10⁵ خلايا لكل بئر في 0.1 مل من وسط المزرعة الكامل (DMEM / F12 مكمل بنسبة 10٪ مصل بقري للجنين (FBS) و 1٪ بنسلين - ستربتومايسين).
3. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية في حاضنة ثاني أكسيد الكربون بنسبة 5٪ لمدة 24 ساعة للسماح بالالتصاق.
4. لإنشاء نموذج PTOA الالتهابي في المختبر ، عالج الخلايا الغضروفية الملتصقة ب IL-1β (10 نانوغرام / مل) لمدة 48 ساعة بمجرد أن يصل التقاء الخلايا إلى حوالي 80٪.
5. للتحكم الإيجابي FD ، قم بإذابة حمض البالمتيك (PA ، CAS رقم 57-11-4) في الكلوروفورم عند تخفيف 1: 1000 لتحضير محلول مخزون 500 ميكرومتر.
   1. عندما يصل التقاء الخلية إلى حوالي 80٪ ، أضف 1 ميكرولتر من محلول مخزون PA لكل 1 مل من وسط الاستزراع للوصول إلى تركيز PA النهائي البالغ 500 نانومتر. عالج الخلايا الغضروفية بهذا المحلول لمدة 48 ساعة.
6. أضف 1 ميكرولتر من الكلوروفورم (التحكم في المركبات) لكل 1 مل من وسط الاستزراع للتحكم في الخلايا بدون PA.

8. جمع العينات ، إزالة الكلس ، وإعداد التضمين

1. القتل الرحيم للحيوانات بعد 12 أسبوعا من التدخل عن طريق استنشاق جرعة زائدة من الأيزوفلوران (≥5٪) في غرفة مغلقة لمدة 5 دقائق على الأقل ، والتأكد من التوقف التام عن التنفس وضربات القلب.
   ملاحظة: تمت الموافقة على هذه الطريقة من قبل لجنة أخلاقيات وامتثلت للمبادئ التوجيهية الوطنية للقتل الرحيم الإنساني لحيوانات المختبر.
2. اجمع مفصلي الركبة من ثلاثة فئران لكل مجموعة (ن = 3 ، الإجمالي = 6 ركبتين) للتقييم النسيجي.
3. قم بإصلاح العينات في 4٪ بارافورمالدهيد (PFA) بنسبة حجم من الأنسجة إلى المثبت أكبر من 1:20 لأكثر من 48 ساعة على شاكر عند درجة مئوية.
4. اشطف المناديل تحت ماء الصنبور الجاري لمدة 1-2 ساعة لإزالة المثبت المتبقي.
5. قم بإزالة كلس الأنسجة في محلول EDTA 0.5 M (درجة الحموضة 7.4 ، ~ 15٪) بنسبة الأنسجة إلى المحلول 1: 20 لمدة 21 يوما عند 3 درجات مئوية ، واستبدلها بمحلول جديد كل 3 أيام.
6. تقييم اكتمال إزالة الكلس عن طريق فحص العظم بإبرة للتليين.
7. اغسل المناديل المنزوعة الكلس تحت ماء الصنبور الجاري لمدة ساعتين وضعها في أشرطة التضمين.
8. تجفيف العينات من خلال سلسلة الإيثانول المتدرجة: 75٪ إيثانول لمدة ساعتين (أو بين عشية وضحاها) ، 80٪ إيثانول لمدة ساعتين ، 95٪ إيثانول لمدة 0.5 ساعة ، والإيثانول المطلق مرتين لمدة 60 دقيقة. ثم انغمس في 1: 1 زيلين: الإيثانول لمدة 20 دقيقة.
9. نظف الأنسجة في الزيلين مرتين (10 دقائق و 60 دقيقة).
10. تسلل الأنسجة بالبارافين بالترتيب التالي: الزيلين: البارافين (1: 1) لمدة 15 دقيقة ، البارافين الناعم عند 52-5 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة (مرتين) ، ثم البارافين الصلب عند 56-5 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
11. قم بتضمين الأنسجة باستخدام نظام تضمين البارافين (على سبيل المثال ، Leica ، ضبط عند 6 درجات مئوية) ، ونقل الكتل إلى صفيحة باردة -2 درجة مئوية لمدة ساعتين.
12. كتل البارافين المقطعية السهمية بسمك ميكرومتر باستخدام ميكروتوم.
13. قم بتعويم الأشرطة في حمام مائي 4 درجات مئوية وقم بتثبيتها على شرائح زجاجية نظيفة.
14. الأقسام المثبتة في الهواء تجفف وتخبزها في فرن 60 درجة مئوية لمدة ساعتين لإزالة البارافين المتبقي.
15. قم بإزالة الأقسام عن طريق الغمر بالتتابع في الزيلين (10 دقائق) ، والزيلين الطازج (10 دقائق) ، والإيثانول المطلق (5 دقائق) ، والإيثانول المطلق الطازج (5 دقائق) ، و 90٪ إيثانول (5 دقائق) ، و 75٪ إيثانول (5 دقائق) ، ثم اشطفه بماء الصنبور قبل تلطيخه.

9. تلطيخ الهيماتوكسيلين والأيوزين (HE)

1. تم غمر أقسام الأنسجة المنزعة البرافين والمعاد ترطيبها في محلول تلطيخ الهيماتوكسيلين بنسبة 0.5٪ لمدة 3-5 دقائق في درجة حرارة الغرفة (RT ؛ ~ 2 °C) ، متبوعا بشطف شامل تحت ماء الصنبور الجاري.
2. عالج الأقسام لفترة وجيزة بمحلول تمايز الهيماتوكسيلين لمدة 2-5 ثوان ، واشطفها تحت ماء الصنبور الجاري.
3. قم بإجراء اللون الأزرق عن طريق غمر الأقسام في محلول الهيماتوكسيلين الأزرق لمدة 2-5 ثوان ، متبوعا بالشطف.
4. قم بتجفيف الأقسام في 85٪ و 95٪ من الإيثانول لمدة 5 دقائق لكل منهما ، ثم قم بتلطيخ 0.05٪ من الإيوزين Y (الكحولي) لمدة 5 دقائق.
5. يجفف مرتين في الإيثانول المطلق (5 دقائق لكل منهما) ، ثم يمسح في الزيلين (5 دقائق) ، يليه الزيلين الطازج (5 دقائق).
6. قم بتركيب أقسام مع بلسم محايد وقم بتغطيتها بغطاء.
   ملاحظة: في الغضروف المحفوظ جيدا ، يلطخ الهيماتوكسيلين النوى الزرقاء وبقع اليوزين باللون الوردي. يظهر الغضروف التالف فقدان الخلايا الغضروفية والرجفان والمصفوفة غير المنظمة.

10. Safranin O - تلطيخ أخضر سريع (SOFG)

1. أقسام البقع بمحلول Fast Green 2٪ لمدة 1-5 دقائق في RT. اغسلها تحت ماء الصنبور الجاري حتى يصبح الغضروف عديم اللون.
2. قم بتمييز الأقسام لفترة وجيزة في حمض الهيدروكلوريك بنسبة 1٪ لمدة 10-15 ثانية ، ثم اشطفها جيدا بالماء الجاري.
3. قم بتلطيخ الأقسام بمحلول Safranin O بنسبة 0.2٪ لمدة 5-10 ثوان ، ثم تجفف بسرعة من خلال أربعة تغييرات في الإيثانول المطلق (3-5 ثوان لكل منهما).
4. أقسام واضحة في الزيلين (5 دقائق) ، تليها الزيلين الطازج (5 دقائق).
5. قم بتركيب الشرائح مع البلسم المحايد وتغطيتها بغطاء الغطاء.
   ملاحظة: Safranin O يلطخ الغضروف البروتيوغليكان باللون الأحمر ، بينما يلطخ Fast Green العظام / الأنسجة الليفية باللون الأخضر. يشير فقدان اللون الأحمر إلى استنفاد وانحطاط البروتيوغليكان.
6. تقييم التغيرات النسيجية باستخدام نظام تسجيل الجمعية الدولية لأبحاث هشاشة العظام (OARSI). قياس عرض مساحة المفصل وسمك الغضروف لتقييم التنكس الهيكلي. التقط الصور تحت المجهر الضوئي (على سبيل المثال ، ECLIPSE Ti2-E) عند 4× (شريط المقياس = 50 ميكرومتر) و 20x (شريط المقياس = 10 ميكرومتر).
   ملاحظة: استخدم برنامج التصوير الخاص بالنظام لالتقاط الصور و ImageJ (الإصدار 1.48 فولت) للتحليل. معايرة الصور عبر تحليل > تعيين المقياس باستخدام ميكرومتر. لكل مفصل ، قم بتحديد خمسة حقول عشوائية من ثلاثة أقسام سهمية باستخدام التحليل الأعمى بواسطة ثلاثة مراقبين مستقلين.

11. مايكرو μ CT

1. قم بتشريح مفاصل ركبة الفئران بعد 12 أسبوعا من التدخل وإصلاحها على الفور في 4٪ بارافورمالدهيد في RT لمدة 24 ساعة للحفاظ على مورفولوجيا الأنسجة.
2. اشطف العينات الثابتة باستخدام PBS وقم بتخزينها في 70٪ من الإيثانول حتى المسح.
3. قم بتركيب كل عينة من مفصل الركبة على حامل عينة مخصص قبل المسح. قم بمحاذاة المفصل على طول محوره الطويل لتقليل القطع الأثرية للحركة.
4. قم بإجراء المسح الضوئي micro-μCT باستخدام نظام micro-μCT مع معلمات المسح التالية: جهد الأشعة السينية 70 كيلو فولت ، والتيار 100 ميكرو أمبير ، والطاقة 7 واط.
5. احصل على أربعة إطارات لكل عرض وقم بتكديسها لتحسين جودة الصورة ، بحجم خطوة دورانية يبلغ 0.72 درجة ، لإكمال دوران كامل بزاوية 360 درجة.
6. اضبط حجم الفوكسل الناتج (سمك الشريحة) على 15 ميكرومتر ، مما يوفر صورا عالية الدقة مناسبة لتحليل العظام التربيقية.
7. حدد منطقة الاهتمام (ROI) بين صفيحة نمو الظنبوب القريبة وهضبة الظنبوب ، مع التركيز على العظم تحت الغضروف لكل من عظم الفخذ والساق.
8. أعد بناء بيانات المسح الخام إلى صور مقطعية باستخدام برنامج إعادة البناء.
9. قم باستيراد مكدسات الصور المعاد بناؤها إلى برنامج مناسب للتحليل المورفومتري الكمي.
10. تقييم المعلمات الرئيسية بما في ذلك جزء حجم العظام (BV / TV ، ٪) ، وكثافة المعادن في العظام (BMD ، جم / سم مكعب) ، والفصل التربيقي (Tb.Sp ، مم).
11. للتصور النوعي وثلاثي الأبعاد ، استخدم برنامج تصور ثلاثي الأبعاد لإنشاء عروض حجمية للهندسة المعمارية الدقيقة للعظام.
12. إجراء تقييم بصري لتأكيد السلامة الهيكلية والتغيرات المورفولوجية التي لوحظت في البيانات الكمية.
    ملاحظة: تم إجراء جميع عمليات معالجة الصور وتحليلها من قبل مشغلين مكفوفين لضمان نتائج غير متحيزة.

12. إليسا

1. تخدير الفئران بعد 12 أسبوعا من التدخل. كشف الشريان الأورطي البطني وتشريحه بعناية لجمع عينات الدم.
2. اترك الدم الذي تم جمعه يتجلط عند RT لمدة 30 دقيقة ثم قم بالطرد المركزي عند 755 × جم (أي ما يعادل 3000 دورة في الدقيقة ، باستخدام جهاز طرد مركزي بنصف قطر دوار 7.5 سم) عند درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.
3. افصل المصل وخزنه للقياس اللاحق لمستويات PGE₂ باستخدام مجموعة ELISA المتوفرة تجاريا.
4. في موازاة ذلك ، قم بزرع الخلايا الغضروفية الأولية وزراعتها لمدة 24 ساعة ، تليها المعالجة ب IL-1β و PA لمدة 48 ساعة ، وفقا لبروتوكول معالجة الخلايا المعمول به. بعد التدخل ، قم بجمع وتحليل المواد الطافية المزرعة لتركيز PGE₂ باستخدام نفس مجموعة ELISA.

13. RT-PCR الكمي

1. استخراج الحمض النووي الريبي الكلي من عينات الخلايا باستخدام كاشف استخراج الحمض النووي الريبي التجاري (TRIzol).
2. قم بتصنيع (كدنا) باستخدام مجموعة النسخ العكسي (مع مزيل gDNA) ، وقم بتخزين (كدنا) الناتج عند -8 درجة مئوية للتحليل اللاحق.
3. قم بإجراء تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي باستخدام SYBR Green ، واحسب مستويات التعبير النسبية باستخدام طريقة 2−ΔΔCt.
   ملاحظة: كانت التسلسلات التمهيدية المستخدمة على النحو التالي: β-أكتين إلى الأمام: ACAACCTTCTTGCAGCTCCTC; عكس β-actin: CTGACCCATACCCACCATCACACACACACACACACAC; EP4 إلى الأمام: GGCACATTGTTGGTAAGCCC ؛ EP4 إلى الأمام: GGCTGTAGAAGTAGGCGTGG; COX-2 إلى الأمام: GATGACGAGCGACTGTTCCA; عكس COX-2: TGGTAACCGCTCAGGTGTTG.

14. تحليل النشاف الغربي

1. قم بعمل الخلايا باستخدام المخزن المؤقت RIPA على الجليد لمدة 30 دقيقة.
2. افصل عينات البروتين بواسطة SDS-PAGE لمدة 90 دقيقة ، ثم انقلها إلى أغشية النيتروسليلوز لمدة ساعتين.
3. سد الأغشية بنسبة 5٪ BSA واغسلها بمحلول مخزن بالفوسفات.
4. إجراء النشاف المناعي باستخدام أجسام مضادة محددة.
   ملاحظة: كانت الأجسام المضادة والتخفيفات الخاصة بها على النحو التالي: مضاد MMP9 (1: 1000) ، مضاد للكولاجين II (1: 1000) ، مضاد COX2 (1: 1000) ، مضاد ل CaMKII (1: 1000) ، مضاد ل p-CaMKII (1: 1000) ، مضاد IP3R (1: 1000) ، مضاد ل Cyt-C (1: 1000) ، ومضاد β أكتين (1: 2000).
5. بعد الحضانة الليلية بالأجسام المضادة الأولية ، اغسل الأغشية باستخدام TBST واحتضن لمدة ساعة واحدة بالأجسام المضادة الثانوية: الفأر HRP (1: 2000) أو أرنب HRP (1: 2000) في الظلام.
6. بعد غسل آخر باستخدام TBST ، قم بإجراء الكشف عن البروتين باستخدام مجموعة تلألؤ كيميائي محسنة.
7. قم بتحليل البيانات باستخدام برنامج ImageJ (الإصدار 1.48v).

15. تلطيخ التألق المناعي

1. استزراع الخلايا الغضروفية على أغطية في ألواح ذات 12 بئرا حتى وصلت إلى التقاء 80٪.
2. بعد العلاج ب IL-1β و PA لمدة 48 ساعة ، أو عدم وجود علاج كعنصر تحكم ، قم بإصلاح الخلايا بنسبة 4٪ بارافورمالدهيد في PBS لمدة 15 دقيقة في RT.
3. تخلل الخلايا باستخدام PBS الذي يحتوي على 0.2٪ Triton X-100 لمدة 15 دقيقة.
4. اغسل الخلايا ثلاث مرات باستخدام PBS (5 دقائق لكل منهما) ، ثم احتضنها بجسم مضاد أولي (مضاد IP3R ، تخفيف 1: 200) في مخزن مؤقت لتخفيف الأجسام المضادة عند درجة مئوية طوال الليل.
5. تعريض الخلايا لتخفيف 1: 500 من الجسم المضاد الثانوي IgG للماعز المضاد للأرانب المسمى بالفلوريسين إيزوثيوسيانات لمدة 1 ساعة.
6. قم بإزالة بقع الخلايا بمحلول DAPI 5 ميكروغرام / مل لمدة 10 دقائق.
   ملاحظة: تم الحصول على صور مضان باستخدام عدسة موضوعية 40x (شريط المقياس = 2 ميكرومتر). تمت معالجة جميع الصور باستخدام برنامج ZEN وقياسها كميا باستخدام ImageJ (الإصدار 1.48v) ، باتباع إجراءات معايرة متسقة.

16. التحليل الإحصائي

1. إجراء تحليلات إحصائية باستخدام GraphPad Prism (الإصدار 8.0.2).
2. قبل تطبيق الاختبارات البارامترية ، قم بتقييم البيانات الخاصة بالتوزيع الطبيعي باستخدام اختبار Shapiro-Wilk وتجانس التباين باستخدام اختبارات Brown-Forsythe و Bartlett.
3. استخدم ANOVA أحادي الاتجاه متبوعا باختبار Tukey اللاحق للمقارنات بين مجموعات متعددة ، وقم بتطبيق اختبار t للطالب غير المتزاوج ثنائي الذيل لمقارنات مجموعتين.
4. ضع في اعتبارك قيمة P أقل من 0.05 ذات دلالة إحصائية.
5. اعرض جميع البيانات كمتوسط ± انحراف معياري (SD) من ثلاث تجارب مستقلة على الأقل.

النتائج

يظهر PTOA الناجم عن ACLT تدميرا مبكرا للغضروف وعجزا سلوكيا بالنسبة ل KOA المزمن الناجم عن FD (الشكل 2 والشكل 3)
يعد تضييق مساحة المفاصل وتنكس الغضروف من النتائج الأولية ل الزراعة العضوية. حددت الدراسات السابقة زيادة الوزن والعوامل البيئية (على سبيل المثال ، المناخ الرطب) كمساهمين محتملين في ظهور التهاب المفاصل^12،13 ، والتي قد تكون مرتبطة ارتباطا مباش...

المناقشة

بالمقارنة مع التهاب المفاصل المزمن الناجم عن العوامل البيئية والغذائية ، تؤدي صدمة المفاصل التي يسببها ACLT إلى تطور المرض بشكل أسرع. كشفت نتائجنا ، بناء على التقييمات السلوكية بما في ذلك تورم المفاصل وقوة قبضة الأطراف الخلفية وتحليل المشي ، عن اختلافات ذات دلالة إحصائية بين المجموعة الضابطة ومجموعة PTOA ومجموعة التحكم الإيجابية الناجمة عن العوامل البيئية والغذائية. بعد 12 أسبوعا من التدخل ، لوحظ تورم مفرط في المفاصل ، مصحوبا بانخفاض كبير في قوة قبضة الأطراف الخلفية والمشية غير المستقرة ...

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
0.2٪ كولاجيناز II	سيجما ألدريتش ، الولايات المتحدة الأمريكية	رقم سجل المستخلصات الكيميائية: 9001-12-1	عزل الخلايا الغضروفية الأولية وزراعتها
0.2٪ تريتون X-100	Beyotime ، الصين	المعيار ST795	التألق المناعي
0.25٪ التربسين EDTA	ووهان بوستر التكنولوجيا البيولوجية المحدودة	طر1071	إزالة الكلس
0.25٪ التربسين EDTA	جيبكو ، الولايات المتحدة الأمريكية	25200072	عزل الخلايا الغضروفية الأولية وزراعتها
4٪ محلول مثبت بارافورمالديهايد	Biyuntian, الصين	P0099-3L	تثبيت الأنسجة
الأجسام المضادة ل CaMKII	هوابيو ، الصين	إت 1608-47	وصمة عار غربية (1:1000)
الأجسام المضادة للكولاجين II	أبكام ، المملكة المتحدة	أب34712	وصمة عار غربية (1:1000)
الأجسام المضادة المضادة ل COX2	أبكام ، المملكة المتحدة	أب179800	وصمة عار غربية (1:1000)
الأجسام المضادة المضادة ل Cyt-C	سيليك ، الصين	إف 2534	وصمة عار غربية (1:1000)
الأجسام المضادة المضادة ل IP3R (B-2)	سانتا كروز ، الولايات المتحدة الأمريكية	SC-377518	وصمة عار غربية (1:1000)
الأجسام المضادة المضادة ل MMP9	أبكام ، المملكة المتحدة	أب76003	وصمة عار غربية (1:1000)
الأجسام المضادة المضادة ل p-CaMKII	سيليك ، الصين	إف 0342	وصمة عار غربية (1:1000)
الأجسام المضادة للأكتين	تكنولوجيا إشارات الخلية (CST) ، الولايات المتحدة الأمريكية	8H10D10	لطخة غربية (1:2000)
حل حجب BSA	سيجما ألدريتش ، الولايات المتحدة الأمريكية	غير متاح	5٪ BSA لحجب اللطخات الغربية
جهاز طرد مركزي (5424 R)	Eppendorf, ألمانيا	غير متاح	755 &مرات ؛ ز سرعة الطرد المركزي
كلوروفورم	سيجما ألدريتش ، الولايات المتحدة الأمريكية	غير متاح	مذيب للسلطة الفلسطينية
غرفة يتم التحكم فيها بالمناخ (RXZ-158A)	الصانع المحلي ، الصين	غير متاح	نموذج البيئة الرطبة
طقم النسخ العكسي للألوان	Invitrogen ، سوتشو ، الصين	غير متاح	تخليق (كدنا)
CTAn البرمجيات	بروكر	الإصداران 1.9 و 4.1	للتحليل المورفومتري الكمي
برنامج CTVol	بروكر	الإصدار 2.0	للتصور النوعي وثلاثي الأبعاد
حل تلطيخ DAPI	Beyotime ، الصين	غير متاح	تلطيخ نووي (5 & جم / مل)
مقياس قوة القبضة الرقمية	أداة Puxin	غير متاح	قياس قوة قبضة الأطراف الخلفية
DMEM / F12 متوسط	كورنينج، الولايات المتحدة الأمريكية	غير متاح	وسط زراعة الخلايا
EDTA (حمض الإيثيلين ديامين تترا أسيتيك)	علاء الدين	غير متاح	إزالة الكلس من أنسجة العظام
طقم ELISA ل PGE2	Elabscience ، ووهان ، الصين	PGE2E-EL-0034	كشف ELISA
طقم التلألؤ الكيميائي المحسن	ميليبور ، الولايات المتحدة الأمريكية	WBKLS0500	كشف اللطخة الغربية
ايثانول	قوانغدونغ قوانغشي كاشف التكنولوجيا المحدودة	سجل المستخلصات الكيميائية: 64-17-5	جفاف الأنسجة
مصل الأبقار الجنينية (FBS)	كورنينج، الولايات المتحدة الأمريكية	غير متاح	تركيز 10٪ للثقافة
الماعز المضادة للأرانب IgG المسمى FITC	Beyotime ، الصين	طقم P0179	التألق المناعي (1: 500)
GraphPad المنشور	برنامج GraphPad ، الولايات المتحدة الأمريكية	الإصدار 8.0.2	تحليل البيانات
الهيماتوكسيلين والإيوسين (H& ه) طقم تلطيخ	سيرفيسبيو ، ووهان	طراز G1005	علم الأنسجة
IL-1 &beta ؛	PeproTech ، الولايات المتحدة الأمريكية	400-01 ب	10 نانوغرام / مل لنموذج خلية PTOA
إيمج جي	المعاهد الوطنية للصحة ، الولايات المتحدة الأمريكية	الإصدار 1.48v	تحليل الصور
برنامج Image-Pro Plus	علم التحكم الآلي الإعلامي	الإصدار 6.0	التحليل الكمي للمشي من آثار الأقدام الممسوحة ضوئيا
إيزوفلوران	شنغهاي ياجي البيولوجية	YS1412C	التخدير لجراحة
مركز لايكا للتضمين	أنظمة لايكا الدقيقة	طراز EG1160	تضمين البارافين
لايكا ميكروتوم	أنظمة لايكا الدقيقة	2235 رينجيت ماليزي	تقسيم الأنسجة المدمجة بالبارافين
حمام مائي لايكا	أنظمة لايكا الدقيقة	مرحبا 1210	أقسام البارافين العائمة
مجهر ضوئي (ECLIPSE Ti2-E)	نيكون ، اليابان	غير متاح	الملاحظة النسيجية
ماسح ضوئي دقيق (ZKKS-MCT-Sharp)	الصانع المحلي ، الصين	غير متاح	تصوير العظام
الجسم المضاد الثانوي Mouse-HRP	تكنولوجيا إشارات الخلية (CST) ، الولايات المتحدة الأمريكية	7076	1: 2000 التخفيف
برنامج التصوير NIS-Elements	نيكون	غير متاح	التقاط وتحليل صور المجهر
برنامج NRecon	بروكر ، ألمانيا	الإصدار 1.6	إعادة بناء التصوير المقطعي المحوسب
حمض البالمتيك (PA)	سيجما ألدريتش ، الولايات المتحدة الأمريكية	ص 0500	500 & مخزون M لنموذج خلية FD
شمع البارافين للتقسيم, درجة علم الأمراض, نقطة الانصهار 52-54° C	قوانغدونغ قوانغشي كاشف التكنولوجيا المحدودة	Y258797-500 جرام	تستخدم لتضمين البارافين أثناء معالجة الأنسجة
شمع البارافين للتقسيم، درجة علم الأمراض، نقطة الانصهار 56-58 ° C	قوانغدونغ قوانغشي كاشف التكنولوجيا المحدودة	Y258799-500 جرام	تستخدم لتضمين الشمع الصلب النهائي في تقسيم الأنسجة
PBS (محلول ملحي مخزن الفوسفات)	جيبكو / ثيرمو فيشر	C10010500BT	غسل الخلايا وشطف الأنسجة
البنسلين - الستربتومايسين	كورنينج، الولايات المتحدة الأمريكية	غير متاح	1٪ لزراعة الخلايا
غشاء PVDF (0.45 & micro; m)	ميليبور ، الولايات المتحدة الأمريكية	IPVH00010	غشاء اللطخة الغربية
الأجسام المضادة الثانوية Rabbit-HRP	تكنولوجيا إشارات الخلية (CST) ، الولايات المتحدة الأمريكية	7074	1: 2000 التخفيف
حبر أحمر	بطل	بطل 204	تتبع البصمة في تحليل المشي
RIPA تحلل المخزن المؤقت	كيجن, الصين	غير متاح	استخراج البروتين
Safranin O – طقم تلطيخ أخضر سريع	سيرفيسبيو ، ووهان	طراز G1053	تلطيخ نسيجي
ميكرومتر حلزوني (الفرجار الورني)	هوانغشان ، الصين	غير متاح	قياس عرض المفصل
برنامج تحليل العظام تحت الغضروف (CTAn)	بروكر ، ألمانيا	الإصداران 1.9 و 4.1	التحليل المورفومتري
SYBR جرين PCR ماستر ميكس	AG Scientific ، الصين	غير متاح	تحليل qPCR
الكواشف الغربية للبقعة (المخزن المؤقت RIPA ، مكونات هلام SDS-PAGE ، المخزن المؤقت للتحميل ، TBST ، إلخ.)	Beyotime Biotechnology (الصين)	غير متاح (يستخدم كإدخال مجموعة)	جميع الكواشف الروتينية المستخدمة في إجراءات النشاف الغربية
الزيلين	قوانغدونغ قوانغشي كاشف التكنولوجيا المحدودة	سجل الوصول المشترك: 1330-20-7	تطهير الأنسجة