مقالة منهجية

تهجين الحمض النووي الريبي في الموقع مع التألق المناعي للبروتين المتسلسل في الفحص الترادفي

DOI:

10.3791/68615

⸱

أكتوبر 10, 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Hematopoietic Biology & Malignancy, The University of Texas MD Anderson Cancer Center, 2Department of Gynecologic Oncology and Reproductive Medicine, The University of Texas MD Anderson Cancer Center, 3Department of Leukemia, The University of Texas MD Anderson Cancer Center, 4Department of Melanoma Medical Oncology Research, The University of Texas MD Anderson Cancer Center, 5Department of Veterinary Medicine & Surgery, The University of Texas MD Anderson Cancer Center

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يوضح هذا البروتوكول تفاصيل تهجين الحمض النووي الريبي في الموقع مع التألق المناعي للبروتين المتسلسل في الأنسجة على منصة آلية لتوصيف omics المكانية المتعددة المستهدفة على المستوى الخلوي.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

لا تعتمد وظيفة الخلايا داخل المضيف على الإشارات المعزولة. بدلا من ذلك ، يجب أن تعمل جميع المكونات ، من أصغر جزيئات الحمض النووي الريبي إلى أكبر البروتينات ، في وئام وتنسيق داخل جسم الإنسان. على هذا النحو ، فإن أهمية الأساليب التي تدمج التحقيقات المكانية على المستوى الخلوي عبر omics متعددة أمر بالغ الأهمية لفهم تفاعلات الخلية والخلايا وتطور المرض. يساعدنا تشريح البروتين والنسخ في نفس الفحص المكاني على فهم كيف ليس فقط ما يتم توجيه الخلية لتنفيذه (RNA) ، ولكن أيضا كيف تنفذ هذه التعليمات في سياق مكانة البيئة الدقيقة التي تجد نفسها فيها (البروتين). تركز هذه المخطوطة على دمج التألق المناعي المتسلسل (SeqIF) مع تهجين الحمض النووي الريبي في الموقع (ISH) مع نظام مدفوع بالموائع الدقيقة على الأنسجة لفحص البروتين عالي الإنتاجية والحمض النووي الريبي في سياق مكاني (seqRNA-ISH + seqIF) الذي سيسمح بما يصل إلى 12 RNA و 24 هدفا من البروتين في جولة واحدة مع أهداف بروتينية إضافية يمكن إضافتها عبر الجولات المتسلسلة. توفر هذه الطريقة منصة متعددة الأوسميات مستهدفة متسلسلة لا تتطلب النظر في توافق الفلوروفور والتحسين الشامل لإرسال أعلى. يتيح ذلك للمرء فهم الرسائل التي تقوم الخلية بتجهيزها أو ترسلها إلى بيئتها المكروية. يساعد هذا النهج المستهدف على التحقق من صحة طرق النسخ الكاملة أثناء فحص التفاعلات بين الحمض النووي الريبي والبروتينات بطريقة أكثر دقة.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعتمد الأداء المعقد للخلايا داخل جسم الإنسان على تفاعل معقد للإشارات ، من جزيئات الحمض النووي الريبي الصغيرة إلى البروتينات الكبيرة ، وكلها تعمل بالتنسيق1. يؤكد هذا التفاعل على أهمية الأساليب التكاملية التي تفحص التفاعلات المكانية على المستوى الخلوي عبر طبقات omics المختلفة2،3. هذه المنهجيات ضرورية لفهم تعقيدات تفاعلات الخلية والخلايا وتطور المرض. تستخدم العديد من الطرق التقليدية ، مثل قياس التدفق الخلوي4 والتسلسل أحادي الخلية5 ، عزلات الخلايا للتحقيق في العينات المصنفة لتحديد النسب السائبة للأنماط الظاهرية الموجودة داخل عينة معينة. ومع ذلك ، فإن عزل الخلايا للتحليل قد يؤدي إلى تنشيط أو تغييرات نمطية قد لا تعكس بدقة بيولوجيتها الأصلية ووظيفتها في الموقع6. تقدم الأساليب المتقدمة في علم الأحياء المكاني استراتيجيات جديدة لدراسة الخلايا وبيئتها المكروية دون المساس بسياق بنية الأنسجة والعلاقات المكانية مع الخلايا المجاورة عبر أنواع جزيئية متعددة2،7.

يوفر دمج تحليلات النسخ والبروتينات في نفس الفحص المكاني ، دون عزل الخلايا الفردية ، رؤية شاملة للوظيفة الخلوية8. تعتمد هذه الطريقة علىطرق تهجين الحمض النووي الريبي الفلوري أحادي الجزيء (FISH) ، ولكنها لا تشمل هضم البروتيناز الذي يعقد استجوابات البروتينالمتسلسلة 8. توفر مرونة النهج المستخدم في قسم واحد دقة مكانية أعلى ومعالجة أقل للصور لدمج الأقسام ومحاذاتها. يوفر هذا النهج نظرة ثاقبة حول كل من التعليمات التي تتلقاها الخلية (الحمض النووي الريبي) وتنفيذها (البروتين) ضمن مكانتها البيئية الدقيقة المحددة. من خلال الجمع بين هذه الطبقات من المعلومات ، يمكن للباحثين اكتساب رؤى أعمق حول السلوك الخلوي والتواصل.

في حين أن الأساليب اليدوية موجودة ، فقد مكنت التطورات الحديثة في تقنيات omics المكانية من إجراء تحليلات أكثر تعقيدا مع عدد أكبر من العلامات البروتينية التي تم فحصها باستخدام تعدد الإرسال اليدوي9. تضمنت هذه الأساليب تقدما في كل من فحوصات البروتين والحمض النووي الريبي-ISH10،11،12،13،14 ، والمنهجيات الآلية التي تتطلب الأجسام المضادة المترافقة الخاصة بالنظام15،16،17 ، وقياس الكتلة الخلوية التصويرية (IMC) 18،19،20 وغيرها من المنهجيات البروتينية الفلورية المتسلسلة الآلية التي تستخدم مضادات البروتين الأولية والثانوية الجاهزة2،21،22. سهلت هذه التقنيات إما البروتينات أو النسخ والبروتينات مجتمعة باستخدام مناهج مستهدفة وعادة ما تتصور هذه الحمض النووي الريبي عبر المجسات والبروتينات عبر الأجسام المضادة القائمة على اقترانات مماثلة مما يسمح باكتشاف الحمض النووي الريبي والبروتين المتزامنين أو المتسلسلين باستخدام نفس المنهجية أو الأدوات. من خلال توفير رؤية شاملة للنشاط الخلوي ، تهدف هذه الأنواع من الأساليب إلى تعزيز فهمنا للاتصال الخلوي بين الخلايا وبيئتها المكروية. إنه يوفر أداة قيمة لفك رموز تعقيدات التفاعل الخلوي ، مما قد يكشف عن رؤى جديدة في العمليات الفسيولوجية الطبيعية وآليات المرض.

يوفر هذا البروتوكول إرشادات لدمج تهجين الحمض النووي الريبي في الموقع (ISH) مع التألق المناعي المتسلسل (SeqIF) مع نظام مدفوع بالموائع الدقيقة على الأنسجة. يوفر هذا أداة عالية الإنتاجية للتحقيق في الحمض النووي الريبي والبروتين في سياقها المكاني الأصلي. هذه الطريقة (seqRNA-ISH + seqIF) التي ستسمح بما يصل إلى 12 RNA و 24 هدفا للبروتين في جولة واحدة ، مع إمكانية إضافة أهداف بروتينية إضافية عبر عمليات تشغيل متسلسلة. بينما يركز هذا البروتوكول على نظام واحد محدد للموائع الدقيقة ، يمكن تكييف معالجة الأنسجة وضمان جودة الحمض النووي الريبي واختيار الأجسام المضادة وإرشادات المعايرة بالتحليل الحجمي المقدمة مع المنهجيات الأخرى. ومع ذلك ، تستخدم هذه الطريقة استرجاع مستضد الأس الهيدروجيني 9.0 لاستعادة الحاتمة الفعالة والخالية من البروتياز ، مما يحسن استقرار البروتينات مع توفير بعض النسخ المستهدفة ، على عكس الحمض النووي الريبي التقليدي عند الرقم الهيدروجيني 6.0 مع البروتياز لزيادة إمكانية الوصول إلى مسبار الحمض النووي الريبي ولكنه فشل في الحفاظ على البروتين8. تم تحديد طريقة seqRNA-ISH + seqIF بصريا في الشكل 1 ، مما يوضح تضخيم RNA FISH متبوعا بالشق قبل استخدام طريقة إقران الأجسام المضادة الأولية والثانوية التي تستخدم إزالة كيميائية لطيفة للانتخابات الأولية والثانوية. تتغلب الطبيعة المتسلسلة ل seqIF والكشف على العديد من القيود المتعلقة بتوافق الفلوروفور من خلال استخدام المنهجيات المتسلسلة23. هذا يقلل من الحاجة إلى تحسين شامل مطلوب في التلوين المتزامن في منهجيات الضفرة العالية التي تتطلب تعويضا عن التداخل الطيفي23.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يستخدم هذا البروتوكول أقسام الأنسجة المضمنة بالبارافين الثابت بالفورمالين (FFPE) التي تم جمعها من مرضى سرطان المبيض المصلي عالي الجودة الساذجين الذين خضعوا لجراحة اختزال الخلايا الأولية. تم الحصول على جميع البيانات السريرية من مستودع سرطان المبيض التابع لقسم الأورام النسائية والطب التناسلي بموجب البروتوكولات المعتمدة من قبل مجلس المراجعة المؤسسية بجامعة تكساس إم دي أندرسون. تم الحصول على موافقة خطية مستنيرة من المرضى من قبل موظفي مكتب الاستقبال ، وأجريت الدراسات وفقا للإرشادات الأخلاقية المعترف بها.

ملاحظة: يتم تخفيف جميع الكواشف ، ما لم ينص على خلاف ذلك ، في ماء منزوع الأيونات خال من النوكلياز.

1. إصلاح وتضمين العينات

ملاحظة: يؤثر اختيار مدة التثبيت والتثبيت بشدة على أداء المقايسات ، وبشكل عام غالبا ما يتم إجراء المقايسات المكانية باستخدام FFPE لأنها تحافظ على الهندسة المرضية. يحدد هذا البروتوكول استخدام أنسجة FFPE ، على هذا النحو يقترح البروتوكول التالي لعينات أنسجة FFPE. ومع ذلك ، تتأثر جودة الحمض النووي الريبي بعمليات التثبيت ، وكذلك حواتم البروتين ، ولكن بدرجة أقل. يمكن أن تؤدي طرق التثبيت هذه والتثبيت غير المكتمل وتدهور العينة إلى زيادة الارتباط غير المحدد في البروتينات القائمة على الأجسام المضادة. ثالثا ، عادة ما يتم إخماد التألق التأسيسي أثناء معالجة FFPE ، لكن بعض الفلوروفورات ستستمر بشكل معتدل وتتطلب اختبارا للتأكد من إخمادها.

  1. قسم الأنسجة إلى سمك ≤ 5 مم لضمان تثبيت موحد ولمنع حواجز الانتشار التي تسببها الدهون. قم بتثبيت الأقسام على الفورمالين بنسبة 10٪ من الفورمالين المخزن بالفوسفات (درجة الحموضة 7.0) عند 4 درجات مئوية لمدة 24 ساعة لتحسين الحمض النووي الريبي والبروتين24.
  2. معالجة الأنسجة الثابتة في معالج الأنسجة أو معالجتها يدويا باستخدام الخطوات التالية
    1. تجفيف أقسام الأنسجة في الإيثانول الجزيئي في الماء الخالي من النوكلياز من (70٪ ، 75٪ ، 95٪ 2x ، 100٪ 3x لمدة 1 ساعة لكل منهما).
    2. ثم اغمر الأنسجة في الزيلين مرتين لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة (~ 23 درجة مئوية).
  3. قم بتسخين شمع البارافين إلى 60 درجة مئوية. اغمر صندوق المناديل في شمع البارافين لمدة 2 مرات لمدة ساعة واحدة لكل منهما.
  4. ضع الأنسجة المنتفخة وتوجيه المناديل في القالب ، واملأها بشمع البارافين الطازج ، واتركها تبرد بسرعة إلى 4 درجة مئوية25.
    ملاحظة: سيتم الحصول على أفضل النتائج للحمض النووي الريبي من خلال إكمال جميع الخطوات في غضون 48 ساعة.

2. تقييم جودة الحمض النووي الريبي

  1. استخدم ثلاثة أقسام تسلسلية ، وقم بتشغيل الشرائح الثلاث بالتوازي أو تشغيل شرائح التحكم قبل اللوحة المستهدفة للتأكد من أن الحظر كاف. تستهدف مجسات التحكم الإيجابية المزدوجة جينات التدبير المنزلي لتقييم جودة الأنسجة والسلامة المكانية عبر الأنسجة ، والتي يمكن أن تتأثر باختلافات المثابرة. تشمل الضوابط شائعة الاستخدام UBC (جين عالي التعبير) و PPIB (تعبير معتدل) و POLR2A (تعبير منخفض) 26. استخدم مجموعات مجسات التحكم السلبية ، مثل Dab1 (الحمض النووي الريبي لبكتيريا التربة) على كل قناة كشف. اختياريا، قم بتضمين جميع مجسات التحكم الإيجابية والسلبية في نفس العينة جنبا إلى جنب مع المجسات المستهدفة. في هذا الإعداد، ضع عناصر التحكم السلبية Dab1 في القنوات T2-T4، وقم بتعيين عناصر تحكم إيجابية من أدنى إلى أعلى تعبير إلى T1 وT5 وT9، وتأكد من أن المجسات المستهدفة تشغل القنوات المتبقية.
    اختياري: بالإضافة إلى ذلك، بالنسبة للعينات ذات جودة الحمض النووي الريبي غير المعروفة، قد يكون من المفيد تحديد قيمة التوزيع 200 (درجة DV200). يوصى بشدة بدرجات DV200 التي تزيد عن 30 ، مع تفضيل عينات عالية الجودة من 50 أو أعلى27. هذه النتيجة هي مؤشر على جودة الحمض النووي الريبي ، وتزيد جودة العينة الأعلى من احتمالية عمل RNA-ISH بفعالية27.

3. احتياطات واستعدادات الحمض النووي الريبي

ملاحظة: من الأفضل تطهير منطقة RNases ومسحها ثم رش منطقة العمل بنسبة 70٪ من الإيثانول قبل المعالجة بالإضافة إلى استخدام منطقة خالية من RNase ، وارتد دائما قفازات نظيفة ومعطف مختبر وقناع لتقليل إدخال RNases من الجلد أو التنفس. استخدم فقط المياه والمواد الاستهلاكية الخالية من RNase وتجنب الوصول إلى أكياس الإمداد. هذه الاحتياطات ، بالإضافة إلى الحفاظ على الأنسجة / الشرائح باردة وجافة ، ضرورية للحفاظ على سلامة الحمض النووي الريبي أثناء التجارب.

  1. قم بقص الأقسام على شرائح زجاجية موجبة الشحنة باستخدام ميكروتوم وضع المنطقة ذات الاهتمام في وسط الشريحة ، والتي تنسق مع منطقة التصوير (تختلف حسب النظام ؛ هنا ، تبلغ حوالي 12.5 مم × 12.5 مم).
    ملاحظة: ضع في اعتبارك أن السماكة المثالية لكل قسم تتراوح بين 4-6 ميكرومتر لأنسجة FFPE.
  2. اخبز شرائح FFPE في فرن جاف خال من الحمض النووي الريبي ، مناديل متجهة لأعلى ، عند 60 درجة مئوية لمدة لا تقل عن 1 ساعة وحتى ليلة واحدة للأنسجة الدهنية أو الأنسجة المعرضة للانفصال.
  3. المعالجة المسبقة الاختيارية
    ملاحظة: في حين أن المعالجة المسبقة اختيارية ، إلا أن بعض الخطوات اختيارية أيضا كما هو موضح أدناه.
    1. تحضير 3٪ بيروكسيد الهيدروجين: في أنبوب مخروطي سعة 50 مل ، أضف 5 مل من بيروكسيد الهيدروجين بنسبة 30٪ إلى 45 مل من 1x PBS. قم بتخزين بيروكسيد الهيدروجين المتبقي في درجة حرارة الغرفة (~ 23 درجة مئوية) ، والغطاء مؤمن بالبارافيلم ، لمدة تصل إلى ثلاثة أشهر.
      ملاحظة: بيروكسيد الهيدروجين مؤكسد قوي. الابتعاد عن المواد القابلة للاحتراق ومصادر الحرارة والمعادن. استخدم في منطقة غطاء الدخان الكيميائي مع معدات الحماية الشخصية (معدات الوقاية الشخصية ؛ على سبيل المثال ، النظارات الواقية والقفازات ومعطف المختبر). تجنب ملامسة الجلد والعينين والاستنشاق. اغسلي البشرة بالماء لمدة 15 دقيقة في حالة تعرضها. اطلب المساعدة الطبية في حالة تناولها أو استنشاقها. يمكن أن تسبب التركيزات العالية حروقا شديدة وقد تشتعل أو تنفجر بمواد عضوية أو معادن معينة. أضف دائما بيروكسيد الهيدروجين إلى الماء لتجنب ردود الفعل العنيفة.
    2. تحضير 3.7٪ فورمالديهايد: في غطاء الدخان الكيميائي ، أضف 1 مل من الفورمالديهايد بنسبة 16٪ لكل 3.3 مل من 1x PBS. قم بتخزين الفورمالديهايد ملفوفا بالبارافيلم لمدة تصل إلى ثلاثة أشهر.
      ملاحظة: قد يتسبب الفورمالديهايد في تلف خطير في العين وتهيجا في الجهاز التنفسي ويشتبه في أنه يسبب السرطان. قد يؤدي التعرض المطول أو المتكرر إلى حساسية الجلد وردود الفعل التحسسية. استخدم فقط في غطاء الدخان الكيميائي وارتد معدات الوقاية الشخصية المناسبة (قفازات ، نظارات واقية / واقي للوجه ، قناع ، معطف مختبر ، إلخ). تجنب ملامسة الجلد وملامسة العين والاستنشاق. الابتعاد عن مصادر الحرارة واللهب المكشوف. تخلص من المواد البارافورمالديهايد والمواد الملوثة كنفايات خطرة ، وقم بإعداد الكمية اللازمة للاستخدام الفوري فقط إن أمكن.
    3. قم بإزالة البارارافين عن طريق غسل شريحة الأنسجة عن طريق وضعها في أنابيب مخروطية سعة 50 مل تحتوي على ما يلي: زيلين (40 مل) لمدة 3 غسلات كل منها في غطاء دخان كيميائي.
      اختياري: بدلا من الزيلين ، يمكن استخدام عامل إزالة نسيجي غير أساسي من الزيلين ، ولكن من المحتمل أن يترك بقايا من البارافين وجودة الصورة المؤثرة. يتضمن ذلك وضع الشرائح في أنابيب مخروطية سعة 50 مل تحتوي على ما يلي: عامل إزالة نسيجي غير أساسي من الزيلين (40 مل) لغسلتين كل منهما 15 دقيقة. قد يكون من الصعب إزالة الشمع من الأقسام من الكتل المصنوعة من شمع العسل باستخدام غير الزيلين. بالنسبة لمخاليط الشمع / البارافين غير المعروفة ، يوصى باستخدام الزيلين مع احتياطات السلامة الصحيحة. الزيلين مادة خطرة وقابلة للاشتعال ، وقد يتسبب التعرض المطول في تلف الجهاز العصبي المركزي والكبد والكلى. استخدم فقط في غطاء الدخان الكيميائي وارتد معدات الوقاية الشخصية (مثل القفازات والأقنعة ومعاطف المختبر). تخلص من الزيلين والمواد الملوثة كنفايات خطرة. في حالة التعرض ، اطلب العناية الطبية الفورية.
    4. إعادة الترطيب عن طريق غسل الشريحة المناديل عن طريق وضعها في 50 مل أنبوب مخروطي يحتوي على ما يلي: 100٪ الإيثانول (40 مل) لمدة 2 غسلة لمدة 3 دقائق لكل منهما; 95٪ إيثانول (40 مل) لمدة غسلتين في 3 دقائق لكل منهما ؛ 70٪ إيثانول (40 مل) لمدة 2 غسلة في 3 دقائق لكل منهما ؛ 50٪ إيثانول (40 مل) ، لمدة 2 غسلة لمدة 3 دقائق لكل منهما ؛ 30٪ إيثانول (40 مل) لمدة 2 غسلة في 3 دقائق لكل منهما ؛ 1x PBS غسيل (40 مل) لمدة 1 غسيل لمدة دقيقتين.
    5. يمنع البيروكسيديز الأنسجة عن طريق وضعها في غرفة رطوبة في درجة حرارة الغرفة (~ 23 درجة مئوية) وتغطية الأنسجة بحوالي 100-200 ميكرولتر من بيروكسيد الهيدروجين 3٪ ، لغسلة واحدة لمدة 10 دقائق ثم غسل المناديل بغسول 1x PBS (40 مل) ، لمدة غسلتين في دقيقتين لكل منهما.
      ملاحظة: حجب البيروكسيديز اختياري ويطفئ إنزيمات البيروكسيديز المتبقية في الأنسجة لتقليل التلوين غير المحدد وقد يقلل من التألق الذاتي للأنسجة. هذا مهم بشكل خاص للأنسجة ذات التألق الذاتي العالي ، مثل نخاع العظام والكلى والكبد والرئة والأمعاء والدماغ ، حيث يمكن أن تتداخل إشارات الخلفية القوية مع التصوير في نطاقات انبعاث TRITC و FITC28،29،30،31،32.
    6. قم بتثبيت الفورمالديهايد عن طريق وضع الأنسجة في غرفة الرطوبة في درجة حرارة الغرفة وتغطية الأنسجة بحوالي 100-200 ميكرولتر من 3.7٪ فورمالديهايد ، لمدة غسيل واحد لمدة 10 دقائق ، ثم اغسل المناديل بغسول 1x PBS (40 مل) ، لمدة غسلتين لمدة دقيقتين لكل منهما.
      ملاحظة: هذه الخطوة اختيارية ولكنها موصى بها للأنسجة الغنية بالدهون أو الأنسجة الأخرى التي تعاني من مشاكل في الالتصاق بالشرائح الزجاجية.

4. استرجاع المستضد

ملاحظة: تختلف طريقة إزالة الشمع واسترجاع المستضد الموصى بها والمبينة هنا عن الطريقة الموصى بها ل seqRNA-ISH + seqIF من قبل الشركة المصنعة ، والتي تستخدم جهاز استرجاع مستضد حراري متحكم فيه بسعة كبيرة.

  1. استرجاع المستضد الناجم عن الحرارة (HEIR) باستخدام الميكروويف
    1. باستخدام ميكروويف مراقب لدرجة الحرارة ، أضف محلول كاف من الأس الهيدروجيني 9.0 HEIR Buffer المتوفر تجاريا (حوالي 250 مل) لتغطية الشرائح في حامل الشريحة أسفل مقياس الحرارة إن أمكن.
      ملاحظة: عادة ما يتم استرجاع مستضد الحمض النووي الريبي عند درجة الحموضة 6.0 ، ولكن المنهجيات التالية مخصصة لدرجة الحموضة 9.0 لزيادة كفاءة ارتباط الأجسام المضادة.
  2. أدخل الشرائح في محلول عازل في الميكروويف وقم بموازنة أي غرف فارغة إذا كان ذلك ممكنا بالماء المقطر المزدوج. تنزلق الحرارة في الميكروويف لمدة 15 دقيقة عند 107 درجة مئوية (عادة ما يكون الوقت الإجمالي 30 دقيقة حتى يصل المخزن المؤقت للوريث إلى درجة الحرارة).
  3. قم بتبريد الشرائح عن طريق وضعها تحت غطاء دخان كيميائي في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة تقريبا.
  4. اغسل الشرائح في 1x PBS في أنبوب مخروطي سعة 50 مل (40 مل) ، لغسيل واحد لمدة دقيقتين.
  5. قم بتخزين الشرائح في بريد منزلق بغطاء لولبي أو أنبوب مخروطي سعة 50 مل مملوء ب 1x PBS (أو مخزن مؤقت متعدد التلوين تجاري) وتابع على الفور ، أو قم بتخزينه عند 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى 7 أيام ، ولكن من الناحية المثالية أقل من 72 ساعة قبل المتابعة مع seqRNA-ISH + seqIF.

5. تحضير حلول المخزون

  1. قم بإعداد المخزن المؤقت للتصوير بالحمض النووي الريبي 40x
    1. قم بإعداد 40x RNA Imaging Buffer عن طريق الجمع بين 400 مجم من مسحوق التصوير الريبي المؤقت و 25 مل من الماء منزوع الأيونات الخالي من النوكلياز
    2. دوامة المحلول الناتج حتى يذوب تماما ثم يتم تقطيعه في أنابيب الطرد المركزي الدقيقة سعة 1.5 مل (1 مل لكل أنبوب)
    3. قم بتجميدها وتخزينها في درجة حرارة -20 درجة مئوية لمدة تصل إلى ثلاثة أشهر ، مع تجنب دورات التجميد والذوبان.
  2. تحضير 20x عازلة سترات الصوديوم المالحة (SSC)
    1. قم بإذابة 157.3 جم من كلوريد الصوديوم (كلوريد الصوديوم) و 88.2 جم من سترات الصوديوم (Na3C6H5O7) في 800 مل من الماء منزوع الأيونات الخالي من النوكلياز.
    2. قم بقياس الأس الهيدروجيني ومعايرة إلى درجة الحموضة 7.0 بالاتجاه التقطيعي باستخدام حمض الهيدروكلوريك 1 M (HCl).
    3. الأوتوكلاف للتعقيم.
      ملاحظة: يمكن أيضا شراء Sterile 20x SSC من شركات مختلفة. بعد الفتح ، يحفظ في درجة حرارة الغرفة إلى 4 درجات مئوية.
    4. قم بإعداد 4x SSC buffer عن طريق الجمع بين 1 مل من مخزون 20x SSC مع 4 مل من الماء منزوع الأيونات الخالي من النوكلياز

6. الرينا الريبي-ISH المتسلسل + التألق المناعي المتسلسل

ملاحظة: يتم تكييف جميع الخطوات الموضحة هنا من بروتوكول الشركة المصنعة ل seqRNA-ISH + seqIF الموضح في جدول المواد ، حيث يتم تحديد معظم الكواشف على أنها كواشف تجارية متوافقة مع النظام. يتم تحديد هذه الكواشف و / أو توفيرها من قبل الشركة المصنعة وتصميمها لتكون متوافقة مع النظام. التعديلات ممكنة ومحددة في المناقشة ولكنها قد تتطلب اختبارات إضافية وغسيل السوائل لمنع التراكم. سيحسب البرنامج الحجم الإجمالي للكواشف المطلوبة بعد تصميم اللوحة والبروتوكول وإدخالها. ومع ذلك ، يتم تقديم التعديلات الموصى بها. سيختلف الحجم الإجمالي دائما بناء على عدد الدورات والأهداف المستخدمة لكل بروتوكول. ومع ذلك ، لن يتم حساب الأجسام المضادة وتخفيفات الحمض النووي الريبي-ISH بواسطة النظام ما لم يتم إدخال كل مجموعة فردية كعنصر فريد في قاعدة البيانات. بالنسبة لهذا البروتوكول ، يلزم 400 ميكرولتر من كوكتيل الأجسام المضادة لكل شريحة عينة.

  1. إعداد النظام
    1. قبل seqRNA-ISH + seqIF ، اغسل جميع الموائع الدقيقة جيدا بالماء الخالي من النوكلياز.
    2. رش خارج النظام بمحلول إزالة التلوث من RNAse ، متبوعا ب 70٪ إيثانول.
  2. تحضير الكواشف العامة
    1. مخزن الغسيل: 50 مل من المخزن المؤقت متعدد التلوين المتوافق مع نظام 20x + 950 مل من الماء منزوع الأيونات الخالي من النوكلياز
    2. الماء: 100 مل من الماء منزوع الأيونات الخالي من النوكلياز.
    3. الإيثانول: 100 مل من 70٪ إيثانول.
    4. المخزن المؤقت للتصوير: 16 مل من محلول التصوير التجاري المتوافق مع النظام 10x + 140 مل من الماء منزوع الأيونات الخالي من النويكلياز + 4 مل من مخزون التصوير التجاري المتوافق مع النظام.
    5. المخزن المؤقت للشطف: 152 من محلول الشطف المتوافق مع النظام ، التجاري ، حل الشطف 1 + 8 متوافق مع النظام ، التجاري ، حل الشطف 2
    6. عازلة التبريد: 130 مل من الماء منزوع الأيونات الخالي من النوكلياز + 14 مل من محلول التبريد المتوافق مع النظام ، التجاري ، 1 + 16 مل من محلول التبريد المتوافق مع النظام ، التجاري ، 2.
  3. تحضير كواشف التلوين لبروتوكول RNA-ISH
    ملاحظة: يمكن إكمال هذه الخطوة في الليلة السابقة وتخزينها عند 4 درجات مئوية في الظلام. بينما تنص توصيات الشركة المصنعة على أنه يمكن استخدام المجسات المجمعة لمدة تصل إلى عام واحد ، لا يوصى بتجميع المجسات قبل أكثر من أسبوع من الموعد المحدد بسبب مخاوف التلوث. بالنسبة للمجسات ، من الأفضل النقر أو الماصة برفق لأعلى ولأسفل لخلطها وطردها برفق لتدور لأسفل قبل الاستخدام.
    1. محلول نفاذية متوافق مع نظام التحميل ، تجاري ، خال من البروتيناز عند 500 ميكرولتر لكل شريحة في أنبوب طرد مركزي دقيق متوافق مع النظام.
    2. مكبرات الصوت RNA-ISH على أساس الدورة (الجدول 1) لما مجموعه 500 ميكرولتر لكل شريحة لكل من كل مما يلي في أنبوب طرد مركزي دقيق متوافق مع النظام: أنا) أشجار الذيل ZZ لذيول T1 إلى T4 ، ثانيا) أشجار الذيل ZZ لذيول T5 إلى T8 ، ثالثا) أشجار ذيل ZZ لذيول T9 إلى T 12.
    3. شجرة ذيل البركة الخاصة ، مطابقة مكبر الصوت ، الفلوروفورات بإجمالي 500 ميكرولتر لكل شريحة لكل شريحة لكل مما يلي في أنبوب طرد مركزي دقيق متوافق مع النظام: أنا) الفلوروفور للشجرة T1 إلى T4 ، ب) الفلوروفور للشجرة T5 إلى T8 ، ثالثا) الفلوروفور ل T9 إلى T 12.
      ملاحظة: هذه الخطوة حساسة للضوء
    4. قم بإعداد 1 مل من تخفيف 1: 200 من DAPI التجاري (تركيز المخزون 1 مجم / مل) في مخزن مؤقت تجاري متعدد التلوين مصنوع من ماء منزوع الأيونات خال من النويكلياز لكل شريحة
      ملاحظة: تم تنفيذ الإجراء وفقا للشركة المصنعة ، والتي تتضمن DAPI كجزء من الكواشف القياسية. في حالة استخدام تركيبات مخصصة من DAPI المخففة في N و N-Dimethylformamide (DMF) ، فقد تختلف التخفيفات ، وسيتعين إجراء اختبارات المعايرة بالتحليل الحجمي. ومع ذلك ، يوصى باستخدام تركيز حوالي 1: 1000-1: 2000 من تركيز مخزون 1 مجم / مل. عادة ما يكون هذا بتركيز أعلى من المعتاد من بروتوكولات التلوين اليدوية ، حيث يجب أن يستمر خلال جولات متعددة من التصوير والتجريد. تميل تركيبات DAPI الطازجة في DMF إلى أن تكون أكثر إشراقا من تركيبات DAPI المتاحة تجاريا. يجب تخصيص الكواشف التي تحتوي على الفورماميد ، مثل DAPI ، تحت غطاء دخان كيميائي. يمكن أن يسبب الفورماميد سمية تكاثرية وتلف في الأعضاء ويشتبه في أنه مسرطن. استخدم معدات الوقاية الشخصية المناسبة (مثل القفازات ومعطف المختبر).
    5. قم بإعداد المخزن المؤقت للتصوير RNA-ISH مباشرة قبل الاستخدام مع 12.125 ماء منزوع الأيونات خال من النوكلياز ، و 1.5 مل من مخزون التصوير المؤقت 10x B و 275 ميكرولتر من 40x Imaging Buffer Storage A (مذاب أو مصنوع حديثا)
    6. قم بإعداد ما يصل إلى 10 أزواج من الأجسام المضادة الأولية (الأجسام المضادة البروتينية الأولية موضحة في الجدول 2) ل seqIF وفقا للتخفيفات التي تم اختبارها بالتحليل الحجمي في المخزن المؤقت التجاري متعدد التلوين بإجمالي 400 ميكرولتر لكل شريحة في أنبوب طرد مركزي دقيق متوافق مع النظام. تأكد من أن كل دورة من seqIF تحتوي على جسم مضاد أساسي واحد فقط لكل نوع مضيف.
    7. تحضير الفلوروفورات الثانوية (الجدول 3) بالإضافة إلى DAPI وفقا لتوليفات الأجسام المضادة الأولية في الخطوة 6.3.7 ل seqIF وفقا للتخفيفات التي تم اختبارها بالتحليل الحجمي. مخفف في مخزن مؤقت متعدد التلوين بإجمالي 400 ميكرولتر لكل دورة في أنبوب مخروطي 50 مل بحجم ميت لا يقل عن 1 مل. أمثلة على تركيزات الأجسام المضادة الثانوية Alexa Fluor و DAPI هي كما يلي: تخفيف 1: 200 ل Alexa Fluor 555 ، تخفيف 1: 400 ل Alexa Fluor 647 ، تخفيف 1: 1800 ل DAPI (من 1 مجم / مل DAPI في DMF)
      ملاحظة: هذه الخطوة حساسة للضوء. لا تتوافق إضافة DAPI إلى الثانوية مع بروتوكول الشركة المصنعة ، حيث يمكن أن تساعد في الحفاظ على تعبير DAPI خلال دورات متعددة من seqIF ، مما يساعد في محاذاة الصور بعد التشغيل. تستخدم معظم برامج معالجة الصور ، مثل تلك المضمنة في هذا النظام ، إشارة DAPI لتأكيد محاذاة التصوير الدوري للتوطين المشترك للفلورسنت.
  4. تهيئة النظام
    1. قم بتحميل كل من الكواشف من الخطوة 6.3 بالترتيب المحدد بواسطة النظام. لاحظ أن الترتيب بشكل عام سيكون على النحو الوارد أعلاه ، ولكن تأكد دائما من تطابق الكواشف مكان تحميلها
    2. قم بتحميل شريحة المستضد المسترجعة في الحامل وتأكد من محاذاة نافذة تصوير الشريحة في وسط مساحة التصوير قبل وضع شريحة الموائع الدقيقة المتوافقة مع النظام في الأعلى وتثبيتها في مكانها.
      ملاحظة: يمكن إعادة استخدام رقائق الموائع الدقيقة لاختبارات المعايرة بالتحليل الحجمي seqIF إذا تم تنظيفها وتخزينها بشكل مناسب لمدة تصل إلى مرة إضافية واحدة، طالما ظلت الحشوات سليمة. لا يمكن إعادة استخدام رقائق الموائع الدقيقة في حالة تشغيل لوحة الحمض النووي الريبي بسبب التلوث المحتمل.
    3. قم بإعداد محلول الشق عن طريق خلط 1.35 مل من 4x SSC و 150 مل من محلول الشق التجاري 10x.
      ملاحظة: يتأكسد محلول الشق 10x بسرعة ويتم تخزينه في أمبولة زجاجية يجب كسرها مباشرة قبل استخدامها في التشغيل التجريبي seqRNA-ISH + seqIF.

7. تشغيل النظام

  1. قم بتشغيل النظام وفقا لتعليمات الشركة المصنعة ، وأوقات التشغيل التقريبية لشريحتين في 12 plex seqRNA-ISH مع 20 plex protein seqIF هي 48 ساعة لنافذة تصوير مقاس 12.5 سم × 12.5 سم.
  2. بعد اكتمال تشغيل seqRNA-ISH + seqIF ، يمكن إزالة الشريحة وتخزينها في 1x PBS أو استخدامها على الفور للحصول على seqIF إضافي (لما يصل إلى 40 بروتينا).
    ملاحظة: من المهم تنظيف وتنظيف الموائع الدقيقة للنظام باستخدام الماء الخالي من النوكلياز قبل وبعد كل تشغيل لتقليل احتمالية التلوث.

8. اختياري: الصورة والتحليل الإحصائي

  1. تابع التحليل الإحصائي والصور عبر تحليل الصور أو أدوات تحليل علم الأمراض.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

كمثال على هذه الطريقة ، قمنا بتشغيل seqRNA-ISH التالي (الجدول 1) + SeqIF (الجدول 2 والجدول 3) على شريحتين من سرطان المبيض المصلي البشري عالي الجودة.

يوضح الشكل 2 تراكب seqRNA-ISH + seqIF على عينة من أنسجة ورم المبيض. تستخدم علامات البروتين الهيكلية مثل الكولاجين 1 لتحديد مناطق الورم ، بينما تساعد علامات النمط الظاهري والوظيفي مثل CD33 و CD8 و Granzyme B (GZMB) في تمييز الخلايا المناعية المحددة الضرورية لفهم البيئة...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الخطوة الأكثر أهمية في تحضير العينات والتعامل معها هي تقليل تلوث الحمض النووي الريبي. يمكن تحقيق ذلك من خلال استخدام الأقنعة لمنع التلوث من التنفس ومسح أسطح العمل بمحلول إزالة التلوث RNase و 70٪ من الإيثانول المصنوع من الماء الخالي من النوكلياز. بالنسبة لشرائح FFPE ، من الأفضل قص شرائح متعددة مجاورة من كتل FFPE ل seqRNA-ISH + seqIF وتخزينها عند 4 درجات مئوية مع المجفف. لمراقبة الجودة ، بالإضافة إلى اختبار DV200 لكتل الأنسجة ، يوصى بتشغيل شريحة التحكم الإيجابية للحمض النووي الريبي (UBC ، ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم تمويل هذا البحث جزئيا من قبل تحالف أبحاث سرطان المبيض (OCRA 811621 و 891490) ، ومؤسسة Sie ، وصندوق Stephanie C. Stelter Endowment. تم إجراء هذا البحث بالتعاون مع المنشأة الأساسية لقياس التدفق الخلوي والتصوير الخلوي ، والتي تدعمها جزئيا المعاهد الوطنية للصحة من خلال منحة دعم مركز السرطان في إم دي أندرسون P30 CA016672 وأخصائي أبحاث جاريد بيركس في المعهد الوطني للسرطان 1 R50 CA243707-01A1.

نود أيضا أن نشكر إميلي مارترستيك من Lunaphore على المساعدة الفنية والتدريب.

تلقى المؤلف (المؤلفون) مجموعة من مجسات RNAScope المستهدفة والتحكم كجزء من برنامج الوصول المبكر من Bio-Techne بسعر مخفض ، وتم توفير بعض الكواشف مجانا لاستخدامها في هذه الدراسة. لم يكن للشركة المصنعة أي دور في تصميم الدراسة أو جمع البيانات وتحليلها أو إعداد المخطوطة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
4 '، 6-دياميدينو-2-فينيليندول (DAPI)ثيرمو فيشر العلمي / المفيثEN62248 / 62248بالنسبة للتلطيخ النووي (المنتج المستخدم خلال هذه الدراسة ، تم إيقاف 62247)
50 مل أنابيب الطرد المركزي المخروطية المعقمة البولي بروبلينثيرمو فيشر العلمي339652تستخدم ل aliquots & الحلول الثانوية المختلطة
70٪ كحول إيزوبروبانول معقمتيكسوايبتي إكس 3270لإزالة التلوث السطحي
الاجسام المضادهمختلفمختلفيستخدم للأهداف الأساسية ، ويختلف بناء على القناة المستخدمة
APOE -- المضيف: الماوس ، استنساخ : 960318آر آند DMAB41443-100(ملاحظة: خاصة بهذه الدراسة) الأجسام المضادة للبروتين الأساسي
aSMA - المضيف: الماوس، الاستنساخ: 1A4CST69319SF(ملاحظة: خاصة بهذه الدراسة) الأجسام المضادة للبروتين الأساسي
قطع أوتوماتيكي ميكروتوملايكا14051956472تقسيم الأنسجة
CD10 -- المضيف: أرنب ، استنساخ: E5P7SCST65534 ثانية(ملاحظة: خاصة بهذه الدراسة) الأجسام المضادة للبروتين الأساسي
CD11c - المضيف: أرنب ، استنساخ: D3V1ECST93233SF(ملاحظة: خاصة بهذه الدراسة) الأجسام المضادة للبروتين الأساسي
CD163 - المضيف: أرنب ، استنساخ: D6U1JCST93498 ثانية(ملاحظة: خاصة بهذه الدراسة) الأجسام المضادة للبروتين الأساسي
CD163 -- المضيف: أرنب ، استنساخ: ja51-30إنفيتروجينMA5-32684(ملاحظة: خاصة بهذه الدراسة) الأجسام المضادة للبروتين الأساسي
CD20 - المضيف: الماوس ، الاستنساخ: L26بيثيلA500-017ACF(ملاحظة: خاصة بهذه الدراسة) الأجسام المضادة للبروتين الأساسي
CD31 - المضيف: الماوس ، استنساخ : 3F8E2بروتين تك66065-2-آي جي(ملاحظة: خاصة بهذه الدراسة) الأجسام المضادة للبروتين الأساسي
CD33 -- المضيف: أرنب ، استنساخ: BLR061GبيثيلA700-061CF(ملاحظة: خاصة بهذه الدراسة) الأجسام المضادة للبروتين الأساسي
CD4 - المضيف: أرنب ، استنساخ: EPR6855أبكامأب181724(ملاحظة: خاصة بهذه الدراسة) الأجسام المضادة للبروتين الأساسي
CD45 - المضيف: أرنب ، استنساخ: BL-178-12C7بيثيلأ700-012(ملاحظة: خاصة بهذه الدراسة) الأجسام المضادة للبروتين الأساسي
CD45RO - المضيف: الماوس ، الاستنساخ: UCHL1بيثيلA500-020ACF(ملاحظة: خاصة بهذه الدراسة) الأجسام المضادة للبروتين الأساسي
CD56 - المضيف: أرنب ، استنساخ: BLR152Jبيثيل99746(ملاحظة: خاصة بهذه الدراسة) الأجسام المضادة للبروتين الأساسي
CD66b - المضيف: أرنب ، استنساخ: BLR111HإنفيتروجينMA5-44413(ملاحظة: خاصة بهذه الدراسة) الأجسام المضادة للبروتين الأساسي
CD68 -- المضيف: الماوس ، استنساخ : KP-1بيوليجند916104(ملاحظة: خاصة بهذه الدراسة) الأجسام المضادة للبروتين الأساسي
CD8 - المضيف: الماوس ، الاستنساخ: C8 / 144Bبيوليجند372902(ملاحظة: خاصة بهذه الدراسة) الأجسام المضادة للبروتين الأساسي
CD86 - المضيف: أرنب ، استنساخ: E2G8PCST76755SF(ملاحظة: خاصة بهذه الدراسة) الأجسام المضادة للبروتين الأساسي
العمود 1A1 - المضيف: الماوس ، الاستنساخ: E3E1XCST66948 ثانية(ملاحظة: خاصة بهذه الدراسة) الأجسام المضادة للبروتين الأساسي
أنابيب الحمض النووي LoBind 2 ملإيبندورف22431048تستخدم لحلول مسبار الحمض النووي الريبي المختلطة
Drierite 21005 يشير إلى المجففكول بالمر21005مجفف للمجفف
شفرات Edge-Rite Microtomeثيرمو فيشر العلمي / Invitrogen4280 لترعلم الأنسجة - يستخدم عند تقسيم العينات
كحول إيثيلي 100٪ (200 دليل)فارمكو111000200لإزالة البارافين
EZ-AR2 العازلة الأناقةبيوجينكسHK547-XAKتستخدم لاسترجاع مستضد أقسام أنسجة FFPE
FOXP3 - المضيف: أرنب ، استنساخ: متعدد النسيلةبيثيلأ 700-034 سي إف(ملاحظة: خاصة بهذه الدراسة) الأجسام المضادة للبروتين الأساسي
ماعز مضاد للفأر IgG (H + L) Alexa Fluor 555ثيرمو فيشر العلمي / المفيثأ -21425(ملاحظة: خاصة بهذه الدراسة) F (ab') 2-Goat المضادة للفأر IgG (H + L) الأجسام المضادة الثانوية الممتزة عبر ، أليكسا فلور والتجارة ؛ 555
الماعز المضادة للفأر IgG (H + L) Alexa Fluor 647ثيرمو فيشر العلمي / المفيثأ - 48289 / أ - 21237(ملاحظة: خاصة بهذه الدراسة) F (ab') 2-Goat المضادة للفأر IgG (H + L) الأجسام المضادة الثانوية الممتزة عبر ، أليكسا فلور والتجارة ؛ زائد 647
الماعز المضادة للأرانب IgG (H + L) Alexa Fluor 555ثيرمو فيشر العلمي / المفيثأ -21430(ملاحظة: خاصة بهذه الدراسة) F (ab') 2-Goat المضادة للأرانب IgG (H + L) الأجسام المضادة الثانوية الممتزة ، Alexa Fluor ™ 555
الماعز المضادة للأرانب IgG (H + L) Alexa Fluor 647ثيرمو فيشر العلمي / المفيثأ -21246(ملاحظة: خاصة بهذه الدراسة) F (ab') 2-Goat المضادة للأرانب IgG (H + L) الأجسام المضادة الثانوية الممتزة ، Alexa Fluor ™ 647
GZMB - المضيف: أرنب ، استنساخ: متعدد النسيلةبروتين تك13588-1-AP(ملاحظة: خاصة بهذه الدراسة) الأجسام المضادة للبروتين الأساسي
HS-POLR2A-T1ACD Biotechne310457-T1مسبار التعبير البشري المنخفض
HS-PPIB-T5ACD Biotechne313907-ت5التحكم في مسبار التعبير البشري المتوسط
HS-UBC-T9ACD Biotechne310047-T9تحكم بشري عالي في التعبير
محلول بيروكسيد الهيدروجين 30٪سيجما ألدريتشHX0640-5لتحضير الأنسجة. يساعد على منع نشاط البيروكسيديز الداخلي وإنتاج منتجات عالية الألوان. لصنع محلول بيروكسيد الهيدروجين 3٪
Ker8/18 - المضيف: الماوس ، الاستنساخ: متعدد النسيلةبروتين تك66187-1-PBS(ملاحظة: خاصة بهذه الدراسة) الأجسام المضادة للبروتين الأساسي
LRP5 - المضيف: أرنب ، استنساخ: HPA030505سيغماHPA030505-100 لتر(ملاحظة: خاصة بهذه الدراسة) الأجسام المضادة للبروتين الأساسي
Lunaphore 20x Multistaining Bufferبيو تكنيبو 06تستخدم كمخفف ولغسيل المذنب
رقاقة المذنب Lunaphoreبيو تكنيعضو الكنيست 03رقاقة mcirofluidics لأداة المذنب
مذنب Lunaphoreبيو تكنيسم 10 - إسSeq-IF autostainer
Lunaphore Elution Buffer Kitبيو تكنيBU07-Lالحل 1 & الحل 2 لخطوات شطف المذنب
Lunaphore Imaging Buffer Kitبيو تكنيبو 09مذاب و مذيب يستخدم للتصوير أثناء تشغيل المذنب
Lunaphore التبريد المخازن المؤقتةبيو تكنيBU08-Lالحل 1 & الحل 2 لخطوات التبريد في المذنب
ماصة دقيقةمختلفغير متاحلتحضير الكاشف
Periostin - المضيف: الماوس ، استنساخ: 1A11A3بروتين تك66491-1-PBS(ملاحظة: خاصة بهذه الدراسة) الأجسام المضادة للبروتين الأساسي
بيرس 16٪ فورمالديهايد (وزن / حجم) ، خالي من الميثانولثيرمو فيشر العلمي28908لعمل 3.7٪ PFA لتحضير الأنسجة
مدخل 320102 المسبار (قناة T2)ACD Biotechne300040التحكم السلبي DapB في T2
مسبار 320102 في (قناة T3)ACD Biotechne300040التحكم السلبي DapB في T3
مدخل 320102 المسبار (قناة T4)ACD Biotechne300040التحكم السلبي DapB في T4
RNAscope HiPlex حل المخزون الشقبيو تكنيالسعر 324399كاشف للشق أثناء مقايسة RNASكوب
RNAscope HiPlex Pro للمذنب 12 plex ، 20 شريحةبيو تكني322075الكواشف المخازن المؤقتة ل RNAScope
مسبار RNAscope HiPlex- Hs-APOE-T2ACD Biotechne433093-ت2(ملاحظة: خاصة بهذه الدراسة) الوصول المبكر RNAscope والتجارة. مسبار HiPlex CS- HS-APOE-T2
مسبار RNAscope HiPlex- HS-ARG1-T4ACD Biotechneهاتف 401581-ت4(ملاحظة: خاصة بهذه الدراسة) الوصول المبكر RNAscope والتجارة. مسبار HiPlex CS- HS-ARG1-T4
مسبار RNAscope HiPlex- HS-CD274-T1ACD Biotechne600863-T1(ملاحظة: خاصة بهذه الدراسة) الوصول المبكر RNAscope والتجارة. مسبار هاي بلكس سي إس - HS-CD274-T1
مسبار RNAscope HiPlex- HS-CD40-T6ACD Biotechneهاتف: 445973-ت6(ملاحظة: خاصة بهذه الدراسة) الوصول المبكر RNAscope والتجارة. مسبار HiPlex CS- HS-CD40-T6
مسبار RNAscope HiPlex- HS-CXCL1-01-T12ACD Biotechne1256473-T12(ملاحظة: خاصة بهذه الدراسة) الوصول المبكر RNAscope والتجارة. مسبار HiPlex CS- HS-CXCL1-01-T12
مسبار RNAscope HiPlex- HS-GZMB-T7ACD Biotechneهاتف: 468453-T7(ملاحظة: خاصة بهذه الدراسة) الوصول المبكر RNAscope والتجارة. مسبار هاي بلكس سي إس- HS-GZMB-T7
مسبار RNAscope HiPlex- HS-IFNG-T3ACD Biotechne310503-T3(ملاحظة: خاصة بهذه الدراسة) الوصول المبكر RNAscope والتجارة. مسبار HiPlex CS- Hs-IFNG-T3
مسبار RNAscope HiPlex- HS-IL23a-T8ACD Biotechneهاتف: 562853-ت8(ملاحظة: خاصة بهذه الدراسة) الوصول المبكر RNAscope والتجارة. مسبار هاي بلكس سي إس- HS-IL23a-T8
مسبار RNAscope HiPlex- HS-IL6-T9ACD Biotechne400883-T9(ملاحظة: خاصة بهذه الدراسة) الوصول المبكر RNAscope والتجارة. مسبار HiPlex CS- HS-IL6-T9
مسبار RNAscope HiPlex- HS-TNFa-T11ACD Biotechne310423-T11(ملاحظة: خاصة بهذه الدراسة) الوصول المبكر RNAscope والتجارة. مسبار HiPlex CS- HS-TNFa-T11
مسبار RNAscope HiPlex- Hs-VEGFa-T5ACD Biotechneهاتف: 423163-ت5(ملاحظة: خاصة بهذه الدراسة) الوصول المبكر RNAscope والتجارة. مسبار HiPlex CS- HS-VEGFa-T5
مسبار RNAscope HiPlex- HS-VISTA-T10ACD Biotechne491513-T10(ملاحظة: خاصة بهذه الدراسة) الوصول المبكر RNAscope والتجارة. مسبار هاي بلكس سي إس- إتش إس-فيستا-T10
مسبار التحكم السلبي RNAscope HiPlex12 CSACD Biotechne324347لوحة تحكم سلبية كاملة 12 plex موصى بها من قبل الشركة المصنعة. DapB في T1-T12.
RNAscope HiPlex12 CS مسبار التحكم الإيجابي-HSACD Biotechne324317لوحة تحكم إيجابية بشرية كاملة 12 plex موصى بها من قبل الشركة المصنعة. Hs -RTU لتتبع جين التدبير المنزلي في القنوات T1 إلى T12: Polr2a و PPIB و UBC و HPRT1 و TUBB و RPL28 و RPL5 و B2M و ACTB و LDHA-O1 و RPLP0-X-RPLP0P2 و GAPDH.
ماء خال من الحمض النووي الريبيكورنينج46-000-سملتنظيف وإعداد جميع المعدات ، واستخدامها كمخفف عند الضرورة
RNaseZap RNase حل إزالة التلوثثيرمو فيشر العلميAM9782محلول إزالة التلوث السطحي الذي يدمر RNases
طقم RNeasy FFPEكياجين73504 & 19093لاستخراج الحمض النووي الريبي & قياس DV200
الشريحة ميلرسimport العلميةM9504MAلتخزين الشرائح في المخزن المؤقت السائل.
التصميم الجراحي للأغراض العامة شفرة الحلاقة الصناعيةثيرمو فيشر العلمي / Invitrogen13-812-236علم الأنسجة - يستخدم عند تقسيم العينات
TOX 1/2 - المضيف: أرنب ، استنساخ: E613QCST62886SF(ملاحظة: خاصة بهذه الدراسة) الأجسام المضادة للبروتين الأساسي
الدرجة النسيجية الزيلينثيرمو فيشر العلميرقم 1307لإزالة البارافين

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Levine, E., Hwa, T. Small RNAs establish gene expression thresholds. Curr Opin Microbiol. 11 (6), 574-579 (2008).
  2. Ferri-Borgogno, S., et al. metabolic, and subcellular mapping of the tumor immune microenvironment via 3D targeted and non-targeted multiplex multi-omics analyses. Cancers (Basel). 16 (5), 846(2024).
  3. Carstens, J. L., et al. Spatial multiplexing and omics. Nat Rev Methods Primers. 4 (1), 1-12 (2024).
  4. Cossarizza, A., et al. Guidelines for the use of flow cytometry and cell sorting in immunological studies. Eur J Immunol. 47 (10), 1584-1797 (2017).
  5. Macosko, Z. E., et al. Highly parallel genome-wide expression profiling of individual cells using nanoliter droplets. Cell. 161 (5), 1202-1214 (2015).
  6. Nichols, A. E. C., et al. Impact of isolation method on cellular activation and presence of specific tendon cell subpopulations during in vitro culture. FASEB J. 35 (7), e21733(2021).
  7. Grünwald, D., Singer, R. H., Czaplinski, K. Methods Enzymol. , Elsevier. London. (2008).
  8. Kochan, J., Wawro, M., Kasza, A. Simultaneous detection of mRNA and protein in single cells using immunofluorescence-combined single-molecule RNA FISH. Biotechniques. 59 (4), 209-221 (2015).
  9. Shih, J. D., Waks, Z., Kedersha, N., Silver, P. A. Visualization of single mRNAs reveals temporal association of proteins with microRNA-regulated mRNA. Nucleic Acids Res. 39 (17), 7740-7749 (2011).
  10. Wang, F., et al. RNAscope. J Mol Diagn. 14 (1), 22-29 (2012).
  11. Zimmerman, S. G., Peters, N. C., Altaras, A. E., Berg, C. A. Optimized RNA ISH, RNA FISH and protein-RNA double labeling (IF/FISH) in Drosophila ovaries. Nat Protoc. 8 (11), 2158-2179 (2013).
  12. Meyer, C., Garzia, A., Tuschl, T. Simultaneous detection of the subcellular localization of RNAs and proteins in cultured cells by combined multicolor RNA-FISH and IF. Methods. 118-119, 101-110 (2017).
  13. Young, A. P., Jackson, D. J., Wyeth, R. C. A technical review and guide to RNA fluorescence in situ hybridization. PeerJ. 8, e8806(2020).
  14. Pemberton, J., Kala, S., Dikshit, A., Hupple, C. Regular and young investigator award abstracts. Thorax. 72 (Suppl 3), A1654(2017).
  15. Goltsev, Y., et al. Deep profiling of mouse splenic architecture with CODEX multiplexed imaging. Cell. 174 (4), 968-981.e15 (2018).
  16. Cheng, Y., Burrack, R. K., Li, Q. Spatially resolved and highly multiplexed protein and RNA in situ detection by combining CODEX with RNAscope in situ hybridization. J Histochem Cytochem. 70 (8), 571-581 (2022).
  17. Pourmaleki, M., et al. Tumor MHC class I expression associates with intralesional IL-2 response in melanoma. Cancer Immunol Res. 10 (3), 303-313 (2022).
  18. Johnstone, R. W., Andrew, S. M., Hogarth, M. P., Pietersz, G. A., McKenzie, I. F. C. The effect of temperature on the binding kinetics and equilibrium constants of monoclonal antibodies to cell surface antigens. Mol Immunol. 27 (4), 327-333 (1990).
  19. Porichis, F., et al. High-throughput detection of miRNAs and gene-specific mRNA at the single-cell level by flow cytometry. Nat Commun. 5 (1), 5641(2014).
  20. Hu, K., Harman, A., Baharlou, H. Imaging mass cytometry for in situ immune profiling. Methods Mol Biol. 2779, 407-423 (2024).
  21. Rivest, F., et al. Fully automated sequential immunofluorescence (seqIF) for hyperplex spatial proteomics. Sci Rep. 13 (1), 1-10 (2023).
  22. Sans, M., et al. Spatial transcriptomics of intraductal papillary mucinous neoplasms of the pancreas identifies NKX6-2 as a driver of gastric differentiation and indolent biological potential. Cancer Discov. 13 (8), 1844-1861 (2023).
  23. Hoyt, C. C. Multiplex immunofluorescence and multispectral imaging: forming the basis of a clinical test platform for immuno-oncology. Front Mol Biosci. 8, 1-12 (2021).
  24. Masuda, N., Ohnishi, T., Kawamoto, S., Monden, M., Okubo, K. Analysis of chemical modification of RNA from formalin-fixed samples and optimization of molecular biology applications for such samples. Nucleic Acids Res. 27 (22), 4436-4443 (1999).
  25. Srinivasan, M., Sedmak, D., Jewell, S. Effect of fixatives and tissue processing on the content and integrity of nucleic acids. Am J Pathol. 161 (6), 1961-1971 (2002).
  26. Bingham, V., et al. RNAscope in situ hybridization confirms mRNA integrity in formalin-fixed, paraffin-embedded cancer tissue samples. Oncotarget. 8 (55), 93392-93403 (2017).
  27. Matsubara, T., et al. DV200 index for assessing RNA integrity in next-generation sequencing. Biomed Res Int. 2020 (1), 1-6 (2020).
  28. Davis, A. S., et al. Characterizing and diminishing autofluorescence in formalin-fixed paraffin-embedded human respiratory tissue. J Histochem Cytochem. 62 (6), 405-423 (2014).
  29. Jenvey, C. J., Stabel, J. R. Autofluorescence and nonspecific immunofluorescent labeling in frozen bovine intestinal tissue sections: solutions for multicolor immunofluorescence experiments. J Histochem Cytochem. 65 (9), 531-541 (2017).
  30. Walters, D. K., Jelinek, D. F. Multiplex immunofluorescence of bone marrow core biopsies: visualizing the bone marrow immune contexture. J Histochem Cytochem. 68 (2), 99-112 (2020).
  31. Zoppolato, E., et al. Optimized immunofluorescence for liver structure analysis: enhancing 3D resolution and minimizing tissue autofluorescence. Biol Methods Protoc. 10 (1), 1-12 (2025).
  32. Zhang, Y., et al. Spectral characteristics of autofluorescence in renal tissue and methods for reducing fluorescence background in confocal laser scanning microscopy. J Fluoresc. 28 (2), 561-572 (2018).
  33. Suresh, S., O'Donnell, K. A. Translational control of immune evasion in cancer. Trends Cancer. 7 (7), 580-582 (2021).
  34. Ferri-Borgogno, S., et al. Spatial transcriptomics depict ligand-receptor cross-talk heterogeneity at the tumor-stroma interface in long-term ovarian cancer survivors. Cancer Res. 83 (9), 1503-1516 (2023).
  35. Croce, A. C., Bottiroli, G. Autofluorescence spectroscopy and imaging: a tool for biomedical research and diagnosis. Eur J Histochem. 58 (4), 1-12 (2014).
  36. Croce, A. C., Bottiroli, G. New light in flavin autofluorescence. Eur J Histochem. 59 (4), 1-10 (2015).
  37. Dubois, L., Andersson, K., Asplund, A., Björkelund, H. Evaluating real-time immunohistochemistry on multiple tissue samples, multiple targets and multiple antibody labeling methods. BMC Res Notes. 6 (1), 542(2013).
  38. Chen, A. K., Cheng, Z., Behlke, M. A., Tsourkas, A. Assessing the sensitivity of commercially available fluorophores to the intracellular environment. Anal Chem. 80 (19), 7437-7444 (2008).
  39. Krenacs, L., Krenacs, T., Stelkovics, E., Raffeld, M. Methods Mol Biol. , Humana Press. New York. (2010).
  40. Weber, J., Peng, H., Rader, C. From rabbit antibody repertoires to rabbit monoclonal antibodies. Exp Mol Med. 49 (3), e305(2017).
  41. Marlin, M. C., et al. A novel process for H&E, immunofluorescence, and imaging mass cytometry on a single slide with a concise analytics pipeline. Cytometry A. 103 (12), 1010-1018 (2023).
  42. Duncan, J. S., Elliott, K. L., Kersigo, J., Gray, B., Fritzsch, B. situ hybridization methods. , Springer. New York, NY. (2015).
  43. Kersigo, J., et al. An RNAscope whole mount approach that can be combined with immunofluorescence to quantify differential distribution of mRNA. Cell Tissue Res. 374 (2), 251-262 (2018).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

مقالات ذات صلة