مقالة منهجية

رسم الخرائط الجزيئي ثنائي الطريقة: دمج الكشف عن mRNA المتعدد مع قياس الخلايا الكتلي لتصوير البروتين

DOI:

10.3791/68616

⸱

نوفمبر 14, 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Gynecologic Oncology and Reproductive Medicine, The University of Texas MD Anderson Cancer Center, 2Department of Hematopoietic Biology & Malignancies, The University of Texas MD Anderson Cancer Center, 3Department of Leukemia, The University of Texas MD Anderson Cancer Center

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يوضح هذا البروتوكول بالتفصيل منهجية للكشف عن mRNA متعدد الإرسال باستخدام قياس الخلايا الكتلية لتصوير البروتين في أقسام الأنسجة المضمنة بالبارافين الثابت للفورمالين.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تساعدنا القدرة على اكتشاف البروتين والحمض النووي الريبوزي المرسال في نفس الفحص على فهم كيفية استعداد الخلية للوصول وما هي الإشارات التي تتلقاها أثناء انتقالها وتفاعلها في البيئة التي تجد نفسها فيها. يسمح التصوير عالي الإرسال الآن بتوصيف mRNA (النسخ المكانية) والبروتين (البروتينات المكانية) التي تم حلها مكانيا في وقت واحد. لتجنب التكرار ، يمكن تحليل هذه التحليلات في قسم واحد من الأنسجة. هناك العديد من التقنيات التي تسمح بالعديد من البروتينات وعدد قليل من mRNAs أو العكس ، ولكن نظرا لأن التحليلات المركزية المؤثرة هي بروتينات ، فإن هذه المخطوطة تركز على دمج قياس الكتلة الخلوية لتصوير البروتين (IMC) مع التهجين المرسال في الموقع (ISH) باستخدام مجسات معدنية. يتيح لنا ذلك فهم الرسائل التي تقوم الخلية بتجهيزها أو ترسلها بسرعة إلى العالم أثناء تواصلها في بيئتها المكروية. كما أنه يتغلب على القيود المتعلقة بالكشف عن البروتينات المفرزة أو العلامات الصعبة التي يصعب عادة تحديدها وتصورها باستخدام الأجسام المضادة فقط. يقلل هذا البروتوكول أيضا من الحاجة إلى التعويضات أو المعالجة اللاحقة التي تظهر في الطرق القائمة على الفلورسنت العالي ، حيث لا يوجد امتداد طيفي فلوري في نظام الكشف القائم على المسبار المعدني ، ولا توجد اعتبارات تألق ذاتي خاصة بالأنسجة.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تظهر السرطانات تنوعا هيكليا ووظيفيا لدى مختلف المرضى. البيئة المكروية للورم (TME) ، المكونة من خلايا طبيعية وخبيثة ، غير متجانسة بين المرضى. ينتج ورم خبيث عن هروب بقايا من الورم الأولي إلى مجرى الدم كمجموعات خلوية وخلايا مفردة ، مما يوفر أدلة حول تطور المرض والاستجابة العلاجية1،2. يجب فهم تعقيد هذه البيئات الدقيقة1. على الرغم من أن الأورام تشتمل على أنواع وافرة من الخلايا ، إلا أن المعيار السريري يعتمد من الناحية النسيجية على علامة واحدة ، والتي بدأت في التغيير1،2. أعطت تقنيات التصوير المتعدد اتجاهات جديدة في علم الأمراض. أصبحت البروتينات التي تم حلها مكانيا ، وعلم الجينوم ، والتمثيل الغذائي ، والدهون للسرطانات البشرية ممكنة الآن بدقة الخلية المفردة أو بالقرب منها3،4،5،6.

يمكن لهذه التقنيات تشريح المواقع الخلوية غير المتجانسة والتفاعلات في الأورام. يسمح استخدام منهجية التصوير الحيوي أحادية الخلية المناسبة بإنشاء ملفات تعريف للعديد من المؤشرات الحيوية البروتينية المرتبطة بالمرض في خزعات المريض لإبلاغ تصميم علاجات السرطان. ستكون الرؤى من الخرائط الخلوية المكانية قادرة على توجيه اختيار العلاج المركب الذي يمكنه القضاء بكفاءة على السرطانات مع تقليل الأهداف والمقاومة والانتكاس1. الخلاف هو القدرة على توحيد هذه التقنيات المتنوعة العديدة التي لا تعمل عادة في وئام على نفس قسم الأنسجة7. يوفر هذا البروتوكول ، الموضح بصريا في الشكل 1 ، الفرصة لفحص كل من البروتينات ومجموعة فرعية مستهدفة من mRNAs في نفس قسم الأنسجة ونفس الخلية في وقت واحد في ضجة أعلى مما هو ممكن مع البروتين الفلوري المتزامن + RNA-ISH8. يمكن أن يكون هذا أيضا بمثابة جسر للتحليل الموازي3،4،6 ، بهدف فك تعقيد تحليل البيانات. أثناء وجود الكشف المزدوج ، يمكن للمرء أيضا فحص الخلايا التي بدأت إنتاج mRNA بسرعة ، ولكن يظل البروتين المفرز غير قابل للاكتشاف بسبب الحساسية المحدودة ونقص تضخيم الإشارة المتأصل في طرق الأجسام المضادة الأولية المسماة مباشرة ، مما يجعل اكتشاف الجزيئات المفرزة أمرا صعبا بشكل خاص. تم تكييف البروتوكول التالي من الكشف الفلوري / الكروموجينيك 12 ضفرة ليكون قابلا للتطبيق للكشف القائم على المعادن عبر مجسات معدلة مخفضة بالثيول للكشف المتزامن في IMC.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يستخدم هذا البروتوكول أنسجة البارافين الثابتة بالفورمالين (FFPE) التي تم جمعها من المرضى الذين لم يعالجوا سابقا ويخضعون لجراحة اختزال الخلايا الأولية لسرطان المبيض المصلي عالي الدرجة. تم الحصول على جميع البيانات السريرية من مستودع قسم الأورام النسائية والطب التناسلي بموجب البروتوكولات المعتمدة من قبل مجلس المراجعة المؤسسية بجامعة تكساس إم دي أندرسون. تم الحصول على موافقة خطية مستنيرة من المرضى ، وأجريت الدراسات وفقا للمبادئ التوجيهية الأخلاقية المعترف بها.

1. الاحتياطات والاستعدادات

  1. استخدم دائما الماء الخالي من النوكلياز (NFW) لتحضير جميع الكواشف المطلوبة.
  2. قم بتنفيذ جميع الخطوات باستخدام عبوات بلاستيكية وبدون استخدام الزجاج لتقليل ارتباط المعدن بتلوث الزجاج والمعادن.
  3. حافظ على نظافة منطقة العمل للغاية ورش الأسطح والماصات بمحلول إزالة التلوث RNase، متبوعا ب 70٪ من الإيثانول المحضر باستخدام NFW.
  4. مجسات الكشف عن mRNA المتقارن (T1-T12) إلى المعادن المناسبة عبر رابط ماليميد كما هو موضح من قبل Schulz et al7 ، وهو مفصل بمزيد من التفصيل في protocol.io في جدول المواد.
    ملاحظة: يجب اختيار أهداف البروتين للإشارة إلى موقع الخلية داخل الأنسجة (العلامات الهيكلية) ، وتحديد الخلايا الموجودة (علامات النمط الظاهري) ، وماذا تفعل الخلايا (العلامات الوظيفية). نظرا لأن بعض العلامات الوظيفية يتم التعبير عنها بشكل عابر ، فإن إدراج أهداف mRNA يسمح بتحديد الخلايا التي تولد هذه الأهداف.

2. تحضير العينة والمعالجة المسبقة

  1. تخبز أجزاء المناديل طوال الليل في فرن جاف على حرارة 60 درجة مئوية.
  2. قم بإجراء إزالة البارافين: ثلاث جولات من الزيلين لمدة 5 دقائق لكل جولة ، و 10 جولات من إعادة الجفاف (100٪ إيثانول (EtOH) × 2 ، 95٪ EtOH × 2 ، 70٪ EtOH × 2 ، 50٪ EtOH × 2 ، 30٪ EtOH x2) ، لمدة 3 دقائق لكل جولة. يغسل بمحلول ملحي 1x (TBS) لمدة دقيقتين مرة واحدة. وفقا لعدد العينات التي تتم معالجتها في نفس الوقت ، استخدم أنابيب مخروطية سعة 50 مل (2 شريحة كحد أقصى) أو 350 مل أشرطة تلطيخ IHC (24 شريحة كحد أقصى).
    ملاحظة: خطوة إزالة الشمع هذه ، على الرغم من أنها موصى بها ، اختيارية وتعتمد على نوع الأنسجة.
  3. ضع محلولا يحتوي على 3.7٪ بارافورمالديهايد (PFA) لمدة 10 دقائق عن طريق احتضان شرائح الأنسجة في أنبوب سعة 50 مل مع محلول PFA كاف لتغطية قسم الأنسجة.
  4. استرجاع المستضد الناجم عن الحرارة (HEIR) باستخدام الميكروويف: باستخدام ميكروويف مراقب لدرجة الحرارة ، املأ صينية واحدة بمخزن استرجاع مستضد الأس الهيدروجيني 6 HEIR (350 مل) والصواني المتبقية ب NFW. ضع أقسام الأنسجة في رف تلطيخ لشرائح المجهر وأضفها إلى الدرج باستخدام مخزن استرجاع المستضد.
    ملاحظة: عند إجراء استرجاع المستضد ، تأكد من أن المخزن المؤقت لاسترجاع المستضد في درجة حرارة الغرفة (RT) قبل الاستخدام.
  5. قم بإجراء استرجاع المستضد عند 107 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة ، ثم اترك شرائح الأنسجة تبرد عند RT لمدة 20 دقيقة في غطاء كيميائي.
  6. أثناء استرجاع المستضد ، اشطف ورق الترطيب بالماء ، وضعه في صينية تلطيخ منزلقة للتحكم في الرطوبة ، وضع الصينية في فرن تهجين عند 60 درجة مئوية.
  7. اشطف الشرائح في TBS خالية من RNase لمدة 3 دقائق ، ثم جفف الشرائح لمدة 3 دقائق.

3. علاج البروتياز

  1. ارسم حاجزا كارهة للماء حول كل قسم من الأنسجة بقلم حاجز كاره للماء. اترك الحاجز يجف تماما لمدة دقيقتين تقريبا.
  2. قم بتحميل الشرائح الجافة في حامل شريحة درج الرطوبة عن طريق فتح مشبك التأرجح.
  3. أضف قطرات كافية من البروتياز لتغطية قسم الأنسجة بالكامل. قم بإزالة درج التحكم في الرطوبة المسخن مسبقا (60 درجة مئوية ، الخطوة 2.6) من فرن التهجين وأدخل حامل الشريحة في درج التحكم في الرطوبة. أعد إغلاق صينية التحكم في الرطوبة وأعدتها إلى فرن التهجين. احتضان عند 40 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
  4. خلال هذه الحضانة ، قم بإعداد مواد فحص RNA-ISH.
    1. قم بإعداد 500 مل من 1x RNA-ISH غسيل المخزن المؤقت عن طريق تخفيف مخزون 50x باستخدام NFW. يخزن في RT لمدة تصل إلى شهر واحد.
      ملاحظة: في حالة حدوث هطول الأمطار في المخزن المؤقت للغسيل 50x ، أعد التعليق عن طريق تسخين المخزن المؤقت إلى 40 درجة مئوية لمدة 10-20 دقيقة قبل تحضير مخزن الغسيل 1x.
  5. قم بإعداد 1 لتر من DTBS-T (0.5٪ Tween) في NFW عن طريق إضافة 5 مل من Tween إلى 1 لتر من DPBS-T.
  6. قم بإعداد مجسات الهدف المقترنة ب RNA-ISH ZZ:
    1. مخزون مسبار mRNA دافئ ومخفف RNA-ISH عند 40 درجة مئوية في فرن جاف لمدة 10 دقائق. قم بتدوير المجسات وتدويرها لأسفل في جهاز طرد مركزي صغير على المقعد.
    2. قم بإعداد مزيج 1x (حتى 12 مسبارا ، الجدول 1) عن طريق تخفيف مجسات المخزون 50x في مخفف RNA-ISH ، مع التأكد من وجود حجم نهائي كاف لتغطية قسم الأنسجة بالكامل.
    3. دوامة جيدا واترك المجسات المختلطة ومخفف الحمض النووي الريبي-ISH في RT حتى الاستخدام.
  7. قم بإزالة صينية التحكم في الرطوبة من فرن التهجين وإزالة حامل الشريحة. أعد الصينية إلى الفرن.
  8. ضع الشرائح في حامل شرائح شفاف مغسول مسبقا باستخدام NFW. اغسل الشرائح في NFW مع تحريك طفيف لمدة 5 دقائق.
  9. كرر خطوة الغسيل باستخدام NFW طازج لمدة 5 دقائق.

4. تهجين المجسات المستهدفة

  1. قم بإزالة السوائل الزائدة من الشرائح. أخرج صينية التحكم في الرطوبة من الفرن وضع حامل الشريحة في الدرج.
  2. أضف ما يكفي من مزيج المسبار المناسب لتغطية كل قسم من الأنسجة بالكامل. أغلق الصينية وأدخلها في الفرن لمدة ساعتين عند 40 درجة مئوية.
  3. ضع كاشف RNA-ISH Amplifier 1 (أشجار الذيل ZZ لذيول T1 إلى T4) ليتوازن عند RT قبل 30 دقيقة من نهاية الحضانة ، لاستخدامه في الخطوة 5.2.
  4. بمجرد الانتهاء من الحضانة ، قم بإزالة صينية التحكم في الرطوبة من فرن التهجين وإزالة حامل الشريحة. أعد الصينية إلى الفرن.
  5. ضع الشرائح في حامل شرائح شفاف مغسول مسبقا باستخدام NFW. اغسل الشرائح في مخزن غسيل 1x مع تحريك طفيف لمدة 2 دقيقة.
  6. كرر خطوة الغسيل باستخدام عازلة غسيل جديدة 1x لمدة دقيقتين في RT.

5. تهجين مكبر للصوت RNA-ISH 1

  1. قم بإزالة السوائل الزائدة من الشرائح وضع الشرائح في حامل شرائح درج الرطوبة. أدخل حامل الشريحة في درج التحكم في الرطوبة.
  2. Vortex RNA-ISH Amplifier 1 وإضافته لتغطية كل قسم بالكامل. أغلق الصينية وأدخلها في فرن التهجين لمدة 30 دقيقة عند 40 درجة مئوية. ضع كاشف RNA-ISH Amplifier 2 (أشجار الذيل ZZ لذيول T5 إلى T8) في RT ، لاستخدامه في الخطوة 6.2.
  3. قم بإزالة صينية التحكم في الرطوبة من فرن التهجين وإزالة حامل الشريحة. أعد الصينية إلى الفرن.
  4. ضع الشرائح في حامل شرائح شفاف مغسول مسبقا باستخدام NFW. اغسل الشرائح في مخزن غسيل 1x مع تحريك طفيف لمدة 2 دقيقة.
  5. كرر خطوة الغسيل باستخدام مخزن غسيل طازج 1x لمدة دقيقتين في RT.

6. تهجين مكبر للصوت RNA-ISH 2

  1. قم بإزالة السوائل الزائدة من الشرائح. أخرج صينية التحكم في الرطوبة من الفرن وضع حامل الشريحة في الدرج
  2. Vortex RNA-ISH Amplifier 2 وإضافته لتغطية كل قسم. أغلق الصينية وأدخلها في فرن التهجين لمدة 30 دقيقة عند 40 درجة مئوية.
  3. ضع كاشف RNA-ISH Amplifier 3 (أشجار الذيل ZZ لذيول T9 إلى T 12) في RT ، لاستخدامه في الخطوة 7.2. قم بإزالة حامل الشريحة من الدرج. ضع الصينية مرة أخرى في الفرن.
  4. ضع الشرائح في حامل شرائح شفاف مغسول مسبقا باستخدام NFW. اغسل الشرائح في مخزن غسيل 1x مع تحريك طفيف لمدة 2 دقيقة.
  5. كرر خطوة الغسيل باستخدام مخزن غسيل طازج 1x لمدة دقيقتين في RT.

7. تهجين مكبر للصوت RNA-ISH 3

  1. قم بإزالة السوائل الزائدة من الشرائح. أخرج صينية التحكم في الرطوبة من الفرن وضع حامل الشريحة في الدرج
  2. Vortex RNA-ISH Amplifier 3 وإضافته لتغطية كل قسم بالكامل. أغلق الصينية وأدخلها في فرن التهجين لمدة 30 دقيقة عند 40 درجة مئوية.
  3. أثناء الحضانة ، قم بإعداد مزيج oligos المعدني للخطوة 8. يتم استخدام كل oligo بتركيز 1:15 (من مخزون 10 ميكرومتر ، مع التأكد من وجود حجم نهائي كاف لتغطية قسم الأنسجة بأكمله). دوامة جيدا واترك قلة المعدن المختلطة في RT حتى الاستخدام. أخرج صينية التحكم في الرطوبة من الفرن ، ثم أخرج حامل الشريحة من الدرج. بعد ذلك ، أعد الصينية إلى الفرن
  4. ضع الشرائح في حامل شرائح شفاف مغسول مسبقا باستخدام NFW. اغسل الشرائح في مخزن غسيل 1x مع تحريك طفيف لمدة 2 دقيقة.
  5. كرر خطوة الغسيل باستخدام عازلة غسيل جديدة 1x لمدة دقيقتين في RT.

8. تهجين oligos المعدنية

  1. قم بإزالة السوائل الزائدة من الشرائح. أخرج صينية التحكم في الرطوبة من الفرن وضع حامل الشريحة في الدرج. أضف قلة معدنية مختلطة محضرة في الخطوة 7.3 (دوامة قبل الاستخدام).
  2. أغلق الصينية وأدخلها في فرن التهجين لمدة 45 دقيقة عند 40 درجة مئوية.
  3. قم بإزالة صينية التحكم في الرطوبة من فرن التهجين وإزالة حامل الشريحة. أعد الصينية إلى الفرن.
  4. ضع الشرائح في حامل شرائح شفاف مغسول مسبقا باستخدام NFW. اغسل الشرائح في مخزن غسيل 1x مع تحريك طفيف لمدة 2 دقيقة.
  5. كرر خطوة الغسيل باستخدام عازلة غسيل جديدة 1x لمدة دقيقتين في RT.

9. الأجسام المضادة المعدنية المقترنة

  1. لحجب المواقع غير المحددة ، ضع حجما كافيا من المخزن المؤقت للحجب لتغطية قسم الأنسجة بالكامل واحتضان لمدة 30 دقيقة في RT.
  2. أثناء الحضانة ، قم بإعداد مزيج الأجسام المضادة لاستخدامه في الخطوة 10.1 عن طريق تخفيف الأجسام المضادة (الجدول 1) في المخزن المؤقت المخفف للأجسام المضادة.

10. الحضانة بالأجسام المضادة المعدنية المترافقة

  1. بعد حجب حضانة المخزن المؤقت ، تخلص من المخزن المؤقت الحجب من شرائح الأنسجة ووزع حجما كافيا من مزيج Ab (من الخطوة 9.2) لتغطية قسم الأنسجة بالكامل.
  2. ضع الشريحة في غرفة الرطوبة واحتضنها طوال الليل (~ 16 ساعة) عند 4 درجات مئوية.

11. تلطيخ الحمض النووي

  1. تحضير محلول Ir-Intercalator الطازج.
    1. من محلول مخزون 500 ميكرومتر ، قم بإعداد حل عمل 1: 2000 في TBS الخالي من RNase. يمكن تحديد حل العمل وتخزينه عند -20 درجة مئوية (لا تجميد الذوبان).
  2. ضع الشرائح في حامل شرائح شفاف مغسول مسبقا باستخدام NFW. اغسل الشرائح في مخزن TBS-T مع تحريك طفيف لمدة 5 دقائق.
  3. كرر الغسيل في TBS-T.
  4. الشرائح البقعة بمحلول العمل بالأشعة تحت الحمراء (من الخطوة 11.1.1) لمدة 5 دقائق في RT.
  5. ضع الشرائح في حامل شرائح شفاف مغسول مسبقا باستخدام NFW. اغسل الشرائح في مخزن TBS-T مع تحريك طفيف لمدة 5 دقائق.
  6. كرر الغسيل في TBS-T.
  7. يغسل مرتين في ملعقة كبيرة ، 5 دقائق (يقلب ببطء).
  8. اغمس الشريحة بسرعة في ddH2O لتجنب تبلور الأملاح الموجودة في TBS على الأنسجة.
  9. جفف الشريحة تحت غطاء كيميائي (10 دقائق) واحفظها في درجة حرارة 4 درجات مئوية حتى الحصول على الصورة.

12. الحصول على الصور

  1. قم بتحميل الشريحة في غرفة الاستئصال الخاصة ب IMC.
  2. التقط صورة بانورامية لتحديد منطقة الاهتمام (ROI).
  3. حدد عائد الاستثمار في برنامج الحصول على الصور.
  4. تطبيق قالب الاكتساب.
  5. اضبط طاقة الليزر (طاقة الاستئصال) بناء على نوع العينة. يتم تعيين الافتراضي على 0 ديسيبل.
    ملاحظة: ينصح باختبار طاقة الاستئصال بمناطق أنسجة صغيرة متعددة (30 ميكرومتر × 30 ميكرومتر) ، وزيادة الطاقة بمقدار 1 ديسيبل في كل مرة. حدد أقل طاقة استئصال تمسح العينة دون حرق في الشريحة. عادة ، ينتج عن هذا طاقة ليزر تبلغ 3-4 ديسيبل. في بعض الأحيان ، إذا كان النسيج أكثر سمكا مما هو موصى به ، فستزيد قوة الليزر إلى 5 ديسيبل.
  6. بدء الاستئصال بالليزر. يوجه النظام الليزر إلى عائد الاستثمار ويزيل البروتينات ذات العلامات المعدنية ، مما يولد أعمدة الهباء الجوي التي يتم نقلها إلى شعلة البلازما المقترنة بالحث (ICP) ، حيث يتم تبخير الأعمدة وتفتيت وتأين في البلازما.
  7. قم بقياس كمية كل نظير يتم قياسه بواسطة الكاشف وتحويله إلى بيانات.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تساعدنا القدرة على اكتشاف البروتين والحمض النووي الريبوزي المرسال في نفس الفحص على فهم كيفية استعداد الخلية للوصول ، ولكن أيضا قوائم الانتظار التي تتلقاها أثناء سفرها وتفاعلها مع بيئتها. كما هو موضح في البيانات التمثيلية ، يعد الكشف عن mRNA والبروتين مكونين حاسمين في أبحاث البيولوجيا المكانية ، حيث يمكن أن تكون الحدود الدنيا للكشف صعبة للغاية بناء على الطريقة التي تتقدم بها خطوات وضع العلامات و / أو الكاشف و / أو التصوير. يمكن أن يؤدي مجرد إدراج البروتياز إلى تعقيد العلامات الحرجة في الب...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعد Multiplex Multi-omics تطورا حاسما في البيانات التي تم جمعها ، حيث يستهدف التفاعلات من خلية إلى خلية ومن خلية إلى أخرى التي تؤثر على تطور المرض وعلاجه. يعد تحليل هذه البيانات في نفس العينة وبالتالي نفس الخلية أمرا بالغ الأهمية ، حيث يتم التعبير عن العديد من أهداف البروتين بشكل عابر ، أو تختلف في مستوى mRNA وتعبير البروتين ، وبالتالي فإن الكشف عن mRNA المستهدف جنبا إلى جنب مع البروتين يسمح باستيعاب الأهداف التي يصعب اكتشافها أو التعبير عنها بشكل تفاضلي21. أدت ال...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

جاريد ك. بيركس هو مستشار في Standard BioTools.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم إجراء هذا البحث بالتعاون مع مرفق قياس التدفق الخلوي والتصوير الخلوي الأساسي ، والذي تدعمه جزئيا المعاهد الوطنية للصحة من خلال منحة دعم مركز السرطان في إم دي أندرسون P30 CA016672. تم دعم هذا البحث أيضا جزئيا من خلال جائزة تطوير منحة الدعم من مركز MD Anderson's Cancer ، وتصوير التصوير المكاني لقياس الخلايا الكتلي عبر RNAscope و P30CA016672 و NIH / NCI و PI - Pisters. تم دعم جهود JKB جزئيا من قبل P30 CA016672 وأخصائي أبحاث NCI 1 R50 CA243707-01A1. تم دعم جهود SFB جزئيا من قبل تحالف أبحاث سرطان المبيض (OCRA 811621 و 891490) ، ومؤسسة تينا بروزمان لأبحاث سرطان المبيض ، وبرنامج البحوث التنموية لبوغ سرطان المبيض MDACC ، المعاهد الوطنية للصحة 1R01CA261952-01A1. تم دعم جهود SFB و JKB و BG جزئيا من خلال منحة 1U01CA294459-01. ويود المؤلفان أن يشكروا صموئيل موك ، الذي قام بتقسيم العينات المستخدمة وتقديمها.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
  https://www.protocols.io/view/oligonucleotide-polymer-conjugation-for-imaging-ma-dm6gpjz91gzp/v2.Protocols.IOdx.doi.org/10.17504/protocols.io.dm6gpjz91gzp/v2اقتران الأوليجونوكليوتيدات والبوليمر لتصوير قياس خلوي الكتلة V.2 
10 مرات TBS خالية من RNAseثيرمو فيشر ساينتفيك J62780. K7للغسلات المتقطعة بين الخطوات
نظام التهجين ACD HybEZ IIACD Biotechne321711فرن لشرائح مناديل الخبز
مخفف الأجسام المضادةداكوS0809 مخزن مخفف الأجسام المضادة
الأجسام المضادة: B7-H3بيثيلA700-025CF، A700-026CFالنسخة: BLR025F، BLR026F
الأجسام المضادة: B7-H4ثيرمو فيشر ساينتفيك 14-5949-82نسخة: H74
الأجسام المضادة: BRD4(6F11)بيثيلA700-005CFنسخة: BL-151-6F11
الأجسام المضادة: CCR6R& DMAB195-100نسخة: 53103
الأجسام المضادة: CD11bAbcam ab209970النسخة: EPR1344
الأجسام المضادة: CD25Abcam AB215378النسخة المستنسخة: EPR6452
الأجسام المضادة: CD278/ICOSCST 89601BFنسخة: D1K2T
الأجسام المضادة: CD31Abcam ab207090النسخة: EPR3094
الأجسام المضادة: CD33Abcam AB238784نسخة: SP266
الأجسام المضادة: CD3e CST85061BFنسخة: D7A6E
الأجسام المضادة: الدورة الرابعةأبكامab181724النسخة المستنسخة: EPR6855
الأجسام المضادة: CD44ثيرمو فيشر ساينتفيك MA1-10225النسخة المستنسخة: IM7
الأجسام المضادة: CD45ثيرمو فيشر ساينتفيك 14-9457-82النسخة المستنسخة: CD45-2B11
الأجسام المضادة: CD8aCST 85336BFنسخة: D8A8Y
الأجسام المضادة: CXCL13R& DAF801النسخة المستنسخة: متعددة النسيلات
الأجسام المضادة: CXCR5R& DMAB190-100النسخة المستنسخة: CXCR5
الأجسام المضادة: غاما-H2AXبيثيلA700-053CFالنسخة: BLR053F
الأجسام المضادة: جرانزيم بسانتا كروزSC-8022 Xالنسخة: 2C5
الأجسام المضادة: KAP1بيثيلA700-014CFنسخة: BL-248-2G6
الأجسام المضادة: Ki67بيثيلA700-021CFالنسخة: BLR021E
الأجسام المضادة: LCK CST2984BFنسخة: D88
الأجسام المضادة: MFAP5لا يوجدلا يوجدPMID: 31332047 / نسخة: 130A  (ملاحظة: مصمم خصيصا) 
الأجسام المضادة: SMACST56856BFنسخة: 1A4
الأجسام المضادة: VEGFSTB-فلويدigm3163028Dنسخة: G153-494
الأجسام المضادة: VISTACST64953BFالنسخة: D1L2G
AZ-AR1 إليغانس سيترا BioGeneXHK546-XAKمخزن استرجاع المستضدات
كحول الإيثيل 100٪ (200 بروف)فارمكو111000200لإزالة البارافينية
EZ & ndash; المسترجع IRBioGeneXMW016-IRنظام استرجاع المستضدات لمقاطع أنسجة FFPE
نظام التهجين HybEZ IIACD Biotechne321710يتكون النظام: فرن HybEZ (PN 321710/321720)، صينية التحكم في الرطوبة (PN 310012)، وورق ترطيب HybEZ (ورقتين PN 310025)، صينية غسل EZ-Batch (PN 321717)، حامل شرائح EZ-Batch (PN 321716)
قلم ImmEdge للحاجز الكاره للماء PAPمختبرات فيكتورH-4000قلم حاجز كاره للماء
حل المعالج بالأشعة تحت الحمراءثيرمو فيشر ساينتفيك NC1038184يستخدم لتحديد الخلايا النووية
كيراتين 18/8CST 4546BFنسخة: C51
ميتال أوليغوسمختلفمختلفالبطاقة المعدنية تتراوح من T1 إلى T12 حسب الحاجة
مياه خالية من النوكلياز (NFW)كورنينغ 46-000-CM تنظيف وتجهيز جميع المعدات، واستخدامها كمخفف عند الحاجة
RNAscope Protease Plus ACD Biotechne322331 يستخدم لنفاذ أغشية الخلايا في العينات
حامل شرائح RNAscope EZ-BatchACD Biotechne310017مصمم لمعالجة ما يصل إلى 20 شريحة يدويا بكفاءة
مجموعة RNAscope HiPlex12 Reagents v2 ACD Biotechne324409المواد المختصة ل RNAScope
مسبار RNAscope HiPlex - مجسات الهدفACD Biotechneمختلفتتراوح من T1 إلى T12 حسب الحاجة
محلول إزالة التلوث RNaseZap RNaseثيرمو فيشر العلميAM9782محلول تطهير سطحي يدمر RNases
حامل سلة منزلق بميكروسكوب التلوين 24 مكانا من البلاستيك المقاوم للمواد الكيميائيةالعلم الأمثل3028لصبغ عدة شرائح
20 سنةثيرمو فيشر ساينتفيك AAJ20605APللغسلات المتقطعة بين الخطوات
كتلة بروتين ألترافيجنثيرمو فيشر ساينتفيك TA125PBQمخزن الحجب

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Cai, S., Allam, M., Coskun, A. F. Multiplex spatial bioimaging for combination therapy design. Trends Cancer. 6 (10), 813-818 (2020).
  2. Lu, S., et al. Comparison of biomarker modalities for predicting response to PD-1/PD-L1 checkpoint blockade: a systematic review and meta-analysis. JAMA Oncol. 5 (8), 1195-1204 (2019).
  3. Parolini, M., et al. Microplastic contamination in snow from western Italian Alps. Int J Environ Res Public Health. 18 (2), 768(2021).
  4. Carstens, J. L., et al. Stabilized epithelial phenotype of cancer cells in primary tumors leads to increased colonization of liver metastasis in pancreatic cancer. Cell Rep. 35 (2), 108990(2021).
  5. Allam, M., Cai, S., Coskun, A. F. Multiplex bioimaging of single-cell spatial profiles for precision cancer diagnostics and therapeutics. NPJ Precis Oncol. 4 (1), 1-12 (2020).
  6. Ferri-Borgogno, S., et al. metabolic, and subcellular mapping of the tumor immune microenvironment via 3D targeted and non-targeted multiplex multi-omics analyses. Cancers (Basel). 16 (5), 846(2024).
  7. Schulz, D., et al. Simultaneous multiplexed imaging of mRNA and proteins with subcellular resolution in breast cancer tissue samples by mass cytometry. Cell Syst. 6 (1), 25-36.e25 (2018).
  8. Kochan, J., Wawro, M., Kasza, A. Simultaneous detection of mRNA and protein in single cells using immunofluorescence-combined single-molecule RNA FISH. Biotechniques. 59 (4), 209-221 (2015).
  9. Ferri-Borgogno, S., et al. Spatial transcriptomics depict ligand-receptor cross-talk heterogeneity at the tumor-stroma interface in long-term ovarian cancer survivors. Cancer Res. 83 (9), 1503-1516 (2023).
  10. Mok, S. C., et al. A gene signature predictive for outcome in advanced ovarian cancer identifies a survival factor: microfibril-associated glycoprotein 2. Cancer Cell. 16 (6), 521-532 (2009).
  11. Yeung, T. L., et al. Anticancer immunotherapy by MFAP5 blockade inhibits fibrosis and enhances chemosensitivity in ovarian and pancreatic cancer. Clin Cancer Res. 25 (21), 6417-6428 (2019).
  12. Ogura, H., et al. Interleukin-17 promotes autoimmunity by triggering a positive-feedback loop via interleukin-6 induction. Immunity. 29 (4), 628-636 (2008).
  13. Murakami, M., et al. Local microbleeding facilitates IL-6- and IL-17-dependent arthritis in the absence of tissue antigen recognition by activated T cells. J Exp Med. 208 (1), 103-114 (2011).
  14. Hou, W., Jin, Y. -H., Kang, H. S., Kim, B. S. Interleukin-6 (IL-6) and IL-17 synergistically promote viral persistence by inhibiting cellular apoptosis and cytotoxic T cell function. J Virol. 88 (15), 8479-8489 (2014).
  15. Geskin, L. J., Viragova, S., Stolz, D. B., Fuschiotti, P. Interleukin-13 is overexpressed in cutaneous T-cell lymphoma cells and regulates their proliferation. Blood. 125 (18), 2798-2805 (2015).
  16. Aspord, C., et al. Breast cancer instructs dendritic cells to prime interleukin 13-secreting CD4+ T cells that facilitate tumor development. J Exp Med. 204 (5), 1037-1047 (2007).
  17. Votava, M., et al. The expression profiles of CD47 in the tumor microenvironment of salivary gland cancers: a next step in histology-driven immunotherapy. BMC Cancer. 22 (1), 1-12 (2022).
  18. Liu, X., Kwon, H., Li, Z., Fu, Y. X. Is CD47 an innate immune checkpoint for tumor evasion. J Hematol Oncol. 10 (1), 1-10 (2017).
  19. Salerno, F., Guislain, A., Cansever, D., Wolkers, M. C. TLR-mediated innate production of IFN-γ by CD8+ T cells is independent of glycolysis. J Immunol. 196 (9), 3695-3705 (2016).
  20. Kalia, V., et al. Prolonged interleukin-2Rα expression on virus-specific CD8+ T cells favors terminal-effector differentiation in vivo. Immunity. 32 (1), 91-103 (2010).
  21. Cancino-Díaz, J. C., et al. Interleukin-13 receptor in psoriatic keratinocytes: overexpression of the mRNA and underexpression of the protein. J Invest Dermatol. 119 (5), 1114-1120 (2002).
  22. Wang, F., et al. RNAscope. J Mol Diagn. 14 (1), 22-29 (2012).
  23. Marlin, M. C., et al. A novel process for H&E, immunofluorescence, and imaging mass cytometry on a single slide with a concise analytics pipeline. Cytometry A. 103 (12), 1010-1018 (2023).
  24. Pemberton, J., Kala, S., Dikshit, A., Hupple, C. Regular and young investigator award abstracts. Thorax. 72 (Suppl 3), A1654(2017).
  25. Hu, K., Harman, A., Baharlou, H. Imaging mass cytometry for in situ immune profiling. Methods Mol Biol. 2779, 407-423 (2024).
  26. Chevrier, S., et al. Compensation of signal spillover in suspension and imaging mass cytometry. Cell Syst. 6 (5), 612-620.e15 (2018).
  27. Shi, S. R., Imam, S. A., Young, L., Cote, R. J., Taylor, C. R. Antigen retrieval immunohistochemistry under the influence of pH using monoclonal antibodies. J Histochem Cytochem. 43 (2), 193-201 (1995).
  28. Duncan, J. S., Elliott, K. L., Kersigo, J., Gray, B., Fritzsch, B. In situ hybridization methods. , Springer. New York, NY. (2015).
  29. Rivest, F., et al. Fully automated sequential immunofluorescence (seqIF) for hyperplex spatial proteomics. Sci Rep. 13 (1), 1-12 (2023).
  30. Sans, M., et al. Spatial transcriptomics of intraductal papillary mucinous neoplasms of the pancreas identifies NKX6-2 as a driver of gastric differentiation and indolent biological potential. Cancer Discov. 13 (8), 1844-1861 (2023).
  31. Glasson, Y., et al. Single-cell high-dimensional imaging mass cytometry: one step beyond in oncology. Semin Immunopathol. 46 (1), 1-12 (2023).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

T CD8

مقالات ذات صلة