يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

تضخيم الحمض النووي الريبي الصغير والتعرف عليه من خلال التهجين الموضعي الموضعي كطريقة جديدة للكشف والقياس الكمي

744 مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/68617

⸱

أكتوبر 7, 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Gynecologic Oncology and Reproductive Medicine, The University of Texas MD Anderson Cancer Center, 2Department of Leukemia, The University of Texas MD Anderson Cancer Center

في هذه المقالة

ملخص

يصف البروتوكول مقايسة تهجين التألق المناعي الترادفي مع الأنسجة المضمنة بالبارافين المثبت بالفورمالين لاكتشاف وقياس الحمض النووي الريبي الصغير والبروتينات متعددة الإرسال في وقت واحد.

الملخص

عند استخدام طرق الكشف عن التصوير التقليدية القائمة على التهجين في الموقع (ISH) ، يصعب التقاط microRNAs (miRNAs) نظرا لحجمها ، والذي يتراوح من 19 إلى 25 نيوكليوتيد. ومع ذلك ، نظرا لأن miRNAs هي منظمات رئيسية لاجينية تساهم في علم وظائف الأعضاء الطبيعي والعديد من الحالات المرضية ، فإن فهم السلوك الزماني المكاني ل miRNAs مهم لكشف وظيفتها على المستويين الخلوي وتحت الخلوي. هذا يخلق حاجة واضحة لتقنيات الكشف والتصور المناسبة. لذلك ، أنشأنا تضخيم الحمض النووي الصغير والتعرف عليه من خلال الحمض النووي المحفل في الموقع الهجين (MARLIN) ، والذي تم تطويره وتحسينه باستخدام تلطيخ التألق المناعي متعدد الإرسال ، ومجسات الحمض النووي المغلق (LNA) التي تستهدف miRNA. يمكن لهذه الطريقة تحديد كمية miRNA من خلال تعبير البروتين متعدد الإرسال ، والذي يسمح بالقياس الكمي للميرنا داخل الخلايا وخارج الخلية داخل البيئة الدقيقة للورم (TME) بحساسية عالية وقابلية للتكاثر. يمكن أن يوفر الاستخدام المشترك للكشف عن miRNA ومقايسات التقاط البروتين أيضا فهما شاملا للوظائف الخلوية والآليات التنظيمية داخل TME.

المقدمة

microRNAs
على الرغم من أن microRNAs (miRNA) صغيرة بشكل لا يصدق ، حيث يتراوح طولها بين 19 و 25 نيوكليوتيد ، إلا أن جزيئات الحمض النووي الريبي أحادية الشريطة هذه هي منظمات قوية في التعبير الجيني ، حيث تعدل الحمض النووي الريبي المرسال (mRNAs) بعد النسخ من خلال التفاعلات الخاصة بالتسلسل1. في جوهرها ، تعمل miRNAs كمنظمات سلبية عن طريق الارتباط ب mRNAs المستهدفة ، إما منع ترجمتها أو تعزيز تدهورها من خلال انقسام mRNA ، اعتمادا على درجة التكامل ، مما يؤدي في النهاية إلى انخفاض إنتاج البروتين من الجين المستهدف. في حين أن miRNAs هي في الأساس RNA غير مشفر ، إلا أن ما يقرب من 40٪ من جميع miRNAs لا تزال موجودة داخل الإنترونات أو الإكسونات لجينات ترميز البروتين2. يشمل الغرض الوظيفي من miRNAs العديد من العمليات البيولوجية الرئيسية مثل تكاثر الخلايا ، وتكوين الأوعية الدموية ، وموت الخلايا المبرمج ، وما إلى ذلك. والجدير بالذكر أن عدم تنظيم miRNAs متورط في تكوين الأورام ، حيث ارتبط التعبير الشاذ عن miRNAs المحددة وتنظيم الجينات بوساطة miRNA بالتحول الورمي في أنواع السرطانالمتعددة 3.

منذ اكتشافها ، تم بحث miRNAs على نطاق واسع في أمراض مختلفة بسبب تعبيرها الخاص بالأنسجة ووظائفها التنظيمية ، مع ارتباط خلل تنظيمها بالعديد من الأمراض ، بما في ذلك الاضطرابات التنكسية العصبية واضطرابات المناعة الذاتية وأنواع السرطان المختلفة4،5،6. يمكن أن ترتبط أنماط التعبير عن miRNAs بنوع السرطان ومرحلته والمتغيرات السريرية ، مما يجعل تنميط miRNA أداة قيمة لتشخيص السرطان والتشخيص4،5،6،7. كما تم تسريع اكتشاف miRNAs الجديدة من خلال التقدم في تقنيات التسلسل عالية الإنتاجية ، مما يعزز فهم مشاركة miRNA في العمليات البيولوجية المتنوعة8. تم التأكيد على أهمية miRNAs من خلال جائزة نوبل في الطب لعام 2024 الممنوحة لفيكتور أمبروس وجاري روفكون لاكتشافهما وظيفة miRNA في لائحة ما بعد النسخ9.

كمؤشرات حيوية قيمة لتشخيص المرض والتشخيص ، تم استكشاف الإمكانات العلاجية ل miRNAs ، مما أدى إلى تطوير الأدوية التي تستهدف miRNA. تكمن الإمكانات العلاجية ل miRNAs في علاج السرطان في قدرتها على تنظيم وحدات الجينات بشكل منسق ، مما قد يؤدي إلى استعادة الوظائف الخلوية الطبيعية10. في السابق ، تم تطوير العلاجات المضادة للسرطان القائمة على miRNA إما كعلاج أحادي أو بالاشتراك مع العلاجات المستهدفة الحالية لتعزيز استجابات العلاج وزيادة معدلات الشفاء11. لقد وضعها الطيف الديناميكي ل miRNAs كموارد أساسية لاستراتيجيات علاج السرطان المبتكرة. في سياق المقاومة العلاجية ، أظهر استهداف miRNAs وعدا في تقليل تكرار ومقاومة علاجات السرطان التقليدية ، مما قد يؤدي إلى تحسين بقاء المريض على قيد الحياة من خلال استهداف الخلاياالسرطانية 12. من خلال استكشاف أدوار miRNAs في تعديل أنشطة أنواع الخلايا المختلفة في البيئة المكروية للورم (TME) ، يمكن اكتشاف علاجات السرطان الفريدة وذات الصلة سريريا.

المقايسات المتاحة للكشف عن miRNAs
حاليا ، تعتمد الطريقة الأكثر شيوعا لقياس miRNA على الحمض النووي الريبي المستخرج من أجل تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي في الوقت الفعلي (q-RT-PCR) أو تسلسل الجيل التالي (NGS) ، مما يفقد السياق المكاني. هناك شركات ستوفر فحوصات TaqMan microRNA ، والتي تستخدم بادئات الحلقة الجذعية الخاصة بالهدف لتخليق (كدنا) ، وكيمياء SYBR Green القائمة على الصبغة مع تخليق (كدنا) عالمي. يمكن أن توفر هذه المقايسات حساسية وخصوصية عالية ويمكن تشغيلها على مجموعة من أدوات q-RT-PCR. لسوء الحظ ، لا يمكن لفحوصات TaqMan توفير القياس الكمي المطلق ، مما قد يؤدي إلى مشكلات مثل الإيجابيات الخاطئة والتباين في النتائج13. أيضا ، على الرغم من حساسيتها العالية ، يمكن أن يكون تطبيق هذه المقايسات في أنواع العينات المختلفة محدودا بسبب الحاجة إلى إعداد عينة مكثفة والتداخل المحتمل من المكونات الأخرى في العينة.

تسلسل الجيل التالي (NGS): يحظى miRNA-seq بشعبية متزايدة لتحليل التعبير التفاضلي عبر miRNome من السوائل الحيوية بأكملها. تتمثل إحدى مزايا تقنيات NGS مثل miRNA-seq في أنها تسمح بإجراء تحليلات متوازية ضخمة للتعبير على مستوى الجينوم ل miRNAs ، مما يتيح التقدير الكمي ل miRNAs الفردية ، وتحديد اختلافات التسلسل ، واكتشاف miRNAs الجديدة14. عيب كبير في الأساليب القائمة على التسلسل ، مثل IlluminaTruSeq Small RNA Sample Sample Kit ، هو تحريض التحيزات الكمية ، مما يؤثر على دقة تحليلات التعبير التفاضلي ، ويرجع ذلك في جزء كبير منه إلى التماثل وأطوال القراءة الأصغر ل miRNAs14. ليس ذلك فحسب ، بل إن وجود isomiRs (المتغيرات التي تختلف في التسلسل أو الطول عن تسلسل miRNA الأساسي) والتحف الفنية يمكن أن يعقد تفسير البيانات ، مما قد يؤدي إلى اكتشافات خاطئة وعوامل مربكة في فحوصات المؤشرات الحيوية14. أيضا ، يمكن أن تؤدي الأدوات المختلفة لتحليل بيانات miRNA-seq ، مثل sRNAbench و miRDeep2 ، إلى نتائج متفاوتة ، مما يؤثر على اتساق وموثوقية اكتشاف miRNA الجديد15،16. حتى شيء مثل تقنية المصفوفات الدقيقة يمكن أن يكون غير كاف في معظم الحالات. على الرغم من أنه يمكن أن يوفر نظاما أساسيا قويا وعالي الإنتاجية للكشف عن miRNA أو مستويات التعبير الجيني ، مما يجعلها مناسبة للدراسات على مستوى الجينوم ، إلا أن التكنولوجيا لا تزال محدودة بعدد miRNAs التي تم تحديدها مسبقا ولا يمكنها التحقق مباشرة من تفاعلات miRNA المستهدفة ، مما يحد من فائدتها في الدراسات الوظيفية17.

العامل الأكثر أهمية الذي يمكن التأكيد عليه هنا عند مقارنة كل هذه الخيارات المتاحة هو عدم وجود سياق مكاني. لا توفر أي سياق فيما يتعلق بمورفولوجيا الأنسجة أو التوزيع الزماني المكاني داخل الخلايا. يعد تصور السلوك الزماني المكاني ل miRNAs أمرا ضروريا لكشف وظيفتها على المستويين الخلوي وتحت الخلوي. في الوقت الحاضر ، يمكن الوصول إلى فحوصات التهجين في الموقع (ISH) ، وعادة ما تستخدم طرق الكشف عن الكروموجينيك. في حين أن هذه المقايسات تسمح بتصور miRNA بدقة خلية واحدة ، فإن النتائج تفتقر إلى الجودة ، مما يجعل من الصعب التمييز بين تعبير miRNA وخلفية العينة. بشكل عام ، ينتج العديد من هذه فحوصات منخفضة الجودة ، وهي غير موثوقة وتتطلب عادة القياس الكمي اليدوي.

لذلك ، قمنا بتطوير تضخيم الحمض النووي الصغير والتعرف عليه من خلال الحمض النووي المحفل في الموقع الهجين (MARLIN) باستخدام تلطيخ التألق المناعي متعدد الإرسال (عن طريق تلطيخ بروتين الأوبال) ومجسات الحمض النووي المغلق (LNA) التي تستهدف miRNA ، داخل أنسجة البارافين المثبتة بالفورمالين (FFPE). لقد حققنا ذلك من خلال تنفيذ نظام تضخيم إشارة التيراميد (TSA) الذي يتم تنشيطه بواسطة جسم مضاد مترافق لبيروكسيداز الفجل (HRP) المضاد للديجوكسيجينين (DIG). يعمل HRP كمحفز لإدارة أمن النقل ، بينما يرتبط Anti-DIG بمسبار LNA. هذا الاختبار مفيد بشكل خاص في فهم الطبيعة الأساسية ل miRs في تعديل ما بعد النسخ مع البروتينات ، وربما الحمض النووي الريبي الآخر في وقت واحد. علاوة على ذلك ، نظرا لعدم وجود اختبار متاح تجاريا يمكنه تحديد كل من miRNA وتعبير البروتين ، يوفر MARLIN طريقة فعالة لفهم العلاقات في الموقع ل miRs والبروتينات داخل عينات FFPE.

أظهرت النتائج الأولية من التقدير الكمي ل miR-181c-3p باستخدام MARLIN جدوى التحليل الموازي ل miRNAs والبروتينات في السياق المكاني الأصلي لأنسجة المبيض البشري FFPE. بعد هذا المثال ، بناء على مكونات MARLIN ، من الممكن نظريا التوسع إلى ما يصل إلى أربعة بروتينات باستخدام الفلوروفورات الفلورية التجارية المضاعفة مثل Alexa Fluor ، أو أصباغ الجزيئات الصغيرةالأخرى 18.

بالإضافة إلى ذلك ، نظرا لأن هذه المنهجية تستخدم اختلافات في طرق الأنسجة القياسية ، فيجب أن تكون متوافقة مع أنسجة FFPE الثدييات الأخرى ، بالنظر إلى اختيار المسبار والأجسام المضادة المناسبة. تحافظ هذه المنهجية على البنية المكانية وتسمح بالتقدير الكمي للميرنا الخلوي وتحت الخلوي وتحديد الموقع المشترك للبروتين. يعالج هذا النهج فجوة حرجة في علم الأحياء المكاني من خلال رسم خرائط أنماط التعبير المشترك للبروتينات miRNAs والتوزيع المكاني ، والتي يمكن وضعها في سياقها مباشرة داخل معماريات الأنسجة الأصلية. نقدم هنا MARLIN نظرة عامة رسومية مفصلة في الشكل 1. بينما تم تحسين البروتوكول المقدم ل miR-181c-3p ، يمكن دراسة miRs الأخرى ، بالنظر إلى تصميم المسبار المناسب. تشمل المعلمات الحاسمة لهذه الطريقة: تقييم جودة الأنسجة وتحسين تركيزات المسبار. يوصى بتقييم سلامة الحمض النووي الريبي لكتلة الأنسجة باستخدام مقياس DV200 من خلال استخدام قسمين بحجم 10 ميكرومتر واستخراج الحمض النووي الريبي باستخدام بروتوكول يحافظ على جميع أحجام أجزاء الحمض النووي الريبي. يجب اختبار العينات ذات درجة DV200 أكبر من 50 أو أفضل ، وتركيزات البروتوكول ، بشكل منهجي.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

يستخدم هذا البروتوكول أنسجة البارافين الثابتة بالفورمالين (FFPE) لأقسام أنسجة ورم المبيض البشري من المرضى الذين يعانون من HGSC. تم جمع هذه العينات من المرضى الذين لم يعالجوا سابقا ويخضعون لجراحة اختزال الخلايا الأولية لسرطان المبيض. تم الحصول على جميع العينات والبيانات السريرية من مستودع سرطان المبيض التابع لقسم الأورام النسائية والطب التناسلي بموجب البروتوكولات المعتمدة من قبل مجلس المراجعة المؤسسية بجامعة تكساس إم دي أندرسون. تم الحصول على موافقة خطية مستنيرة من المرضى من قبل موظفي مكتب الاستقبال ، وأجريت الدراسات وفقا للإرشادات الأخلاقية المعترف بها.

1. تحضير الأنسجة

  1. اخبز جميع عينات FFPE طوال الليل عند 60 درجة مئوية ونظف كل قطعة من المعدات والأدوات بمياه خالية من الحمض النووي الريبي. تأكد من أن الأقسام يبلغ سمكها حوالي 5 ميكرومتر.
    ملاحظة: تم تحسين هذا البروتوكول لأورام المبيض ولكن يمكن استخدامه مع أنواع الأنسجة الأخرى بعد إجراء مزيد من الاختبارات.
  2. قم بإجراء إزالة البارافين بثلاث جولات من الزيلين لمدة 5 دقائق لكل جولة ، و 10 جولات من الجفاف لمدة 3 دقائق لكل جولة (100٪ إيثانول (EtOH) 2x ، 95٪ EtOH 2x ، 70٪ EtOH 2x ، 50٪ EtOH 2x ، 30٪ EtOH 2x). يغسل بمحلول ملحي 1x (TBS) لمدة دقيقتين مرة واحدة.
    ملاحظة: خطوة إزالة الشمع هذه ، على الرغم من أنها موصى بها ، اختيارية وتعتمد على نوع الأنسجة.
  3. بعد إزالة البارافين وإعادة الجفاف ، ضع محلول 3٪ بيروكسيد الهيدروجين (H2O2) لمدة 10 دقائق. يغسل لمدة 2 دقيقة مع 1x TBS ، 2x. ثم ضع محلول 3.7٪ بارافورمالديهايد (PFA) لمدة 10 دقائق. يغسل لمدة 2 دقيقة مع 1x TBS ، 2x.
    ملاحظة: هذه الخطوة اختيارية ويجب أخذها في الاعتبار فقط للأنسجة الدهنية أو العينات المعرضة للانفصال.
  4. انتقل إلى الجولة الأولى من استرجاع المستضد. يستخدم هذا البروتوكول نظام الأشعة تحت الحمراء EZ-Retriver. باتباع تعليمات النظام ، قم بتسخين العينات في الميكروويف أثناء غمرها في مخزن مؤقت EZ-AR1 جديد عند 95 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة. اتركيه ليبرد لمدة 20 دقيقة.
  5. يغسل لمدة 2 دقيقة مع 1x TBS. ثم لمدة دقيقتين مع 1x TBS-T (1x TBS مع 0.1٪ Tween) ، 2x.

2. تطبيق البروتين

  1. ارسم حاجزا حول كل قسم من الأنسجة بقلم حاجز كاره للماء.
  2. أضف محلول حجب الأجسام المضادة 1x (يكفي لتغطية منطقة الأنسجة بأكملها) واحتضنه لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة في غرفة الرطوبة (الرطوبة المحيطة وغير المنضبطة).
  3. بعد ذلك ، قم بتخفيف الجسم المضاد الأساسي الأول بنفس محلول الحظر ، وقم بتطبيقه بما يكفي لتغطية منطقة الأنسجة بأكملها ، واتركه للاحتضان لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة في غرفة الرطوبة.
    ملاحظة: أثناء تطوير هذا البروتوكول ، تم استخدام Anti-CD8 بتخفيف 1:75.
  4. يغسل لمدة 2 دقيقة في 1x TBS-T ، 3x. بعد ذلك ، أضف Anti-Ms + Rb HRP واترك العينات للاحتضان لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة في غرفة الرطوبة (الرطوبة المحيطة وغير المنضبطة).
  5. يغسل لمدة 2 دقيقة في 1x TBS-T ، 3x. قم بتخفيف الفلوروفور الأول بمخفف التضخيم عند 1: 100 واحتضنه لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة في غرفة الرطوبة.
    ملاحظة: أثناء تطوير هذا البروتوكول ، تم استخدام فلوروفور انبعاث 690 نانومتر. من هذه النقطة ، يوصى باستخدام الحد الأدنى من الإضاءة لبقية الإجراء بعد تطبيق الجولة الأولى من الفلوروفور.
  6. يغسل لمدة 2 دقيقة في 1x TBS-T ، 3x. ابدأ الجولة الثانية من تلطيخ الأجسام المضادة بالجولة الثانية من استرجاع المستضد في الميكروويف ، عن طريق غمر العينات مرة أخرى في مخزن مؤقت جديد EZ-AR1 عند 95 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة ، ثم التبريد لمدة 20 دقيقة.
  7. يغسل لمدة 2 دقيقة مع 1x TBS. ثم اغسلها لمدة دقيقتين باستخدام 1x TBS-T ، 2x.
  8. ضع محلول حجب الأجسام المضادة 1x مرة أخرى لمدة 30 دقيقة في غرفة الرطوبة في درجة حرارة الغرفة (الرطوبة المحيطة وغير المنضبطة).
  9. خفف الجسم المضاد الأساسي الثاني بنفس محلول الانسداد ، وقم بتطبيقه بما يكفي لتغطية منطقة الأنسجة بأكملها ، واتركه للاحتضان طوال الليل عند 4 درجات مئوية في غرفة الرطوبة لمدة 16 ساعة على الأقل.
    ملاحظة: أثناء تطوير هذا البروتوكول ، تم استخدام Anti-EpCAM بتخفيف 1: 200.
  10. ابدأ في اليوم التالي بالغسيل لمدة دقيقتين في 1x TBS-T ، 3x. ثم أضف Anti-Ms + Rb HRP واترك العينات لتحتضن لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة في غرفة الرطوبة (الرطوبة المحيطة وغير المنضبطة).
  11. يغسل لمدة 2 دقيقة في 1x TBS-T ، 3x. قم بتخفيف الفلوروفور الثاني بمخفف التضخيم عند 1: 100 واحتضان لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة في غرفة الرطوبة.
    ملاحظة: أثناء تطوير هذا البروتوكول ، تم استخدام فلوروفور انبعاث 620 نانومتر.

3. تطبيق التحقيق

  1. يغسل لمدة 2 دقيقة في 1x TBS-T ، 3x.
  2. ابدأ استرجاع المستضد الثالث والأخير باستخدام EZ-AR1 Elegance في الميكروويف عند 107 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة. اتركيه ليبرد لمدة 20 دقيقة. يغسل لمدة 3 دقائق في 1x TBS.
  3. ضعي RNAscope Protease Plus (يكفي لتغطية منطقة الأنسجة بالكامل) واحتفظي بها عند 40 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. استخدم الفرن. يغسل لمدة 5 دقائق في 1x TBS ، 2x.
  4. قم بإعداد المسبار عن طريق التمسخ عند 90 درجة مئوية لمدة 4 دقائق من مسبار miRNA LNA. ثم قم بتخفيف المسبار على الفور باستخدام المخزن المؤقت miRNA-ISH. دوامة وتدوير محلول المسبار.
    ملاحظة: أثناء تطوير هذا البروتوكول ، تم استخدام مسبار الهدف miR-181c-3p بتخفيف قدره 1: 250.
  5. ضع المسبار (يكفي لتغطية منطقة الأنسجة بالكامل) وضعه مرة أخرى في الفرن لمدة ساعة واحدة عند 60 درجة مئوية. يغسل لمدة 5 دقائق في 5x محلول مؤقت من سترات الصوديوم المالحة (SSC).
  6. قم بإجراء خمس عمليات غسيل صارمة في SSC مسخنة مسبقا عند 60 درجة مئوية بالترتيب التالي والتخفيف لمدة 5 دقائق لكل جولة: جولة واحدة من 5x SSC ، وجولتان من 1x SSC ، وجولتان من 0.2x SSC.
  7. يغسل لمدة 5 دقائق في 0.2x SSC في درجة حرارة الغرفة. احتضان مع عازلة حجب لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة في غرفة مرطبة. استخدم مزيجا من مسحوق الكاشف 1x TBS و 0.5٪ Blocking Reagent ، وتأكد من دوامة وتدوير محلول الحجب قبل التطبيق.
  8. ضع مقترن HRP مضاد للDigoxigenin (الماوس) (لهذه العينات ، تم استخدام تخفيف 1: 500) واحتضان لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة في غرفة مرطبة.
  9. يغسل لمدة 5 دقائق في 1x TBS-T ، 3x ضع التخفيف الموصى به بنسبة 1:50 من تضخيم إشارة التيراميد بالإضافة إلى فلوروفور السيانين 3 (TSA + Cy3) لمدة 10 دقائق في غرفة الرطوبة في درجة حرارة الغرفة (الرطوبة المحيطة وغير المنضبطة). تأكد من دوامة وتدوير محلول TSA + Cy3 قبل التطبيق.
  10. يغسل لمدة 5 دقائق في 1x TBS-T ، 3x.

4. تلطيخ وتركيب نووي

  1. ضع محلول عمل 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) (يكفي لتغطية منطقة الأنسجة بأكملها) لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة في غرفة مرطبة (الرطوبة المحيطة وغير المنضبطة).
    ملاحظة: بالنسبة لهذا البروتوكول، تم استخدام تخفيف قدره 1: 1000، مع تخفيف مخزون DAPI العامل في TBS.)
  2. يغسل لمدة 5 دقائق في 1x TBS-T ، 3x. عند الانتهاء ، ضع الأغطية باستخدام وسائط التثبيت واترك الشرائح حتى تجف لمدة 10 دقائق. قم بتخزين الشرائح عند 4 درجات مئوية في الظلام بين 24-72 ساعة قبل التصوير وحتى ثلاثة أشهر بعد ذلك.

5. التصوير والتحليل

  1. للتصوير ، استخدم مجهر مسح الشرائح (يفضل) بتكبير 40x.
  2. قم بإجراء تحليل كمي لاحق لتعداد النقاط باستخدام DAPI والتلوين المضاد للبروتين لتجزئة الخلايا والتنميط الظاهري.
    ملاحظة: خلال هذا البروتوكول ، استخدمنا التصوير باستخدام Phenoimager HT. تم التقاط عمليات مسح الشرائح الكاملة بتكبير 40x باستخدام المرشحات المناسبة للفلوروفورات الموجودة ، ثم تم تصدير الصور متعددة الإرسال كملفات OME-TIFF. ثم تم تحميل الصور الممسوحة ضوئيا في برنامج Visiopharm Image Analysis Software للتحليل الكمي.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

عند اختبار هذا البروتوكول ، من المهم أن يكون لديك قسمان تسلسليان من نفس العينة التمثيلية من أجل الدقة والمقارنة. في هذه الحالة ، تم استخدام عينة من سرطان المبيض عالي الجودة (HGSC) لمقارنة النتائج. تم استخدام شريحة تحكم (الشكل 2A-B) التي لن تمر إلا عبر تلطيخ miRNA وشريحة اختبار تخضع لتلوين البروتين و miRNA (الشكل 2C-J).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

على الرغم من أن أهمية miRNAs معترف بها ومفهومة ، إلا أن ملاحظات كل من التطور الطبيعي وحالات المرض تعوقها حاليا صعوبة دراسة miRNAs باستخدام الطرق القياسية. أدت ندرة الطرق في الموقع إلى تطوير MARLIN (مقايسة miRNA FISH). بالنظر إلى التماثل والطول القصير ل miRNAs ، يصبح من الصعب تصور موقعها وتأثيرها على تنظيم ما بعد النسخ. يستخدم تطوير البروتوكول هذا مجسات الحمض النووي المقفلة (LNA). الحمض النووي الريبي عبارة عن قواعد RNA معدلة يتم فيها قفل الريبوز بجسر الميثيلين ، يربط ذرة الأكسجين...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

نود أن نعرب عن تقديرنا للأشخاص التاليين ، تشي لام أو يونغ ومانجوناث نيماكايالو ، الذين كانوا جزءا من لجنة أطروحة بسنت أثناء التطوير للمقايس. أيضا ، صموئيل موك ، الذي قام بتقسيم وتقديم العينات المستخدمة. أخيرا ، نعرب عن تقديرنا ليوهان دوري ودان وينكوفسكي ، اللذين قدما مساعدة مكثفة أثناء التحليل واستخدام برنامج Visiopharm. تم تمويل هذا البحث جزئيا من قبل تحالف أبحاث سرطان المبيض (OCRA 811621 و 891490) ، ومؤسسة Sie ، وصندوق Stephanie C. Stelter Endowment. تم إجراء هذا البحث بالتعاون مع المنشأة الأساسية لقياس التدفق الخلوي والتصوير الخلوي ، والتي تدعمها جزئيا المعاهد الوطنية للصحة من خلال منحة دعم مركز السرطان في إم دي أندرسون P30 CA016672 وأخصائي أبحاث جاريد بيركس في المعهد الوطني للسرطان 1 R50 CA243707-01A1.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
10 مرات محلول ملحي مخزن TRIS (TBS) بدرجة حموضة 7.6 ثيرمو فيشر العلمي  J62662  K7للغسلات المتقطعة بين الخطوات
مخفف الأجسام المضادة من أوبال/حجب أكويا للعلوم الحيويةARD1001EAمحلول حجب البروتين
مخفف تضخيم أتمتة 1x Plusأكويا للعلوم البيولوجية FP1609يستخدم لتخفيف فلوروفورات الأوبال
20x Concentrate  محلول سترات الصوديوم الملحي (SSC)سيغما-ألدرتشS6639-1Lلغسولات miRNA بعد تهجين المجس
4',6-دياميدينو-2-فينيليندول (DAPI) ثيرمو فيشر ساينتيفيك/إنفيتروجينEN62248 / 62248للتلوين النووي
نظام التهجين ACD HybEZ IIACD Biotechne321711فرن يستخدم لتنظيم درجة الحرارة أثناء بروتوكول miRNAscope
Anti-CD8 (D8A8Y)، mAb الأرنبتقنيات الإشارات الخلوية85336Sمثال على الأجسام المضادة الأولية المستخدمة لتحسين هذا البروتوكول
مرافق HRP مضاد للديغوكسيجينين (الفأر)شركة ريفيتي للعلوم الصحيةNEF832001EAالكاشف الثانوي المستخدم في اكتشاف الميكرو الريبي الريبي
Anti-EpCAM (E6V8Y)، متال الأرنبتقنيات الإشارات الخلوية93790مثال على الأجسام المضادة الأولية المستخدمة لتحسين هذا البروتوكول
مسحوق كاشف الحجبأكويا للعلوم البيولوجية FP1012حل حجب ال miRNA
كحول الإيثيل 100٪ (200 بروف)فارمكو111000200لإزالة البارافينية
مخزن EZ-AR1BioGeneXHK521-XAKيستخدم لاسترجاع المستضدات لمقاطع نسيج FFPE عند خطوة البروتين
مخزن الأناقة EZ-AR1BioGeneXHK546-XAKيستخدم لاسترجاع المستضدات لمقاطع نسيج FFPE عند خطوة مسبار miRNA
نظام الأشعة تحت الحمراء EZ-RetrieverBioGeneXMW015-IRاستخدام الميكروويف لاسترجاع المستضدات لمقاطع أنسجة FFPE
محلول بيروكسيد الهيدروجين 30٪ سيغما-ألدريتش HX0640-5 لتحضير الأنسجة. يساعد على منع نشاط البيروكسيداز الداخلي وإنتاج منتجات ذات ألوان عالية
مسبار miR-181c-3p miRNAتشياغن339112مثال على مسبار miRNA المستخدم لتحسين هذا البروتوكول
مجموعة المخزن المؤقت miRNA ISH (FFPE)تشياغن339450 يستخدم لتخفيف مسبار ال miRNA
أوبال 620أكويا للعلوم البيولوجية FP1495001KTالفلوروفور لتحديد الجسم المضاد الأساسي
أوبال 690 أكويا للعلوم البيولوجية FP1497001KTالفلوروفور لتحديد الجسم المضاد الأساسي
أوبال Anti-Ms + Rb HRPأكويا للعلوم الحيويةARH1001EAالأجسام المضادة الثانوية المستخدمة كعامل كشف
بيرس 16٪ فورمالدهيد (بدون مضادة)، خال من الميثانولثيرمو فيشر العلمي28908لصنع 3.7٪ PFA لتحضير الأنسجة
برولونج ألماسة مضاد التلاشيثيرمو فيشر العلميP36970وسائط التركيب
RNAscope Protease PlusACD Biotechne322331لنفخ مقاطع الأنسجة&nb; عن طريق هضم البروتينات جزئيا و كشف جزيئات ال miRNA المستهدفة
ماء خال من RNAe كورنينغ 46-000-CM تنظيف وتجهيز جميع المعدات، واستخدامها كمخفف عند الحاجة  
20 سنةسيغما-ألدرتشP1379-25MLلصنع TBS-T
تضخيم إشارة التيراميد بالإضافة إلى السيانين 3أكويا للعلوم البيولوجية NEL744001KTالفلوروفور لتحديد الميكرو الريبي الريبي
مجسات الميكروRNA اليو6 والخلفيتشياغن339459مجسات التحكم الاختيارية
درجة زيلين الأنسجةثيرمو فيشر العلميUN1307لإزالة البارافينية

المراجع

  1. Smolarz, B., Nowak, A. Z., Romanowicz, H. Breast cancer-epidemiology, classification, pathogenesis and treatment (review of literature). Cancers. 14 (10), 2569(2022).
  2. Davis-Dusenbery, B. N., Hata, A. Microrna in cancer: The involvement of aberrant microrna biogenesis regulatory pathways. Genes Cancer. 1 (11), 1100-1114 (2010).
  3. Peng, Y., Croce, C. M. The role of microRNAs in human cancer. Signal Transduct Targeted Ther. 1 (1), 15004(2016).
  4. Shi, Y., et al. Mirnas and cancer: Key link in diagnosis and therapy. Genes. 12 (8), 1289(2021).
  5. Juźwik, C. A., et al. MicroRNA dysregulation in neurodegenerative diseases: A systematic review. Prog Neurobiol. 182, 101664(2019).
  6. Pauley, K. M., Cha, S., Chan, E. K. L. Microrna in autoimmunity and autoimmune diseases. J Autoimmun. 32 (3-4), 189-194 (2009).
  7. Lee, Y. S., Dutta, A. Micrornas in cancer. Ann Rev Pathol Mech Dis. 4 (1), 199-227 (2009).
  8. Thomson, D. W., et al. Assessing the gene regulatory properties of argonaute-bound small rnas of diverse genomic origin. Nuc Acids Res. 43 (1), 470-481 (2015).
  9. Kim, Y. K., Han, J. Nobel-winning microRNA, the microRNAestro of gene silencing. Mol Cells. 47 (11), 100123(2024).
  10. Lai, X., Eberhardt, M., Schmitz, U., Vera, J. Systems biology-based investigation of cooperating microRNAs as monotherapy or adjuvant therapy in cancer. Nuc Acid Res. 47 (15), 7753-7766 (2019).
  11. Garzon, R., Marcucci, G., Croce, C. M. Targeting micrornas in cancer: Rationale, strategies and challenges. Nat Rev Drug Disc. 9 (10), 775-789 (2010).
  12. Jiao, X., et al. MicroRNA: The impact on cancer stemness and therapeutic resistance. Cells. 9 (1), 8(2019).
  13. Lin, B., Jiang, J., Jia, J., Zhou, X. Recent advances in exosomal miRNA biosensing for liquid biopsy. Molecules. 27 (21), 7145(2022).
  14. Farrell, D., et al. The identification of circulating miRNAs in bovine serum and their potential as novel biomarkers of early Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis infection. PLoS One. 10 (7), e0134310(2015).
  15. Aparicio-Puerta, E., et al. Srnabench and srnatoolbox 2022 update: Accurate mirna and sncrna profiling for model and non-model organisms. Nuc Acid Res. 50 (W1), W710-W717 (2022).
  16. Friedländer, M. R., Mackowiak, S. D., Li, N., Chen, W., Rajewsky, N. Mirdeep2 accurately identifies known and hundreds of novel microRNA genes in seven animal clades. Nuc Acid Res. 40 (1), 37-52 (2012).
  17. Chou, C. H., et al. Mirtarbase 2016: Updates to the experimentally validated miRNA-target interactions database. Nuc Acid Res. 44 (D1), D239-D247 (2016).
  18. Porichis, F., et al. High-throughput detection of miRNAs and gene-specific mRNA at the single-cell level by flow cytometry. Nat Commun. 5 (1), 5641(2014).
  19. Eichert, A., et al. The crystal structure of an 'all locked' nucleic acid duplex. Nuc Acid Res. 38 (19), 6729-6736 (2010).
  20. Viratham Pulsawatdi, A., et al. A robust multiplex immunofluorescence and digital pathology workflow for the characterisation of the tumour immune microenvironment. Mol Oncol. 14 (10), 2384-2402 (2020).
  21. Janati-Idrissi, S., et al. Looking for a needle in a haystack: De novo phenotypic target identification reveals hippo pathway-mediated mir-202 regulation of egg production. Nuc Acid Res. 52 (2), 738-754 (2024).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

EpCAM
تضخيم الحمض النووي الريبي الصغير والتعرف عليه من خلال التهجين الموضعي الموضعي كطريقة جديدة للكشف والقياس الكمي
اتصل بنا
أوصِ بها للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

2026 © حقوق الطبع والنشر MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.