Method Article

الكشف المتسلسل عن الجزيئات الحيوية في العينات الثابتة للفورمالين والبارافين مع تصوير قياس الطيف الكتلي

DOI:

10.3791/68618

⸱

October 24th, 2025

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Chemistry, University of Texas at Austin, 2Department of Leukemia, The University of Texas MD Anderson Cancer Center, 3Department of Gynecologic Oncology and Reproductive Medicine, The University of Texas MD Anderson Cancer Center

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هنا ، نقدم بروتوكول تصوير قياس الطيف الكتلي للكشف عن المستقلب المتسلسل ، والجليكان المرتبط ب N ، والببتيد التربتيكي في عينات الأنسجة المثبتة بالفورمالين والبارافين.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الأنسجة هي بيئات خلوية معقدة ، تتكون من مجموعة واسعة من أنواع الخلايا والجزيئات الحيوية التي تتفاعل جميعها مع بعضها البعض لأداء وظائف العضو. تقليديا ، تضمنت تقنيات تحليل الجزيئات الحيوية مثل المستقلبات والجليكان والبروتينات تجانس الأنسجة ، مما يؤدي إلى تدمير جميع المعلومات المكانية. تمنع هذه الطرق التقليدية الفهم الكامل للتفاعلات الجزيئية المعقدة داخل الخلية وخارجها. من ناحية أخرى ، لا يحافظ تصوير الطيف الكتلي (MSI) على المعلومات المكانية للجزيئات الحيوية في الأنسجة فحسب ، بل يسمح أيضا باكتشاف فئات متعددة من المواد التحليلية من نفس قسم الأنسجة من خلال التحليل المتسلسل بدقة شبه خلية واحدة. وهذا يمكننا من اشتقاق صورة أكثر اكتمالا للتفاعلات الجزيئية عبر فئات مختلفة من الجزيئات الحيوية. يحدد البروتوكول المقدم هنا خطوات إجراء تصوير الطيف الكتلي للمستقلبات والجليكانات المرتبطة ب N والببتيدات التريبتيك بالتتابع من نفس قسم الأنسجة بدقة 20 ميكرومتر. يسمح النظر الضميري بالترتيب الذي يتم به تصوير فئات التحليلات ، جنبا إلى جنب مع التعامل الدقيق مع الأقسام لضمان السلامة ، بجمع صور متعددة عالية الجودة من نفس القسم. يمكن بعد ذلك دمج هذه البيانات مع بيانات omics المكانية الأخرى (النسخ ، الكيمياء المناعية ، إلخ) التي تم جمعها من الأقسام التسلسلية ، حيث يمكن تحليل نفس الخلية في هذه الأقسام المجاورة.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

التصوير اللطيف الكتلي (MSI) هو تقنية قوية تسمح باكتشاف وتصور مئات إلى آلاف الجزيئات الحيوية من أقسام الأنسجة الرقيقة ، دون الحاجة إلى معرفة مسبقة بالجزيئات الدقيقة الموجودة في الأنسجة ، مما يجعلها أداة ممتازة لاكتشاف المؤشرات الحيوية1. بينما يتم استخدام عدة أنواع من MSI من قبل مختبرات مختلفة ، بما في ذلك تأين الرش الكهربائي للامتصاص (DESI) 2،3 ، وتأين الرش الكهربائي بالليزر بمساعدة مصفوفة الأشعة تحت الحمراء (IR-MALDESI) 4 ، ومطياف كتلة الأيونات الثانوي (SIMS) 5 ، يظل امتصاص / تأين الليزر بمساعدة المصفوفة (MALDI) هو الأكثر استخداما والأكثر تنوعا. يمكن اكتشاف معظم فئات الجزيئات الحيوية بواسطة MSI عن طريق تخصيص تحضير العينة ، بما في ذلك الغسيل / المعالجة المسبقة للأنسجة ، والهضم الأنزيمي ، والمصفوفة / المذيب المستخدم6،7. تم استخدام MALDI MSI للكشف عن نواتج الأيض والدهون والجليكان والبروتينات والببتيدات المحللة للبروتينات.

تم استخدام دراسات MSI في مجموعة متنوعة من الدراسات السريرية وما قبل السريرية لفهم آليات المرض8،9 بشكل أفضل ، وتحسين تصنيف السرطان وتحديد مرحلته10،11 ، والتنبؤ بنتائج العلاج12 ، وتحسين التشخيص13 ، وتحديد هوامش الورم الجزيئي14 ، من بين أمور أخرى. ركزت معظم هذه الدراسات على اكتشاف فئة واحدة فقط من التحليلات. ومع ذلك ، غالبا ما يكون من المهم تحليل أكثر من فئة واحدة من الجزيئات الحيوية من نفس العينة. تقليديا ، تم إجراء ذلك مع أقسام متسلسلة من الأنسجة. ولكن في الآونة الأخيرة ، تم عرض أمثلة على التحليل المتسلسل لفئات التحليل المتعددة من نفس قسم الأنسجة. على سبيل المثال ، Yagnik et al. أظهر تصويرا دهنيا للأنسجة المجمدة متبوعا بالكيمياء المناعية MALDI من نفس القسم لتصنيف نوع الخلية15. Clift et al. أظهر تطبيقا متسلسلا ل PNGaseF و Collagenase و Trypsin على أقسام الأنسجة المثبتة بالفورمالين والبارافين (FFPE) لتصوير الجليكانات المرتبطة ب N وبروتينات المصفوفة خارج الخلية والبروتينات العامة ، على التوالي16. Escobar et al. أظهر التحليل المتسلسل للجليكانات المرتبطة ب N ، و O-GlcNAc ، والببتيدات التربتيكية من نفس القسم من الأنسجة المجمدة17. يتم إنجاز هذه الأنواع من التجارب من خلال التخطيط التجريبي الدقيق لتحليل التحليلات المفقودة بسهولة أولا ، تليها تلك الأكثر استقرارا في الأنسجة. في كثير من الحالات ، تساعد عمليات الغسيل المستخدمة لإزالة فئات الجزيئات غير المرغوب فيها في تعزيز فئات أخرى من الجزيئات6 ، وهي خاصية يمكن الاستفادة منها ، حيث يساعد كل غسيل يزيل المصفوفة المطبقة مسبقا أيضا على تحسين إشارة الفئة التالية من المواد التحليلية المراد تصويرها.

في الآونة الأخيرة ، نشرنا سير عمل للتحليل المتسلسل للمستقلبات ، والجليكانات المرتبطة ب N ، والببتيدات التريبتيك من نفس القسم من أنسجة سرطان المبيض FFPE18. هنا ، نقدم سير العمل التفصيلي لتحليل هذه الفئات الثلاث من الجزيئات الحيوية من نفس قسم الأنسجة. يتم تفصيل نظرة عامة على البروتوكول في الشكل 1. على حد علمنا ، هذا هو البروتوكول الأول الذي يصف بالتفصيل سير العمل هذا للتصوير المتسلسل من أنسجة FFPE. باختصار ، يتم إزالة الشمع من أقسام الأنسجة بالزيلين قبل الطلاء بمصفوفة 1،5-ديامينونفثالين (10 مجم / مل في 50٪ أسيتونيتريل) لتصوير المستقلب بوضع الأيونات السالبة. ثم تتم إزالة المصفوفة ، وإعادة ترطيب الأقسام ، واسترجاعها بالمستضد ، قبل رشها ب PNGase F (0.1 ميكروغرام / ميكرولتر في بيكربونات الأمونيوم) لإطلاق الجليكانات المرتبطة ب N في الموقع. بعد الحضانة ، يتم طلاء الأقسام بحمض α-سيانو -4-هيدروكسي سيناميك (CHCA) (10 مجم / مل في 70٪ أسيتونيتريل ، 0.1٪ حمض ثلاثي فلورو أسيتيك) ويتم تصويرها في وضع الأيون الموجب. ثم تتم إزالة المصفوفة مرة أخرى ، وتكرار الإماهة واسترجاع المستضد ، ويتم رش الأقسام بالتربسين (0.075 ميكروغرام / ميكرولتر في بيكربونات الأمونيوم) وتحضينها قبل أن يتم تغليفها مرة أخرى بمصفوفة CHCA (10 مجم / مل في 70٪ أسيتونيتريل ، 0.1٪ حمض ثلاثي فلورو أسيتيك) وتصويرها في وضع الأيونات الموجبة. يجب أن تكون جميع الحلول طازجة ، قبل الاستخدام مباشرة ، وإذا كان ذلك ممكنا ، يجب إجراء التجارب على مدار 3 أيام متتالية. في حالة مواجهة تأخيرات ، يجب تخزين الأقسام في فريزر -80 درجة مئوية تحت التجفيف.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يستخدم هذا البروتوكول أنسجة البارافين الثابتة بالفورمالين (FFPE) التي تم جمعها من المرضى الذين لم يعالجوا سابقا ويخضعون لجراحة اختزال الخلايا الأولية لسرطان المبيض المصلي عالي الدرجة. تم الحصول على جميع البيانات السريرية من مستودع سرطان المبيض التابع لقسم الأورام النسائية والطب التناسلي بموجب البروتوكولات المعتمدة من قبل مجلس المراجعة المؤسسية بجامعة تكساس إم دي أندرسون. تم الحصول على موافقة خطية مستنيرة من المرضى من قبل موظفي مكتب الاستقبال ، وأجريت الدراسات وفقا للإرشادات الأخلاقية المعترف بها.

1. تحضير عينة تصوير المستقلب

ملاحظة: يفترض هذا البروتوكول أن أجزاء من الأنسجة المثبتة بالفورمالين والبارافين (سمك 4 ميكرومتر) قد تم تركيبها بالفعل على شرائح المجهر الزجاجي ، حيث يجب تقسيم العينات السريرية بشكل عام داخل قلب علم الأمراض السريري بواسطة فنيي الأنسجة. نظرا لأن العمل المقدم هنا يتم تنفيذه على أداة TOF المشار إليها ، فإن قياس TOF المتعامد يخفف من الحاجة إلى الشرائح الموصلة المستخدمة تقليديا في تجارب MSI. يعد استخدام شرائح المجهر القياسية أيضا أكثر ملاءمة لسير العمل القياسي في مختبرات علم الأمراض السريرية ، بالإضافة إلى تمكين استخدام الأنسجة الأرشيفية الموجودة بالفعل على الشرائح.

  1. ضع علامات ائتمانية في الزوايا الأربع للشريحة باستخدام كاتب ماسي.
  2. إزالة البارافينات من الأقسام عن طريق الغمر في الزيلين النسيجي لمدة 3 دقائق.
    ملاحظة: الزيلين ضار ويجب استخدامه في غطاء الدخان الكيميائي.
  3. اغمر الأقسام في الزيلين الطازج لمدة 3 دقائق.
  4. اترك الشريحة تجف في درجة حرارة الغرفة.
  5. ضع الشريحة في هدف محول الشريحة.
  6. احصل على صورة بصرية للشريحة باستخدام ماسح ضوئي مسطح بدقة 4,800 نقطة في البوصة.
  7. اصنع مصفوفة MALDI عن طريق إذابة 15 مجم من 1،5-ديامينونفثالين (DAN) في 1.5 مل من 50٪ ACN. سونيكات حتى يذوب تماما ، ~ 5 دقائق. قم بتصفية محلول المصفوفة قبل التحميل في حلقة العينة.
    ملاحظة: DAN مادة مسرطنة مشتبه بها ويجب استخدامها مع معدات الحماية الشخصية المناسبة. يجب إجراء رش المصفوفة في غطاء دخان كيميائي.
  8. رش الشريحة بمحلول DAN باستخدام بخاخ كاشف آلي مع المعلمات التالية: سرعة المسار - 1,200 مم / ثانية ؛ تباعد المسار - 3 مم ؛ درجة حرارة الفوهة - 60 درجة مئوية ؛ ارتفاع الفوهة - 40 مم ؛ معدل التدفق - 100 ميكرولتر / دقيقة ؛ يمر - 4 ؛ N 2 الضغط - 10 رطل لكل بوصة مربعة ؛ نمط - CC
  9. ضع 0.5 ميكرولتر من الفوسفور الأحمر المعلق في الميثانول على مكان معروف على الشريحة.

2. جمع بيانات تصوير المستقلب

  1. ضع الشريحة (الشريحات) المعدة في محول الشريحة II وقم بتحميلها في مطياف الكتلة timsTOF fleX MALDI QTOF.
  2. قم بتحميل الطريقة المناسبة لجمع بيانات وضع الأيونات السالبة في timsControl مع إيقاف تشغيل الوقت. إذا لم تكن الأداة بالفعل في وضع الأيونات السالبة ، فاترك 25 دقيقة على الأقل بعد تبديل القطبية للتوازن قبل المعايرة وجمع البيانات باستخدام معلمات الأداة التالية للمستقلبات: نطاق m / z - 50 - 600 ؛ نطاق المسح بالليزر - 16.0 ميكرومتر في كل من X و Y ؛ حجم الحقل الناتج - 20.0 ميكرومتر في كل من X و Y ؛ لقطات الليزر - 150 ؛ طلاقة الليزر - ~ 30٪ ؛ قمع 1 RF - 150.0 Vpp ؛ قمع 2 RF - 200.0 Vpp ؛ RF متعدد الأقطاب - 200.0 Vpp ؛ طاقة الاصطدام - 10.0 فولت ؛ تصادم RF - 500.0 Vpp ؛ وقت النقل - 55.0 ميكرو ثانية ؛ تخزين PrePulse - 5.0 ميكرو ثانية (الشكل التكميلي S1).
  3. قم بإجراء ملف تعريف مستهدف (انقر فوق الزر إنشاء الآن ) وضبط التركيز (انقر فوق الزر ضبط الآن ) في علامة التبويب نموذج الناقل. اضبط موضع الليزر في X و Y ، إذا لزم الأمر على علامة تبويب الليزر للتأكد من محاذاة الليزر تماما مع الشعيرات المتقاطعة.
  4. اجمع طيفا من الفسفور الأحمر عن طريق جمع ما لا يقل عن خمس مجموعات من لقطات الليزر من المكان الموجود على الشريحة.
  5. قم بإجراء معايرة بالنقر فوق الزر معايرة في علامة التبويب المعايرة. قم بإزالة أي قمم ذات كثافة منخفضة جدا أو خطأ مرتفع في الدقيقة.
    ملاحظة: حتى مجموعات الفوسفور (P2 و P4) تعطي عموما إشارة ضعيفة جدا. يجب أن تكون درجة المعايرة 100٪ قبل النقر فوق قبول. إذا لم يكن الأمر كذلك ، فقم بمسح الطيف المجمع واحصل على طيف جديد.
  6. قم بتشغيل برنامج flexImaging . ستبدأ واجهة المستخدم الرسومية للحصول على الصور تلقائيا.
  7. حدد إعداد تشغيل تصوير جديد في الإطار اختيار تشغيل التصوير .
  8. اختر سير العمل الكلاسيكي في النافذة تحديد سير العمل .
  9. في نافذة تخزين البيانات ، قم بتوفير اسم تشغيل التصوير ودليل النتائج للبيانات.
    ملاحظة: يجب عدم استخدام المسافات في أسماء الملفات.
  10. في نافذة إعدادات الاكتساب ، اختر مناطق القياس المعرفة من قبل المستخدم واكتب 20 في المربع عرض البيانات النقطية . انقر فوق استعراض لتحديد طريقة timsControl التي تم إنشاؤها مسبقا.
  11. في الإطار نموذج صورة ، انقر فوق استعراض لتحديد الصورة الضوئية التي تم الحصول عليها باستخدام الماسح الضوئي المسطح.
  12. في نافذة عينة التدريس ، قم بإجراء محاذاة ثلاثية النقاط بين الصورة البصرية والشريحة ؛ بعد ذلك ، انقل حامل العينة إلى أول مؤمن محفور على الشريحة وقم بمحاذاة الشعيرات المتصالبة في timsControl مع ميزة مميزة في النقش. قم بتكبير الصورة (يوصى بتكبير 100٪) ، واضبط نموذج الصورة على تعيين نقاط التدريس ، وانقر فوق نفس الموقع في الصورة البصرية. كرر هذه العملية مرتين أكثر ليصبح المجموع ثلاث نقاط تعليمية. انقر فوق التالي لإكمال التدريس.
  13. انقر فوق موافق للخروج من معالج تشغيل التصوير الجديد.
  14. تحقق من دقة التدريس من خلال النقر على زر Position Sample Carrier في البرنامج. قم بالتكبير والنقر على ميزة مميزة للنقطة الائتمانية الرابعة (غير المستخدمة) في الصورة ؛ سينتقل الموجة الحاملة للعينة إلى هذا الموضع داخل timsControl. تأكد من أن الشعيرات المتصالبة تتماشى مع الميزة المحددة. إذا لم يصطفوا ، فقم بمسح التدريس في flexImaging وكرر عملية التدريس لتحسين الدقة.
  15. في البرنامج ، حدد أداة Add Polygon Measurement Region وحدد الأنسجة (الأنسجة) المراد تصويرها. كل نقرة بالماوس ستنشئ نقطة ربط. اضغط على زر المسافة الخلفية على لوحة المفاتيح لإزالة النقاط ، واحدة تلو الأخرى. بمجرد رسم المنطقة ، انقر نقرا مزدوجا فوق الماوس لإغلاق المضلع.
  16. تحقق من الإشارة عن طريق إطلاق الليزر في مواقع قليلة داخل الأنسجة. انقر فوق موقع في الصورة باستخدام زر Position Sample Carrier ، كما في الخطوة 2.14 ، للتحقق من التدريس. ستهيمن على الطيف قمم المصفوفة حول m / z 157 و 313 ؛ قم بتكبير منطقة M / Z أقل من 154 و 250-300 لإظهار العديد من مستقلبات الجزيئات الصغيرة وقمم الأحماض الدهنية ، على التوالي. اضبط طلاقة الليزر حسب الحاجة للحصول على إشارة مثالية.
  17. احفظ طريقة timsControl.
  18. ابدأ الحصول على التصوير بالنقر فوق الزر Start AutoXecute Run في البرنامج
    ملاحظة: ينتج عن التصوير في وضع الأيونات السالبة باستخدام مصفوفة DAN الكشف عن العديد من المستقلبات من دورة TCA والأحماض الأمينية والأحماض الدهنية وغيرها.

3. تحضير العينة لتصوير الجليكان المرتبط ب N

  1. بعد إزالة العينة من مطياف الكتلة ، قم بإزالة مصفوفة DAN عن طريق غمر الشريحة في الإيثانول بنسبة 100٪ (200 برهان) لمدة 1 دقيقة.
  2. أعد ترطيب الشريحة في برطمانات كوبلين: إيثانول طازج 100٪ لمدة 1 دقيقة ؛ 95٪ إيثانول لمدة 1 دقيقة ؛ 70٪ إيثانول لمدة 1 دقيقة ؛ ماء لمدة 3 دقائق ؛ الماء العذب لمدة 3 دقائق.
  3. اترك الشريحة تجف لمدة ~ 15 دقيقة.
  4. قم بإجراء استرجاع المستضد عن طريق غمر الشريحة في مخزن مؤقت تريس 100 ملي مولار (مصنوع عن طريق إذابة 6.06 جم من قاعدة تريس في 500 مل من الماء وضبط الرقم الهيدروجيني حسب الحاجة) ، ودرجة الحموضة 9 ، في وعاء كوبلين بغطاء يوضع بشكل غير محكم في الأعلى ويوضع في غرفة فك الغطاء مع 500 مل من الماء في الغرفة. يسخن إلى 95 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة.
  5. أخرج جرة كوبلن من غرفة فك الغطاء وضعها على سطح الطاولة لتبرد لمدة 20 دقيقة.
  6. قم باستبدال الشريحة بالماء على مدى خمسة تغييرات. بالنسبة للثلاثة الأوائل ، اسكب نصف المحلول واستبدله بالماء. بالنسبة للأخيرين ، اسكب كل المحلول واستبدله بالماء.
  7. اترك الشريحة تجف تماما.
  8. قم بإنشاء غرفة رطوبة لحضانة الشريحة بعد تطبيق PNGaseF. قطع دائرة من مناديل ماصة لتغطية قاع طبق بتري بقطر 100 مم. قم بلف منديلتين مختبريتين لإنشاء وسائد على جانبي طبق بتري (الشكل 2). أضف 8 مل من الماء لتشبع هذه المناديل المبللة وضع الغطاء على طبق بتري وضعه في فرن على حرارة 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة على الأقل للتسخين المسبق.
    ملاحظة: يجب أن يبدو الجزء الداخلي من الطبق مشبعا بالبخار.
  9. قم بإعداد PNGaseF عن طريق إعادة تكوين 100 ميكروغرام من الإنزيم المجفف بالتجميد في 200 ميكرولتر من 100 ملي مولار بيكربونات الأمونيوم ، ودرجة الحموضة 7.8 ، والدوامة للخلط. انقل المحلول إلى أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 مل وقم بتخفيفه إلى 1 مل بالماء.
  10. رش الشريحة باستخدام PNGaseF باستخدام بخاخ الكاشف الآلي بالمعلمات التالية. استخدم مضخة الحقنة لتطبيقات الحجم المنخفض/معدل التدفق المنخفض: سرعة الجنزير - 1200 مم/ثانية؛ تباعد المسار - 3 مم ؛ درجة حرارة الفوهة - 45 درجة مئوية ؛ ارتفاع الفوهة - 40 مم ؛ معدل التدفق - 25 ميكرولتر / دقيقة ؛ يمر - 15 ؛ N 2 الضغط - 10 رطل لكل بوصة مربعة ؛ نمط - CC
  11. ضع الشريحة في طبق بتري المسخن مسبقا ، بحيث يكون جانب المناديل لأعلى ، بحيث يكون أحد طرفيه على كل وسائد من وسائد مسح المختبر. استبدل الشريحة وأغلق طبق بتري بغشاء لاصق مانع للتسرب. ضعيها في فرن 37 درجة مئوية وضعي وسادة تسخين الزواحف مضبوطة على 40 درجة مئوية فوق طبق بتري.
    ملاحظة: هذا يحافظ على الغطاء في الجزء الأكثر دفئا من الطبق ويمنع التكثيف من التكون على الغطاء والسقوط على الأنسجة ، مما يتسبب في ظهور قطع أثرية في الصور.
  12. احتضن الشريحة لمدة 2 ساعة للسماح بمواصلة عملية الهضم.
  13. أخرجي الشريحة من طبق بتري واتركيها تجف لمدة ~ 5 دقائق.
  14. اصنع مصفوفة MALDI عن طريق إذابة 15 مجم من حمض α-cyano-4-hydroxycinnamic (CHCA) في 1.5 مل من 70٪ ACN و 0.1٪ TFA و 10 ملي فوسفات الأمونيوم.
    ملاحظة: TFA مادة كاوية ويجب استخدامها في غطاء محرك السيارة مع معدات الحماية الشخصية المناسبة.
  15. سونيكات حتى يذوب تماما ، ~ 5 دقائق.
  16. قم بتصفية محلول المصفوفة قبل التحميل في حلقة العينة.
  17. رش الشريحة باستخدام CHCA باستخدام بخاخ الكاشف الآلي بالمعلمات التالية: سرعة المسار - 1,200 مم / ثانية ؛ تباعد المسار - 3 مم ؛ درجة حرارة الفوهة - 75 درجة مئوية ؛ ارتفاع الفوهة - 40 مم ؛ معدل التدفق - 120 ميكرولتر / دقيقة ؛ يمر - 3 ؛ N 2 الضغط - 10 رطل لكل بوصة مربعة ؛ نمط - HH
  18. ضع 0.5 ميكرولتر من الفوسفور الأحمر المعلق في الميثانول على مكان معروف على الشريحة.

4. جمع بيانات التصوير الجليكاني المرتبط ب N

  1. ضع الشريحة (الشريحات) المعدة في هدف محول الشريحة وقم بتحميلها في مطياف الكتلة MALDI QTOF.
  2. قم بتحميل الطريقة المناسبة لجمع بيانات وضع الأيونات الإيجابية في timsControl. إذا لم يكن الجهاز بالفعل في وضع الأيونات الموجبة ، فاترك 25 دقيقة على الأقل بعد تبديل القطبية للتوازن قبل المعايرة وجمع البيانات باستخدام معلمات الأداة التالية للجليكان: نطاق m / z - 700-3500 ؛ نطاق المسح بالليزر - 16.0 ميكرومتر في كل من X و Y ؛ حجم الحقل الناتج - 20.0 ميكرومتر في كل من X و Y ؛ لقطات الليزر - 200 ؛ طلاقة الليزر - ~ 25٪ ؛ قمع 1 RF - 450.0 Vpp ؛ قمع 2 RF - 500.0 Vpp ؛ RF متعدد الأقطاب - 500.0 Vpp ؛ طاقة الاصطدام - 10.0 فولت ؛ تصادم RF - 2,700.0 Vpp ؛ وقت النقل - 140.0 ميكرو ثانية ؛ تخزين PrePulse - 14.0 ميكرو ثانية (الشكل التكميلي S2).
  3. قم بإجراء ملف تعريف الهدف (انقر فوق الزر إنشاء الآن) وضبط التركيز البؤري (انقر فوق الزر ضبط الآن) في علامة التبويب عينة الناقل. اضبط موضع الليزر بالشكلين X وY، إذا لزم الأمر، على علامة تبويب الليزر للتأكد من محاذاة الليزر مع الشعيرات المتصالبة.
  4. اجمع طيفا من الفسفور الأحمر عن طريق جمع ما لا يقل عن خمس مجموعات من لقطات الليزر من المكان الموجود على الشريحة.
  5. قم بإجراء معايرة بالنقر فوق الزر معايرة في علامة التبويب المعايرة. قم بإزالة أي قمم ذات كثافة منخفضة جدا أو خطأ مرتفع في الدقيقة.
    ملاحظة: يجب أن تكون درجة المعايرة 100٪ قبل النقر فوق قبول. إذا لم يكن الأمر كذلك ، فقم بمسح الطيف المجمع واحصل على طيف جديد.
  6. افتح ملف .mis المستخدم مسبقا لتصوير المستقلب في البرنامج.
  7. احفظ الملف باسم جديد يشير إلى أنه بيانات جليكان.
  8. تحت تحرير | خصائص تشغيل التصوير ، قم بتغيير طريقة الاستحواذ إلى طريقة الجليكان المطلوبة.
  9. امسح التدريس السابق باستخدام Edit | نقاط تعليم واضحة.
    ملاحظة: لن تكون الشريحة في نفس الموضع بالضبط بعد إزالتها من محول الشريحة وإعادة تحميلها.
  10. إجراء تدريس جديد باستخدام Edit | تعيين نقاط التدريس. قم بتعيين 3 نقاط كما حدث في معالج التصوير الأصلي (الخطوة 2.12).
  11. تحقق من دقة التدريس من خلال النقر على زر Position Sample Carrier في البرنامج. قم بالتكبير وانقر على ميزة مميزة للنقطة الائتمانية الرابعة (غير المستخدمة) في الصورة. سينتقل الموجة الحاملة للعينة إلى هذا الموضع داخل timsControl ؛ تأكد من أن الشعيرات المتصالبة تتماشى مع الميزة المحددة.
    ملاحظة: إذا لم تصطف الشعيرات المتصالبة ، فقم بمسح التدريس وكرر عملية التدريس لتحسين الدقة.
  12. احفظ الملف.
  13. تحقق من الإشارة عن طريق إطلاق الليزر في مواقع قليلة داخل الأنسجة. انقر فوق موقع في الصورة باستخدام زر Position Sample Carrier كما في الخطوة 4.11 للتحقق من التدريس. تأكد من أن الطيف يحتوي على قمم جليكان وفيرة مع قمم سائدة عادة عند m / z 1،663 و 1،809. اضبط طلاقة الليزر حسب الحاجة للحصول على إشارة مثالية.
  14. احفظ طريقة timsControl.
  15. ابدأ الحصول على التصوير بالنقر فوق الزر Start AutoXecute Run .

5. تحضير العينة لتصوير الببتيد التربتيكي

  1. قم بإزالة مصفوفة CHCA عن طريق غمر الشريحة في الإيثانول بنسبة 100٪ (200 برهان) لمدة ~ 1 دقيقة
  2. أعد ترطيب الشريحة في برطمانات كوبلين على النحو التالي: إيثانول طازج 100٪ لمدة 1 دقيقة ؛ 95٪ إيثانول لمدة 1 دقيقة ؛ 70٪ إيثانول لمدة 1 دقيقة ؛ ماء لمدة 3 دقائق ؛ الماء العذب لمدة 3 دقائق.
  3. اترك الشريحة تجف لمدة ~ 15 دقيقة.
  4. قم بإجراء استرجاع المستضد عن طريق غمر الشريحة في مخزن مؤقت تريس 100 ملي مولار ، درجة الحموضة 9 ، في برطمان كوبلين مع غطاء يوضع بشكل فضفاض في الأعلى ويوضع في غرفة فك الغطاء مع 500 مل من الماء في الغرفة. يسخن إلى 95 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة.
    ملاحظة: يعد استرجاع المستضد الثاني هذا ضروريا لتشويه طبيعة البروتينات من أجل وصول أكثر كفاءة للتربسين إلى مواقع الانقسام.
  5. أخرج جرة كوبلن من غرفة فك الغطاء وضعها على سطح الطاولة لتبرد لمدة 20 دقيقة.
  6. قم باستبدال الشريحة بالماء على مدى خمسة تغييرات. بالنسبة للثلاثة الأوائل ، اسكب نصف المحلول واستبدله بالماء. بالنسبة للأخيرين ، اسكب كل المحلول واستبدله بالماء.
  7. اترك الشريحة تجف تماما.
  8. تحضير التربسين عن طريق إعادة تكوين 100 ميكروغرام من الإنزيم المجفف بالتجميد في 200 ميكرولتر من حمض الخليك 100 ملي مولار والماصة لأعلى ولأسفل للخلط. قم بتخزين الأحجام المناسبة للتجربة (عادة 40 ميكرولتر) وتخزينها عند -20 درجة مئوية.
  9. قم بإعداد 40 ميكرولتر من التربسين عن طريق إضافة 350 ميكرولتر من بيكربونات الأمونيوم 100 ملي ، ودرجة الحموضة 7.8 ، و 39 ميكرولتر من ACN. اخلط جيدا.
    ملاحظة: يزيد الأسيتونيتريل (10٪ ACN) من نشاط التربسين مقارنة بالمحلول المائي ويقلل من التوتر السطحي للمحلول للرش19.
  10. رش الشريحة بالتربسين باستخدام بخاخ الكاشف الآلي بالمعلمات التالية. استخدم مضخة الحقنة لتطبيقات الحجم المنخفض / معدل التدفق المنخفض: سرعة الجنزير - 750 مم / ثانية ؛ تباعد المسار - 3 مم ؛ درجة حرارة الفوهة - 30 درجة مئوية ؛ ارتفاع الفوهة - 40 مم ؛ معدل التدفق - 10 ميكرولتر / دقيقة ؛ يمر - 12 ؛ N 2 الضغط - 10 رطل لكل بوصة مربعة ؛ نمط - HH
  11. ضع مربعا من المناديل الماصة في قاع طبق بتري بقطر 100 مم ؛ تأكد من أن الزوايا تلامس حافة الطبق فقط ، ووزع 1 مل من الماء على المسح.
  12. ضع الشريحة فوق المنديل ، بحيث يكون جانب المناديل لأعلى ، ثم ضع الغطاء على طبق بتري ، وأغلق طبق بتري بغشاء لاصق مانع للتسرب.
  13. احتضن الشريحة لمدة 4 ساعات عند 37 درجة مئوية للسماح بمواصلة عملية الهضم.
  14. أخرج الشريحة من طبق بتري واتركها تجف لمدة ~ 5 دقائق.
  15. اصنع مصفوفة MALDI عن طريق إذابة 15 مجم من حمض α-سيانو-4-هيدروكسي سيناميك (CHCA) في 1.5 مل من 70٪ ACN و 0.1٪ TFA و 10 ملي فوسفات الأمونيوم.
  16. سونيكات حتى يذوب تماما ، ~ 5 دقائق.
  17. قم بتصفية محلول المصفوفة قبل التحميل في حلقة العينة.
  18. رش الشريحة باستخدام CHCA باستخدام بخاخ الكاشف الآلي بالمعلمات التالية: سرعة المسار - 1200 مم / ثانية ؛ تباعد المسار - 3 مم ؛ درجة حرارة الفوهة - 75 درجة مئوية ؛ ارتفاع الفوهة - 40 مم ؛ معدل التدفق - 120 ميكرولتر / دقيقة ؛ يمر - 4 ؛ N 2 الضغط - 10 رطل لكل بوصة مربعة ؛ نمط - HH
  19. ضع 0.5 ميكرولتر من الفوسفور الأحمر المعلق في الميثانول على مكان معروف على الشريحة.

6. جمع بيانات تصوير الببتيد التربتيكي

  1. ضع الشريحة (الشريحات) المعدة في محول الشريحة وقم بتحميلها في مطياف الكتلة timsTOF MALDI QTOF.
  2. قم بتحميل الطريقة المناسبة لجمع بيانات وضع الأيونات الإيجابية في timsControl. إذا لم يكن الجهاز بالفعل في وضع الأيونات الموجبة ، فاترك 25 دقيقة على الأقل بعد تبديل القطبية للتوازن قبل المعايرة وجمع البيانات باستخدام معلمات الأداة التالية للببتيدات: مدى m / z - 600-4500 ؛ نطاق المسح بالليزر - 16.0 ميكرومتر في كل من X و Y ؛ حجم الحقل الناتج - 20.0 ميكرومتر في كل من X و Y ؛ لقطات الليزر - 200 ؛ طلاقة الليزر - ~ 25٪ ؛ قمع 1 RF - 450.0 Vpp ؛ قمع 2 RF - 500.0 Vpp ؛ RF متعدد الأقطاب - 600.0 Vpp ؛ طاقة الاصطدام - 10.0 فولت ؛ تصادم RF - 3400.0 Vpp ؛ وقت النقل - 180.0 ميكرو ثانية ؛ تخزين ما قبل النبض - 18.0 ميكرو ثانية (الشكل التكميلي S3).
  3. قم بإجراء ملف تعريف مستهدف (انقر فوق الزر إنشاء الآن) وضبط التركيز (انقر فوق الزر ضبط الآن) في علامة التبويب نموذج الناقل. اضبط موضع الليزر بالشكل X و Y ، إذا لزم الأمر ، على علامة تبويب الليزر للتأكد من محاذاة الليزر مع الشعيرات المتقاطعة.
  4. اجمع طيفا من الفسفور الأحمر عن طريق جمع ما لا يقل عن خمس مجموعات من لقطات الليزر من المكان الموجود على الشريحة.
  5. قم بإجراء معايرة بالنقر فوق الزر معايرة في علامة التبويب المعايرة. قم بإزالة أي قمم ذات كثافة منخفضة جدا أو خطأ مرتفع في الدقيقة. تأكد من أن درجة المعايرة هي 100٪ قبل النقر فوق قبول. إذا لم يكن الأمر كذلك ، فقم بمسح الطيف المجمع واحصل على طيف جديد.
  6. افتح ملف .mis المستخدم مسبقا لتصوير الجليكان.
  7. احفظ الملف باسم جديد يشير إلى أنه بيانات الببتيد.
  8. تحت تحرير | خصائص تشغيل التصوير ، قم بتغيير طريقة الاستحواذ إلى طريقة الببتيد المطلوبة.
  9. امسح التدريس السابق باستخدام Edit | نقاط تعليم واضحة.
    ملاحظة: لن تكون الشريحة في نفس الموضع بالضبط بعد إزالتها من محول الشريحة وإعادة تحميلها.
  10. إجراء تدريس جديد باستخدام Edit | تعيين نقاط التدريس. قم بتعيين ثلاث نقاط كما تم في معالج التصوير الأصلي (الخطوة 2.12).
  11. تحقق من دقة التدريس بالنقر فوق الزر Position Sample Carrier . قم بالتكبير وانقر على ميزة مميزة للنقطة الائتمانية الرابعة (غير المستخدمة) في الصورة. سينتقل الموجة الحاملة للعينة إلى هذا الموضع داخل timsControl ؛ تأكد من أن الشعيرات المتصالبة تتماشى مع الميزة المحددة.
    ملاحظة: إذا لم تصطف الشعيرات المتصالبة ، فقم بمسح التدريس وكرر عملية التدريس لتحسين الدقة.
  12. احفظ الملف.
  13. تحقق من الإشارة عن طريق إطلاق الليزر في مواقع قليلة داخل الأنسجة. انقر فوق موقع في الصورة باستخدام زر Position Sample Carrier كما في الخطوة 6.11 للتحقق من التدريس. تأكد من أن الطيف يحتوي على قمم ببتيد وفيرة مع قمم سائدة عادة عند m / z 944 و 1،105 و 1،198. اضبط طلاقة الليزر حسب الحاجة للحصول على إشارة مثالية.
  14. احفظ طريقة timsControl.
  15. ابدأ الحصول على التصوير بالنقر فوق الزر Start AutoXecute Run .

7. تلطيخ نسيجي

ملاحظة: هناك عدة طرق متاحة للهيماتوكسيلين واليوزين. يتم تقديم طريقة Carazzi المعدلة المستخدمة بشكل متكرر في هذا المختبر.

  1. قم بإزالة مصفوفة CHCA عن طريق غمر الشريحة في الإيثانول بنسبة 100٪ لمدة 1 دقيقة.
  2. وصمة عار الشريحة على النحو التالي: 95٪ إيثانول لمدة 30 ثانية ؛ 70٪ إيثانول لمدة 30 ثانية ؛ ماء لمدة 30 ثانية ؛ الهيماتوكسيلين لمدة 2 دقيقة ؛ ماء لمدة 30 ثانية ؛ 70٪ إيثانول لمدة 30 ثانية ؛ 95٪ إيثانول لمدة 30 ثانية ؛ إيوسين لمدة 1 دقيقة ؛ 95٪ إيثانول لمدة 30 ثانية ؛ 100٪ إيثانول لمدة 30 ثانية ؛ الزيلين لمدة 2.5 دقيقة ؛ غطاء مع وسط تصاعد.
  3. اترك الشريحة تجف لمدة >1 ساعة وقم بإزالة أي فقاعات بالضغط برفق على الغطاء.
  4. رقمنة باستخدام ماسح ضوئي رقمي للشرائح.

8. تصور البيانات

ملاحظة: هناك تحليل مكثف يمكن إجراؤه باستخدام SCiLS Lab خارج نطاق هذا البروتوكول. هنا ، سنصف فقط إنشاء الملفات الأساسية ، وتصور البيانات ، والبحث عن القمم مقابل قواعد البيانات لتحديد الهوية المفترضة.

  1. قم بتشغيل SCiLS Lab 2025b واختر جديد.
  2. حدد ملف (ملفات) البيانات المراد تحميله في البرنامج.
    ملاحظة: باستخدام SCiLS Lab Pro، يمكن تحميل ملفات بيانات متعددة تم جمعها بنفس المعلمات معا لتطبيع بعضها البعض وتصورها في وقت واحد.
  3. رتب العينات في التخطيط المفضل. انقل العينات بالنقر بزر الماوس الأيسر وسحبها. قم بتدوير العينات بالنقر بزر الماوس الأيمن والسحب. حدد التالي.
  4. في نافذة إعدادات المحور الشامل ، قم بإجراء أي تعديلات ضرورية. تعمل القيم الافتراضية بشكل جيد بشكل عام لبيانات timsTOF. انقر فوق التالي.
  5. في نافذة البحث عن الميزات ، قم بتعيين القيم المناسبة لانتقاء الذروة التلقائي أثناء الاستيراد. انقر فوق التالي.
    ملاحظة: هذا لا يعمل بشكل جيد لبيانات المستقلب من أنسجة FFPE ويجب تخطيه.
  6. سيتم عرض إعدادات الاستيراد في نافذة ملخص الاستيراد . انقر على استيراد.
  7. قم بتوفير اسم ملف وموقعا لحفظ ملف SCiLS.
    ملاحظة: بناء على حجم الملف، قد يستغرق الاستيراد من بضع دقائق إلى عدة ساعات.
  8. عند الانتهاء ، ستكون نافذة الملخص مرئية. انقر فوق فتح مجموعة البيانات المستوردة للتفاعل مع ملف SCiLS.
  9. في الجزء العلوي الأيمن من البرنامج ، انقر فوق القائمة المنسدلة بجانب التطبيع وحدد مربع متوسط الجذر.
    ملاحظة: هذه هي الطريقة الأنسب لبيانات timsTOF نظرا لقذور بيانات النقطة الوسطى المستوردة وستوفر أفضل تصور.
  10. ضمن ملف | خصائص الملف، اضبط عرض الفاصل الزمني على قيمة مناسبة، عادة من 10 إلى 15 صفحة في الدقيقة لبيانات timsTOF. تأكد من أن القيمة مناسبة من خلال تقييم ما إذا كانت تمتد على عرض الذروة في الطيف المتوسط.
  11. قم بتكبير متوسط الطيف في الجزء السفلي من البرنامج ، إما عن طريق النقر والسحب أو لف عجلة الماوس للأمام.
  12. حدد ذروة لتصورها عن طريق وضع الشعيرات المتصالبة في القمة والنقر بزر الماوس الأيسر فوق عجلة الماوس.
  13. أضف أيونات ذات أهمية إلى قائمة الصور الأيونية النشطة بالضغط على التحكم + مفتاح المسافة.
  14. احفظ قائمة الميزات المنسقة بالنقر فوق حفظ كقائمة ميزات زر في الجزء السفلي من نافذة الصور الأيونية على الجانب الأيمن من البرنامج.
  15. افتح قائمة ميزات محفوظة بالنقر فوق ملف | جدول الميزات والبحث باستخدام MetaboScape عن مستقلب مفترض أو معرفات glycan ، إذا تم تثبيت MetaboScape وتكوينه على نفس الشبكة. بدلا من ذلك ، قم بتحويل ملفات SCiLS إلى ملفات .imzML للاستيراد إلى METASPACE (https://metaspace2020.org/) لتحديد الهوية المفترضة.
    ملاحظة: يمكن العثور على وصف كامل لإمكانيات SCiLS Lab في دليل المستخدم ضمن خيار قائمة التعليمات .

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يجب أن يؤدي إكمال هذا البروتوكول إلى ثلاث مجموعات بيانات قوية ل MSI من نفس قسم الأنسجة. في تصور الطيف الكامل لبيانات المستقلب ، ستهيمن على الطيف بشدة قمم المصفوفة عند m / z 157 و 315. هذا أمر طبيعي لأنسجة FFPE. ستتم ملاحظة العديد من إشارات المستقلب والأحماض الدهنية عن طريق تكبير نطاقات m / z <155 وبين 250 و 300. يوضح الشكل 3 أمثلة على الطيف الكامل ونطاقات التكبير التي تسلط الضوء على أطياف المستقلب المعقدة التي تم الحصول عليها من الأنسجة. عادة ، يتم ملاحظة ما بين 700 و 900 ذروة مستقلب من أ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يتطلب جمع بيانات MSI المتسلسلة من قسم أنسجة واحد اهتماما دقيقا بالتفاصيل. هناك بعض الخطوات الحاسمة للغاية لتحقيق بيانات عالية الجودة. أولا ، يجب توخي الحذر إذا تم تحضير أكثر من شريحة واحدة في نفس الوقت. عند وضع الشرائح في برطمانات كوبلين أو التنقل بينها ، احرص على عدم وضع شريحتين في نفس الموضع في البرطمان. سيؤدي ذلك إلى تعرض المذيبات بشكل غير كاف لسطح الأنسجة ، أو يمكن لشريحة واحدة كشط الأنسجة من الشريحة الأخرى. ثانيا ، من الأهمية بمكان أن يسمح للأداة بالموازنة لمدة لا تقل عن 25 دقيقة عن...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ليس لدى المؤلفين تضارب في المصالح للإفصاح عنها.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يتم دعم EHS وجامعة تكساس في أوستن لتصوير الطيف الكتلي من قبل جائزة معهد الوقاية من السرطان وبحوثه في تكساس (RP240559). تم تمويل هذا البحث جزئيا من قبل تحالف أبحاث سرطان المبيض (OCRA 811621 و 891490) ، ومؤسسة Sie ، وصندوق Stephanie C. Stelter Endowment. تم إجراء هذا البحث بالتعاون مع المنشأة الأساسية لقياس التدفق الخلوي والتصوير الخلوي ، والتي تدعمها جزئيا المعاهد الوطنية للصحة من خلال منحة دعم مركز السرطان في إم دي أندرسون P30 CA016672 وأخصائي أبحاث جاريد بيركس في المعهد الوطني للسرطان 1 R50 CA243707-01A1.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
1،5-ديامينونفثالينفيشر العلميةD010125Gمصفوفة MALDI لتصوير المستقلب
أسيتونيتريلفيشر العلميةأ 955-4مذيب من الدرجة LC-MS يستخدم لإعداد المصفوفة
α-cyano-4-hydroxycinnamic acidسيجما ألدريتش70990-1 جيجا إفمصفوفة MALDI لتصوير الجليكان والببتيد
بيكربونات الأمونيومفيشر العلميةأ 643-500عازلة للإنزيمات
فوسفات الأمونيومسيجما ألدريتش467782-50 جراممادة مضافة لتقليل مجموعات المصفوفة أثناء التصوير
غرفة الكشف عن الغطاء NxGenبيوكير الطبيةغير متاحتستخدم لاسترجاع المستضد للأنسجة
ايثانولفيشر العلمية04-355-223مذيب من الدرجة LC-MS يستخدم لإعداد المصفوفة وتلوينها
بخاخ الكاشف الآلي M5تصوير HTXغير متاحتستخدم لتطبيق الإنزيمات والمصفوفات على الأنسجة
ميثانولفيشر العلميةأ456-4مذيب من الدرجة LC-MS لصنع تعليق الفوسفور الأحمر
MS الصف التربسينفيشر العلميةPI90058إنزيم لهضم البروتين
محول الشرائح MTP IIبروكر دالتونيكس8235380محول لإدخال شرائح micrscope في مطياف الكتلة
NanoZoomer SQ الماسح الضوئي الرقمي للشرائحشركة هاماماتسوغير متاحتستخدم لتوليد صور مجهرية رقمية للأنسجة الملطخة
Perfection V600 ماسح ضوئي مسطحإبسونغير متاحتستخدم لإنشاء صورة بصرية للشريحة لجمع بيانات MSI
بتري الختمفيشر العلمية50-212-518لختم طبق بتري أثناء الهضم الأنزيمي
PNGaseFبولدوغ السيرة الذاتيةNZPP550LYإنزيم لانقسام الجليكانات المرتبطة ب N من البروتينات
الفوسفور الأحمرسيجما ألدريتش04004-250 جراممعايرة MALDI لكل من وضع الأيونات الموجبة والسالبة
مختبر SCiLS (2025b)بروكر دالتونيكسغير متاحبرنامج لتصور بيانات MSI
timsTOF fleX QTOF مطياف الكتلةبروكر دالتونيكسغير متاحتستخدم لجمع بيانات قياس الطيف الكتلي
حمض ثلاثي فلور راسيتيكفيشر العلمية85183مادة مضافة مصفوفة لتقليل درجة الحموضة لتصوير وضع الأيونات الموجب
قاعدة تريسفيشر العلميةBP152-500عازلة لاسترجاع المستضد
الماءفيشر العلميةدبليو 64مذيب من الدرجة LC-MS يستخدم للمصفوفات والإنزيمات والتلوين
دبليو اي بي آل X60فيشر العلمية19-413-113مناديل ماصة لحضانة الإنزيم المرطب
الزيلينفيشر العلميةX3P-1GALعامل المقاصة للتلطيخ

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Caprioli, R. M., Farmer, T. B., Gile, J. Molecular imaging of biological samples: Localization of peptides and proteins using MALDI-TOF MS. Anal Chem. 69 (23), 4751-4760 (1997).
  2. Dehoog, R. J., et al. Preoperative metabolic classification of thyroid nodules using mass spectrometry imaging of fine-needle aspiration biopsies. Proc Natl Acad Sci U S A. 116 (43), 21401-21408 (2019).
  3. Eberlin, L. S., et al. Pancreatic cancer surgical resection margins: Molecular assessment by mass spectrometry imaging. PLoS Med. 13 (8), e1002108(2016).
  4. Barry, J. A., Groseclose, M. R., Robichaud, G., Castellino, S., Muddiman, D. C. Assessing drug and metabolite detection in liver tissue by UV-MALDI and IR-MALDESI mass spectrometry imaging coupled to FT-ICR-MS. Int J Mass Spectrom. 377, 448-155 (2015).
  5. Fletcher, J. S., Vickerman, J. C., Winograd, N. Label free biochemical 2D and 3D imaging using secondary ion mass spectrometry. Curr Opin Chem Biol. 15 (5), 733-740 (2011).
  6. Seeley, E. H., Oppenheimer, S. R., Mi, D., Chaurand, P., Caprioli, R. M. Enhancement of protein sensitivity for MALDI imaging mass spectrometry after chemical treatment of tissue sections. J Am Soc Mass Spectrom. 19 (8), 1069-1077 (2008).
  7. Yang, J., Caprioli, R. M. Matrix sublimation/recrystallization for imaging proteins by mass spectrometry at high spatial resolution. Anal Chem. 83 (14), 5728-5734 (2011).
  8. Ščupáková, K., et al. Spatial systems lipidomics reveals nonalcoholic fatty liver disease heterogeneity. Anal Chem. 90 (8), 5130-5138 (2018).
  9. Goncalves, J. P. L., et al. MALDI-MSI: A powerful approach to understand primary pancreatic ductal adenocarcinoma and metastases. Molecules. 27 (15), 4811(2022).
  10. Janssen, C., et al. Robust subtyping of non-small cell lung cancer whole sections through MALDI mass spectrometry imaging. Proteomics Clin Appl. 16 (4), e2100068(2022).
  11. Oezdemir, R. F., et al. Proteomic tissue profiling for the improvement of grading of noninvasive papillary urothelial neoplasia. Clin Biochem. 45 (1-2), 7-11 (2012).
  12. Bauer, J. A., et al. Identification of markers of taxane sensitivity using proteomic and genomic analyses of breast tumors from patients receiving neoadjuvant paclitaxel and radiation. Clin Cancer Res. 16 (2), 681-690 (2010).
  13. Lazova, R., et al. Histopathology-guided mass spectrometry differentiates benign nevi from malignant melanoma. J Cutan Pathol. 47 (3), 226-240 (2020).
  14. Oppenheimer, S. R., Mi, D., Sanders, M. E., Caprioli, R. M. Molecular analysis of tumor margins by MALDI mass spectrometry in renal carcinoma. J Proteome Res. 9 (5), 2182-2190 (2010).
  15. Yagnik, G., Liu, Z., Rothschild, K. J., Lim, M. J. Highly multiplexed immunohistochemical MALDI-MS imaging of biomarkers in tissues. J Am Soc Mass Spectrom. 32 (4), 977-988 (2021).
  16. Clift, C. L., Drake, R. R., Mehta, A., Angel, P. M. Multiplexed imaging mass spectrometry of the extracellular matrix using serial enzyme digests from formalin-fixed paraffin-embedded tissue sections. Anal Bioanal Chem. 413 (10), 2709-2719 (2021).
  17. Escobar, E. E., Seeley, E. H., Serrano-Negron, J. E., Vocadlo, D. J., Brodbelt, J. S. In situ imaging of O-linked beta-N-acetylglucosamine using on-tissue hydrolysis and MALDI mass spectrometry. Cancers (Basel). 15 (4), 1224(2023).
  18. Ferri-Borgogno, S., et al. metabolic, and subcellular mapping of the tumor immune microenvironment via 3d targeted and non-targeted multiplex multi-omics analyses. Cancers. 16 (5), 846(2024).
  19. Wall, M. J., Crowell, A. M. J., Simms, G. A., Liu, F., Doucette, A. A. Implications of partial tryptic digestion in organic-aqueous solvent systems for bottom-up proteome analysis. Analytica Chimica Acta. 703 (2), 194-203 (2011).
  20. Goncalves, J. P. L., Bollwein, C., Schwamborn, K. Mass spectrometry imaging spatial tissue analysis toward personalized medicine. Life (Basel). 12 (7), 1037(2022).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Mass Spectrometry ImagingFormalin Fixed SamplesParaffin Embedded TissueSequential Biomolecule DetectionSpatial OmicsMetabolite ImagingGlycan ImagingTryptic Peptide ImagingTissue Section AnalysisMolecular Interactions

Related Articles