Method Article

التنميط المكاني الشامل للنسخ غير الحيادية للأنواع عبر Stereo-seq

DOI:

10.3791/68619

⸱

October 31st, 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Hematopoietic Biology and Malignancies, The University of Texas MD Anderson Cancer Center, 2Department of Gynecologic Oncology and Reproductive Medicine, The University of Texas MD Anderson Cancer Center, 3Department of Veterinary Medicine & Surgery, University of Texas MD Anderson Cancer Center, 4Department of Genetics, The University of Texas MD Anderson Cancer Center

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تقدم هذه المقالة بروتوكولا لإجراء تنميط نسخي مكاني شامل للحمض النووي الريبي المضيف والفيروسي والفطري والميكروبيوم من أقسام الأنسجة المضمنة بالبارافين الثابت بالفورمالين باستخدام Stereo-seq ، والذي يتيح رسم خرائط عالية الدقة للنسخ المتنوعة مع الحفاظ على بنية الأنسجة.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يمكن أن يؤثر التركيب المكاني للخلايا داخل المضيف ، وكذلك البكتيريا أو الأحمال الفيروسية داخل الأنسجة ، على تفاعل أنواع الخلايا والتحليلات التي تدفع الخلية من خلال عمليات خاصة بنوع الخلية. يستخدم Stereo-seq لأنسجة FFPE التحضير العشوائي للرموز الشريطية المكانية ، والتي تختلف عن طرق النسخ المكانية القياسية ، والتي تستخدم A'tailing لالتقاط الحمض النووي الريبي المرسال (mRNA) أو المستند إلى المسبار لالتقاط النصوص الخاصة بالأنواع. لا تحتضن هذه الطرق المعرفة الأكثر حداثة حول تأثير وأهمية الأنواع الأخرى من الحمض النووي الريبي من الحمض النووي الريبي الطويل غير المشفر ، أو الحمض النووي الريبي للميتوكوندريا ، أو الحمض النووي الريبي الصغير ، أو الأنواع الأخرى ، الحمض النووي الريبي ، مثل الميكروبات والفيروسية والفطرية. الموضح هنا هو إجراء خطوة بخطوة من تقسيم الأنسجة من خلال إعداد المكتبة لتطبيق تسلسل ستيريو محايد للأنواع المكانية مع اكتشاف الحمض النووي الريبي باستخدام منهجية مسبار عشوائي ، والتي تتوافق مع أنسجة البارافين الثابتة الفورمالين (FFPE). تحتوي طريقة Stereo-seq هذه على حبة التقاط عشوائية يبلغ حجمها 0.22 ميكرومتر تتكرر في مصفوفة كل 0.5 ميكرومتر ، مما يسمح بدقة خلوية من تقنية قائمة على التسلسل. نظرا لأن هذه الطريقة تكتشف كلا من الحمض النووي الريبي المضيف وغير المضيف ، فإن البروتوكول يتطلب اعتبارات محددة للسماح بتحديد ما يوجد داخل الأنسجة مقابل ما تم ترسيبه على الأنسجة أثناء عملية الجمع والحفظ والقطع والكشف (أي الملوثات البيئية والتعامل معها). أخيرا ، يسمح هذا البروتوكول للمرء بالحصول على دقة عالية (خلية واحدة) لأنواع الحمض النووي الريبي المتعدد في سياق مكاني ، مما يوفر نظرة ثاقبة لأنواع الخلايا والأنواع المرضية داخل وبين الأفعال الوبينة.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

أحدثت تقنيات الأوميكس المكانية ثورة في دراسة عدم التجانس الخلوي للأنسجة من خلال تمكين القياس الكمي المتزامن لأهداف متعددة ، أو الحمض النووي (علم الجينوم) ، أو الحمض النووي الريبي (علم النسخ) ، أو المستقلبات (التمثيل الغذائي) ، أو البروتين (البروتينات) 1. غالبا ما تختلف دقة هذه المقايسات المختلفة ، مما يوفر قيودا مختلفة عند قياس التحليلات ، إما مع زيادة التناثر عند قياس خلية واحدة2،3 أو السياق المكاني الأصلي4. في المقابل ، توفر الطرق المجمعة مثل تسلسل الحمض النووي الريبي فقط متوسط التعبير الجيني عبر عينات كاملة وتحجب عدم التجانس الخلوي2 ، أو تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية (scRNA-seq) 2،3 ، والذي يتطلب تفكك الأنسجة لتسلسل الخلية المفردة ، غالبا ما يتطلب التصفية. لذلك ، تستبعد هذه الطرق الخلايا الكبيرة والمجاميع ، بينما تحاول طرق المعلوماتية الحيوية إزالة الشظايا والمضاعفات ، وكلها تحفزالتحيزات 5،6،7. تحتفظ علم النسخ المكاني ببنية الأنسجة مما يوفر رؤى مهمة حول التنظيم الخلوي والتفاعلات. لا تحتوي معظم طرق التسلسل المكاني غير المستهدفة على دقة خلية واحدة ، مما يتطلب تفكيك مناطق الالتقاط المكانية التي تحتوي على 10 إلى 100 خلية8،9،10. ومع ذلك ، في العقد الماضي ، تجاوزت النسخ المكاني الاحتياجات من هذه الأساليب ، حيث كانت هناك تقدم في الدقة ، ومساحات أكبر للالتقاط ، وتكامل مناهج omics المتعددة ، إما باستخدام استراتيجية تجريبية أو تقنيات جديدة1،11،12.

يوفر تسلسل Omics المعزز للدقة المكانية (Stereo-seq) دقة نانوية (500 نانومتر) ومنطقة التقاط على نطاق سنتيمتر ، مع التقاط نسخ كامل محايد للأنواع يسمح بالتقاط الترميز والحمض النووي الريبي غير المضيف13. هذه الطريقة هي حاليا أعلى دقة لنسخ النسخ المكانية ولديها خيارات لتوفير أكبر مجالات الرؤية. ومع ذلك ، فإن هذه الطريقة لها بعض القيود الملحوظة ، بما في ذلك متطلبات الوقت والعمالة التي تبلغ حوالي 15 ساعة من الوقت العملي ، والتي تمتد على 4 أيام لإكمال المكتبات الجاهزة للتسلسل. بالمقارنة ، تتطلب تقنيات النسخ المكانية الأخرى القائمة على التسلسل ، مثل النسخ المكاني القائم على المسبار ، وعلم النسخ المكاني المستند إلى مصفوفة polyA-capture ، و Slide-seq ، والترميز الشريطي الحتمي في الأنسجة لتسلسل omics المكاني (DBiT-seq) عادة ما يتطلب من 5 إلى 8 ساعات من الوقت العملي على مدار 2 إلى 3 أيام (الجدول 1). بالنسبة للعديد من الباحثين ، تفوق هذه التطورات التحديات التقنية وهي مثالية لبناء أطالس مكانية كاملة لنسخ النسخ لدراسة تطور المرض على المستويين الخلوي وتحت الخلوي ، خاصة إذا تم وضعها في طبقات مع تقنيات أخرى1.

يحتوي بروتوكول Stereo-seq على إمكانيات تتجاوز نسخ mRNA التقليدية ، والتي تعتمد على مجسات poly-T لالتقاط نصوص mRNA متعددة الأدينيل. يمكن تعديل هذه الطرق عن طريق إضافة polyadenylation إلى الأنسجة الطازجة14 أو مجسات خاصة بالأنواع لمجموعات الجينات المحددة مسبقا المستهدفة15 لتحليل التعبير المكاني. بدلا من ذلك ، يستخدم Stereo-seq مجسات نيوكليوتيدات عشوائية لاختيار الحمض النووي الريبي المتنوع بغض النظر عن الأنواع ، بما في ذلك الحمض النووي الريبي الميكروبي ، والحمض النووي الريبي الفطري ، والحمض النووي الريبي الفيروسي ، والحمض النووي الريبي غير متعدد الأدينيل مثل الحمض النووي الريبي المحسن ، والحمض النووي الريبي الدائري ، والحمض النووي الريبي الطويل غير المشفر (lncRNAs) 16. من الناحية النظرية ، من الممكن التقاط الحمض النووي الريبي الأصغر أو العناصر التعويضية مثل الحمض النووي الريبي المتداخل الصغير (siRNAs) ، والحمض النووي الريبي الصغير (miRNAs) ، والينقولات17. ومع ذلك ، لا تزال المعلوماتية الحيوية ورسم خرائط هذه الحمض النووي الريبي حاليا صعبة وغالبا ما يتم تصفيتها أثناء المحاذاة الأولية ، والتي تستخدم عادة قطعا 30 نقطة أساس.

الموضح هنا هو بروتوكول مفصل ، مع تعديلاتنا لالتقاط النيوكليوتيدات العشوائية للشركة المصنعة على رقائق كرات الحمض النووي النانوية (DNB) لضمان فهم ومعالجة أفضل لبروتوكول Stereo-seq الموضح في الشكل 1. يتضمن هذا البروتوكول استراتيجيات لعلماء الأحياء الجزيئية لاختبار أنسجة FFPE الجديدة على Stereo-seq مع التقاط النيوكليوتيدات العشوائي لإنتاج عوائد أكثر اتساقا وأعلى من العينات المؤرشفة والأنسجة الدهنية ذات الجودة المنخفضة. تم تحسين البروتوكول الموضح لعينات FFPE من معظم الأعضاء ، بغض النظر عن أنواع المنشأ. ومع ذلك ، لا يتضمن هذا البروتوكول التعديلات الحالية اللازمة للتعامل مع الأنسجة الصعبة مثل نخاع العظام ، والتي تتطلب إزالة الكلس.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

لا يتم توفير أي بيانات سريرية في ورقة الطرق هذه لعينة مريض سرطان المبيض المصلي الساذج عالي الجودة. ومع ذلك ، تم جمع البيانات السريرية المرتبطة باتباع البروتوكولات المعتمدة من قبل مجلس المراجعة المؤسسية (IRB) في مركز إم دي أندرسون للسرطان بجامعة تكساس ، قسم الأورام النسائية والطب التناسلي ، من المشاركين الذين قدموا موافقة خطية مستنيرة.

ملاحظة: يوصى بارتداء قناع جراحي وقفازات أثناء البروتوكول بأكمله لمنع تلوث RNase. ينصح الباحثون ذوو الشعر الطويل بسحبه للخلف أو حتى ارتداء شبكة شعر. استخدم دائما المياه المعقمة الخالية من النوكلياز (NFW) وأنابيب الحمض النووي / الحمض النووي الريبي الخالية من النوكلياز منخفضة الارتباط لزيادة الإنتاجية. قد تتطلب الأنسجة غير الثديية ، مثل الأنسجة النباتية ، تحسين الالتزام ، بما في ذلك بولي إل لايسين (PLL) وأوقات النفاذية الممتدة بسبب جدران الخلايا. في حين أن الالتقاط الجزيئي لا يزال ممكنا من الناحية النظرية ، إلا أن التحقق التجريبي ضروري لأن الأنسجة النباتية لا تزال غير مختبرة في سير عملنا الحالي.

1. تقييم جودة الحمض النووي الريبي وقيمة توزيع شظايا الحمض النووي الريبي 200 درجة

  1. قم بتقييم جودة الحمض النووي الريبي باستخدام قيمة توزيع أجزاء الحمض النووي الريبي 200 (DV200) ، والتي تقيس النسبة المئوية للحمض النووي الريبي التي تزيد عن 200 نقطة أساس.
  2. استخدم قسمين بحجم 10 ميكرومتر من نفس كتلة الأنسجة المخصصة لمعالجة Stereo-seq.
    ملاحظة: المعالجة الفورية هي الأمثل، ولكن يمكن تخزين العينات في درجة حرارة 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى أسبوع واحد، أو -20 درجة مئوية لمدة 4 أسابيع، أو -80 درجة مئوية لمدة 6 أشهر.
  3. استخراج الحمض النووي الريبي باستخدام بروتوكول استخراج الحمض النووي الريبي الانتقائي غير الحجم كما هو موضح من قبل Patel et al.18 للسماح بتقييم دقيق لتوزيع أحجام أجزاء الحمض النووي الريبي.
  4. قم بتقييم جودة الحمض النووي الريبي باستخدام أحد الخيارات التالية باستخدام محلل الأجزاء لتحديد درجة DV200 ، أو النسبة المئوية للمساحة الموجودة أسفل المنحنى التي تمثل شظايا الحمض النووي الريبي الأطول من 200 نقطة أساس. من الناحية المثالية ، يجب أن يكون للأنسجة درجة DV200 (> 50٪) وتركيز (> 10 نانوغرام / ميكرولتر).

2. تنظيف مساحة العمل

  1. نظف جميع الأسطح بمادة تبييض بنسبة 30٪. اترك الأسطح تجف لمدة 30 دقيقة على الأقل لمنع تكوين الكلوروفورم من مزيج المبيض والإيثانول.
  2. امسح الأسطح بمناديل إزالة التلوث من الحمض النووي (DDW). رش جميع الأسطح بمحلول إزالة التلوث RNase (RDS) ثم 70٪ إيثانول محضر باستخدام NFW.
    ملاحظة: لا تخلط أبدا المبيض أو أي كحول آخر. أنتج هذا المزيج الكلوروفورم ، وهو شديد السمية ويمكن أن يسبب فقدان الوعي أو تلف الأعضاء أو الموت حتى في حالات التعرض المنخفض.

3. إعداد رقاقة التقاط قليل النوكليوتيدات العشوائية (N-رقاقة) ستيريو

  1. قم بتنظيف مساحة العمل كما هو موضح في الخطوتين 2.1 و2.2، بما في ذلك جميع الأنظمة المستخدمة في هذه الخطوة.
  2. قم بإزالة شريحة Stereo-seq N من عبوتها ، وسجل معرف الشريحة ، ونظف حواف شريحة Stereo-seq N والشريحة الزجاجية بالإيثانول بنسبة 100٪ دون لمس الشريحة. اتركيه حتى يجف تماما.
  3. تطبيق الراتنج لتثبيت الشريحة على الشريحة (اختياري للمستخدمين الذين يستخدمون الزيلين).
    ملاحظة: على الرغم من أن البائعين التجاريين غالبا ما يوصون بعوامل الإزالة غير الزيلين ، فقد لوحظ أن عوامل الإزالة غير الزيلين يمكن أن تكون أقل فعالية اعتمادا على خليط البارافين. غالبا ما تكون غير متوافقة مع بعض المواد البلاستيكية أو الراتنجات الاصطناعية أو الأنسجة المدمجة في شمع النحل ، ولا تمسح البارافينات المتشابكة بشدة أو ذات نقطة الانصهار العالية بكفاءة. إذا لم تكن متأكدا من تركيبة البارافين المستخدمة لتضمين العينة ، فمن المستحسن استخدام الزيلين للتطهير الأمثل. علاوة على ذلك ، فإن الزيلين أكثر قدرة على تنظيف الأنسجة الدهنية ، مثل الثدي أو المبيض أو البويضة أو أنسجة المخ.
    1. رج الراتنج أو اخلطه جيدا للتأكد من أنه أبيض متجانس. باستخدام ماصة دقيقة ، ضع بعناية 10 ميكرولتر من راتنج السيراميك القابل للمعالجة بالأشعة فوق البنفسجية حول حافة شريحة Stereo-seq N (الشكل 2 أ).
      ملاحظة: يمكن أن يسبب الراتنج تهيج الجلد والعين وقد يؤدي إلى ردود فعل تحسسية للجلد مع التعرض المتكرر. عند سحب العينات أو التعامل مع هذا الراتنج ، ارتد دائما قفازات النتريل ونظارات واقية ومعطف مختبر. اعمل في منطقة جيدة التهوية وارتد قناعا عند استخدام كميات كبيرة أو محلول تسخين وتجنب ملامسة الجلد أو العينين مباشرة.
    2. استخدم مسحة رغوة محكمة الغلق ، وقم بإزالة الراتنج الزائد ، ولم يترك سوى خط رفيع حول حافة الرقاقة. ضع الشريحة في جهاز المعالجة بالأشعة فوق البنفسجية ، مع التأكد من عدم لمس سطح الشريحة.
    3. ضع الشريحة المطبقة بالراتنج فوق قناع غير شفاف على مصدر ضوء الأشعة فوق البنفسجية 405 نانومتر لإضاءة الجزء الخلفي من الشريحة وعلاجها لمدة 5 دقائق. هذا موضح في الشكل 2 ب.
      ملاحظة: لا تفرط في تعريض شريحة Stereo-seq N للأشعة فوق البنفسجية ولا تلمس الراتنج على سطح الرقاقة ، لأنها قد تسبب آثارا ضارة على الكرات النانوية.
    4. بعد المعالجة ، استخدم مسحات رغوية محكمة الغلق مبللة في كل مما يلي: 100٪ إيثانول جزيئي ؛ 70٪ إيثانول وأخيرا NFW للتنظيف حول الحافة حيث تم وضع الراتنج. إذا انفصلت البقع البيضاء ، فقم بتنظيف الحافة مرة أخرى. لا تلمس سطح الرقاقة أبدا (الشكل 2 ج).
    5. اترك الشريحة تجف تماما في الهواء. بعد الفحص ، قم بتخزين الرقائق طوال الليل عند 4 درجات مئوية مع مجفف إذا لزم الأمر. ومع ذلك ، يوصى بالاستمرار في تحضير الرقائق وتقسيمها على الفور عندما يكون ذلك ممكنا.
      ملاحظة: ارتد دائما معدات الحماية الشخصية المناسبة ، بما في ذلك النظارات الواقية من الأشعة فوق البنفسجية ، عند العمل مع ضوء الأشعة فوق البنفسجية. تعامل مع الإيثانول والراتنج في منطقة جيدة التهوية ، ويفضل أن يكون غطاء الدخان. التخلص من النفايات وفقا للإرشادات المؤسسية.
  4. تحضير الرقاقة باستخدام Poly-L-lysine (اختياري للأنسجة الدهنية أو الأنسجة التي تعاني من مشاكل الالتصاق.)
    1. قم بتنظيف مساحة العمل كما هو موضح في الخطوتين 2.1 و2.2، بما في ذلك جميع الأنظمة المستخدمة في هذه الخطوة.
      ملاحظة: لا ترش المواد الكيميائية مباشرة في جهاز PCR. بالنسبة لجميع خطوات ما قبل تفاعل البوليميراز المتسلسل ، اعمل في غطاء تفاعل البوليميراز المتسلسل ، إن أمكن ، لمنع التلوث بما في ذلك التضخيم السابق ل (كدنا).
    2. اغمر الرقاقة ثلاث مرات في NFW جديد باستخدام أنبوب مخروطي سعة 50 مل.
    3. جفف الرقاقة باستخدام الهواء المضغوط ، باستخدام القوة الكاملة للهواء المضغوط بزاوية 60 درجة إلى 80 درجة تقريبا قطريا (45 درجة) عبر سطح الرقاقة من حوالي 5 سم بعيدا عن سطح الرقاقة (الشكل 2E). إذا بدا السطح غائما ، كرر الغسيل باستخدام NFW جديد وجففه مرة أخرى (يعني سطح السحابة عادة أن السيراميك لم يتم غسله أو معالجته بشكل كاف في الخطوات السابقة).
    4. ضع 150 ميكرولتر من محلول PLL لتغطية سطح الرقاقة بالكامل. احتضان لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة (22 درجة مئوية إلى 25 درجة مئوية). هذا موضح في الشكل 2D.
    5. قم بإزالة محلول PLL واغسل الشريحة مرتين بالماء الخالي من النوكلياز لمدة 10-15 ثانية.
    6. جفف حواف الشريحة بعناية بعد الغسيل الثاني (دون لمس الشريحة).
    7. جفف الرقاقة بإحكام باستخدام الهواء المضغوط ، باستخدام القوة الكاملة للهواء المضغوط بزاوية 60 درجة إلى 45 درجة تقريبا تتحرك قطريا عبر سطح الرقاقة من حوالي 5 سم بعيدا عن سطح الرقاقة (الشكل 2E).
      ملاحظة: يجب أن تكون الشريحة جافة تماما في غضون 30 ثانية أو أقل. إذا استغرق الأمر وقتا أطول من ذلك ، إزعاج DNB ، مما سيؤدي إلى ظهور قطع أثرية في الالتقاط.
    8. تابع التركيب في غضون 1 ساعة وحافظ على الشريحة جافة.
      ملاحظة: إذا بدا سطح الرقاقة غائما بعد التجفيف ، اغسله باستخدام NFW جديد وكرر عملية التجفيف. إذا كانت هناك قطع أثرية على سطح الرقاقة بعد التجفيف ، فقد يتسبب ذلك في حدوث مشكلات في الالتقاط في تلك المناطق. تجنب استخدام PLL للالتصاق إذا كانت الأنسجة لا تتطلب ذلك. يمكن أن يتسبب لمس الشريحة في حدوث خدوش وفقدان مناطق الالتقاط قبل إطلاق (كدنا) ، أو التقاط غير متساو بعد الإطلاق. يؤدي الراتنج الموجود على سطح الرقاقة إلى فقدان مرقط لمناطق الالتقاط. قد يؤدي وضع الرقاقة بالقرب من فوهة الهواء المضغوط إلى تكوين بلورات ورذاذ من علامات DBN التالفة عبر سطح الرقاقة ؛ ومع ذلك ، فإن هذا نادر الحدوث ويحدث عادة فقط إذا كانت الفوهة تكاد تلمس الرقاقة وكانت زجاجة الهواء المضغوط باردة جدا. يوصى بممارسة هذا الإجراء عدة مرات باستخدام رقائق التقييم ، لأن هذه الخطوة تمثل تحديا تقنيا.

4. تقسيم الأنسجة وتركيبها

  1. تأكد من نظافة مساحة العمل كما هو موضح في الخطوتين 2.1 و 2.2. تأكد من استخدام شفرات جديدة و NFW لجميع الحمامات المائية والثلج أثناء تقسيم الأنسجة وتركيبها. لا تلمس الرقاقة مباشرة ، وقم بتغطية 80٪ فقط من الرقاقة بالمناديل.
    ملاحظة: يوصى باستخدام سمك 5 ميكرومتر للأنسجة القياسية أو 4 ميكرومتر للأنسجة عالية الدهون. استخدم شريطا من المقاطع التسلسلية لمطابقة الطرائق عبر العينات، إن أمكن.
  2. جفف الشرائح عند 42 درجة مئوية لمدة 3 ساعات إما في فرن أو على جهاز تفاعل البوليميراز المتسلسل مع فتح الغطاء. ثم انقل الشرائح أو قم بتغيير درجة الحرارة على الفرن أو جهاز PCR إلى 37 درجة مئوية واخبزها طوال الليل لمدة 12-48 ساعة. يوصى باستخدام حوالي 18 ساعة.
  3. نقطة توقف اختيارية: بعد التجفيف ، أغلق الشرائح في أكياس الألمنيوم بمجفف عند 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى أسبوع واحد قبل المتابعة.
    ملاحظة: قد تقلل أوقات التجفيف الأطول من سلامة الحمض النووي الريبي. سيؤدي التجفيف القصير جدا إلى انخفاض التصاق الأنسجة بالشريحة قد يقلل الخبز على درجة حرارة أعلى من سلامة الحمض النووي الريبي. يمكن شحن الشرائح للمعالجة الخارجية (على سبيل المثال ، تحليل المضيف). ومع ذلك ، لا ينصح بالشحن لتحليل الميكروبيوم بسبب زيادة التلوث المحتمل أثناء العبور.

5. إزالة الشرائح

  1. تأكد من نظافة مساحة العمل كما هو موضح في الخطوتين 2.1 و 2.2.
  2. قم بإعداد الكواشف لإزالة البارافين وبروتوكول Stereo-seq.
    1. Aliquot الكواشف المطلوبة: اثنان 30 مل من الزيلين في أنابيب مخروطية سعة 50 مل ، واثنان 30 مل من الإيثانول بنسبة 100٪ في أنابيب مخروطية سعة 50 مل.
    2. قم بإعداد الكواشف المخففة التالية باستخدام NFW: 96٪ إيثانول لكل شريحة (مطلوب 2 مخروطي أو 1 مل) ، 90٪ إيثانول لكل رقاقة ، 80٪ إيثانول لكل شريحة ، 70٪ إيثانول لكل رقاقة ، 50٪ إيثانول لكل شريحة ، 30٪ إيثانول لكل شريحة ، 2.5 مل من سترات الصوديوم المالحة 5 أضعاف (SSC) من محلول 20x ، 5 مل من 0.01N حمض الهيدروكلوريك (تمييع 0.1N HCl مع NFW إلى الرقم الهيدروجيني 2). بالنسبة لتخفيف الإيثانول ، قم إما بإعداد محلول واحد سعة 30 مل في أنابيب مخروطية سعة 50 مل أو محلول 500 ميكرولتر في أنبوب سعة 1.5 مل في حالة استخدام حشوات سيليكون.
    3. قم بإعداد المحاليل التالية واحتفظ بها على الثلج: أنا) 32.5 مل من 0.1x SSC من محلول 5x (احتفظ ب 30 مل من المحلول في أنبوب مخروطي وضع 2.5 مل الأخرى في أنبوب 5 مل لاستخدامها في المستقبل) ، ب) 400 ميكرولتر من 0.1x SSC مع 5٪ RI ، استمر على الثلج.
    4. قم بإعداد الكواشف المخففة التالية ب 0.1 نيوتن حمض الهيدروكلوريك.
      1. قم بإعداد محلول كاشف النفاذية (PR) 10x عن طريق إضافة 1 مل من 0.1 N HCl إلى الكاشف المجفف بالتجميد المقدم تجاريا.
        ملاحظة: احتفظ بالثلج لمدة 1 ساعة فقط ، وتأكد من الاقتباس للاستخدام في المستقبل ، وقم بتجميده عند -20 درجة مئوية.
      2. قم بإعداد 500 ميكرولتر من محلول PR 1x (قم بتخفيف محلول PR 10x مع 0.01 نيوتن حمض الهيدروكلوريك ، واحتفظ بالثلج لمدة تصل إلى 6 ساعات).
        ملاحظة: من الأهمية بمكان أن يكون الرقم الهيدروجيني ل 0.01 N HCl في حدود 10٪ من الرقم الهيدروجيني 2.0 ، حيث تعمل الإنزيمات القائمة على البيبسين على النحو الأمثل عند الرقم الهيدروجيني 2.
  3. قم بإزالة البارافينات من الشرائح عن طريق نقع الشرائح في الزيلين (موصى به) لمدة جولتين كل منهما 20 دقيقة.
  4. على الفور ، قم بترطيب العينة بالإيثانول (100٪ ، 96٪ ، لجولتين ، 5 دقائق لكل منهما ، متبوعا ب 90٪ و 70٪ و 50٪ و 30٪ لمدة جولة واحدة ، دقيقتين). أخيرا ، أعد الترطيب باستخدام NFW لمدة 1 دقيقة. لتخفيف الإيثانول ، استخدم 30 مل من المحلول في أنبوب مخروطي سعة 50 مل لكل شريحة إذا كنت تقوم بإعداد عينات لدراسات الميكروبيوم ، أو استخدم 30 مل لكل شريحتين في حالة تحضير عينات غير ميكروبيوم. لجميع التخفيفات اللاحقة ، قم بإعداد 30 مل من المحلول في أنبوب مخروطي سعة 50 مل ، أو في حالة استخدام حشوات السيليكون ، استخدم 500 ميكرولتر من المحلول لكل شريحة 1 سم2 لتغطية منطقة الرقاقة بالكامل.
    اختياري: يقترح وضع غرفة سيليكون من شريحة إزالة من 3 غرف حول الرقاقة لإنشاء ختم بعد خطوة الإيثانول بنسبة 100٪ ، كما هو موضح في الشكل 2F-H. هذا يسمح باستخدام كميات أصغر من الكواشف ويقلل من خطر إتلاف الشريحة. بدلا من ذلك ، يمكن استخدام أنابيب مخروطية سعة 50 مل لغمر شريحة Stereo-seq بالكامل طوال الإجراء.

6. (اختياري) التصوير النووي وتلوين ssDNA

ملاحظة: اسمح لكاشف فك الارتباط FFPE بالوصول إلى درجة حرارة الغرفة (~ 25 درجة مئوية) قبل الاستخدام في 6.1. حلول تلطيخ أخرى ممكنة ، لكن التلوين النووي الفلوري مطلوب حاليا لتجزئة الخلية المفردة وتجميع الخلايا للبيانات النسخية.

  1. تلطيخ التألق باستخدام صبغة الحمض النووي أحادية الشريطة (ssDNA)
    1. قم بإعداد 2 ميكرولتر من محلول تلطيخ ssDNA في المخزن المؤقت SSC عن طريق تخفيف كاشف Qubit ssDNA باستخدام مخزن مؤقت 5x SSC بتخفيف 1: 1 لكل 1 إلى 2 شريحة.
      ملاحظة: يمكن أن يتغير تخفيف ssDNA بناء على المجهر المستخدم عند التصوير.  لذلك ، يجب اختبار المجاهر الجديدة باستخدام مجموعة تخفيفات صبغ ssDNA باستخدام رقاقة التقييم وأنسجة الاختبار لتحديد أفضل نطاق ديناميكي.
    2. قم بإنشاء مزيج رئيسي من محلول التلوين (200 ميكرولتر لكل شريحة) باستخدام تخفيف 1:20 من مثبط RNase (RI) ، وتخفيف 1: 200 لتخفيف ssDNA ، و 5x SSC المتبقي.
    3. أضف محلول تلطيخ (150 ميكرولتر لكل شريحة) واحتضنه في الظلام لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. قم بإزالة محلول التلوين برفق من زاوية الرقاقة باستخدام ماصة.
      ملاحظة: في حالة استخدام حجرة السيليكون القابلة للإزالة ، قم بإزالتها قبل تلطيخ الرقاقة بمزيج صبغة ssDNA.
    4. اغسل الشريحة مرتين باستخدام 0.1x SSC (150 ميكرولتر لكل شريحة في كل مرة) لمدة 10-15 ثانية. جفف حواف الشريحة بعناية باستخدام ورق العدسة بعد الغسيل الثاني (دون لمس الشريحة).
    5. أضف ~ 3-5 ميكرولتر من الجلسرين (استخدم كمية أقل للمجهر المقلوب) لتركيب البرسيم (كن حذرا من الفقاعات).
      ملاحظة: تأكد من تطبيق الحجم الصحيح للجلسرين على منطقة الشريحة ، عادة حوالي 4 ميكرولتر لشريحة 1 سم2. يمكن أن يؤدي استخدام الكثير من الجلسرين إلى إزاحة الغطاء عند تثبيت الشريحة عموديا. يزيد استخدام القليل جدا من الجلسرين من خطر تلف الأنسجة عند إزالة الغطاء وقد يؤدي إلى ظهور فقاعات ، مما قد يؤثر سلبا على نتائج التصوير وتجزئة الخلية الواحدة.
    6. قم بإسقاط الغطاء من ارتفاع حوالي 1 سم على الشريحة. في حالة استخدام مجهر متداخل ، تأكد من عدم انزلاق الغطاء عند الإمساك به عموديا. إذا حدث ذلك ، أعد التركيب دون إضافة المزيد من الجلسرين.
    7. التقط صورا فلورية للأنسجة الملطخة ب ssDNA باستخدام مجهر واسع المجال مع تداخل بنسبة 10٪ بين مربعات الصور.
      ملاحظة: يوصى بعمل خريطة تركيز يدوية من 9-13 نقطة باستخدام مجهر واسع المجال باستخدام هدف 10x. يمكن استخدام المجهر متحد البؤر ، لكنه أكثر حساسية للتغيرات البؤرية عبر الأنسجة والرقاقة.
    8. قم بدمج برامج معالجة الصور مثل ImageJ، باستخدام التداخل النظري لإنشاء الموضع التقريبي لكل بلاطة ثم إجراء تداخل حسابي مطابق للبكسل لضبط تجانب الصورة
    9. قم بمعالجة الصور في برنامج StereoMap وتأكد من مرور Image QC قبل المتابعة.
    10. اغمر شريحة Stereo-seq في 30 مل من 0.1x SSC حتى ينفصل الغطاء.

7. عملية فك الربط

ملاحظة: تجنب لمس الرقاقة أو إمالتها أثناء هذه الخطوة، وقم بسحب الماصة برفق.

  1. تأكد من أن كاشف فك الارتباط FFPE في درجة حرارة الغرفة الدافئة (~ 25 درجة مئوية) وافحصه للتأكد من عدم وجود جزيئات تجعل المحلول غائما. إذا كانت الجسيمات مرئية ، سخنيها إلى 55 درجة مئوية واتركيها تبرد إلى 30 درجة مئوية قبل الاستخدام.
  2. قم بتشغيل جهاز التدوير الحراري بالإعدادات التالية: 30 درجة مئوية للتوازن (غطاء ساخن 85 درجة مئوية) ؛ 95 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة حضانة ؛ 4 °C وقت الانتظار اللانهائي.
  3. قم بتجميع حشية الكاسيت ، ثم ضع شريحة شريحة Stereo-seq في الكاسيت.
  4. أضف كاشف فك الربط FFPE (400 ميكرولتر لكل شريحة) إلى بئر الكاسيت الذي يحتوي على الشريحة. ضع شريط مانع للتسرب على الكاسيت وتأكد من إغلاقه بإحكام.
  5. ابدأ الحضانة لمدة 30 دقيقة عند 95 درجة مئوية من الخطوة 7.2. بمجرد مرور 10 دقائق ، ضع 10 مل من الميثانول في وعاء سعة 15 مل (ستكون هناك حاجة إلى حوالي 1 مل لكل شريحة) في فريزر -20 درجة مئوية.
  6. قم بإزالة الرقاقة بعناية من جهاز التدوير الحراري ، وانقل الكاسيت إلى المقعد ، وانزع شريط الختم.
  7. قم بإزالة كاشف فك الارتباط FFPE وتجاهله باستخدام ماصة. بمجرد إزالة جميع الكواشف الفك ، افصل الكاسيت والحشية وتخلص منهما.
  8. قم بموازنة شريحة Stereo-seq إلى درجة حرارة الغرفة ~ 23 درجة مئوية. تحت غطاء دخان معقم ، جفف حافة الشريحة وقم بتطبيق حجرة سيليكون جديدة (إن أمكن). أضف 500 ميكرولتر من الميثانول المبرد من الفريزر -20 درجة مئوية ، مع التأكد من غمر القسم بأكمله بالكامل لمدة 20 دقيقة.
    ملاحظة: بدلا من ذلك ، يمكن غمر شريحة Stereo-seq بأكملها في أنبوب مخروطي سعة 50 مل مملوء ب 30 مل من الميثانول المبرد.
  9. قم بتسخين محلول PR 1x على كتلة جافة بدرجة حرارة 37 درجة مئوية لمدة 10 دقائق قبل الاستخدام قبل حوالي 5 دقائق من نهاية تثبيت الميثانول (الخطوة 7.8).
  10. بعد اكتمال التثبيت ، انقل الشريحة إلى غطاء دخان معقم. امسح أي ميثانول زائد على الشريحة وانتظر تبخر الميثانول المتبقي على الرقاقة (~ 5 دقائق). قم بتجميع كاسيت وحشية جديدة. بمجرد أن يتبخر الميثانول بالكامل ، ضع شريحة شريحة Stereo-seq في الكاسيت.

8. النفاذية والنسخ العكسي

ملاحظة: بالنسبة للخطوات 8.1-8.11، قم بسحب الماصة ببطء ولا تلمس الشريحة. سيؤدي الضغط الزائد إلى انتشار أو علامات في DNBs.

  1. أضف 200 ميكرولتر من كاشف النفاذية إلى الشريحة. ضع شريط مانع للتسرب على كاسيت الشرائح Stereo-seq وتأكد من إغلاقه بإحكام.
  2. احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
  3. قم بإعداد المخزن المؤقت للغسيل عن طريق إضافة 380 ميكرولتر من 0.1x SSC و 20 ميكرولتر من RI (مثبط الحمض النووي الريبي) لكل شريحة. اصنع 400 ميكرولتر لكل شريحة واحتفظ بها على الثلج حتى يتم استخدامها.
  4. اسحب الكواشف الخاصة بالنسخ العكسي ل FFPE (FFPE RT) ، ثم قم بتدوير كل ما يلي ، واحتفظ بمزيج الإنزيم ، وقليل القلة ، والثنائيات على الجليد. قم بتسخين المخزن المؤقت FFPE RT إلى درجة حرارة الغرفة (~ 23 درجة مئوية).
  5. قبل 5 دقائق من نهاية النفاذية ، قم بإعداد 200 ميكرولتر لكل شريحة من مزيج FFPE RT. أضف المخزن المؤقت FFPE RT (158 ميكرولتر) ، ومزيج إنزيم FFPE RT (30 ميكرولتر) ، وقليل FFPE RT (10 ميكرولتر) ، وثنائي FFPE (2 ميكرولتر). امزج هذا برفق واحتفظ به على الثلج.
  6. مع الحفاظ على الرقاقة على جهاز التدوير الحراري ، قم بتغيير درجة حرارة الحضانة إلى درجة حرارة الغرفة (~ 23 درجة مئوية). قم بإزالة الختم وتخلص برفق من محلول 1x PR.
  7. اغسل الشريحة برفق شديد باستخدام 200 ميكرولتر من 0.1x SSC (مع 5٪ RI) لكل شريحة 1 سم2 .
  8. قم بإزالة 0.1x SSC (مع 5٪ RI) من زاوية الشريحة.
  9. أضف 200 ميكرولتر من محلول FFPE RT إلى زاوية الشريحة.
  10. ضع شريط مانع للتسرب على كاسيت الشريحة Stereo-seq وتأكد من إغلاقه بإحكام ؛ خلاف ذلك ، فإن التبخر يقلل من المحصول.
  11. ابدأ بروتوكول تفاعل حضانة FFPE RT متساوي الحرارة عند 42 درجة مئوية مع غطاء ساخن 45 درجة مئوية لمدة (5 إلى 24 ساعة).
    ملاحظة: يوصى بالاحتضان لمدة 12 إلى 16 ساعة وأن تكون متسقة عبر التجارب.

9. إطلاق وتنقية (كدنا)

ملاحظة: بالنسبة للخطوات 9.6-9.7، قم بإشعال الماصة ببطء ولا تلمس الشريحة. سيؤدي الضغط الزائد إلى انتشار أو علامات في DNBs.

  1. قم بإعداد 400 ميكرولتر من المخزن المؤقت لإطلاق (كدنا) عن طريق تسخين المخزن المؤقت لإطلاق (كدنا) عند 55 درجة مئوية لإذابة أي راسب قد تكون قد تشكلت.
  2. قم بموازنة المخزن المؤقت لإطلاق (كدنا) إلى درجة حرارة الغرفة الدافئة (25 درجة مئوية). لا تضع الجليد.
  3. قم بتدوير المخزن المؤقت لإطلاق (كدنا) ويقوم إنزيم (كدنا) بتحرير 100 × جم في جهاز طرد مركزي منضدية قبل الاستخدام.
  4. قم بإعداد المخزن المؤقت (كدنا) عن طريق إضافة 20 ميكرولتر من إنزيم الإطلاق إلى 380 ميكرولتر من المخزن المؤقت لإطلاق (كدنا).
  5. مع الحفاظ على الرقاقة على جهاز التدوير الحراري ، قم بتغيير درجة حرارة الحضانة إلى درجة حرارة الغرفة (~ 23 درجة مئوية). قم بإزالة الختم وقم بإزالة محلول FFPE RT برفق وتخلص منه.
  6. اغسل الشريحة مرة واحدة ، برفق بشكل لا يصدق ، باستخدام 0.1x SSC لكل شريحة (200 ميكرولتر).
  7. قم بإزالة 0.1x SSC من زاوية الشريحة، مع سحب العنصة بحذر شديد.
  8. أضف 400 ميكرولتر من محلول إطلاق (كدنا) المحضر إلى كل شريحة.
  9. أغلق كاسيت الشريحة Stereo-seqs عن طريق وضع شريط مانع للتسرب (أو غطاء PCR) على الكاسيت. تأكد من إغلاق الكاسيت بإحكام لمنع أي تبخر أو تسرب أو تلوث.
  10. احتضان عند 55 درجة مئوية لمدة 5 ساعات ≥ (5 ساعات كحد أدنى حتى 24 ساعة) مع غطاء مسخن إلى 60 درجة مئوية.
    ملاحظة: يوصى بالاحتضان لمدة 5 إلى 7 ساعات أو أن تكون متسقة عبر التجارب مع ساعتين.

10. جمع مزيج إطلاق (كدنا)

  1. سخن NFW إلى 37 درجة مئوية (500 ميكرولتر على الأقل لكل شريحة 1 سم2).
  2. قم بإزالة الختم والماصة بقوة في كل زاوية ووسط من الرقاقة فوق المنديل ، لكن لا تكشط أو تلمس الأنسلة. اجمع كل مزيج تحرير (كدنا) من الشريحة وانقله إلى أنبوب طرد مركزي سعة 1.5 أو 2.0 مل. سجل أرقام تعريف الرقاقة (معرف الرقاقة) على كل أنبوب.
  3. أضف 350 ميكرولتر من NFW المسخن مسبقا مباشرة على سطح الشريحة. ومرة أخرى ، قم بسحب الماصة بقوة باستخدام ماصة أصغر (P100 أو P200) ، مع إمالة الطرف لتطبيق المزيد من قوة القص ، ولكن لا تلمس المنديل أو تتخلص من الشريحة.
  4. اجمع بين الغسيل من الخطوة 10.3 (350 ميكرولتر) مع مزيج تحرير (كدنا) من الخطوة 10.2 (400 ميكرولتر). تأكد من دمج العينات من شريحة واحدة فقط.
  5. ضع 100 ميكرولتر من NFW على الشريحة ، وأغلق شريحة شريحة Stereo-seq في الكاسيت ، وقم بتخزينها في الثلاجة حتى نهاية البروتوكول.
    ملاحظة: في حالات العائد المنخفض ، ضع في اعتبارك إعادة إطلاق (كدنا). يمكن تقييم وجود الحمض النووي على الرقاقة باستخدام صبغة ssDNA وإعادة التصوير مع أو بدون غطاء.

11. جمع تنظيف حبة (كدنا)

  1. أعد تعليق (كدنا) من الخطوة 10.4 بحجم متساو من حبات التثبيت العكسي للطور الصلب (SPRI). امزج حتى يتم توزيع الخرزات بالتساوي في جميع أنحاء المحلول لتحديد شظايا الحمض النووي أكثر من ~ 100 نقطة أساس.
  2. احتضان لمدة 10 دقائق عند درجة حرارة من 27 درجة مئوية إلى 37 درجة مئوية (يوصى ب 30 درجة مئوية).
    1. أثناء الحضانة. قم بإعداد 5 مل من الإيثانول الطازج بنسبة 80٪ في NFW لكل 2 رقائق تتم معالجتها.
  3. خذ الأنابيب مع مزيج الخرز المحتضن وقم بتدويرها لفترة وجيزة عند 100 × جم على جهاز طرد مركزي على الطاولة.
  4. ضع الأنابيب على رف فصل مغناطيسي واحتضنه لمدة 5 دقائق على الأقل (حتى يصبح السائل صافيا).
  5. قم بإزالة المادة الطافية بعناية دون إزعاج الخرز وحفظها في أنبوب نظيف مسمى. قم بتسمية إصدار (كدنا) باستخدام معرف الشريحة والتاريخ.
  6. أضف 1.5 مل من الإيثانول بنسبة 80٪ إلى الأنابيب دون إزعاج الخرزات واحتضنه لمدة 30 ثانية قبل إزالة الإيثانول.
  7. كرر الخطوة 11.6 مرة إضافية ، وهذه المرة قم بإزالة أكبر قدر ممكن من الإيثانول باستخدام طرف ماصة صغير دون إزعاج الخرز.
  8. جفف الخرز في الأنابيب بالهواء حتى لا تعود عاكسة. سيختلف الوقت ، لذا تحقق بانتظام لمنع الإفراط في الجفاف (التشققات) ، مما يؤدي إلى انخفاض المحصول.
    ملاحظة: قم بقياس رطوبة ودرجة حرارة الغرفة. في درجات الحرارة المرتفعة (27 درجة مئوية) والرطوبة المنخفضة (أقل من 20٪) ، تجف الخرزات بسرعة كبيرة (من 3 إلى 5 دقائق). في درجات الحرارة المنخفضة (23 درجة مئوية) ، والرطوبة العالية (أكثر من 40٪) ، تجف الخرز بشكل أبطأ بكثير (من 7 إلى 15 دقيقة).
  9. قم بإزالة أنابيب الخرزة من رف المغناطيس ، وأضف 22 ميكرولتر من NFW ، واخلطها عن طريق الدوامة.
  10. احتضان في حمام جاف أو جهاز PCR عند 27 درجة مئوية لمدة 5 إلى 15 دقيقة.
  11. قم بإجراء أجهزة الطرد المركزي لفترة وجيزة ووضع الأنبوب مرة أخرى على رف الفصل المغناطيسي حتى يصبح السائل صافيا (من 2 إلى 5 دقائق).
  12. انقل 21 ميكرولتر من المادة الطافية التي تحتوي على (كدنا) إلى أنبوب تفاعل البوليميراز المتسلسل 0.2 مل المسمى بالعينة دون إزعاج الخرز.
  13. كرر الخطوات من 11.9 إلى 11.12 لكل أنبوب ، واجمع ما مجموعه 42 ميكرولتر من (كدنا). استمر مباشرة في تضخيم (كدنا) (الخطوات من 12.1 إلى 12.8).
    ملاحظة: سيؤدي التأخير في بدء التضخيم إلى انخفاض الإنتاجية وزيادة القراءات القصيرة وتدهور قالب الحمض النووي أحادي الشريبة.

12. تضخيم (كدنا)

  1. قم بإزالة مزيج تضخيم (كدنا) وبادئات FFPE (كدنا) من الفريزر وضعها على ثلج مبلل لإذابتها.
  2. قم بتدوير مزيج تضخيم (كدنا) وبادئات FFPE (كدنا) على جهاز طرد مركزي منضدية عند ~ 100 × جم.
  3. أضف 50 ميكرولتر من محلول تضخيم (كدنا) و 8 ميكرولتر من بادئات كدنا FFPE إلى كل أنبوب (كدنا) من 42 ميكرولتر من (الخطوة 11.13) وضعها في جهاز تدوير حراري مع محول الغطاء المسطح لمنع تشوه الأنبوب.
  4. قم بتشغيل برنامج التدوير الحراري لتضخيم (كدنا): التمسخ الأولي: 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق ؛ ركوب الدراجات: [98 درجة مئوية لمدة 20 ثانية ، 58 درجة مئوية لمدة 20 ثانية ، 72 درجة مئوية لمدة 3 دقائق] × 15 دورة ؛ التمديد النهائي: 72 درجة مئوية لمدة 5 دقائق ؛ درجة حرارة الاحتفاظ: 12 درجة مئوية (في حالة المعالجة على الفور) / 4 درجات مئوية (إذا تم الاحتفاظ بها طوال الليل).
  5. قم بقياس تركيز الحمض النووي البالغ 1 ميكرولتر من (كدنا) قبل وبعد تنظيف الخرزة.
    ملاحظة: يجب حساب كمية منتج (كدنا) قبل التنظيف لتتجاوز 1 ميكروغرام لكل شريحة 1 سم مربع. يجب أن يكون تركيز ما بعد التنظيف 10 نانوغرام / ميكرولتر على الأقل. عادة ما ترتبط الغلة المنخفضة بانخفاض تنوع المكتبة. يرتبط فقدان العينة الكبير في هذه المرحلة بدرجات DV200 ؛ ومع ذلك ، فإن DV200 ليس مؤشرا مثاليا للنتائج.
  6. كرر تنظيف حبة (كدنا) من الخطوات 11 (تنظيف الخرزة) باستخدام منتج تفاعل البوليميراز المتسلسل من الخطوة 12.4 ، مع ثلاثة تعديلات: استخدم رف مغناطيسي أصغر لتفاعل البوليميراز المتسلسل ، وأضف 200 ميكرولتر فقط من 80٪ إيثانول في الخطوة 11.6 ، وأعد التعليق في 22 ميكرولتر من المخزن المؤقت Tris-EDTA (TE) (الرقم الهيدروجيني 8) في الخطوة 11.9.
  7. قم بتخزين الخرز في أنبوب به 20 ميكرولتر من NFW ، مع وضع علامة بأسماء العينات والباركود والتاريخ ومعرف الشريحة.
  8. قم بقياس توزيع شظايا (كدنا) باستخدام محلل الأجزاء. يجب أن يتراوح نطاق حجم الشظية بين 250-400 نقطة أساس. إذا كانت الشظايا صغيرة جدا ، كرر تنظيف الخرزة ولكن استخدم درجة حرارة الغرفة (~ 25 درجة مئوية) بدلا من 27 درجة مئوية.
    نقطة توقف اختيارية: بعد قياس (كدنا) ، يمكن تخزينه في -20 درجة مئوية لمدة تصل إلى شهر واحد و -80 درجة مئوية لمدة تصل إلى 1 سنة. يمكن تخزين الخرز في NFW لمدة أسبوع واحد عند 4 درجات مئوية. لا تجمد الخرز.

13. إعداد المكتبة (اليوم 4)

  1. إعداد مزيج تفاعل التضخيم
    1. قم بإزالة حل تضخيم PCR للمكتبة ومجموعات الباركود للمكتبة ومنتج cDNA و NFW. قم بإذابة (كدنا) والكواشف على الثلج والماء في درجة حرارة الغرفة وقم بتدوير 100 × جم لمدة 10 ثوان.
  2. حدد استراتيجية الباركود المكتبي لكل 25 ميكرولتر من مزيج برايمر الباركود PCR.
    ملاحظة: بالنسبة إلى جهاز التسلسل هذا، يجب تمثيل جميع القواعد بالتساوي في كل موضع في مجموعة الباركود. لذلك تم تصميم معظم المجموعات التجارية المتوافقة مع هذا مع رباعيات الباركود المحددة مسبقا (مجموعات من أربعة). يمكن تطبيق هذه الرباعيات على العينات الفردية عند التقسيم عبر ممر التسلسل ، أو يمكن تجميعها معا لعينة واحدة عند تسلسل عينة واحدة لكل حارة. يعد الحفاظ على الرموز الشريطية المتوازنة أمرا ضروريا ، حيث ستقلل الرموز الشريطية غير المتوازنة من كمية البيانات القابلة للاستخدام التي تم إنشاؤها بواسطة جهاز التسلسل.
  3. حدد حجم (كدنا) ل 20 نانوغرام (على سبيل المثال ، 10 نانوغرام / ميكرولتر سيحتاج إلى 2 ميكرولتر). باستخدام هذا ، قم بعمل محلول NFW (25 ميكرولتر) من (كدنا) المخفف (مخفف إلى ~ 1 نانوغرام / ميكرولتر).
  4. اجمع بين مزيج تضخيم المكتبة (50 ميكرولتر) مع (كدنا) المخفف في NFW (25 ميكرولتر) ومزيج برايمر الباركود PCR (25 ميكرولتر) إلى أنبوب PCR 0.2 مل.
  5. امزج البئر عن طريق سحب العينة وقم بتدويرها لأسفل عند 100 × جم لمدة 10 ثوان (لا تدوا)
  6. ضع أنابيب PCR سعة 0.2 مل في جهاز التدوير الحراري وتأكد من وجود ملحق لمنع سحق الأنابيب.
  7. قم بتشغيل برنامج التدوير الحراري لتضخيم (كدنا): التمسخ الأولي: 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق ؛ ركوب الدراجات: [98 درجة مئوية لمدة 20 ثانية ، 58 درجة مئوية لمدة 20 ثانية ، 72 درجة مئوية لمدة 3 دقائق] × 8 دورات ؛ التمديد النهائي: 72 درجة مئوية لمدة 5 دقائق ؛ درجة حرارة العقد: 12 درجة مئوية (في حالة المعالجة على الفور) / 4 درجة مئوية إذا تم الاحتفاظ بها طوال الليل.
    ملاحظة: من الممكن استخدام كميات متفاوتة من (كدنا) المدخلات لإعداد المكتبة. ومع ذلك ، فإن الكمية المستخدمة ستؤثر على عدد دورات تفاعل البوليميراز المتسلسل المطلوبة للتضخيم. على سبيل المثال ، يوصي البائع ب 20 نانوغرام من الحمض النووي المدخل واستخدام 8 دورات. من الممكن أيضا استخدام 40 نغ مع 7 دورات أو 80 نانوغرام مع 6 دورات. لا ينصح باستخدام أقل من 20 نانوغرام أو أكثر من 80 نانوغرام من إدخال (كدنا).

14. تنظيف حبة تضخيم المكتبة

  1. حدد كمية منتج المكتبة الأولية كما هو الحال في الخطوة 12.5.
  2. كرر تنظيف الخرزة من الخطوة 11 (تنظيف الخرزة) باستخدام منتج المكتبة الخام من الخطوة 13.7 مع ثلاثة تعديلات: استخدم حبة بنسبة 0.8: 1 إلى المنتج ، واستخدم رفا مغناطيسيا أصغر PCR ، واستخدم 200 ميكرولتر فقط من 80٪ إيثانول مقارنة بالخطوة 11.7 ، وأعد التعليق في 22 ميكرولتر من المخزن المؤقت TE (الرقم الهيدروجيني 8) في الخطوة 11.9. قم بإعداد حوالي 1 مل من الإيثانول الطازج بنسبة 80٪ طازج لكل شريحتين 1 سم2 .
  3. نقطة توقف اختيارية: بعد قياس المكتبة ، يمكن تخزينها عند -20 درجة مئوية لمدة تصل إلى شهر واحد و -80 درجة مئوية لمدة تصل إلى 1 سنة. يمكن تخزين الخرز في NFW لمدة أسبوع عند 4 درجات مئوية. لا تجمد الخرز.

15. نظام DNBSEQ-T7RS لتسلسل DNBs الأوليغونوكليوتيدات العشوائية Stereo-Seq

  1. باستخدام مجموعة PE75 على نظام DNBSEQ-T7RS ، قم بتخصيص الدورات على أنها 25 للقراءة 1 و 62 للقراءة 2 (PE25 + 62) ، متبوعة بمؤشر 10 نقاط أساس:
    1. تلتقط القراءة الأولى (قراءة 1 من 25 دورة) معرف الشريحة المكاني (CID) أو المعلومات الخاصة بالموقع من الرموز الشريطية المستندة إلى الرقاقة.
    2. تلتقط القراءة الثانية (قراءة 2 من 62 دورة) المعرف الجزيئي (MID) ، وهو تسلسل عشوائي 6 نقاط أساس ، متصل مباشرة بإدخالات الجينات مع 3 دورات مظلمة إضافية تستخدم لتصحيح المراحل ومعايرة إزاحة الباركود. يتبع ذلك إدخال جيني من 30-59 نقطة أساس من القراءة 2 ، والذي يتم تحديده عن طريق تعيين الجينومات أو النسخ المعروفة.
      ملاحظة: من الممكن إدراج الجينات الأطول ، ولكنه يتطلب مجموعات نهائية مقترنة مختلفة ، وتعديلا على سير عمل رسم الخرائط.
    3. تغطي دورة الفهرس لإلغاء تعدد الإرسال 10 بت في الثانية استنادا إلى الرموز الشريطية المتسلسلة المجمعة في الخطوة 13.2.
      ملاحظة: وقت التسلسل النموذجي من حوالي 10-12 ساعة لخلية تدفق 75 PE. غالبا ما يتم إجراء التسلسل في نواة التسلسل ، أو منشأة تجارية ، وليس عملية داخلية لمعظم المختبرات ، لأنها تتطلب DNBSEQ-T7RS أو أداة تسلسل مماثلة.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

توضح البيانات أدناه القدرة على إجراء تجزئة أحادية الخلية باستخدام خط أنابيب SAW وتعيين الحمض النووي الريبي غير الأدينيل مثل الحمض النووي الريبي (TRDMT1) من قسم FFPE. تسمح البيانات غير المتحيزة من Stereo-seq للمرء بفحص أهمية ليس فقط mRNAs ولكن أيضا tRNAs و rRNAs و RNAs غير المضيفة (إذا كان ذلك مناسبا). باستخدام الإخراج المباشر من خط أنابيب SAW16 والتجسيم لتقييم جودة إخراج Stereo-seq في الشكل 3A-G

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

بروتوكول Stereo-seq مفصل للغاية ويتضمن العديد من الخطوات الحاسمة التي تتطلب الدقة والتوقيت وبيئة نظيفة لضمان النجاح خاصة مع الميكروبيوم أو التنميط غير المضيف الذي قد يتطلب احتياطات محددة.

مطلوب استخدام الماء الخالي من النوكلياز خلال جميع الخطوات ، ويجب عدم لمس شريحة الالتقاط بأي شيء آخر غير العينة والكواشف. توخي الحذر الشديد عند استخدام مجموعة الكاسيت ، مع أخذ بعض الوقت لاستخدام رقائق الممارسة. سيؤدي الخدش في منطقة الأنسجة إلى تدمير الدقة المكانية للأنسجة ، وم...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعلن المؤلفون أن هذا العمل لم يتم تمويله من قبل Complete Genomics. ومع ذلك ، فإن Complete Genomics تدعم تكاليف نشر هذه المقالة.  لم يتم إعطاؤهم نسخة متقدمة أو مدخلات على المحتوى.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم تمويل هذا البحث جزئيا من قبل تحالف أبحاث سرطان المبيض (OCRA 811621 و 891490) ، ومؤسسة Sie ، وصندوق Stephanie C. Stelter Endowment. تم إجراء هذا البحث بالتعاون مع منشأة قياس التدفق الخلوي والتصوير الخلوي الأساسية ، وقسم الطب البيطري والجراحة ، وتكنولوجيا الجينوم المتقدمة الأساسية ، والتي يتم دعمها جزئيا من قبل المعاهد الوطنية للصحة من خلال منحة دعم مركز السرطان في إم دي أندرسون P30 CA016672 وأخصائي أبحاث جاريد بيركس في المعهد الوطني للسرطان 1 R50 CA243707-01A1.

نود أيضا أن نشكر Compete Genomics ، وتحديدا براندون فاندربوش وتانزين يوسف على التدريب الفني واستكشاف الأخطاء وإصلاحها ، بالإضافة إلى جيا "جاكي" تشاو ويونغفو وونغ وإيرين بتريلي. تلقى المؤلف (المؤلفون) مجموعة من كواشف FFPE OMNI وكواشف التسلسل ، بالإضافة إلى الوصول إلى برنامج الوصول المبكر T7 ، من Complete Genomics بسعر مخفض. بالإضافة إلى ذلك ، تم توفير بعض الكواشف مجانا لاستخدامها في هذه الدراسة.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
أنابيب طرد مركزي بسعة 1.5 مل من DNAse/RNAse العاديثيرمو فيشر ساينتفيك / إنفيتروجين3456لخلط الكواشف (النطاقات الأخرى جيدة) 
100٪ إيثانولسيغما-ألدرتشE7023الدرجة الجزيئية
أنابيب طرد مركزي بولي بروبيلين مخروطية معقمة بسعة 15 ملثيرمو فيشر ساينتفيك / إنفيتروجين339650يستخدم في aliquots 
20x Concentrate  محلول سترات الصوديوم الملحي (SSC)سيغما-ألدرتشS6639-1Lاستخدمت لصنع 5X SSC للتلوين و1X SSC لخطوات الغسيل وإزالة الغطاء.
جهاز المحلل الحيوي 2100أجيلينتتم الاستغناء عنهالمؤسسة: محلل حيوي
غرفة بئر ثلاثية، قابلة للإزالةإيبيدي80381غرفة سيليكون لتقليل الأحجام أثناء إعادة الترطيب وتثبيت الميثانول.
مصدر ضوء فوق بنفسجي 405 نانومترمختلفلا يوجدلمعالجة راتنج الأشعة فوق البنفسجية
أنابيب الطرد المركزي المخروطية المعقمة من البولي بروبيلين بسعة 50 ملثيرمو فيشر ساينتفيك / إنفيتروجين339652يستخدم في الاقتباسات الإضافية وللإزالة من البارافينيز 
70٪ كحول إيزوبروبانول معقمتيكسوايب  TX3270لإزالة التلوث من السطح  
مجموعة الحمض النووي عالية الحساسية لأجيلينتأجيلينت5067-4626لتوصيف التحليل الحيوي للحمض النووي ومكتبات الحمض النووي
مجموعة Agilent RNA 6000 Picoأجيلينت5067-1513لتوصيف الحمض النووي الريبي بواسطة المحلل الحيوي
رقائق الألمنيوممختلفلا يوجدلتغطية الشريحة أثناء تلوين ssDNA.
بيكمان كولتر SPRIselectبيكمان كولتر لايف ساينسز  B23317/B23318/B23319خرز SPRI CDNA وتنظيف المكتبة
المبيضمختلفلا يوجدتنظيف محطة العمل وإزالة تلوث الميكروبيوم
مسحات الرغوة المختومة من كونستكسكونتيك19161023لتنظيف الراتنج بدقة
غطاء الغطاءسيغما-ألدرتشBR470045-2000EA
حزم المجففاتمختلفلا يوجدعبوات مجففة خالية من RNase وخالية من الغبار.
قناع وجه قابل للتخلص من مرة واحدةثيرمو فيشر ساينتفيك / إنفيتروجين12-888-001الحماية، تلوث RNAse و العقم  
مناديل محو الحمض النوويسيغما-ألدرتشL9060-250EAالتطهير عن طريق مسح الأسطح (المناديل الرطبة)
أنابيب الربط النووي 1.5 ملإبندورف 22431021يستخدم لجمع cDNA وتضخيم الكتب بعد المكتبة.
أنابيب ربط DNA 2 ملإبندورف 22431048يستخدم لجمع cDNA قبل التضخيم.
DNBSEQ OneStep DNB صنع مجموعة كاشفالجينوميات الكاملة940-001891-00كواشف تحضير وتضخيم كرة الحمض النووي النانوية (DNB)
مجموعة كاشف تنظيف DNBSEQ-T7RSالجينوميات الكاملة940-001903-00خرطوشة للغسل بعد الانتهاء من التسلسل
مجموعة كاشف تحميل DNB DNBSEQ-T7RSالجينوميات الكاملة940-001894-00الكواشف والصفائح لتحميل DNBs إلى خلية التدفق
خلية تدفق تسلسل DNBSEQ-T7RSالجينوميات الكاملة940-001902-00خلية تدفق واحدة
مجموعة كاشف التصوير الستيريو-سيق DNBSEQ-T7RSالجينوميات الكاملة940-001893-00الخرطوشة والكواشف الخاصة بالتسلسل.
نظام DNBSEQ-T7RSالجينوميات الكاملةتستخدم مجموعة التصوير الستيريو-سيكو هذه تقنية DNBSEQ. تبدأ عملية التسلسل بتهجين مرساة DNA، ثم يتم توصيل مسبار فلوري بكرة الحمض النووي النانوية (DNB) باستخدام كيمياء تسلسل تثبيت المجس التوافقي (cPAS). وأخيرا، يلتقط نظام التصوير عالي الدقة إشارة الفلورسنت. بعد معالجة الإشارة البصرية الرقمية، يولد المتسلسل معلومات تسلسل عالية الجودة ودقيقة.
الهواء المضغوط المقاوم للغبارماتينM-6318من المهم استخدام هذه العلامة التجارية أو واحدة ذات وقود مماثل
شفرات الميكروتوم من إيدج-رايتثيرمو فيشر ساينتفيك / إنفيتروجين4280Lعلم الأنسجة - يستخدم عند تقسيم العينات
فريزر مقاوم للانفجارمختلفلا يوجدلتبريد الميثانول قبل وأثناء مرحلة تثبيت الميثانول.
فرش الأنسجةمختلفلا يوجدعلم الأنسجة - يستخدم عند تقسيم العينات
حمض الهيدروكلوريكسيغما-ألدرتش2104-50MLلتخفيف إنزيم التحول المسبق بمقدار 0.01 نيتروتن HCl (pH 2). تركيز المخزون القياسي لمحلول HCl هو 0.1 نيوتن.
نظام التصويرمختلفلا يوجدGC Stomics Imager، ليسيا، إيفو ريفولوشن
محلول إزالة التلوث من إنفيتروجين RNaseZap RNaseثيرمو فيشر ساينتفيك / إنفيتروجينAM9780تنظيف محطة العمل وإزالة تلوث RNAse
مساحات Kimtech Delicate Task Maskpers كيمتيك34155لتجفيف المقاعد والمعدات والماصات وغيرها.
معطف المختبرمختلفلا يوجدمعدات الحماية الشخصية (PPE)
ورق العدسةثيرمو فيشر ساينتفيك / إنفيتروجين11-997أعمال متنوعة لتجفيف الزلاجات بدون رأسها
مناديل محو الحمض النووي من لوكاوتسيغما-ألدرتشL9060تنظيف محطة العمل وإزالة تلوث PCR
رف الفصل المغناطيسي 5uL - 0.2 Permagen LabwareMSRLV08لفصل الخرزات في أنابيب PCR
Magjet Rack بحجم 12x1.5 ملثيرمو فيشر ساينتفيك / إنفيتروجينMR02لفصل الخرزات في أنابيب 1.5 مل
الميكروتوم الدوار اليدويلايكاRM2235علم الأنسجة - يستخدم عند تقسيم العينات
ميثونال & ge; 99.9٪، مناسبة للتألق المناعي، HPLCسيغما-ألدرتش34860للتثبيت (يجب أن يكون بدرجة HPLC)
ملقط التشريح الدقيقسيغما-ألدرتشF4142-1EAعلم الأنسجة - يستخدم عند تقسيم العينات
ميكروبايبتمختلفلا يوجد
المياه الخالية من النوكلياز من الدرجة الجزيئية غير معالجة DPECمختلفلا يوجدتخفيف واستنتاج الخرزات
قفازات النيتريلمختلفلا يوجدمعدات الحماية الشخصية
الفرنمختلفلا يوجدلخبز البطاطس
أنابيب PCR 0.2 mL مع أغطية ملحقةمختلفلا يوجدلتطبيقات PCR
تغطية PCR  مختلفلا يوجداستبدال إذا كان اللاصق على الغطاء المرفق ضعيفا
غطاء PCR & محطة العملميستايرMY-PCR24-010بالنسبة لخطوات ما قبل PCR (RNA إلى cDNA)
مقياس الرقم الهيدروجينيمختلفلا يوجدمقياس الرقم الهيدروجيني لتأكيد درجة الحموضة HCl.
محلول بولي-إل-ليسينسيغما-ألدرتشA005-Cاختياري لزيادة التصاق الأنسجة بالشريحة
فلوروميتر الكيوبت 4ثيرمو فيشر ساينتفيك / إنفيتروجينQ33226الضرر؛ قياس كمية الحمض النووي
مجموعات قياس كمية الحمض النووي الكيوبت dsDNAثيرمو فيشر ساينتفيك / إنفيتروجينس32851لقياس cDNA وقياسات المكتبات
مجموعة اختبار كيوبت ssDNAثيرمو فيشر ساينتفيك / إنفيتروجينس10212تلوين ssDNA (الصبغة المستخدمة فقط)
كتلة الجليد الخالية من الحمض النووي الريبيمختلفلا يوجدعلم الأنسجة - يستخدم عند تقطيع العينات لترطيب الكتل قبل التقسيم.
محلول إزالة التلوث RNaseZap RNaseثيرمو فيشر ساينتفيك / إنفيتروجينAM9782محلول تطهير سطحي يدمر الحمض النووي الريبي
مجموعة RNeasy FFPEتشياغن73504 & 19093لاستخراج الحمض النووي الريبي واستخراج قياس DV200  
راتنج سكالبت ألترا وايتسيرايا تكلا يوجدراتنج قابل للمعالجة للأشعة فوق البنفسجية المقاومة لدرجات الحرارة العالية
مجموعة تحضير مكتبة الباركود بنظام ستيريو-سيك 16STOmics / الجينوميات الكاملة111KL160لبناء مكتبة OMNI FFPE بنظام ستيريو
مجموعة ملحقات FFPE ستيريوSTOmics / الجينوميات الكاملة310AK002أجزاء ملحقات OMNI المكانية في مجموعة 211SN114
شريحة N ذات شريحة ستيريو (1 سم × 1 سم)STOmics / الجينوميات الكاملة210CN114شريحة OMNI المكانية جزء من مجموعة 211SN114
محول PCR ستيريو-سكيف STOmics / الجينوميات الكاملة301AUX001بالنسبة لنظام PCR، تم تعديل خطوات التهجين لتناسب ثلاثة خطوات مشابهة لمحول التهجين الموضعي PCRmax
مجموعة N لتقنية النسخ الستيريوSTOmics / الجينوميات الكاملة211KN114جزء ضابط OMNI المكاني من مجموعة 211SN114
شفرة حلاقة صناعية متعددة الأغراض من تصميم جراحيثيرمو فيشر ساينتفيك / إنفيتروجين13-812-236علم الأنسجة - يستخدم عند تقسيم العينات
محلول مخزن TE pH 8.0سيغما-ألدرتش8890لاستخراج cDNA والمكتبات
الدورات الحراريةBioRad / مختلف1861096 /12015392 / مختلفجهاز PCR مع غطاء يدوي أو خيارات بئر عميقة (T100 Thermal Cycler / PTC Tempo Deepwell Thermal Cycler وغيرها)
مجموعات التخزين الحاملة الشاملة لدرجة الحموضة من ثيرمو ساينتفيك أوريونثيرمو فيشر ساينتفيك / إنفيتروجين13-624-500
حمام الطفو بالأنسجة - Digital XH-1003العرض الأولNC0779538علم الأنسجة - يستخدم عند تقسيم العينات
نظارات واقية من الأشعة فوق البنفسجيةمختلفلا يوجدللسلامة أثناء المعالجة بالأشعة فوق البنفسجية
الزيلينسيغما-ألدرتش247642لإزالة البارافينية

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Ferri-Borgogno, S., et al. metabolic, and subcellular mapping of the tumor immune microenvironment via 3D targeted and non-targeted multiplex multi-omics analyses. Cancers (Basel). 16 (5), 846(2024).
  2. Lähnemann, D., et al. Eleven grand challenges in single-cell data science. Genome Biol. 21 (1), 31(2020).
  3. Molla Desta, G., Birhanu, A. G. Advancements in single-cell RNA sequencing and spatial transcriptomics: transforming biomedical research. Acta Biochim Pol. 72, 1-12 (2025).
  4. Fang, S., et al. Computational approaches and challenges in spatial transcriptomics. Genomics Proteomics Bioinformatics. 21 (1), 24-47 (2023).
  5. Chen, G., Ning, B., Shi, T. Single-cell RNA-seq technologies and related computational data analysis. Front Genet. 10, 317(2019).
  6. Burja, B., et al. An optimized tissue dissociation protocol for single-cell RNA sequencing analysis of fresh and cultured human skin biopsies. Front Cell Dev Biol. 10, 882114(2022).
  7. Yu, X., Abbas-Aghababazadeh, F., Chen, Y. A., Fridley, B. L. Statistical and bioinformatics analysis of data from bulk and single-cell RNA sequencing experiments. Methods Mol Biol. 2194, 143-175 (2021).
  8. Ma, Y., Zhou, X. Spatially informed cell-type deconvolution for spatial transcriptomics. Nat Biotechnol. 40 (9), 1349-1359 (2022).
  9. Zhou, Z., Zhong, Y., Zhang, Z., Ren, X. Spatial transcriptomics deconvolution at single-cell resolution using Redeconve. Nat Commun. 14 (1), 428(2023).
  10. Wei, R., et al. Spatial charting of single-cell transcriptomes in tissues. Nat Biotechnol. 40 (8), 1190-1199 (2022).
  11. Cheng, M., et al. Spatially resolved transcriptomics: a comprehensive review of their technological advances, applications, and challenges. J Genet Genomics. 50 (9), 625-640 (2023).
  12. To, A., Yu, Z., Sugimura, R. Recent advancement in the spatial immuno-oncology. Semin Cell Dev Biol. 166, 22-28 (2025).
  13. Chen, A., et al. Spatiotemporal transcriptomic atlas of mouse organogenesis using DNA nanoball-patterned arrays. Cell. 185 (10), 1777-1792.e21 (2022).
  14. McKellar, D. W., et al. Spatial mapping of the total transcriptome by in situ polyadenylation. Nat Biotechnol. 41 (4), 513-520 (2023).
  15. Kuemmerle, L. B., et al. Probe set selection for targeted spatial transcriptomics. Nat Methods. 21 (12), 2260-2270 (2024).
  16. Gong, C., et al. an efficient and accurate data analysis workflow for stereo-seq spatial transcriptomics. Gigabyte. 2024, 1-12 (2024).
  17. Zhou, Y., Jia, E., Pan, M., Zhao, X., Ge, Q. Encoding method of single-cell spatial transcriptomics sequencing. Int J Biol Sci. 16 (14), 2663-2674 (2020).
  18. Patel, P. G., et al. Reliability and performance of commercial RNA and DNA extraction kits for FFPE tissue cores. PLoS One. 12 (6), e0179732(2017).
  19. Zhao, Y., et al. Stereo-seq V2: Spatial mapping of total RNA on FFPE sections with high resolution. Cell. , (2025).
  20. Russell, A. J. C., et al. Slide-tags enables single-nucleus barcoding for multimodal spatial genomics. Nature. 625 (7993), 101-109 (2024).
  21. Stenbeck, L., Taborsak-Lines, F., Giacomello, S. Enabling automated and reproducible spatially resolved transcriptomics at scale. Heliyon. 8 (6), e09651(2022).
  22. Vol. Rev A. , 10X Genomics. Pleasanton, CA. (2022).
  23. Su, G., et al. Spatial multi-omics sequencing for fixed tissue via DBiT-seq. STAR Protoc. 2 (2), 100532(2021).
  24. Stickels, R. R., et al. Highly sensitive spatial transcriptomics at near-cellular resolution with Slide-seqV2. Nat Biotechnol. 39 (3), 313-319 (2021).
  25. Groelz, D., Viertler, C., Pabst, D., Dettmann, N., Zatloukal, K. Impact of storage conditions on the quality of nucleic acids in paraffin embedded tissues. PLoS One. 13 (9), e0203608(2018).
  26. Yi, Q. Q., et al. Effect of preservation time of formalin-fixed paraffin-embedded tissues on extractable DNA and RNA quantity. J Int Med Res. 48 (6), 030006052093125(2020).
  27. Eccher, A., et al. Pathology laboratory archives: Conservation quality of nucleic acids and proteins for NSCLC molecular testing. J Pers Med. 14 (4), 333(2024).
  28. Chen, T. Y., You, L., Hardillo, J. A. U., Chien, M. P. Spatial transcriptomic technologies. Cells. 12 (16), 2042(2023).
  29. Wang, F., et al. RNAscope. J Mol Diagn. 14 (1), 22-29 (2012).
  30. Merritt, C. R., et al. Multiplex digital spatial profiling of proteins and RNA in fixed tissue. Nat Biotechnol. 38 (5), 586-599 (2020).
  31. Janesick, A., et al. High resolution mapping of the tumor microenvironment using integrated single-cell, spatial and in situ analysis. Nat Commun. 14 (1), 3602(2023).
  32. You, Y., et al. Systematic comparison of sequencing-based spatial transcriptomic methods. Nat Methods. 21 (9), 1743-1754 (2024).
  33. Chen, K. H., Boettiger, A. N., Moffitt, J. R., Wang, S., Zhuang, X. Spatially resolved, highly multiplexed RNA profiling in single cells. Science. 348 (6233), aaa6090(2015).
  34. Wang, X., et al. Three-dimensional intact-tissue sequencing of single-cell transcriptional states. Science. 361 (6400), eaat5691(2018).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Spatial TranscriptomicsStereo seqFFPE TissueSpecies Agnostic ProfilingSpatial RNA DetectionSingle Cell SegmentationMicrobiome ProfilingNon Polyadenylated RNATumor MicroenvironmentSpatial Barcoding

Related Articles