مقالة منهجية

التحديد الهيكلي بدقة دون النانومتر للهيماجلوتينين من التصوير المقطعي الإلكتروني بالتبريد لفيروسات الأنفلونزا

DOI:

10.3791/68636

⸱

نوفمبر 7, 2025

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biochemistry and Molecular Biotechnology, University of Massachusetts Chan Medical School

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تقدم هذه المقالة بروتوكولا لمعالجة بيانات فيروسات الأنفلونزا التي تم تصويرها باستخدام التصوير المقطعي الإلكتروني بالتبريد ومتوسط التصوير الفرعي اللاحق للبروتين السكري للهيماجلوتينين. يغطي هذا البروتوكول معالجة البيانات خطوة بخطوة، بدءا من المعالجة المسبقة للصور وحتى تحسين النموذج النهائي.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعد التصوير المقطعي الإلكتروني بالتبريد أداة قوية لتصور العينات غير المتجانسة ، وأحد التطبيقات الرئيسية هو التوصيف الهيكلي للفيروسات متعددة الأشكال. في السنوات الأخيرة ، ظهر متوسط التصوير المقطعي للبروتينات السكرية الفيروسية كطريقة لتصور هذه البروتينات الحاسمة مباشرة على سطح الفيروسات السليمة. أحد الأهداف المهمة هو البروتين السكري للهيماجلوتينين (HA) لفيروس الأنفلونزا ، والذي يغطي الغلاف الفيروسي بكثافة وهو مسؤول عن ربط مستقبلات الأنفلونزا واندماج الغشاء. بينما تم الإبلاغ عن متوسطات التصوير المقطعي للأنفلونزا HA ، إلا أن دقلها كانت محدودة بسبب انخفاض نسبة الإشارة إلى الضوضاء المتأصلة في cryoET بالإضافة إلى الجهد اليدوي المطلوب لتحليل فيروسات الأنفلونزا غير المتجانسة. يتم تقديم خط أنابيب تحليل cryoET يدمج العديد من حزم البرامج لتحليل البيانات المقطعية لفيروسات الأنفلونزا بكفاءة وقوة. يصف هذا البروتوكول التحديد الهيكلي لحمض الهيالورونيك من فيروسات الأنفلونزا ، من خلال خطوات من تصحيح الحركة الأولي إلى بناء النموذج النهائي. بعد خط الأنابيب هذا ، تم الحصول على إعادة بناء HA بدقة 6.0 Å من مجموعتي بيانات cryoET تم جمعها من سلالة الأنفلونزا A / Puerto Rico / 8/34 (PR8).

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم تطبيق التصوير المقطعي الإلكتروني بالتبريد (cryoET) على مدى العقود الماضية لالتقاط لقطات لمجمعات البروتين والفيروسات والخلايا والكائنات الحية. طريقة للفحص المجهري الإلكتروني بالتبريد (cryoEM) ، cryoET هي طريقة بيولوجيا هيكلية حيث يتم تجميد عينة بيولوجية بشكل وميض ، ثم تصويرها من خلال مجموعة متنوعة من الاتجاهات من خلال إمالة1،2،3. ثم تتم محاذاة الصور الملتقطة في كل اتجاه حسابيا مع محور الميل المشترك وإعادة بنائها في مخطط مقطعي لتوفير عرض ثلاثي الأبعاد4.

في حين أن علم البلورات بالأشعة السيني....

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ملاحظة: يمكن الوصول إلى مجموعات البيانات النموذجية المستخدمة لهذا البروتوكول في EMPIAR-12864، والتي تتضمن مجموعتين من سلاسل الإمالة المستخدمة لهذا البروتوكول. يتم جمع سلسلة الإمالة من شبكات مغمورة يدويا من فيروس الأنفلونزا A المنقى بحجم بكسل مادي يبلغ 2.09 Å / بكسل لضمان مجال رؤية كبير بما يكفي بحيث تحتوي كل سلسلة إمالة على العديد من الفيروسات ، وأيضا لتقديم أعلى دقة ممكنة لإعادة البناء. بالنسبة لمجموعات بيانات المستخدمين الخاصة ، يوصى ببدء سير العمل باستخدام أفلام الإمالة الأولية. تمت معالجة مجموعات البيانات هذه وتصورها باستخدام محطات عمل عالية الأداء. يسرد جدول المواد الأجهزة والبرامج المستخدمة لهذا البروتوكول. جميع....

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

لإثبات استخدام بروتوكول المعالجة هذا (الشكل 1) ، تم تطبيق سير العمل الموضح سابقا على مجموعتي بيانات من 25 مقطعيا مجتمعة ، تم الحصول عليها من سلالة فيروس الأنفلونزا H1N1 A (A / Puerto Rico / 8/1934). يتم تحديد معلمات جمع البيانات في الجدول 1. يوضح الشكل 2 تصويرا مقطعيا تمثيليا ومناظر مكبرة لفروسات الأنفلونزا متعددة الأشكال. يتم التقاط أشكال متنوعة في هذا التصوير المقطعي ، حيث تتراوح الفيروسات من كروية إلى بيضاوية.......

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يمكن أن يؤدي الفهم الهيكلي الأفضل للبروتينات الفيروسية الحرجة إلى تسريع اكتشاف علاجات جديدة ضد هذه الفيروسات. في العقد الماضي ، أدت ثورة الدقة إلى تسريع تحديد الهياكل الفيروسية عالية الدقة باستخدام cryoEM الجسيم الفردي ، لكن هذه الطريقة تقتصر إما على البروتينات المنقاة أو الفيروسات غير المغلفة ذات التناظر عشري الوجوه. في المقابل ، فإن cryoET قادر على تصور فيروسات غشائية متنوعة شكليا في 3D ، ولكنه ذو دقة محدودة. يعتمد خط الأنابيب المعروض هنا على خط أنابيب Warp-RELION-M 9.......

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يود المؤلفون أن يشكروا المناقشات المفيدة مع مختبر شيفر. نود أيضا أن نشكر منشأة UMass Chan cryoEM Core على مساعدتها في الحصول على البيانات وتقديم الدعم والمشورة لنا. تم دعم هذا العمل من قبل المعهد الوطني للعلوم الطبية العامة R01GM143773 إلى MS و R35GM151996 إلى C.A.S.

....

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
AMD Ryzen Threadripper PRO 5965WXAMDhttps://www.amd.com/en/support/downloads/drivers.html/processors/ryzen-threadripper-pro/ryzen-threadripper-pro-5000wx-series/amd-ryzen-threadripper-pro-5965wx.html
AreTomo 1.3.4جامعة كاليفورنيا في سان فرانسيسكوhttps://drive.google.com/drive/folders/1Z7pKVEdgMoNaUmd_cOFhlt-QCcfcwF3_
EMAN2 2.99.52كلية بايلور للطبhttps://blake.bcm.edu/emanwiki/EMAN2
IMOD 4.12.27جامعة كولورادو في بولدرhttps://bio3d.colorado.edu/imod/
سكريبتات تحليل الإنفلونزاكلية الطب في جامعة ماساتشوستس تشانhttps://github.com/jqyhuang/influenza-analysis
IsoNet 0.3جامعة كاليفورنيا في لوس أنجلوسhttps://github.com/IsoNet-cryoET/IsoNet
M 2.0.0جينينتكhttps://warpem.github.io/warp/home/m/
NVIDIA A4000NVIDIA https://www.nvidia.com/en-us/products/workstations/rtx-a4000/
Open3D مختبرات إنتلhttps://www.open3d.org/
فينيكس 1.21-5207مختبر لورانس بيركلي الوطنيphenix-online.org
ريليون 4.0مختبر علم الأحياء الجزيئي التابع لمجلس البحوث الطبيةhttps://relion.readthedocs.io/en/release-4.0/
أوبونتو 20.04أوبونتوhttps://releases.ubuntu.com/focal/
UCSF ChimeraX 1.6.1جامعة كاليفورنيا في سان فرانسيسكوhttps://www.cgl.ucsf.edu/chimerax/
الوارب 2.0.0جينينتكhttp://warpem.github.io/warp/

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Young, L. N., Villa, E. Bringing structure to cell biology with cryo-electron tomography. Annu Rev Biophys. 52, 573-595 (2023).
  2. Navarro, P. P. Quantitative cryo-electron tomography. Front Mol Biosci. 9, 934465(2022).
  3. Hong, Y., Song, Y., Zhang, Z., Li, S.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

Cryo Electron TomographySubtomogram AveragingInfluenza HemagglutininViral GlycoproteinsPleomorphic VirusesStructural DeterminationParticle PickingConvolutional Neural Network3D Auto RefinementGlycosylation Sites

مقالات ذات صلة