مقالة منهجية

التحديد الهيكلي بدقة دون النانومتر للهيماجلوتينين من التصوير المقطعي الإلكتروني بالتبريد لفيروسات الأنفلونزا

DOI:

10.3791/68636

⸱

نوفمبر 7, 2025

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biochemistry and Molecular Biotechnology, University of Massachusetts Chan Medical School

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تقدم هذه المقالة بروتوكولا لمعالجة بيانات فيروسات الأنفلونزا التي تم تصويرها باستخدام التصوير المقطعي الإلكتروني بالتبريد ومتوسط التصوير الفرعي اللاحق للبروتين السكري للهيماجلوتينين. يغطي هذا البروتوكول معالجة البيانات خطوة بخطوة، بدءا من المعالجة المسبقة للصور وحتى تحسين النموذج النهائي.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعد التصوير المقطعي الإلكتروني بالتبريد أداة قوية لتصور العينات غير المتجانسة ، وأحد التطبيقات الرئيسية هو التوصيف الهيكلي للفيروسات متعددة الأشكال. في السنوات الأخيرة ، ظهر متوسط التصوير المقطعي للبروتينات السكرية الفيروسية كطريقة لتصور هذه البروتينات الحاسمة مباشرة على سطح الفيروسات السليمة. أحد الأهداف المهمة هو البروتين السكري للهيماجلوتينين (HA) لفيروس الأنفلونزا ، والذي يغطي الغلاف الفيروسي بكثافة وهو مسؤول عن ربط مستقبلات الأنفلونزا واندماج الغشاء. بينما تم الإبلاغ عن متوسطات التصوير المقطعي للأنفلونزا HA ، إلا أن دقلها كانت محدودة بسبب انخفاض نسبة الإشارة إلى الضوضاء المتأصلة في cryoET بالإضافة إلى الجهد اليدوي المطلوب لتحليل فيروسات الأنفلونزا غير المتجانسة. يتم تقديم خط أنابيب تحليل cryoET يدمج العديد من حزم البرامج لتحليل البيانات المقطعية لفيروسات الأنفلونزا بكفاءة وقوة. يصف هذا البروتوكول التحديد الهيكلي لحمض الهيالورونيك من فيروسات الأنفلونزا ، من خلال خطوات من تصحيح الحركة الأولي إلى بناء النموذج النهائي. بعد خط الأنابيب هذا ، تم الحصول على إعادة بناء HA بدقة 6.0 Å من مجموعتي بيانات cryoET تم جمعها من سلالة الأنفلونزا A / Puerto Rico / 8/34 (PR8).

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم تطبيق التصوير المقطعي الإلكتروني بالتبريد (cryoET) على مدى العقود الماضية لالتقاط لقطات لمجمعات البروتين والفيروسات والخلايا والكائنات الحية. طريقة للفحص المجهري الإلكتروني بالتبريد (cryoEM) ، cryoET هي طريقة بيولوجيا هيكلية حيث يتم تجميد عينة بيولوجية بشكل وميض ، ثم تصويرها من خلال مجموعة متنوعة من الاتجاهات من خلال إمالة1،2،3. ثم تتم محاذاة الصور الملتقطة في كل اتجاه حسابيا مع محور الميل المشترك وإعادة بنائها في مخطط مقطعي لتوفير عرض ثلاثي الأبعاد4.

في حين أن علم البلورات بالأشعة السينية و cryoEM للجسيم الفردي يتطلبان جزيئات نقية ومتجانسة هيكليا ، يمكن ل cryoET تصوير جزيء مباشرة في سياقه الأصلي4. لذلك ، تتمثل إحدى الميزات الرئيسية ل cryoET في قدرته على تصور عينات متعددة الأشكال ، مثل الفيروسات الغشائية ، بما في ذلك الأنفلونزا5،6،7. وعد آخر ل cryoET هو قدرته على التصوير عبر المقاييس. في حين أن المخططات المقطعية لا يتم حلها عادة بعد 5-10 نانومتر8 ، فإن تكامل متوسط التصوير المقطعي ، حيث يتم تحديد نسخ من نفس الجسيم ومحاذاة ومتوسطه ، يمكن أن يؤدي إلى دقة ذرية قريبة في بعض الجزيئات البيولوجية مثل الريبوسومات9،10. ومع ذلك ، يمكن لأنواع محدودة فقط من الجزيئات الوصول إلى هذه الدقة. لا تتجاوز متوسطات التصوير الفرعي عادة الدقة 10-15 Å. في المقابل ، يحقق cryoEM أحادي الجسيم بشكل روتيني دقة من 3-4 Å بعد ثورة الدقة11. سمحت التطورات الحديثة في كل من الإنتاجية الأعلى لبرامج الحصول على بيانات cryoET وتحليلها بتحديد هيكل دقة دون النانومتر للجزيئات البيولوجية الإضافية في سياقها الأصلي12،13،14،15،16،17،18.

أحد الاستخدامات الشائعة ل cryoET هو تصور مورفولوجيا الفيروس وتنظيمه وهيكله. على الرغم من الدقة المنخفضة التي توفرها هذه التقنية مقارنة ب cryoEM أحادي الجسيم أو علم البلورات بالأشعة السينية ، يمكن أن يوفر cryoET جنبا إلى جنب مع متوسط التصوير الفرعي معلومات حول كيفية تصرف البروتينات الفيروسية في بيئتها الأصلية ويوفر تفاصيل مهمة حول تنظيمها في سياق الفيروس. الهدف المشترك ل cryoET للفيروسات هو البروتينات السكرية السطحية التي يشيع استخدامها لربط الخلايا المضيفة والاندماج ، لأنها غالبا ما تكون المستضدات والأهداف الرئيسية للعلاجات أو اللقاحات. مع التطورات الحديثة في حزم معالجة cryoET ، أصبح من الممكن بشكل متزايد تحقيق متوسطات دقة دون نانومتر لهذه البروتينات السكرية19،20،21،22. أحد الأمثلة على ذلك هو الهيماجلوتينين (HA) ، وهو البروتين الرئيسي على سطح فيروسات الأنفلونزا. لا يقتصر الأمر على إجراء كل من ربط المستقبلات واندماج الغشاء فحسب ، بل إنه يغطي أيضا الفيريون بطريقة كثيفة بشكل لا يصدق ، مع مئات إلى آلاف HAs على virion5 المفرد. يدمج البروتوكول المقدم هنا (الشكل 1) العديد من الحزم شائعة الاستخدام مع البرامج النصية الداخلية لتحديد المراحل من المعالجة المسبقة إلى تحسين النموذج لمتوسط التصوير المقطعي لمعدل التصوير المقطعي لمعدل الأنفلونزا HA.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ملاحظة: يمكن الوصول إلى مجموعات البيانات النموذجية المستخدمة لهذا البروتوكول في EMPIAR-12864، والتي تتضمن مجموعتين من سلاسل الإمالة المستخدمة لهذا البروتوكول. يتم جمع سلسلة الإمالة من شبكات مغمورة يدويا من فيروس الأنفلونزا A المنقى بحجم بكسل مادي يبلغ 2.09 Å / بكسل لضمان مجال رؤية كبير بما يكفي بحيث تحتوي كل سلسلة إمالة على العديد من الفيروسات ، وأيضا لتقديم أعلى دقة ممكنة لإعادة البناء. بالنسبة لمجموعات بيانات المستخدمين الخاصة ، يوصى ببدء سير العمل باستخدام أفلام الإمالة الأولية. تمت معالجة مجموعات البيانات هذه وتصورها باستخدام محطات عمل عالية الأداء. يسرد جدول المواد الأجهزة والبرامج المستخدمة لهذا البروتوكول. جميع حزم البرامج المستخدمة في هذا البروتوكول مفتوحة المصدر ومتاحة للتنزيل. يتم سرد روابط التثبيت والتعليمات في جدول المواد. يجب أن تكون محطة العمل الموصى بها لمعالجة مجموعات بيانات cryoET مزودة بمعالج 8 نواة على الأقل وبطاقة GPU مخصصة مع 6 جيجابايت من ذاكرة الوصول العشوائي (VRAM) و 64 جيجابايت من ذاكرة الوصول العشوائي (RAM) و2 تيرابايت من التخزين المحلي.

1. المعالجة المسبقة للبيانات لأفلام الإمالة وإعادة بناء الصور المقطعية بالتبريد الإلكتروني في Warp 23 و IMOD 24

  1. في محطة طرفية، قم بتنشيط بيئة conda التي تم تثبيت Warp عليها باستخدام الأمر التالي:
    conda activate warp_environment
  2. قم بإنشاء ملف إعدادات سلسلة الإطارات لمعالجة سلسلة الإطارات. هذا ملف تكوين يحتوي على بيانات وصفية حول المجهر وموقع البيانات المراد معالجتها ومكان تخزين ملفات الإخراج.
    WarpTools create_settings --folder_data path/to/.tif --folder_processing warp_frameseries --output warp_frameseries.settings --extension “*.tif” --angpix 1.04 --gain_path gain_file.mrc --exposure 3.07
    ملاحظة: تم جمع هذه البيانات في وضع الدقة الفائقة.
  3. إجراء تقدير وظيفة نقل التباين (CTF) وتصحيح الحركة.
    WarpTools fs_motion_and_ctf --settings warp_frameseries.settings --m_grid 1x1x5 --c_grid 2x2x1 --c_range_max 7 --c_defocus_max 10 --c_defocus_min 4 --c_use_sum --out_averages
    ملاحظة: يجب أن تتوافق m_grid المعلمة مع عدد الإطارات الفرعية داخل فيلم إمالة - تتكون مجموعات البيانات الخاصة بنا من 5 إطارات فرعية لكل فيلم إمالة.
  4. قم باستيراد بيانات تعريف سلسلة الإمالة حتى يتمكن WarpTools من تحديد الأفلام التي تنتمي إلى سلسلة الإمالة.
    WarpTools ts_import --mdocs path/to/.mdoc --frameseries /path/to/frameseries --tilt_exposure 3.07 --min_intensity 0.3 --output tomostar
  5. بعد ملء مجلد tomostar ، قم بإنشاء ملف إعدادات سلسلة الإمالة لمعالجة سلسلة الإمالة
    WarpTools create_settings --folder_data tomostar --folder_processing warp_tiltseries --output warp_tiltseries.settings --extension “*.tomostar” --angpix 1.04 --gain_path gain_file.mrc --exposure 3.07 --tomo_dimensions NxNxN
  6. اكتب مكدسات الإمالة وقم بإجراء محاذاة سلسلة الإمالة المستندة إلى الإيمانات التلقائية باستخدام برنامج batchruntomo الخاص ب IMOD باستخدام واجهة المستخدم الرسومية Etomo24.
    1. قم بتشغيل الأمر التالي في المحطة الطرفية:
      Warptools ts_stack --settings warp_tiltseries.settings --angpix 8.35
      ملاحظة: تم تصدير سلاسل الإمالة بمقدار 4 أضعاف حجم البكسل الفعلي لتقليل وقت المحاذاة والموارد الحسابية.
    2. اختر عينة من مجموعة البيانات لتعيين معلمات المحاذاة أولا قبل تطبيقها كقالب ل batchruntomo.
    3. استيراد معلمات المحاذاة من IMOD في حالة استخدام batchruntomo.
      WarpTools ts_import_alignments --settings warp_tiltseries.settings --alignments warp_tiltseries/tiltstack/ --alignment_angpix 8.35
      ملاحظة: بالنسبة لمجموعة البيانات هذه، أدى استخدام واجهة المستخدم الرسومية (GUI) من Etomo إلى نتائج أفضل من الأغلفة داخل WarpTools.
    4. بدلا من ذلك ، قم بإجراء محاذاة سلسلة إمالة آلية بدون ائتمان باستخدام غلاف AreTomo25 داخل WarpTools.
      WarpTools ts_aretomo --settings warp_tiltseries.settings --angpix 8.35 --alignz 1000 --axis_iter 3 --exe AreTomo_executive
      ملاحظة: تم اختبار غلاف AreTomo باستخدام AreTomo1.3.4.
  7. قم بتشغيل الأمر التالي في المحطة الطرفية لتقدير معلمات CTF لسلسلة الإمالة:
    WarpTools ts_ctf --settings warp_tiltseries.settings --range_high 7 --defocus_min 2 --defocus_max 10 --auto_hand 4
  8. أعد بناء الصور المقطعية باستخدام WarpTools.
    1. تعيين متغير البيئة:
      export WARP_FORCE_MRC_FLOAT32=1
      ملاحظة: تضمن هذه الخطوة أن تكون الصور المقطعية متوافقة مع المراحل اللاحقة من معالجة الصور وتصورها في البرامج الأخرى المستخدمة في هذا البروتوكول.
    2. لإعادة بناء الصور المقطعية ، قم بتنفيذ في محطة طرفية: WarpTools ts_reconstruct --settings  warp_tiltseries.settings --input_data input file names --angpix 8.35 --dont_invert
  9. كرر الخطوات من 1.2 إلى 1.8.2 لجميع مجموعات البيانات.

2. المعالجة المسبقة للتصوير المقطعي واختيار الجسيمات

  1. في محطة طرفية، قم بتنشيط بيئة conda مع تثبيت IsoNet26 .
    conda activate isonet_env
  2. استعد لمعالجة الصور المقطعية عن طريق إنشاء مجلد فرعي أولا ونقل جميع الصور المقطعية إلى هذا المجلد.
    mkdir tomo_folder
    mv tomograms*.mrc tomo_folder/
  3. قم بإنشاء ملف نجمة في مجلد المشروع.
    isonet.py prepare_star tomo_folder --output_star tomograms.star --pixel_size 8.35
  4. باستخدام محرر نصوص، افتح ملف النجمة الذي تم إنشاؤه وأدخل قيمة إلغاء التركيز التقريبي لصور الإمالة بدرجة 0 درجة في العمود الرابع (_rlnDefocus) لكل صورة تصويرية، والتي يمكن أن تكون موجودة في ملف processed_items.json في المجلد warp_tiltseries.
    ملاحظة: يجب أن تكون قيمة إلغاء التركيز البؤري في angstroms ل IsoNet. يكتب الاعوجاج قيم إلغاء التركيز البؤري بالميكرومتر، الأمر الذي يتطلب عامل ضرب قدره 10,000.
  5. قم بتشغيل الأمر CTF deconvolve في المحطة الطرفية.
    isonet.py deconv tomograms.star --snrfalloff 0.7 --deconv_folder deconvolve
  6. بعد فك الالتفاف ، ابدأ EMAN2 GUI27 لبدء المعالجة المسبقة للتصوير المقطعي لالتقاط الجسيمات.
    conda activate eman_env
    e2projectmanager.py
  7. ضمن التصوير المقطعي ، انقر بزر الماوس الأيسر على السهم بجوار البيانات الأولية وحدد استيراد الصور المقطعية من القائمة المنسدلة.
  8. انقر بزر الماوس الأيسر على السهم المجاور للتجزئة وحدد التصوير المقطعي قبل المعالجة.
    ملاحظة: من المحتمل أن تكون المعلمات الافتراضية مناسبة للعديد من مجموعات البيانات. بالنسبة لهذه الصور المقطعية ، تم تطبيق مرشح تمرير منخفض عند 4 Å وتم تطبيع الصور المائلة. بعد المعالجة المسبقة ، سيتم إنشاء دليل معلومات تلقائيا بواسطة EMAN2 مع ملفات .json فارغة (بأسماء أساسية مماثلة للملفات المعالجة مسبقا). يجب إضافة angpix إلى ملفات json قبل انتقاء الجسيمات.
  9. تدريب الشبكة العصبية التلافيفية (CNN) للتعرف على البروتين السكري HA.
    1. قم بتغيير دليل العمل إلى موقع المخططات المقطعية لاستخدامها في تدريب CNN وانتقاء الجسيمات:
      cd path/to/tomograms
    2. استخدم الجهاز لفتح نافذة تدريب CNN.
      e2spt_boxer_convnet.py --label label_name
    3. تأكد من أن أربع نوافذ مفتوحة: واحدة تحتوي على معلومات عن معلمات CNN والصور المقطعية في الدليل ، والنوافذ الثلاث الأخرى التي تحتوي على صور مراجع جيدة (إيجابية) ، والمراجع السيئة (سلبية) ، والجسيمات التي حددتها CNN (الجسيمات).
    4. انقر بزر الماوس الأيسر فوق الزر "جديد" على واجهة المستخدم الرسومية (GUI) الخاصة ب CNN لتهيئة CNN جديدة. اضبط معدل التعلم الافتراضي على 0.0001 وحجم الصندوق على 8.
    5. ضمن عمود اسم الملف ، انقر بزر الماوس الأيسر على مخطط مقطعي تمثيلي لفتحه في نافذة جديدة.
      ملاحظة: يمكن فتح تصوير مقطعي واحد فقط في كل مرة.
      1. للتنقل عبر المحور z للتصوير المقطعي ، ضع المؤشر فوق التصوير المقطعي المفتوح واضغط على عجلة التمرير لماوس الكمبيوتر لفتح نافذة جديدة. سيؤدي شريط التمرير المسمى N# إلى تغيير المحور z.
    6. في التصوير المقطعي المفتوح ، حدد 10-20 ميزة تتوافق مع HA باستخدام زر الماوس الأيسر في لوحة Positive.
      ملاحظة: حدد كلا من المشاهدات العلوية والجانبية ل HA ، والتي تظهر إما على شكل أسطوانات أو مثلثات فوق الغشاء ، كمراجع جيدة لشبكة أكثر قوة.
      1. ستظهر صور المراجع الإيجابية في نافذة إيجابية . لإزالة مرجع ، اضغط مع الاستمرار على مفتاح Shift وانقر بزر الماوس الأيسر على صورة مرجعية.
    7. قم بالتبديل إلى اللوحة السلبية وحدد 10-20 مرجعا يتوافق مع ميزات مثل رقع الغشاء الفارغة وكثافة vRNP والعلامات الائتمانية والحطام.
      ملاحظة: ستظهر المراجع في الإطار سلبي .
    8. ابدأ تدريب CNN بالنقر بزر الماوس الأيسر على زر التدريب في النافذة الرئيسية.
      ملاحظة: يغير عدد التكرارات (Niter) في النافذة الرئيسية عدد تكرارات التدريب التي تخضع لها CNN. نوصي بضبط المعلمة على 50.
    9. بمجرد تدريب CNN على المراجع المحددة ، انقر بزر الماوس الأيسر فوق تطبيق لاستخدام CNN لالتقاط الجسيمات في التصوير المقطعي المفتوح.
      ملاحظة: يمكن رؤية صور الجسيمات المختارة في نافذة الجسيمات. سيتم أيضا عرض الجسيمات المحددة على التصوير المقطعي في دوائر زرقاء.
    10. استمر في تحديد المراجع الإيجابية والسالبة استنادا إلى الشبكة المطبقة، مع حفظ التقدم بشكل دوري من خلال الزر حفظ .
    11. بمجرد أن يكون ذلك مرضيا ، حدد تطبيق الكل لجعل CNN تختار الجسيمات في جميع الصور المقطعية في الدليل وتقييم النتائج على العديد من الصور المقطعية ؛ إجراء تدريب إضافي حسب الحاجة.
  10. احفظ الإحداثيات في ملف نصي لكل تصوير مقطعي.
    1. افتح واجهة المستخدم الرسومية EMAN2 باستخدام الأمر e2projectmanager.py .
    2. انقر فوق السهم بجوار متوسط Subtomogram وانقر فوق الملاكمة اليدوية.
    3. أدخل اسم التصوير المقطعي وانقر فوق تشغيل.
    4. احفظ الإحداثيات في ملف نصي عن طريق تحديد ملف > حفظ مربع تنسيق > tomogram_ha.txt.
    5. انتقل إلى المجلد الفرعي neuralnets والمجلد الفرعي للمعلومات لعمل نسخة احتياطية من nnet_save.hdf و trainouts.hdf و segouts.hdf و boxes3dref.hdf.
  11. لضمان إجراء التحليل فقط على فيريونات مجمعة بالكامل حيث يكون وجود طبقة بروتين المصفوفة (M1) ومركب البروتين النووي الريبي الفيروسي (vRNP) واضحا ، قم بتدريب شبكة عصبية تلافيفية ثانية للتعرف على بروتين M1.
    1. اتبع نفس البروتوكول كما هو موضح في الخطوة 2.9 ، وتغيير حجم صندوق التدريب من 8 إلى 14.

3. تنظيم الجسيمات

  1. قم بتنزيل دفاتر الملاحظات من https://github.com/jqyhuang/influenza-analysis.
  2. افتح دفتر ملاحظات CNN_Particle_Cleaning.ipynb وقم بتحميل الوحدات النمطية المطلوبة.
    ملاحظة: يستخدم البرنامج النصي Open3D28 كحزمة لتصور إحداثيات الجسيمات كسحب نقطة ثلاثية الأبعاد.
  3. قم بتحميل الملفات النصية المقابلة لإحداثيات HA و M1 وعرضها كسحب نقطة ثلاثية الأبعاد باستخدام حزمة Open3D.
  4. قم بتصفية القيم المتطرفة لإحداثيات HA باستخدام إزالة القيم المتطرفة الإحصائية كما هو مطبق في Open3D.
    ملاحظة: القيم الأولية المقترحة ل HA هي nb_neighbors = 50 (عدد الإحداثيات المجاورة حول إحداثيات) و std_ratio = 0.5.
  5. احسب المسافة بين السحب النقطية HA و M1. سيتم بعد ذلك تحديد جميع إحداثيات HA على بعد أكثر من 20 بكسل من سحابة نقطة M1 على أنها متطرفة. سيتم حفظ جميع إحداثيات الجسيمات التي لم يتم تحديدها كقيم متطرفة في ملف .txt الإخراج.
    ملاحظة: 20 بكسل تتوافق مع مسافة تقريبية تبلغ 16 نانومتر بحجم بكسل يبلغ 8.35 Å/بكسل. يبلغ مركز أداة تشذيب HA لطبقة M1 حوالي 15 نانومتر في التصوير المقطعي لدينا.
  6. قم بتسلسل جميع الجسيمات وحفظها كملفات نجوم باستخدام pts2starfile.ipynb.

4. متوسط الرسم البياني الفرعي التكراري والتصنيف

  1. باستخدام WarpTools ، قم باستخراج الجسيمات بعامل تجميع 4 وقم بإجراء جولات أولية من الرسم التخطيطي الفرعي بمتوسط29 RELION4.
    WarpTools ts_export_particles --settings warp_tiltseries.setting --input_star pts2star.star --coords_angpix 8.35 --output_star bin4_export.star --output_angpix 8.35 --box 48 --diameter 140 --3d
    ملاحظة: حجم الصندوق المقترح 48 × 48 × 48 بكسل ، وهو ما يتوافق مع صندوق ~ 360 Å3الذي سيكون كبيرا بما يكفي لاحتواء مصفوفة من 7-8 هكتار.
    1. تحويل ملف الالتواء إلى ملف متوافق مع RELION 4
      relion_convert_star --i bin4_export.star --o bin4_conv.star
    2. قم بإنشاء مرجع أولي باستخدام relion_refine_mpi على مجموعة فرعية من الجسيمات.
      head -n 30 bin4_conv.star >> subset.star & tail -n +31 bin4_conv.star | shuf -n 2000 >> subset.star
      mpiexec -n 3 relion_refine_mpi --o init_ref/job001/run --auto_refine --split_random_halves --i subset.star --firstiter_cc --ini_high 20 --dont_combine_weights_via_disc --pool 3 --pad 2 --ctf --particle_diameter 300 --flatten_solvent --zero_mask --oversampling 1 --healpix_order 2 --auto_local_healpix_order 4 --offset_range 14 --offset_step 4 --sym C1 --low_resol_join_halves 40 --norm --scale --j 12 --gpu 0:1 --pipeline_control init_ref/job001
    3. استخدم relion_refine_mpi لإجراء تنقيح تلقائي ثلاثي الأبعاد على المخططات الفرعية.
      1. أمر عينة: mpiexec -n 3 relion_refine_mpi --o Refine3D/job001/run --auto_refine --split_random_halves --i bin4_conv.star --ref init_ref/job001/run_class001.mrc --firstiter_cc --ini_high 20 --dont_combine_weights_via_disc --pool 3 --pad 2 --ctf --particle_diameter 400 --flatten_solvent --zero_mask --oversampling 1 --healpix_order 2 --auto_local_healpix_order 4 --offset_range 16 --offset_step 4 --sym C1 --low_resol_join_halves 40 --norm --scale --j 12 --gpu 0:1 --pipeline_control Refine3D/job001
        ملاحظة: تم تعيين أخذ العينات العالمية والمحلية الأولية على 7.5 و 1.8 درجة ، وهو ما يتوافق مع ترتيب healpix من 4 و healpix المحلي 2. تستفيد التحسينات الأولية في الغالب من الكثافة القوية للغشاء وبروتين M1 ومصفوفة HA. يسمح لنطاق إزاحة الترجمة بأن يكون أكبر ليشمل أي تحولات قد تحدث عند محاذاة المصفوفة.
    4. كرر التحسين بعد تقارب تشغيل التنقيح الأول ، وقم بتغيير الترجمة إلى 8 والخطوة إلى 2.
  2. استفد من التصنيف ثنائي الأبعاد للتخلص من الجسيمات غير المرغوب فيها باستخدام relion_refine.
    1. أمر العينة: relion_refine --o Class2D/job003/run --grad --class_inactivity_threshold 0.1 --grad_write_iter 200 --iter 200 --i Refine3D/job002/run_data.star --dont_combine_weights_via_disc --pool 3 --pad 2 --ctf --tau2_fudge 2 --particle_diameter 300 --K 20 --flatten_solvent --zero_mask -- strict_highres_exp 14 --center_classes --oversampling 1 --norm --scale --j 24 --skip_align --pipeline_control Class2D/job002.
      ملاحظة: تم استخدام تصنيف 2D بدلا من التصنيف ثلاثي الأبعاد لأنه أكثر كفاءة من الناحية الحسابية. يمكن استخدام الصور الفرعية مباشرة كمدخلات لوظيفة التصنيف ثنائية الأبعاد دون معالجة صور إضافية.
    2. اجمع بين الفئات التي تحتوي على مصفوفة HA يمكن تحديدها تحتوي على HA أسطواني وغشاء وكثافة M1 باستخدام relion_star_handler.
    3. أولا ، قم بإنشاء ملفات نجمة تحتوي على فئات جيدة.
      relion_star_handler --i input_file2.star --o output_good_class.star --select rlnClassNumber --minval goodclassnumber -maxval goodclassnumber
    4. بعد ذلك ، استخدم أمر relion_star_handler التالي لدمج ملفات النجوم الفردية.
      relion_star_handler --i "output_good_class1.star output_good_class2.star … output_good_classn.star" --o bin4_keep.star --combine
  3. أعد الاستخراج في bin2 والجزيئات غير المجمعة لتحسين محلي تكراري.
    1. لتحسين bin2 ، استخرج الجسيمات باستخدام حجم صندوق أصغر يبلغ 80 وقم بإجراء بحث محلي مع ضبط كل من healpix و healpix المحلي على 4 (أخذ عينات زاوية محلية 1.8 درجة).
    2. في هذه المرحلة ، اجمع مجموعات الجسيمات من مجموعات بيانات مختلفة باستخدام relion_star_handler.
      relion_star_handler --i input_file.star --o output_file.star --combine
    3. بعد الجولة الأولى من التحسين ، قم بإنشاء قناع أسطواني باستخدام e2filtertool.py داخل بيئة EMAN2 التي تشمل HA المركزي بالإضافة إلى الغشاء وكثافة M1.
      ملاحظة: المعلمات المستخدمة للقناع الأسطواني: cx = 24 ، cy = 24 ، outer_radius = 8 ، zmax = 40 ، zmin = 12 ؛ جميع المعلمات الأخرى غير محددة.
    4. قم بإجراء جولة إضافية من التحسين مع تطبيق القناع.
    5. قم بإجراء جولة أخرى من التصنيف ثنائي الأبعاد للتخلص من القيم المتطرفة التي لا تتماشى مع HA المركزي والحطام الإضافي.
    6. كرر العملية مع الجسيمات غير المجمعة بحجم صندوق 120 وقم بإنشاء قناع ناعم يغطي HA المركزي ، ومحاذاة المرجع إلى تناظر C3 ، وقم بتطبيق التماثل في مرحلة التحسين هذه.
      relion_image_handler --i bin1_ref.mrc --o bin1_c3.mrc --sym c3
      ملاحظة: كانت الدقة النهائية التي تم تحقيقها باستخدام RELION هي 6.1 Å.
  4. التحسين النهائي في MTools9
    1. إنشاء مجموعة صقل (بعد تنشيط بيئة Warp conda).
      MTools create_population --directory refine_m --name ha_final
    2. أضف مصادر بيانات لكل مجموعة بيانات.
      MTools create_source --name source_1 --population refine_m/ha_final.population --processing_settings warp_tiltseries.settings
      1. كرر الخطوة السابقة مع مجموعات بيانات إضافية.
    3. قم بإنشاء أنواع الصقل.
      MTools create_species --population refine_m/ha_final.population --name ha_todaysdate --diameter 160 --sym c3 --temporal_samples 1 --half1 last_relion_refine/run_half1_class001_unfil.mrc --half2 last_relion_refine/run_half2_class001_unfil.mrc --particles_relion last_relion_refine/run_data.star --mask mask.mrc
    4. صقل متعدد الجسيمات.
      1. أولا ، يحدد الجسيم مع الأمر: MCore --population refine_m/ha_final.population --refine_particles
      2. بعد ذلك ، قم بتحسين كل من وضعيات الجسيمات والانحراف الكروي باستخدام الأمر: MCore --population refine_m/ha_final.population --refine_particles --ctf_cs
        ملاحظة: تم إيقاف التحسين هنا لأن التكرارات الإضافية لم تحسن الدقة. ومع ذلك ، قد تستمر مجموعات مختلفة من المعلمات التي لم يتم اختبارها بشكل شامل في تعزيز النتائج.

5. صقل النموذج

  1. باستخدام ChimeraX30 ، قم بالتحميل في الخريطة النهائية والنموذج الذري ل HA.
  2. قم بتعيين ودمج جميع المقاطع التي تتوافق مع المجال الكهسي العالي ، واستخدم أداة Fit to Segments للإرساء في نموذج HA.
    1. حفظ الإحداثيات المحولة للنموذج.
  3. افتح واجهة المستخدم الرسوميةPhenix 31 ، واستخدم أداة Real Space Refinement .
    1. عند مطالبتك بإضافة ملفات ، أضف نموذج HA المحول والخريطة ، واملأ دقة إعادة البناء النهائية.
    2. إجراء خمس جولات من التقليل العالمي ، وتركيب التدوير المحلي ، وتحسين الإشغال ، وتحسين ADP للمجموعة.
  4. تصور إعادة البناء النهائي والنموذج باستخدام ChimeraX.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

لإثبات استخدام بروتوكول المعالجة هذا (الشكل 1) ، تم تطبيق سير العمل الموضح سابقا على مجموعتي بيانات من 25 مقطعيا مجتمعة ، تم الحصول عليها من سلالة فيروس الأنفلونزا H1N1 A (A / Puerto Rico / 8/1934). يتم تحديد معلمات جمع البيانات في الجدول 1. يوضح الشكل 2 تصويرا مقطعيا تمثيليا ومناظر مكبرة لفروسات الأنفلونزا متعددة الأشكال. يتم التقاط أشكال متنوعة في هذا التصوير المقطعي ، حيث تتراوح الفيروسات من كروية إلى بيضاوية...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يمكن أن يؤدي الفهم الهيكلي الأفضل للبروتينات الفيروسية الحرجة إلى تسريع اكتشاف علاجات جديدة ضد هذه الفيروسات. في العقد الماضي ، أدت ثورة الدقة إلى تسريع تحديد الهياكل الفيروسية عالية الدقة باستخدام cryoEM الجسيم الفردي ، لكن هذه الطريقة تقتصر إما على البروتينات المنقاة أو الفيروسات غير المغلفة ذات التناظر عشري الوجوه. في المقابل ، فإن cryoET قادر على تصور فيروسات غشائية متنوعة شكليا في 3D ، ولكنه ذو دقة محدودة. يعتمد خط الأنابيب المعروض هنا على خط أنابيب Warp-RELION-M 9...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يود المؤلفون أن يشكروا المناقشات المفيدة مع مختبر شيفر. نود أيضا أن نشكر منشأة UMass Chan cryoEM Core على مساعدتها في الحصول على البيانات وتقديم الدعم والمشورة لنا. تم دعم هذا العمل من قبل المعهد الوطني للعلوم الطبية العامة R01GM143773 إلى MS و R35GM151996 إلى C.A.S.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
AMD Ryzen Threadripper PRO 5965WXAMDhttps://www.amd.com/en/support/downloads/drivers.html/processors/ryzen-threadripper-pro/ryzen-threadripper-pro-5000wx-series/amd-ryzen-threadripper-pro-5965wx.html
AreTomo 1.3.4جامعة كاليفورنيا في سان فرانسيسكوhttps://drive.google.com/drive/folders/1Z7pKVEdgMoNaUmd_cOFhlt-QCcfcwF3_
EMAN2 2.99.52كلية بايلور للطبhttps://blake.bcm.edu/emanwiki/EMAN2
IMOD 4.12.27جامعة كولورادو في بولدرhttps://bio3d.colorado.edu/imod/
سكريبتات تحليل الإنفلونزاكلية الطب في جامعة ماساتشوستس تشانhttps://github.com/jqyhuang/influenza-analysis
IsoNet 0.3جامعة كاليفورنيا في لوس أنجلوسhttps://github.com/IsoNet-cryoET/IsoNet
M 2.0.0جينينتكhttps://warpem.github.io/warp/home/m/
NVIDIA A4000NVIDIA https://www.nvidia.com/en-us/products/workstations/rtx-a4000/
Open3D مختبرات إنتلhttps://www.open3d.org/
فينيكس 1.21-5207مختبر لورانس بيركلي الوطنيphenix-online.org
ريليون 4.0مختبر علم الأحياء الجزيئي التابع لمجلس البحوث الطبيةhttps://relion.readthedocs.io/en/release-4.0/
أوبونتو 20.04أوبونتوhttps://releases.ubuntu.com/focal/
UCSF ChimeraX 1.6.1جامعة كاليفورنيا في سان فرانسيسكوhttps://www.cgl.ucsf.edu/chimerax/
الوارب 2.0.0جينينتكhttp://warpem.github.io/warp/

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Young, L. N., Villa, E. Bringing structure to cell biology with cryo-electron tomography. Annu Rev Biophys. 52, 573-595 (2023).
  2. Navarro, P. P. Quantitative cryo-electron tomography. Front Mol Biosci. 9, 934465(2022).
  3. Hong, Y., Song, Y., Zhang, Z., Li, S. Cryo-electron tomography: the resolution revolution and a surge of in situ virological discoveries. Annu Rev Biophys. 52, 339-360 (2023).
  4. Turk, M., Baumeister, W. The promise and the challenges of cryo-electron tomography. FEBS Lett. 594 (20), 3243-3261 (2020).
  5. Huang, Q. J., et al. Quantitative structural analysis of influenza virus by cryo-electron tomography and convolutional neural networks. Structure. 30 (5), 777-786.e3 (2022).
  6. Ke, Z., et al. Structures and distributions of SARS-CoV-2 spike proteins on intact virions. Nature. 588 (7838), 498-502 (2020).
  7. Mangala Prasad, V., et al. Cryo-ET of Env on intact HIV virions reveals structural variation and positioning on the Gag lattice. Cell. 185 (4), 641-653.e17 (2022).
  8. Förster, F. Subtomogram analysis: the sum of a tomogram's particles reveals molecular structure in situ. J Struct Biol X. 6, 100063(2022).
  9. Tegunov, D., Xue, L., Dienemann, C., Cramer, P., Mahamid, J. Multi-particle cryo-EM refinement with M visualizes ribosome-antibiotic complex at 3.5 Å in cells. Nat Methods. 18 (2), 186-193 (2021).
  10. Xue, L., et al. Visualizing translation dynamics at atomic detail inside a bacterial cell. Nature. 610 (7930), 205-211 (2022).
  11. Kühlbrandt, W. The resolution revolution. Science. 343 (6178), 1443-1444 (2014).
  12. Chen, S., et al. Cryo-electron tomography reveals the microtubule-bound form of inactive LRRK2. Elife. 13, e97222(2024).
  13. Chen, Z., et al. De novo protein identification in mammalian sperm using in situ cryoelectron tomography and AlphaFold2 docking. Cell. 186 (23), 5041-5053.e19 (2023).
  14. Kelley, R., et al. Towards community-driven visual proteomics with large-scale cryo-electron tomography of Chlamydomonas reinhardtii. bioRxiv. , (2024).
  15. Klumpe, S., et al. In-cell structure and snapshots of copia retrotransposons in intact tissue by cryo-ET. Cell. 188 (8), 2094-2110.e18 (2025).
  16. Li, S., et al. The structure of basal body inner junctions from Tetrahymena revealed by electron cryo-tomography. EMBO J. 44 (7), e1975-e2001 (2025).
  17. Song, X., et al. The mechanism underlying fascin-mediated bundling of actin filaments unveiled by cryo-electron tomography. J Struct Biol. 217 (2), 108212(2025).
  18. Waltz, F., et al. In-cell architecture of the mitochondrial respiratory chain. Science. 387 (6740), 1296-1301 (2025).
  19. Huang, Q. J., et al. Virion-associated influenza hemagglutinin clusters upon sialic acid binding visualized by cryo-electron tomography. bioRxiv. , (2024).
  20. Turoňová, B., et al. In situ structural analysis of SARS-CoV-2 spike reveals flexibility mediated by three hinges. Science. 370 (6513), 203-208 (2020).
  21. Ke, Z., et al. Structures and distributions of SARS-CoV-2 spike proteins on intact virions. Nature. 588 (7838), 498-502 (2020).
  22. Calcraft, T., et al. Integrated cryoEM structure of a spumaretrovirus reveals cross-kingdom evolutionary relationships and the molecular basis for assembly and virus entry. Cell. 187 (16), 4213-4230.e19 (2024).
  23. Tegunov, D., Cramer, P. Real-time cryo-electron microscopy data preprocessing with Warp. Nat Methods. 16 (11), 1146-1152 (2019).
  24. Mastronarde, D. N., Held, S. R. Automated tilt series alignment and tomographic reconstruction in IMOD. J Struct Biol. 197 (2), 102-113 (2017).
  25. Zheng, S., et al. AreTomo: an integrated software package for automated marker-free, motion-corrected cryo-electron tomographic alignment and reconstruction. J Struct Biol X. 6, 100068(2022).
  26. Liu, Y. T., et al. Isotropic reconstruction for electron tomography with deep learning. Nat Commun. 13 (1), 6482(2022).
  27. Chen, M., et al. A complete data processing workflow for cryo-ET and subtomogram averaging. Nat Methods. 16 (11), 1161-1168 (2019).
  28. Zhou, Q. Y., Park, J., Koltun, V. Open3D: a modern library for 3D data processing. arXiv. , (2018).
  29. Zivanov, J., et al. A Bayesian approach to single-particle electron cryo-tomography in RELION-4.0. Elife. 11, e83724(2022).
  30. Pettersen, E. F., et al. UCSF ChimeraX: structure visualization for researchers, educators, and developers. Protein Sci. 30 (1), 70-82 (2021).
  31. Adams, P. D., et al. PHENIX: a comprehensive Python-based system for macromolecular structure solution. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 66 (Pt 2), 213-221 (2010).
  32. Burt, A., Gaifas, L., Dendooven, T., Gutsche, I. A flexible framework for multi-particle refinement in cryo-electron tomography. PLoS Biol. 19 (8), e3001319(2021).
  33. Watanabe, R., et al. Intracellular Ebola virus nucleocapsid assembly revealed by in situ cryo-electron tomography. Cell. 187 (20), 5587-5603.e19 (2024).
  34. Woldeyes, R. A., et al. Structure of the thin filament in human iPSC-derived cardiomyocytes and its response to heart disease. bioRxiv. , (2025).
  35. Li, W., et al. HIV-1 Env trimers asymmetrically engage CD4 receptors in membranes. Nature. 623 (7989), 1026-1033 (2023).
  36. Scaramuzza, S., Castaño-Díez, D. Step-by-step guide to efficient subtomogram averaging of virus-like particles with Dynamo. PLoS Biol. 19 (8), e3001318(2021).
  37. Castaño-Díez, D., Kudryashev, M., Arheit, M., Stahlberg, H. Dynamo: a flexible, user-friendly development tool for subtomogram averaging of cryo-EM data in high-performance computing environments. J Struct Biol. 178 (2), 139-151 (2012).
  38. Tran, E. E., et al. Cryo-electron microscopy structures of chimeric hemagglutinin displayed on a universal influenza vaccine candidate. mBio. 7 (2), e00257-e00316 (2016).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

Cryo Electron TomographySubtomogram AveragingInfluenza HemagglutininViral GlycoproteinsPleomorphic VirusesStructural DeterminationParticle PickingConvolutional Neural Network3D Auto RefinementGlycosylation Sites

مقالات ذات صلة