Subnanometer-resolution Structural Determination of Hemagglutinin from Cryo-electron Tomography of Influenza Viruses

Qiuyu J. Huang; Clint N. McDaniel; Alijah A. Griffith; Celia A. Schiffer; Mohan Somasundaran

doi:10.3791/68636

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

Research Article

التحديد الهيكلي بدقة دون النانومتر للهيماجلوتينين من التصوير المقطعي الإلكتروني بالتبريد لفيروسات الأنفلونزا

DOI: 10.3791/68636

November 7, 2025

Qiuyu J. Huang¹, Clint N. McDaniel¹, Alijah A. Griffith¹, Celia A. Schiffer¹, Mohan Somasundaran¹

¹Department of Biochemistry and Molecular Biotechnology,University of Massachusetts Chan Medical School

Cite Watch Download PDF Download Material list

Please note that some of the translations on this page are AI generated. Click here for the English version.

In This Article

Summary Abstract Introduction Protocol Representative Results Discussion Disclosures Acknowledgements Materials References Reprints and Permissions

Summary

تقدم هذه المقالة بروتوكولا لمعالجة بيانات فيروسات الأنفلونزا التي تم تصويرها باستخدام التصوير المقطعي الإلكتروني بالتبريد ومتوسط التصوير الفرعي اللاحق للبروتين السكري للهيماجلوتينين. يغطي هذا البروتوكول معالجة البيانات خطوة بخطوة، بدءا من المعالجة المسبقة للصور وحتى تحسين النموذج النهائي.

Abstract

يعد التصوير المقطعي الإلكتروني بالتبريد أداة قوية لتصور العينات غير المتجانسة ، وأحد التطبيقات الرئيسية هو التوصيف الهيكلي للفيروسات متعددة الأشكال. في السنوات الأخيرة ، ظهر متوسط التصوير المقطعي للبروتينات السكرية الفيروسية كطريقة لتصور هذه البروتينات الحاسمة مباشرة على سطح الفيروسات السليمة. أحد الأهداف المهمة هو البروتين السكري للهيماجلوتينين (HA) لفيروس الأنفلونزا ، والذي يغطي الغلاف الفيروسي بكثافة وهو مسؤول عن ربط مستقبلات الأنفلونزا واندماج الغشاء. بينما تم الإبلاغ عن متوسطات التصوير المقطعي للأنفلونزا HA ، إلا أن دقلها كانت محدودة بسبب انخفاض نسبة الإشارة إلى الضوضاء المتأصلة في cryoET بالإضافة إلى الجهد اليدوي المطلوب لتحليل فيروسات الأنفلونزا غير المتجانسة. يتم تقديم خط أنابيب تحليل cryoET يدمج العديد من حزم البرامج لتحليل البيانات المقطعية لفيروسات الأنفلونزا بكفاءة وقوة. يصف هذا البروتوكول التحديد الهيكلي لحمض الهيالورونيك من فيروسات الأنفلونزا ، من خلال خطوات من تصحيح الحركة الأولي إلى بناء النموذج النهائي. بعد خط الأنابيب هذا ، تم الحصول على إعادة بناء HA بدقة 6.0 Å من مجموعتي بيانات cryoET تم جمعها من سلالة الأنفلونزا A / Puerto Rico / 8/34 (PR8).

Introduction

تم تطبيق التصوير المقطعي الإلكتروني بالتبريد (cryoET) على مدى العقود الماضية لالتقاط لقطات لمجمعات البروتين والفيروسات والخلايا والكائنات الحية. طريقة للفحص المجهري الإلكتروني بالتبريد (cryoEM) ، cryoET هي طريقة بيولوجيا هيكلية حيث يتم تجميد عينة بيولوجية بشكل وميض ، ثم تصويرها من خلال مجموعة متنوعة من الاتجاهات من خلال إمالة¹^،²^،³. ثم تتم محاذاة الصور الملتقطة في كل اتجاه حسابيا مع محور الميل المشترك وإعادة بنائها في مخطط مقطعي لتوفير عرض ثلاثي الأبعاد⁴.

في حين أن علم البلورات بالأشعة السينية و cryoEM للجسيم الفردي يتطلبان جزيئات نقية ومتجانسة هيكليا ، يمكن ل cryoET تصوير جزيء مباشرة في سياقه الأصلي⁴. لذلك ، تتمثل إحدى الميزات الرئيسية ل cryoET في قدرته على تصور عينات متعددة الأشكال ، مثل الفيروسات الغشائية ، بما في ذلك الأنفلونزا⁵^،⁶^،⁷. وعد آخر ل cryoET هو قدرته على التصوير عبر المقاييس. في حين أن المخططات المقطعية لا يتم حلها عادة بعد 5-10 نانومتر⁸ ، فإن تكامل متوسط التصوير المقطعي ، حيث يتم تحديد نسخ من نفس الجسيم ومحاذاة ومتوسطه ، يمكن أن يؤدي إلى دقة ذرية قريبة في بعض الجزيئات البيولوجية مثل الريبوسومات⁹^،¹⁰. ومع ذلك ، يمكن لأنواع محدودة فقط من الجزيئات الوصول إلى هذه الدقة. لا تتجاوز متوسطات التصوير الفرعي عادة الدقة 10-15 Å. في المقابل ، يحقق cryoEM أحادي الجسيم بشكل روتيني دقة من 3-4 Å بعد ثورة الدقة¹¹. سمحت التطورات الحديثة في كل من الإنتاجية الأعلى لبرامج الحصول على بيانات cryoET وتحليلها بتحديد هيكل دقة دون النانومتر للجزيئات البيولوجية الإضافية في سياقها الأصلي¹²^،¹³^،¹⁴^،¹⁵^،¹⁶^،¹⁷^،¹⁸.

أحد الاستخدامات الشائعة ل cryoET هو تصور مورفولوجيا الفيروس وتنظيمه وهيكله. على الرغم من الدقة المنخفضة التي توفرها هذه التقنية مقارنة ب cryoEM أحادي الجسيم أو علم البلورات بالأشعة السينية ، يمكن أن يوفر cryoET جنبا إلى جنب مع متوسط التصوير الفرعي معلومات حول كيفية تصرف البروتينات الفيروسية في بيئتها الأصلية ويوفر تفاصيل مهمة حول تنظيمها في سياق الفيروس. الهدف المشترك ل cryoET للفيروسات هو البروتينات السكرية السطحية التي يشيع استخدامها لربط الخلايا المضيفة والاندماج ، لأنها غالبا ما تكون المستضدات والأهداف الرئيسية للعلاجات أو اللقاحات. مع التطورات الحديثة في حزم معالجة cryoET ، أصبح من الممكن بشكل متزايد تحقيق متوسطات دقة دون نانومتر لهذه البروتينات السكرية¹⁹^،²⁰^،²¹^،²². أحد الأمثلة على ذلك هو الهيماجلوتينين (HA) ، وهو البروتين الرئيسي على سطح فيروسات الأنفلونزا. لا يقتصر الأمر على إجراء كل من ربط المستقبلات واندماج الغشاء فحسب ، بل إنه يغطي أيضا الفيريون بطريقة كثيفة بشكل لا يصدق ، مع مئات إلى آلاف HAs على virion⁵ المفرد. يدمج البروتوكول المقدم هنا (الشكل 1) العديد من الحزم شائعة الاستخدام مع البرامج النصية الداخلية لتحديد المراحل من المعالجة المسبقة إلى تحسين النموذج لمتوسط التصوير المقطعي لمعدل التصوير المقطعي لمعدل الأنفلونزا HA.

Protocol

ملاحظة: يمكن الوصول إلى مجموعات البيانات النموذجية المستخدمة لهذا البروتوكول في EMPIAR-12864، والتي تتضمن مجموعتين من سلاسل الإمالة المستخدمة لهذا البروتوكول. يتم جمع سلسلة الإمالة من شبكات مغمورة يدويا من فيروس الأنفلونزا A المنقى بحجم بكسل مادي يبلغ 2.09 Å / بكسل لضمان مجال رؤية كبير بما يكفي بحيث تحتوي كل سلسلة إمالة على العديد من الفيروسات ، وأيضا لتقديم أعلى دقة ممكنة لإعادة البناء. بالنسبة لمجموعات بيانات المستخدمين الخاصة ، يوصى ببدء سير العمل باستخدام أفلام الإمالة الأولية. تمت معالجة مجموعات البيانات هذه وتصورها باستخدام محطات عمل عالية الأداء. يسرد جدول المواد الأجهزة والبرامج المستخدمة لهذا البروتوكول. جميع حزم البرامج المستخدمة في هذا البروتوكول مفتوحة المصدر ومتاحة للتنزيل. يتم سرد روابط التثبيت والتعليمات في جدول المواد. يجب أن تكون محطة العمل الموصى بها لمعالجة مجموعات بيانات cryoET مزودة بمعالج 8 نواة على الأقل وبطاقة GPU مخصصة مع 6 جيجابايت من ذاكرة الوصول العشوائي (VRAM) و 64 جيجابايت من ذاكرة الوصول العشوائي (RAM) و2 تيرابايت من التخزين المحلي.

1. المعالجة المسبقة للبيانات لأفلام الإمالة وإعادة بناء الصور المقطعية بالتبريد الإلكتروني في Warp ²³ و IMOD ²⁴

في محطة طرفية، قم بتنشيط بيئة conda التي تم تثبيت Warp عليها باستخدام الأمر التالي:
conda activate warp_environment
قم بإنشاء ملف إعدادات سلسلة الإطارات لمعالجة سلسلة الإطارات. هذا ملف تكوين يحتوي على بيانات وصفية حول المجهر وموقع البيانات المراد معالجتها ومكان تخزين ملفات الإخراج.
WarpTools create_settings --folder_data path/to/.tif --folder_processing warp_frameseries --output warp_frameseries.settings --extension “*.tif” --angpix 1.04 --gain_path gain_file.mrc --exposure 3.07
ملاحظة: تم جمع هذه البيانات في وضع الدقة الفائقة.
إجراء تقدير وظيفة نقل التباين (CTF) وتصحيح الحركة.
WarpTools fs_motion_and_ctf --settings warp_frameseries.settings --m_grid 1x1x5 --c_grid 2x2x1 --c_range_max 7 --c_defocus_max 10 --c_defocus_min 4 --c_use_sum --out_averages
ملاحظة: يجب أن تتوافق m_grid المعلمة مع عدد الإطارات الفرعية داخل فيلم إمالة - تتكون مجموعات البيانات الخاصة بنا من 5 إطارات فرعية لكل فيلم إمالة.
قم باستيراد بيانات تعريف سلسلة الإمالة حتى يتمكن WarpTools من تحديد الأفلام التي تنتمي إلى سلسلة الإمالة.
WarpTools ts_import --mdocs path/to/.mdoc --frameseries /path/to/frameseries --tilt_exposure 3.07 --min_intensity 0.3 --output tomostar
بعد ملء مجلد tomostar ، قم بإنشاء ملف إعدادات سلسلة الإمالة لمعالجة سلسلة الإمالة
WarpTools create_settings --folder_data tomostar --folder_processing warp_tiltseries --output warp_tiltseries.settings --extension “*.tomostar” --angpix 1.04 --gain_path gain_file.mrc --exposure 3.07 --tomo_dimensions NxNxN
اكتب مكدسات الإمالة وقم بإجراء محاذاة سلسلة الإمالة المستندة إلى الإيمانات التلقائية باستخدام برنامج batchruntomo الخاص ب IMOD باستخدام واجهة المستخدم الرسومية Etomo²⁴.
1. قم بتشغيل الأمر التالي في المحطة الطرفية:
  Warptools ts_stack --settings warp_tiltseries.settings --angpix 8.35
  ملاحظة: تم تصدير سلاسل الإمالة بمقدار 4 أضعاف حجم البكسل الفعلي لتقليل وقت المحاذاة والموارد الحسابية.
2. اختر عينة من مجموعة البيانات لتعيين معلمات المحاذاة أولا قبل تطبيقها كقالب ل batchruntomo.
3. استيراد معلمات المحاذاة من IMOD في حالة استخدام batchruntomo.
  WarpTools ts_import_alignments --settings warp_tiltseries.settings --alignments warp_tiltseries/tiltstack/ --alignment_angpix 8.35
  ملاحظة: بالنسبة لمجموعة البيانات هذه، أدى استخدام واجهة المستخدم الرسومية (GUI) من Etomo إلى نتائج أفضل من الأغلفة داخل WarpTools.
4. بدلا من ذلك ، قم بإجراء محاذاة سلسلة إمالة آلية بدون ائتمان باستخدام غلاف AreTomo²⁵ داخل WarpTools.
  WarpTools ts_aretomo --settings warp_tiltseries.settings --angpix 8.35 --alignz 1000 --axis_iter 3 --exe AreTomo_executive
  ملاحظة: تم اختبار غلاف AreTomo باستخدام AreTomo1.3.4.
قم بتشغيل الأمر التالي في المحطة الطرفية لتقدير معلمات CTF لسلسلة الإمالة:
WarpTools ts_ctf --settings warp_tiltseries.settings --range_high 7 --defocus_min 2 --defocus_max 10 --auto_hand 4
أعد بناء الصور المقطعية باستخدام WarpTools.
1. تعيين متغير البيئة:
  export WARP_FORCE_MRC_FLOAT32=1
  ملاحظة: تضمن هذه الخطوة أن تكون الصور المقطعية متوافقة مع المراحل اللاحقة من معالجة الصور وتصورها في البرامج الأخرى المستخدمة في هذا البروتوكول.
2. لإعادة بناء الصور المقطعية ، قم بتنفيذ في محطة طرفية: WarpTools ts_reconstruct --settings warp_tiltseries.settings --input_data input file names --angpix 8.35 --dont_invert
كرر الخطوات من 1.2 إلى 1.8.2 لجميع مجموعات البيانات.

2. المعالجة المسبقة للتصوير المقطعي واختيار الجسيمات

في محطة طرفية، قم بتنشيط بيئة conda مع تثبيت IsoNet²⁶ .
conda activate isonet_env
استعد لمعالجة الصور المقطعية عن طريق إنشاء مجلد فرعي أولا ونقل جميع الصور المقطعية إلى هذا المجلد.
mkdir tomo_folder mv tomograms*.mrc tomo_folder/
قم بإنشاء ملف نجمة في مجلد المشروع.
isonet.py prepare_star tomo_folder --output_star tomograms.star --pixel_size 8.35
باستخدام محرر نصوص، افتح ملف النجمة الذي تم إنشاؤه وأدخل قيمة إلغاء التركيز التقريبي لصور الإمالة بدرجة 0 درجة في العمود الرابع (_rlnDefocus) لكل صورة تصويرية، والتي يمكن أن تكون موجودة في ملف processed_items.json في المجلد warp_tiltseries.
ملاحظة: يجب أن تكون قيمة إلغاء التركيز البؤري في angstroms ل IsoNet. يكتب الاعوجاج قيم إلغاء التركيز البؤري بالميكرومتر، الأمر الذي يتطلب عامل ضرب قدره 10,000.
قم بتشغيل الأمر CTF deconvolve في المحطة الطرفية.
isonet.py deconv tomograms.star --snrfalloff 0.7 --deconv_folder deconvolve
بعد فك الالتفاف ، ابدأ EMAN2 GUI²⁷ لبدء المعالجة المسبقة للتصوير المقطعي لالتقاط الجسيمات.
conda activate eman_env e2projectmanager.py
ضمن التصوير المقطعي ، انقر بزر الماوس الأيسر على السهم بجوار البيانات الأولية وحدد استيراد الصور المقطعية من القائمة المنسدلة.
انقر بزر الماوس الأيسر على السهم المجاور للتجزئة وحدد التصوير المقطعي قبل المعالجة.
ملاحظة: من المحتمل أن تكون المعلمات الافتراضية مناسبة للعديد من مجموعات البيانات. بالنسبة لهذه الصور المقطعية ، تم تطبيق مرشح تمرير منخفض عند 4 Å وتم تطبيع الصور المائلة. بعد المعالجة المسبقة ، سيتم إنشاء دليل معلومات تلقائيا بواسطة EMAN2 مع ملفات .json فارغة (بأسماء أساسية مماثلة للملفات المعالجة مسبقا). يجب إضافة angpix إلى ملفات json قبل انتقاء الجسيمات.
تدريب الشبكة العصبية التلافيفية (CNN) للتعرف على البروتين السكري HA.
1. قم بتغيير دليل العمل إلى موقع المخططات المقطعية لاستخدامها في تدريب CNN وانتقاء الجسيمات:
  cd path/to/tomograms
2. استخدم الجهاز لفتح نافذة تدريب CNN.
  e2spt_boxer_convnet.py --label label_name
3. تأكد من أن أربع نوافذ مفتوحة: واحدة تحتوي على معلومات عن معلمات CNN والصور المقطعية في الدليل ، والنوافذ الثلاث الأخرى التي تحتوي على صور مراجع جيدة (إيجابية) ، والمراجع السيئة (سلبية) ، والجسيمات التي حددتها CNN (الجسيمات).
4. انقر بزر الماوس الأيسر فوق الزر "جديد" على واجهة المستخدم الرسومية (GUI) الخاصة ب CNN لتهيئة CNN جديدة. اضبط معدل التعلم الافتراضي على 0.0001 وحجم الصندوق على 8.
5. ضمن عمود اسم الملف ، انقر بزر الماوس الأيسر على مخطط مقطعي تمثيلي لفتحه في نافذة جديدة.
  ملاحظة: يمكن فتح تصوير مقطعي واحد فقط في كل مرة.
  1. للتنقل عبر المحور z للتصوير المقطعي ، ضع المؤشر فوق التصوير المقطعي المفتوح واضغط على عجلة التمرير لماوس الكمبيوتر لفتح نافذة جديدة. سيؤدي شريط التمرير المسمى N# إلى تغيير المحور z.
6. في التصوير المقطعي المفتوح ، حدد 10-20 ميزة تتوافق مع HA باستخدام زر الماوس الأيسر في لوحة Positive.
  ملاحظة: حدد كلا من المشاهدات العلوية والجانبية ل HA ، والتي تظهر إما على شكل أسطوانات أو مثلثات فوق الغشاء ، كمراجع جيدة لشبكة أكثر قوة.
  1. ستظهر صور المراجع الإيجابية في نافذة إيجابية . لإزالة مرجع ، اضغط مع الاستمرار على مفتاح Shift وانقر بزر الماوس الأيسر على صورة مرجعية.
7. قم بالتبديل إلى اللوحة السلبية وحدد 10-20 مرجعا يتوافق مع ميزات مثل رقع الغشاء الفارغة وكثافة vRNP والعلامات الائتمانية والحطام.
  ملاحظة: ستظهر المراجع في الإطار سلبي .
8. ابدأ تدريب CNN بالنقر بزر الماوس الأيسر على زر التدريب في النافذة الرئيسية.
  ملاحظة: يغير عدد التكرارات (Niter) في النافذة الرئيسية عدد تكرارات التدريب التي تخضع لها CNN. نوصي بضبط المعلمة على 50.
9. بمجرد تدريب CNN على المراجع المحددة ، انقر بزر الماوس الأيسر فوق تطبيق لاستخدام CNN لالتقاط الجسيمات في التصوير المقطعي المفتوح.
  ملاحظة: يمكن رؤية صور الجسيمات المختارة في نافذة الجسيمات. سيتم أيضا عرض الجسيمات المحددة على التصوير المقطعي في دوائر زرقاء.
10. استمر في تحديد المراجع الإيجابية والسالبة استنادا إلى الشبكة المطبقة، مع حفظ التقدم بشكل دوري من خلال الزر حفظ .
11. بمجرد أن يكون ذلك مرضيا ، حدد تطبيق الكل لجعل CNN تختار الجسيمات في جميع الصور المقطعية في الدليل وتقييم النتائج على العديد من الصور المقطعية ؛ إجراء تدريب إضافي حسب الحاجة.
احفظ الإحداثيات في ملف نصي لكل تصوير مقطعي.
1. افتح واجهة المستخدم الرسومية EMAN2 باستخدام الأمر e2projectmanager.py .
2. انقر فوق السهم بجوار متوسط Subtomogram وانقر فوق الملاكمة اليدوية.
3. أدخل اسم التصوير المقطعي وانقر فوق تشغيل.
4. احفظ الإحداثيات في ملف نصي عن طريق تحديد ملف > حفظ مربع تنسيق > tomogram_ha.txt.
5. انتقل إلى المجلد الفرعي neuralnets والمجلد الفرعي للمعلومات لعمل نسخة احتياطية من nnet_save.hdf و trainouts.hdf و segouts.hdf و boxes3dref.hdf.
لضمان إجراء التحليل فقط على فيريونات مجمعة بالكامل حيث يكون وجود طبقة بروتين المصفوفة (M1) ومركب البروتين النووي الريبي الفيروسي (vRNP) واضحا ، قم بتدريب شبكة عصبية تلافيفية ثانية للتعرف على بروتين M1.
1. اتبع نفس البروتوكول كما هو موضح في الخطوة 2.9 ، وتغيير حجم صندوق التدريب من 8 إلى 14.

3. تنظيم الجسيمات

قم بتنزيل دفاتر الملاحظات من https://github.com/jqyhuang/influenza-analysis.
افتح دفتر ملاحظات CNN_Particle_Cleaning.ipynb وقم بتحميل الوحدات النمطية المطلوبة.
ملاحظة: يستخدم البرنامج النصي Open3D²⁸ كحزمة لتصور إحداثيات الجسيمات كسحب نقطة ثلاثية الأبعاد.
قم بتحميل الملفات النصية المقابلة لإحداثيات HA و M1 وعرضها كسحب نقطة ثلاثية الأبعاد باستخدام حزمة Open3D.
قم بتصفية القيم المتطرفة لإحداثيات HA باستخدام إزالة القيم المتطرفة الإحصائية كما هو مطبق في Open3D.
ملاحظة: القيم الأولية المقترحة ل HA هي nb_neighbors = 50 (عدد الإحداثيات المجاورة حول إحداثيات) و std_ratio = 0.5.
احسب المسافة بين السحب النقطية HA و M1. سيتم بعد ذلك تحديد جميع إحداثيات HA على بعد أكثر من 20 بكسل من سحابة نقطة M1 على أنها متطرفة. سيتم حفظ جميع إحداثيات الجسيمات التي لم يتم تحديدها كقيم متطرفة في ملف .txt الإخراج.
ملاحظة: 20 بكسل تتوافق مع مسافة تقريبية تبلغ 16 نانومتر بحجم بكسل يبلغ 8.35 Å/بكسل. يبلغ مركز أداة تشذيب HA لطبقة M1 حوالي 15 نانومتر في التصوير المقطعي لدينا.
قم بتسلسل جميع الجسيمات وحفظها كملفات نجوم باستخدام pts2starfile.ipynb.

4. متوسط الرسم البياني الفرعي التكراري والتصنيف

باستخدام WarpTools ، قم باستخراج الجسيمات بعامل تجميع 4 وقم بإجراء جولات أولية من الرسم التخطيطي الفرعي بمتوسط²⁹ RELION4.
WarpTools ts_export_particles --settings warp_tiltseries.setting --input_star pts2star.star --coords_angpix 8.35 --output_star bin4_export.star --output_angpix 8.35 --box 48 --diameter 140 --3d
ملاحظة: حجم الصندوق المقترح 48 × 48 × 48 بكسل ، وهو ما يتوافق مع صندوق ~ 360 Å³الذي سيكون كبيرا بما يكفي لاحتواء مصفوفة من 7-8 هكتار.
1. تحويل ملف الالتواء إلى ملف متوافق مع RELION 4
  relion_convert_star --i bin4_export.star --o bin4_conv.star
2. قم بإنشاء مرجع أولي باستخدام relion_refine_mpi على مجموعة فرعية من الجسيمات.
  head -n 30 bin4_conv.star >> subset.star & tail -n +31 bin4_conv.star | shuf -n 2000 >> subset.star mpiexec -n 3 relion_refine_mpi --o init_ref/job001/run --auto_refine --split_random_halves --i subset.star --firstiter_cc --ini_high 20 --dont_combine_weights_via_disc --pool 3 --pad 2 --ctf --particle_diameter 300 --flatten_solvent --zero_mask --oversampling 1 --healpix_order 2 --auto_local_healpix_order 4 --offset_range 14 --offset_step 4 --sym C1 --low_resol_join_halves 40 --norm --scale --j 12 --gpu 0:1 --pipeline_control init_ref/job001
3. استخدم relion_refine_mpi لإجراء تنقيح تلقائي ثلاثي الأبعاد على المخططات الفرعية.
  1. أمر عينة: mpiexec -n 3 relion_refine_mpi --o Refine3D/job001/run --auto_refine --split_random_halves --i bin4_conv.star --ref init_ref/job001/run_class001.mrc --firstiter_cc --ini_high 20 --dont_combine_weights_via_disc --pool 3 --pad 2 --ctf --particle_diameter 400 --flatten_solvent --zero_mask --oversampling 1 --healpix_order 2 --auto_local_healpix_order 4 --offset_range 16 --offset_step 4 --sym C1 --low_resol_join_halves 40 --norm --scale --j 12 --gpu 0:1 --pipeline_control Refine3D/job001
    ملاحظة: تم تعيين أخذ العينات العالمية والمحلية الأولية على 7.5 و 1.8 درجة ، وهو ما يتوافق مع ترتيب healpix من 4 و healpix المحلي 2. تستفيد التحسينات الأولية في الغالب من الكثافة القوية للغشاء وبروتين M1 ومصفوفة HA. يسمح لنطاق إزاحة الترجمة بأن يكون أكبر ليشمل أي تحولات قد تحدث عند محاذاة المصفوفة.
4. كرر التحسين بعد تقارب تشغيل التنقيح الأول ، وقم بتغيير الترجمة إلى 8 والخطوة إلى 2.
استفد من التصنيف ثنائي الأبعاد للتخلص من الجسيمات غير المرغوب فيها باستخدام relion_refine.
1. أمر العينة: relion_refine --o Class2D/job003/run --grad --class_inactivity_threshold 0.1 --grad_write_iter 200 --iter 200 --i Refine3D/job002/run_data.star --dont_combine_weights_via_disc --pool 3 --pad 2 --ctf --tau2_fudge 2 --particle_diameter 300 --K 20 --flatten_solvent --zero_mask -- strict_highres_exp 14 --center_classes --oversampling 1 --norm --scale --j 24 --skip_align --pipeline_control Class2D/job002.
  ملاحظة: تم استخدام تصنيف 2D بدلا من التصنيف ثلاثي الأبعاد لأنه أكثر كفاءة من الناحية الحسابية. يمكن استخدام الصور الفرعية مباشرة كمدخلات لوظيفة التصنيف ثنائية الأبعاد دون معالجة صور إضافية.
2. اجمع بين الفئات التي تحتوي على مصفوفة HA يمكن تحديدها تحتوي على HA أسطواني وغشاء وكثافة M1 باستخدام relion_star_handler.
3. أولا ، قم بإنشاء ملفات نجمة تحتوي على فئات جيدة.
  relion_star_handler --i input_file2.star --o output_good_class.star --select rlnClassNumber --minval goodclassnumber -maxval goodclassnumber
4. بعد ذلك ، استخدم أمر relion_star_handler التالي لدمج ملفات النجوم الفردية.
  relion_star_handler --i "output_good_class1.star output_good_class2.star … output_good_classn.star" --o bin4_keep.star --combine
أعد الاستخراج في bin2 والجزيئات غير المجمعة لتحسين محلي تكراري.
1. لتحسين bin2 ، استخرج الجسيمات باستخدام حجم صندوق أصغر يبلغ 80 وقم بإجراء بحث محلي مع ضبط كل من healpix و healpix المحلي على 4 (أخذ عينات زاوية محلية 1.8 درجة).
2. في هذه المرحلة ، اجمع مجموعات الجسيمات من مجموعات بيانات مختلفة باستخدام relion_star_handler.
  relion_star_handler --i input_file.star --o output_file.star --combine
3. بعد الجولة الأولى من التحسين ، قم بإنشاء قناع أسطواني باستخدام e2filtertool.py داخل بيئة EMAN2 التي تشمل HA المركزي بالإضافة إلى الغشاء وكثافة M1.
  ملاحظة: المعلمات المستخدمة للقناع الأسطواني: cx = 24 ، cy = 24 ، outer_radius = 8 ، zmax = 40 ، zmin = 12 ؛ جميع المعلمات الأخرى غير محددة.
4. قم بإجراء جولة إضافية من التحسين مع تطبيق القناع.
5. قم بإجراء جولة أخرى من التصنيف ثنائي الأبعاد للتخلص من القيم المتطرفة التي لا تتماشى مع HA المركزي والحطام الإضافي.
6. كرر العملية مع الجسيمات غير المجمعة بحجم صندوق 120 وقم بإنشاء قناع ناعم يغطي HA المركزي ، ومحاذاة المرجع إلى تناظر C3 ، وقم بتطبيق التماثل في مرحلة التحسين هذه.
  relion_image_handler --i bin1_ref.mrc --o bin1_c3.mrc --sym c3
  ملاحظة: كانت الدقة النهائية التي تم تحقيقها باستخدام RELION هي 6.1 Å.
التحسين النهائي في MTools⁹
1. إنشاء مجموعة صقل (بعد تنشيط بيئة Warp conda).
  MTools create_population --directory refine_m --name ha_final
2. أضف مصادر بيانات لكل مجموعة بيانات.
  MTools create_source --name source_1 --population refine_m/ha_final.population --processing_settings warp_tiltseries.settings
  1. كرر الخطوة السابقة مع مجموعات بيانات إضافية.
3. قم بإنشاء أنواع الصقل.
  MTools create_species --population refine_m/ha_final.population --name ha_todaysdate --diameter 160 --sym c3 --temporal_samples 1 --half1 last_relion_refine/run_half1_class001_unfil.mrc --half2 last_relion_refine/run_half2_class001_unfil.mrc --particles_relion last_relion_refine/run_data.star --mask mask.mrc
4. صقل متعدد الجسيمات.
  1. أولا ، يحدد الجسيم مع الأمر: MCore --population refine_m/ha_final.population --refine_particles
  2. بعد ذلك ، قم بتحسين كل من وضعيات الجسيمات والانحراف الكروي باستخدام الأمر: MCore --population refine_m/ha_final.population --refine_particles --ctf_cs
    ملاحظة: تم إيقاف التحسين هنا لأن التكرارات الإضافية لم تحسن الدقة. ومع ذلك ، قد تستمر مجموعات مختلفة من المعلمات التي لم يتم اختبارها بشكل شامل في تعزيز النتائج.

5. صقل النموذج

باستخدام ChimeraX³⁰ ، قم بالتحميل في الخريطة النهائية والنموذج الذري ل HA.
قم بتعيين ودمج جميع المقاطع التي تتوافق مع المجال الكهسي العالي ، واستخدم أداة Fit to Segments للإرساء في نموذج HA.
1. حفظ الإحداثيات المحولة للنموذج.
افتح واجهة المستخدم الرسومية^{Phenix 31} ، واستخدم أداة Real Space Refinement .
1. عند مطالبتك بإضافة ملفات ، أضف نموذج HA المحول والخريطة ، واملأ دقة إعادة البناء النهائية.
2. إجراء خمس جولات من التقليل العالمي ، وتركيب التدوير المحلي ، وتحسين الإشغال ، وتحسين ADP للمجموعة.
تصور إعادة البناء النهائي والنموذج باستخدام ChimeraX.

Representative Results

لإثبات استخدام بروتوكول المعالجة هذا (الشكل 1) ، تم تطبيق سير العمل الموضح سابقا على مجموعتي بيانات من 25 مقطعيا مجتمعة ، تم الحصول عليها من سلالة فيروس الأنفلونزا H1N1 A (A / Puerto Rico / 8/1934). يتم تحديد معلمات جمع البيانات في الجدول 1. يوضح الشكل 2 تصويرا مقطعيا تمثيليا ومناظر مكبرة لفروسات الأنفلونزا متعددة الأشكال. يتم التقاط أشكال متنوعة في هذا التصوير المقطعي ، حيث تتراوح الفيروسات من كروية إلى بيضاوية / ممدودة الشكل. في حين أن معظم جزيئات الأنفلونزا تحتوي على مجموعات M1 و vRNP جيدة التنظيم ، يبدو أن بعض الفيروسات أكثر تنظيما وتفتقر إلى المكونات الهيكلية الحاسمة.

من مجموعة البيانات هذه ، تم استخدام مجموعة أولية من 40,995 مقطعيا فرعيا لإعادة بناء bin4 (8.35 Å / pix) بعد انتقاء الجسيمات ومعالجتها. تمت معالجة مجموعتي البيانات في البداية بشكل مستقل في RELION4 مع تناظر C1 وقناع كروي عريض يشمل مصفوفة HA الشاملة. تم إجراء ثلاث دورات تحسين لهذه المخططات الفرعية ، تليها التصنيف ثنائي الأبعاد. بعد التصنيف ، تم التخلص من الرسوم البيانية الفرعية وسيئة الحل والجزيئات غير المرغوب فيها ؛ تم استخراج المخططات الفرعية المتبقية في bin2 (4.17 Å / pix) وتم الجمع بين مجموعتي البيانات. تم محاذاة المخططات الفرعية Bin2 معا أولا في جولة من متوسط التصوير الفرعي ، ثم تم تطبيق قناع أسطواني حول HA المركزي لمحاذاة التركيز. في هذه المرحلة ، يمكن تصور التماثل الثلاثي بوضوح لإعادة بناء HA. تم إجراء جولات إضافية من التحسين في bin2 و 2.8 Å / pix. تم إجراء جولة أخيرة من التصنيف ثنائي الأبعاد باستخدام قناع صغير يغطي فقط أداة تشذيب HA المركزية مع مخططات فرعية محاذاة. تم استخراج الفئة الرئيسية ، التي تتكون من ~ 94٪ من الرسوم المقطعية المتبقية ، إلى جزيئات غير مجمعة وخضعت لتحسين ثلاثي الأبعاد مع تطبيق تناظر C3. أخيرا ، تم تصدير هذه المخططات الفرعية إلى M ، حيث تم إجراء أوضاع الجسيمات ودورات تحسين الانحراف الكروي (الشكل التكميلي 1).

وصل متوسط الرسم التخطيطي الفرعي النهائي (الشكل 3 أ) ، الذي يتكون من 15,970 جسيم HA ، إلى دقة عالمية تبلغ 6.0 Å ونطاق دقة محلي من 5-7 Å (الشكل 4). تم تحسين نموذج PR8 HA بمرونة في الكثافة. في FSC = 0.5 و FSC = 0.143 ، كانت استبانة الخريطة إلى النموذج 8.1 Å و 6.6 Å على التوالي. تشبه بنية إعادة بناء HA إلى حد كبير خرائط cryoEM و cryoET السابقة. عند هذا القرار ، يمكن تمييز حلزونات ألفا وأوراق بيتا (الشكل 3 ب) ؛ علاوة على ذلك ، يمكن البدء في التعرف على الجليكانات في أربعة مواقع للارتباط بالجليكوزيل على رأس وساق حمض الهيالورونيك (الشكل 3 ج).

تظهر نتائجنا مدى ملاءمة cryoET في إعادة بناء حمض الهيالورونيك من فيروسات الأنفلونزا الأصلية. من خلال البروتوكول ، لوحظت كثافة واضحة للبروتين السكري الأسطواني بشكل عمودي على الغشاء الفيروسي ، وتحسنت الدقة من خلال كل خطوة. بالنسبة للبيانات الخاصة ، يقترح أن يبدأ متوسط التصوير المقطعي الفرعي من كومة جسيمات مجمعة ، ويجب مراقبة النتائج عن كثب في كل دورة صقل. إذا لم تكن كثافة البروتين السكري واضحة من المراحل الأولى ، فمن المستحسن تعيين مواقع التصوير الفرعي مرة أخرى على التصوير المقطعي للتحقق من تحديد المواقع بدقة. خلاف ذلك ، يمكن للمرء تعديل معلمات المحاذاة أو تنفيذ مراحل تصنيف إضافية لتحقيق أفضل النتائج.

الشكل 1: خط الأنابيب الكلي لمتوسط التصوير الفرعي لحمض الهيالورونيك من التبريد لفيروس الأنفلونزا. تمثل اللوحة العلوية سير عمل موجز لمجموعتي البيانات المستخدمتين لتوضيح البروتوكول. وتتوافق اللوحة الثانية مع القسم 1 من البروتوكول، وتتوافق اللوحة الثالثة مع الأقسام 2-3، وتتوافق اللوحة الرابعة مع الأقسام 4-5. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2: التصوير المقطعي التمثيلي لفيروس الأنفلونزا PR8. (أ) تقطيع من خلال التصوير المقطعي المعاد بناؤه. شريط المقياس 100 نانومتر. (ب د) مكبرة في عرض (B) كروية ، (C) أسطوانية ، (D) M1 أقل PR8. تتوافق جميع أشرطة المقياس في B-D مع 50 نانومتر. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 3: متوسط التصوير الفرعي ل PR8 HA. (أ) منظر علوي وجانبي لإعادة بناء HA عند مستويين كفافيين مزودين بمرونة بهيكل PR8 HA بالتبريد أحادي الجسيم. (ب) مناظر مقطوعة من خلال إعادة بناء HA. الأسهم الملونة تتوافق مع الصناديق الملونة. (ج) إعادة بناء حمض الهيالورونيك الموضحة في المحيط السفلي للكشف عن كثافة الجليكان. كما يتم عرض مناظر مقربة للجليكان في تمثيل العصا في خريطة cryoET. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 4: تقدير الدقة لمتوسط التصوير الفرعي HA. (أ) تقدير الدقة المحلية لمتوسط التصوير الفرعي HA المعين على إعادة البناء. يصور شريط الألوان 5-7 Å على لوحة اللون الأزرق والأبيض والأحمر. (ب) منحنيات FSC لنصف الخرائط والاستبانة من خريطة إلى نموذج. المنحنى الأزرق هو من إعادة الإعمار غير المقنعة ، والأحمر مقنع. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

	مجموعة البيانات 1	مجموعة البيانات 2
حجم البكسل	2.09	2.09
نطاق الإمالة	0 إلى ±54 درجة	0 إلى ±66 درجة
خطوة الإمالة	3°	3°
سنة التحصيل	2024	2021
نطاق إلغاء التركيز البؤري	4-8 ميكرومتر	4-8 ميكرومتر
الجرعة الإجمالية	120 [ه-/أ]2	120 [ه-/أ]2
# الإطارات الفرعية	6	5
# سلسلة الإمالة المستخدمة	15	11
# الجسيمات	3278	12692

الجدول 1: معلمات جمع البيانات لمجموعات بيانات cryoET لفيروس الأنفلونزا PR8.

الشكل التكميلي 1: متوسط سير عمل الرسم البياني الفرعي ل HA. يتم إجراء المحاذاة التكرارية والمتوسط والتصنيف للتصوير الفرعي لحمض الهيالورونيك من خلال الفك التدريجي. الرجاء النقر هنا لتنزيل هذا الملف.

Discussion

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

Disclosures

Acknowledgements

يود المؤلفون أن يشكروا المناقشات المفيدة مع مختبر شيفر. نود أيضا أن نشكر منشأة UMass Chan cryoEM Core على مساعدتها في الحصول على البيانات وتقديم الدعم والمشورة لنا. تم دعم هذا العمل من قبل المعهد الوطني للعلوم الطبية العامة R01GM143773 إلى MS و R35GM151996 إلى C.A.S.

Materials

AMD Ryzen Threadripper PRO 5965WX	AMD	https://www.amd.com/en/support/downloads/drivers.html/processors/ryzen-threadripper-pro/ryzen-threadripper-pro-5000wx-series/amd-ryzen-threadripper-pro-5965wx.html
AreTomo 1.3.4	جامعة كاليفورنيا في سان فرانسيسكو	https://drive.google.com/drive/folders/1Z7pKVEdgMoNaUmd_cOFhlt-QCcfcwF3_
EMAN2 2.99.52	كلية بايلور للطب	https://blake.bcm.edu/emanwiki/EMAN2
IMOD 4.12.27	جامعة كولورادو في بولدر	https://bio3d.colorado.edu/imod/
سكريبتات تحليل الإنفلونزا	كلية الطب في جامعة ماساتشوستس تشان	https://github.com/jqyhuang/influenza-analysis
IsoNet 0.3	جامعة كاليفورنيا في لوس أنجلوس	https://github.com/IsoNet-cryoET/IsoNet
M 2.0.0	جينينتك	https://warpem.github.io/warp/home/m/
NVIDIA A4000	NVIDIA	https://www.nvidia.com/en-us/products/workstations/rtx-a4000/
Open3D	مختبرات إنتل	https://www.open3d.org/
فينيكس 1.21-5207	مختبر لورانس بيركلي الوطني	phenix-online.org
ريليون 4.0	مختبر علم الأحياء الجزيئي التابع لمجلس البحوث الطبية	https://relion.readthedocs.io/en/release-4.0/
أوبونتو 20.04	أوبونتو	https://releases.ubuntu.com/focal/
UCSF ChimeraX 1.6.1	جامعة كاليفورنيا في سان فرانسيسكو	https://www.cgl.ucsf.edu/chimerax/
الوارب 2.0.0	جينينتك	http://warpem.github.io/warp/

References

Young, L. N., Villa, E. Bringing structure to cell biology with cryo-electron tomography. Annu Rev Biophys. 52, 573-595 (2023).
Navarro, P. P. Quantitative cryo-electron tomography. Front Mol Biosci. 9, 934465 (2022).
Hong, Y., Song, Y., Zhang, Z., Li, S. Cryo-electron tomography: the resolution revolution and a surge of in situ virological discoveries. Annu Rev Biophys. 52, 339-360 (2023).
Turk, M., Baumeister, W. The promise and the challenges of cryo-electron tomography. FEBS Lett. 594 (20), 3243-3261 (2020).
Huang, Q. J., et al. Quantitative structural analysis of influenza virus by cryo-electron tomography and convolutional neural networks. Structure. 30 (5), 777-786.e3 (2022).
Ke, Z., et al. Structures and distributions of SARS-CoV-2 spike proteins on intact virions. Nature. 588 (7838), 498-502 (2020).
Mangala Prasad, V., et al. Cryo-ET of Env on intact HIV virions reveals structural variation and positioning on the Gag lattice. Cell. 185 (4), 641-653.e17 (2022).
Förster, F. Subtomogram analysis: the sum of a tomogram's particles reveals molecular structure in situ. J Struct Biol X. 6, 100063 (2022).
Tegunov, D., Xue, L., Dienemann, C., Cramer, P., Mahamid, J. Multi-particle cryo-EM refinement with M visualizes ribosome-antibiotic complex at 3.5 Å in cells. Nat Methods. 18 (2), 186-193 (2021).
Xue, L., et al. Visualizing translation dynamics at atomic detail inside a bacterial cell. Nature. 610 (7930), 205-211 (2022).
Kühlbrandt, W. The resolution revolution. Science. 343 (6178), 1443-1444 (2014).
Chen, S., et al. Cryo-electron tomography reveals the microtubule-bound form of inactive LRRK2. Elife. 13, e97222 (2024).
Chen, Z., et al. De novo protein identification in mammalian sperm using in situ cryoelectron tomography and AlphaFold2 docking. Cell. 186 (23), 5041-5053.e19 (2023).
Kelley, R., et al. Towards community-driven visual proteomics with large-scale cryo-electron tomography of Chlamydomonas reinhardtii. bioRxiv. , (2024).
Klumpe, S., et al. In-cell structure and snapshots of copia retrotransposons in intact tissue by cryo-ET. Cell. 188 (8), 2094-2110.e18 (2025).
Li, S., et al. The structure of basal body inner junctions from Tetrahymena revealed by electron cryo-tomography. EMBO J. 44 (7), e1975-e2001 (2025).
Song, X., et al. The mechanism underlying fascin-mediated bundling of actin filaments unveiled by cryo-electron tomography. J Struct Biol. 217 (2), 108212 (2025).
Waltz, F., et al. In-cell architecture of the mitochondrial respiratory chain. Science. 387 (6740), 1296-1301 (2025).
Huang, Q. J., et al. Virion-associated influenza hemagglutinin clusters upon sialic acid binding visualized by cryo-electron tomography. bioRxiv. , (2024).
Turoňová, B., et al. In situ structural analysis of SARS-CoV-2 spike reveals flexibility mediated by three hinges. Science. 370 (6513), 203-208 (2020).
Ke, Z., et al. Structures and distributions of SARS-CoV-2 spike proteins on intact virions. Nature. 588 (7838), 498-502 (2020).
Calcraft, T., et al. Integrated cryoEM structure of a spumaretrovirus reveals cross-kingdom evolutionary relationships and the molecular basis for assembly and virus entry. Cell. 187 (16), 4213-4230.e19 (2024).
Tegunov, D., Cramer, P. Real-time cryo-electron microscopy data preprocessing with Warp. Nat Methods. 16 (11), 1146-1152 (2019).
Mastronarde, D. N., Held, S. R. Automated tilt series alignment and tomographic reconstruction in IMOD. J Struct Biol. 197 (2), 102-113 (2017).
Zheng, S., et al. AreTomo: an integrated software package for automated marker-free, motion-corrected cryo-electron tomographic alignment and reconstruction. J Struct Biol X. 6, 100068 (2022).
Liu, Y. T., et al. Isotropic reconstruction for electron tomography with deep learning. Nat Commun. 13 (1), 6482 (2022).
Chen, M., et al. A complete data processing workflow for cryo-ET and subtomogram averaging. Nat Methods. 16 (11), 1161-1168 (2019).
Zhou, Q. Y., Park, J., Koltun, V. Open3D: a modern library for 3D data processing. arXiv. , (2018).
Zivanov, J., et al. A Bayesian approach to single-particle electron cryo-tomography in RELION-4.0. Elife. 11, e83724 (2022).
Pettersen, E. F., et al. UCSF ChimeraX: structure visualization for researchers, educators, and developers. Protein Sci. 30 (1), 70-82 (2021).
Adams, P. D., et al. PHENIX: a comprehensive Python-based system for macromolecular structure solution. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 66 (Pt 2), 213-221 (2010).
Burt, A., Gaifas, L., Dendooven, T., Gutsche, I. A flexible framework for multi-particle refinement in cryo-electron tomography. PLoS Biol. 19 (8), e3001319 (2021).
Watanabe, R., et al. Intracellular Ebola virus nucleocapsid assembly revealed by in situ cryo-electron tomography. Cell. 187 (20), 5587-5603.e19 (2024).
Woldeyes, R. A., et al. Structure of the thin filament in human iPSC-derived cardiomyocytes and its response to heart disease. bioRxiv. , (2025).
Li, W., et al. HIV-1 Env trimers asymmetrically engage CD4 receptors in membranes. Nature. 623 (7989), 1026-1033 (2023).
Scaramuzza, S., Castaño-Díez, D. Step-by-step guide to efficient subtomogram averaging of virus-like particles with Dynamo. PLoS Biol. 19 (8), e3001318 (2021).
Castaño-Díez, D., Kudryashev, M., Arheit, M., Stahlberg, H. Dynamo: a flexible, user-friendly development tool for subtomogram averaging of cryo-EM data in high-performance computing environments. J Struct Biol. 178 (2), 139-151 (2012).
Tran, E. E., et al. Cryo-electron microscopy structures of chimeric hemagglutinin displayed on a universal influenza vaccine candidate. mBio. 7 (2), e00257-e00316 (2016).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request Permission

Play Video

التحديد الهيكلي بدقة دون النانومتر للهيماجلوتينين من التصوير المقطعي الإلكتروني بالتبريد لفيروسات الأنفلونزا