مقالة منهجية

طريقة طفيفة التوغل لتوليد نموذج فأر تقويمي متزاوي لسرطان الرئة

DOI:

10.3791/68676

⸱

أغسطس 19, 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Stead Family Department of Pediatrics, University of Iowa Health Care, 2Department of Neuroscience and Pharmacology, Carver College of Medicine, University of Iowa, 3Department of Radiation Oncology, Holden Comprehensive Cancer Center, University of Iowa, 4Free Radical Radiation Biology Program, Carver College of Medicine, University of Iowa, 5Geminii, Inc., 6Interdisciplinary Graduate Program in Molecular Medicine, Carver College of Medicine, University of Iowa, 7Department of Ophthalmology and Visual Sciences, University of Iowa Health Care

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يتضمن التحدي الرئيسي لتطوير علاجات جديدة لسرطان الرئة نمذجة البيئة المكروية للورم مع تقدم المرض الإقليمي إلى مرض نقيلي. هنا ، نصف طريقة بسيطة لإنشاء نموذج متجانسي تقويمي لسرطان الرئة يسمح بتتبع المرض في الجسم الحي بمرور الوقت.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

لا يزال سرطان الرئة ذو الخلايا غير الصغيرة (NSCLC) هو السبب الأول للوفاة المرتبطة بالسرطان لكل من النساء والرجال في جميع أنحاء العالم. يجب جمع المزيد من المعلومات لفهم التفاعلات بين الخلايا السرطانية والجهاز المناعي والبيئة المكروية داخل كل ورم والأنسجة المضيفة لتطوير طرق علاج أكثر فعالية. تم الإبلاغ هنا عن طريقة بسيطة وقابلة للتكرار لإحداث السرطان داخل رئة الفأر ، مما يسمح بمراقبة نمو الورم من المرض في مراحله المبكرة إلى المتأخرة. يتضمن الإجراء الجراحي شقا سطحيا صغيرا في الجلد وحقن الخلايا السرطانية عبر العضلات الوربية في الرئة. توفر أنظمة التصوير في الجسم الحي (IVIS) بالاشتراك مع الخلايا المصممة للتعبير عن لوسيفيراز طريقة ملائمة لتقييم نمو الورم وتطور المرض على مدار الدراسة. يمكن نقل هذه التقنية بسهولة عبر نماذج مختلفة من سرطان الرئة ويمكن استخدامها لاختبار جدوى وفعالية العلاجات الجديدة في نموذج قبل سريري لسرطان الرئة يحاكي البيئة المكروية الطبيعية للورم. هذا يوسع أهمية كل من دراسات الفعالية والسلامة / السمية باستخدام علاجات الرعاية القياسية ، بما في ذلك الاستئصال الجراحي والإشعاع والعلاجات المناعية جنبا إلى جنب مع العلاجات التجريبية.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

لا يزال سرطان الرئة أحد أكثر أنواع السرطان التي تم تشخيصها والسبب الأول للوفيات المرتبطة بالسرطان بين الرجال والنساء على مستوى العالم1،2،3. يمثل سرطان الرئة ذو الخلايا غير الصغيرة (NSCLC) ما يقرب من 90٪ من جميع حالات سرطان الرئة في الولايات المتحدة ، وعلى الرغم من تحسن مشهد العلاج بشكل كبير خلال السنوات القليلة الماضية ، إلا أنه لا يزال هناك اهتمام كبير بتطوير علاجات جديدة تعمل على تحسينالنتائج 4. في حين كان هناك العديد من التطورات في تطوير علاجات مستهدفة لطفرات الدافعة المحددة والعلاجات المناعية لأنواع فرعية مستجيبة من NSCLC ، إلا أن معدل البقاء على قيد الحياة لمدة خمس سنوات لا يزال منخفضا ، حيث يجلس حول 20٪ لجميع مراحل سرطان الرئة2،5،6،7. علاوة على ذلك ، على الرغم من أن العلاج المناعي قد قطع خطوات كبيرة في تحسين البقاء على قيد الحياة في المرض المتقدم ، إلا أن هذه التحسينات لم تنقل سوى الإبرة من البقاء على قيد الحياة لمدة خمس سنوات بنسبة 6.8٪ إلى 10.7٪ وزيادة وقت البقاء على قيد الحياة من 7 أشهر إلى 8 أشهر8. لا تزال هناك حاجة كبيرة لفهم آليات عمل المرض وتطوير علاجات جديدة تتآزر مع العلاجات الحالية القياسية للرعاية. يتطلب فهم الآليات التي تلعب دورا في التقدم الطبيعي ل NSCLC والاستجابة للعلاجات الجديدة نماذج قبل السريرية قابلة للتكرار بشكل موثوق ، ويسهل تحريضها ، وتغليف البيئة المكروية للورم التي يتطور فيها السرطان.

على مدى العقود القليلة الماضية ، تم تطوير العديد من الإجراءات المختلفة لتقييم نماذج تقويم العظام لسرطان الرئة في القوارض. تتراوح الإجراءات من شديدة التوغل ، وتتطلب مستوى عال من الخبرة ، مثل الزرع داخل الرئة أو إجراءات الزرع التي تفتح تجويف الصدر9،10،11،12،13. معتدلة التوغل مثل إجراءات داخل القصبة الهوائية و orotracheal14،15،16،17; للإجراءات طفيفة التوغل ، مثل الحقن عن طريق الجلد أو الوريد الذيل أو التحريض داخل الأنف18،19،20،21. تقدم جميع الإجراءات مخاطر وفوائد مختلفة - مع تقنيات أكثر توغلا تسمح بمزيد من الدقة ولكن من المحتمل أن تكون معدلات استنزاف أعلى ، وتقنيات أقل توغلا تضفي بقاء أفضل ولكن المزيد من التباين في مواقع زرع الورم. من بين هذه البروتوكولات المختلفة ، يختار البعض عدم تتبع نمو الورم في الجسم الحي وإجراء تقييمات كاملة للأورام خارج الجسم الحي9،11،12،16. من بين البروتوكولات التي تتعقب نمو الورم بمرور الوقت ، تعتمد البروتوكولات السابقة بشكل أكبر على أنظمة مثل التصوير المقطعي المحوسب (CT) 14،19 ، والتصوير المقطعي بالإصدار البوزيتروني (PET) 18 ، والتصوير بالرنين المغناطيسي (MRI) 17 ، في حين أن البروتوكولات اللاحقة ، بعد أن أصبحت أنظمة التصوير الحيوي (BLI) والخلايا المعدلة وراثيا متاحة بسهولة أكبر ، تختار تتبع نمو الورم بمرور الوقت باستخدام BLI20 ، 21.

كان الغرض من تطوير هذا البروتوكول هو أخذ الدروس المستفادة من هذه الإجراءات الأخرى وإنشاء طريقة بسيطة ولكنها موثوقة لتحفيز ورم الرئة الانفرادي لدراسة تطور NSCLC بدءا من المرض المبكر ، حيث يقتصر الورم على الرئة. الهدف العام من هذه الورقة هو وصف طرق إنشاء نموذج فأر متعامم متساوي موثوق به وبسيط التوغل لسرطان الرئة يمكن مراقبته باستخدام التصوير في الجسم الحي ويمكن أن يمكن الباحثين من دراسة سرطان الرئة في العضو الذي ينشأ منه المرض. هذه الطريقة فعالة في توليد كل من نماذج الفئران التقويمية الغريبة باستخدام خطوط خلايا سرطان الرئة البشرية ونماذج الفئران المتعامدة المتزامنة باستخدام خطوط خلايا سرطان الرئة للفأر في الفئران ذات الجهاز المناعي السليم ، مما يعطي تنوعا في طريقة دراسة كل من أنواع السرطان البشري والتفاعل المعقد لجهاز المناعة و NSCLC.

ركزنا على تحسين هذا البروتوكول في نموذج فأر NSCLC ذي الكفاءة المناعية ، سرطان الرئة لويس (LLC) ، حيث يمكن هذا النموذج الباحثين من فهم استجابة الجهاز المناعي بشكل أفضل مع وبدون العلاجات الحالية مثل العلاج الكيميائي والعلاج الإشعاعي والعلاج المناعي والعلاجات المستهدفة الأخرى22،23،24،25. يولد البروتوكول نموذجا يمثل المرض في مراحله المبكرة عند التلقيح (ورم في حمة الرئة) ورم خبيث في نهاية الدراسات حيث غالبا ما يتفوق الورم على حمة الرئة ويزرع الأنسجة الأخرى.

يتمثل أحد الجوانب المهمة لدراسة نماذج تقويم العظام في القدرة على تتبع نمو الورم بشكل متكرر ، مع الحد الأدنى من الضغط على ، وبسرعة بحيث يمكن تقييم كل في الدراسة في نقطة زمنية واحدة. في حين أن تقنيات التصوير مثل التصوير بالرنين المغناطيسي أو التصوير المقطعي المحوسب تسمح بتحسين دقة الورم ، فإن طرق التصوير هذه باهظة الثمن وتستغرق وقتا طويلا وتواجه صعوبة في تتبع نمو الورم المبكر في نماذج الصغيرة مثل الفئران26،27،28،29،30،31. لذلك ، اخترنا مراقبة نمو الورم من خلال التلألؤ البيولوجي باستخدام الخلايا السرطانية المصممة باستخدام لوسيفيراز. في هذا البروتوكول ، قمنا بحقن 25,000-50,000 خلية ذات مسؤولية محدودة تم تصميمها باستخدام لوسيفيراز اليراع (LLC-luc) واكتشفنا الأورام في أقرب وقت في اليوم التالي بواسطة BLI. يعد تفاعل لوسيفيرين لوسيفيراز أداة مفيدة لتتبع نمو الورم في الجسم الحي باستخدام أدوات التصوير الطيفي. نظرا لحساسية أنظمة التصوير هذه لتتبع فوتونات الضوء ، يمكن تتبع الخلايا السرطانية التي تعبر عن اللوسيفيراز في الجسم الحي مبكرا ، غالبا قبل اكتشاف الأورام في نموذج الفأر عن طريق التصوير بالرنين المغناطيسي أو التصوير المقطعي المحوسب ، وغالباما 26،32،33،34.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تتم مراجعة جميع الإجراءات المتعلقة بالحيوانات والموافقة عليها من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدام بجامعة أيوا (IACUC). يتم شراء الفئران C57BL6 / N (التي تتراوح أعمارها بين 4 و 6 أسابيع) والتأقلم لمدة أسبوع واحد على الأقل قبل العمليات الجراحية. جميع في دورة ضوء / ظلام لمدة 12 ساعة. يتم إيواء 4 لكل قفص ولديها إمكانية الوصول الكامل إلى الطعام والماء حتى وقت التخدير.

1. اختيار ونمو الخلايا للحقن

  1. قم بإجراء اختبار لوسيفيراز لتحديد خط خلية كما هو موضح في35.
    1. قم بزراعة خلايا LLC-luc في وسط النسر المعدل (DMEM) من Dulbecco المكملة بمصل الأبقار الجنيني بنسبة 10٪ (FBS) ، و L-glutamine ، والبنسلين / الستربتومايسين في حاضنة ثاني أكسيد الكربونبنسبة 5٪ عند 37 درجة مئوية مع رطوبة عالية. قم بإجراء الفحص عندما تكون الخلايا ملتقية بنسبة 50٪ -100٪.
    2. قبل إجراء الفحص ، اغسل الخلايا باستخدام 1x PBS.
    3. أضف 200 ميكرولتر من محلول التحلل المؤقت / البئر (25 ملي مولار تريس / فوسفات ، 4 ملي مولار EGTA ، 1٪ تريتون X-100 ، 10٪ جلسرين) في طبق 6 آبار. كشط الخلايا من البئر ونقلها إلى أنبوب الطرد المركزي الدقيق. قم بتدوير الخلايا عند 16,000 × جم لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. تأكد من تشكل حبيبات الخلية المضغوطة في الجزء السفلي من الأنبوب واجمع المادة الطافية في أنبوب طرد مركزي دقيق جديد.
    4. انقل نصف مستخلص الخلية إلى أنبوب طرد مركزي دقيق جديد واحتفظ به لقياس كمية البروتين. أضف 2 ملي من ديثيوثريتول إلى النصف المتبقي واخلط جيدا.
    5. امزج 8 ميكرولتر من مستخلص الخلية الذي يحتوي على 2 ملي مولار من ثنائي ثيوثريتول مع 42 ميكرولتر من المخزن المؤقت للفحص (25 ملي تريس / فوسفات ، 20 ملي ملي مجم4 ، 4 ملي مولار EGTA ، 2 ملي مولار ATP ، 1 ملي ديثيوثريتول). أضف 50 ميكرولتر من 0.5-1 ملي مولار لوسيفيرين.
    6. قم بقياس ذروة اللمعان التي تم الإبلاغ عنها كوحدات ضوء نسبية (RLU) وتقييم محتوى البروتين بطريقة تحديد كمية البروتين المفضلة للإبلاغ عن اللمعان ك RLU لكل مجم من البروتين (RLU / mg).
  2. حدد خط خلية مع تلألؤ بين 8,000-15,000 RLU/mg.
    ملاحظة: تجنب اختيار تعبير لوسيفيراز أعلى (>15,000 RLU/mg) لأن هذا قد يشبع أداة BLI.

2. تحضير الخلية

  1. تنمو خلايا LLC-luc في DMEM مع 10٪ FBS و L-glutamine و penicillin / streptomycin في حاضنة 5٪ CO2 عند 37 درجة مئوية مع رطوبة عالية لمدة أسبوع واحد على الأقل قبل الاستخدام.
    ملاحظة: راقب النمو للحد من الالتقاء إلى 70٪ -80٪ وقم بالتقسيم باستخدام 0.25٪ تريبسين-EDTA حسب الحاجة للوصول إلى الكمية المطلوبة للحقن كما هو موضحسابقا 36.

3. التحضير قبل الجراحة

  1. بالنسبة للفئران ذات الفراء ، احلق قبل يوم واحد من الجراحة.
  2. ضع الفأر في حجرة الحث للتخدير باستخدام الأيزوفلوران. اضبط معدل تدفق الأكسجين على 2.0 لتر / دقيقة والمبخر عند 2٪ إيزوفلوران ؛ اضبط هذا بناء على حجم الماوس الذي يتم تحريضه.
  3. راقب تنفس الفئران واستخدم منعكس سحب الدواسة لتأكيد التخدير المناسب.
  4. ضع الماوس في مخروط الأنف في وضع الانبطاح على جهاز تسخين معتمد من IACUC. تحقق للتأكد من تخدير الماوس بشكل صحيح باستخدام منعكس سحب الدواسة قبل المتابعة.
  5. ضع مرهم العين على كلتا العينين.
  6. عندما يتم تخدير الماوس بشكل مناسب ، استخدم المقصات الكهربائية لإزالة مساحة مستطيلة كبيرة (2 سم × 3 سم) في الجزء الظهري الأيسر من الماوس. احلق إلى العمود الفقري وسطيا ، والطاولة بشكل جانبي حتى لا يكون الفراء مرئيا ، والضلع الأخير (13) السفلي ، والحافة العلوية للكتف باتجاه الرأس.
  7. ضع الماوس في قفص فارغ على جهاز تسخين معتمد من IACUC وراقب تنفس الماوس حتى يستيقظ الماوس ويتأهب. في هذا الوقت ، أعد الفأر إلى قفص منزله حتى الجراحة.

4. تحضير تعليق الخلية للحقن

  1. في يوم حصاد الخلايا (الخطوة 2.2) ، أضف وسائط جديدة تحتوي على 50 مجم / مل من الجنتاميسين قبل 3-4 ساعات من التجميع لإزالة الخلايا الميتة والمنفصلة.
  2. استنشق الوسائط واغسل الخلايا باستخدام 1x PBS. أضف التربسين EDTA واحتضنه لمدة 1-2 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
  3. قم بتفريق الخلايا وإضافة وسائط لتحييد التربسين. اجمع الخلايا في أنبوب مخروطي سعة 50 مل.
  4. تدور في 1,200 × جم لمدة 3 دقائق في درجة حرارة الغرفة. تأكد من تشكل حبيبات الخلية المضغوطة في الجزء السفلي من الأنبوب, استنشاق المادة الطافية, واغسل الحبيبات باستخدام 1x PBS. كرر هذه الخطوة 3x.
  5. أعد تعليق حبيبات الخلية في 1x PBS بحوالي 1-2 مليون خلية / مل للعد. قم بالتصفية من خلال مصفاة خلية 40 ميكرومتر قبل العد.
  6. امزج 10 ميكرولتر من تعليق الخلية مع 10 ميكرولتر من Trypan Blue واعدها باستخدام مقياس كثافة الدم. قم بعمل تعليق خلية 2x واعدها للتحقق من عدد الخلايا. احسب إجمالي عدد الخلايا وقابليتها للحياة.
  7. قم بتدوير الخلايا عند 1,200 × جم لمدة 3 دقائق في درجة حرارة الغرفة لإعادة التعليق في حجم الحقن النهائي. استنشق برنامج تلفزيوني.
  8. أعد تعليق الخلايا في 0.5 مجم / مل Matrigel في 1x PBS إلى رقم الخلية المطلوب لكل حقنة بحجم 50 ميكرولتر. احتفظ بتعليق الخلية النهائي على الجليد طوال الإجراء لمنع التصلب.
    ملاحظة: يستخدم هذا البروتوكول خلايا LLC-luc. حقن 25,000-50,000 خلية في 50 ميكرولتر من الحجم لكل فأر.

5. التحضير الجراحي

  1. قم بإجراء العملية في غرفة جراحية معتمدة من IACUC لإجراء الإجراءات المعقمة. نظف طاولة الجراحة بمطهر معتمد من الطب البيطري.
  2. ضع وسادة تدفئة مطهرة معتمدة من IACUC في منطقة الجراحة. ضع ستارة جراحية معقمة فوق وسادة التدفئة.

6. التخدير الجراحي

  1. ضع الفأر في حجرة الحث للتخدير باستخدام الأيزوفلوران. اضبط معدل تدفق الأكسجين على 2.0 لتر / دقيقة والمبخر عند 2٪ أيزوفلوران.
    ملاحظة: يمكن ضبط تركيز الأيزوفلوران بناء على حجم الماوس.
  2. راقب تنفس الفأر واستخدم منعكس سحب الدواسة لتأكيد التخدير المناسب.
  3. ضع الفأر في مخروط الأنف في وضع الاستلقاء الجانبي الأيمن على الستارة الجراحية المعقمة. تحقق للتأكد من تخدير الماوس بشكل صحيح باستخدام منعكس سحب الدواسة قبل المتابعة.
  4. إعطاء مسكن قبل الجراحة، ميلوكسيتام (2 ملغ/كغ من الوزن) تحت الجلد، ومرهم للعينين قبل الجراحة.

7. حقن الرئة تقويم العظام

  1. نظف موقع الجراحة 3 مرات بالتناوب بين 70٪ من الإيثانول والبيتادين باستخدام شاش معقم. ضع ستارة جراحية معقمة بفتحة 3 سم × 4 سم على الماوس. ضع الأدوات المعقمة المعقمة على الستارة الجراحية.
  2. حدد مكان إجراء الشق عن طريق تحديد موقع الحافة القحفية للكتف والحافة الذيلية للقفص الصدري الصدري باستخدام الملقط. تأكد من شد الجلد باستخدام إبهام الجراح والسبابة وقم بعمل شق سطحي 5 مم فقط من خلال الجلد أسفل لوح الكتف مباشرة بشفرة مقاس 10.
    ملاحظة: يجب على الجراح ارتداء قفازات معقمة.
  3. استخدم مقصا مستقيما مقاس 115 مم لتشريح الدهون تحت الجلد من الأضلاع والعضلات الوربية. لا تقطع العضلات الوربية.
    ملاحظة: احرص على عدم إتلاف الشريان الصدري والفرع العميق للشريان العنقي المستعرض ، والتي تقع بالقرب من لوح الكتف. قد يحدث نزيف خفيف بسبب قطع الشعيرات الدموية داخل الجلد والدهون تحت الجلد. أوقف النزيف عن طريق الضغط الخفيف باستخدام قضيب معقم برأس قطني.
  4. استخدم ملقط Micro-Adson لإبقاء الشق مفتوحا. بدءا من الضلع الحقيقي السابع ، استخدم ملقط متوسط منحني للعد لأعلى لتحديد الأضلاع الأربعة والخامسة. لاحظ هذه المنطقة للحقن.
  5. امزج معلق الخلية عن طريق التقليب برفق 3-4x. قبل الحقن مباشرة ، استخدم حقنة أنسولين معقمة 300 ميكرولتر 31 جم 8 مم لسحب 50 ميكرولتر من تعليق الخلية والتأكد من عدم وجود فقاعات.
  6. أضف شريطا من الشريط المعدني المعقم بسمك 4 مم إلى الإبرة ، واشطفه إلى المحقنة ، ليكون بمثابة سدادة. هذا يضمن أن الإبرة تذهب إلى عمق 4 مم فقط في الرئة.
  7. حقن معلق الخلية سعة 50 ميكرولتر أسفل الضلع الرابع مباشرة في الفراغ الوربي بين الضلع الرابع والخامس بزاوية 90 درجة عموديا على الرئة. بعد حقن معلق الخلية ، امسك الإبرة في مكانها لمدة 2-3 ثوان للسماح ل Matrigel بالتصلب ومنع الخلايا من الخروج من موقع الحقن.
  8. قم بإزالة الإبرة ببطء في نفس الزاوية وتخلص منها في حاوية الأدوات الحادة.
  9. خياطة الجلد باستخدام 2-3 غرز ، وأغلقها بعقد مربعة ، وأضف مادة لاصقة جراحية بيطرية لضمان إغلاق الجرح بشكل كاف.

8. إجراءات ما بعد الجراحة

  1. ضع الماوس في قفص فارغ على جهاز تسخين معتمد من IACUC. راقب الماوس حتى يتعافى تماما من التخدير ، والذي يجب أن يستغرق 1-2 دقيقة.
  2. بمجرد أن يكون الماوس في حالة تأهب ويتحرك ، ضعه في قفص به فراش جديد. راقب الفأر بشكل متكرر خلال أول 24 ساعة بحثا عن أي علامات للألم أو العدوى.
  3. إعطاء مسكن مضادات الالتهاب غير الستيروئيدية ، ميلوكسيكام (2 مجم / كجم من الوزن) ، عن طريق الحقن تحت الجلد لمدة يومين بعد الجراحة.

9. مراقبة نمو الورم بواسطة in vivo BLI

  1. راقب نمو الورم في الرئة باستخدام BLI في وقت مبكر من اليوم التالي للجراحة ومرة واحدة يوميا.
  2. إجراء التصوير في الجسم الحي باستخدام نظام التصوير في الجسم الحي (IVIS).
    1. اصنع اللوسيفيرين بمعدل 15 مجم / مل في 1x PBS بدون مغنيسيوم أو كالسيوم. بالنسبة للفأر 20 جم ، فإن هذا يعادل حقن 200 ميكرولتر من محلول لوسيفيرين 15 مجم / مل.
      ملاحظة: قم بحماية محلول اللوسيفيرين المحضر من الضوء عن طريق تغطيته بورق الألمنيوم عندما لا يكون قيد الاستخدام لأنه حساس للضوء.
    2. افتح البرنامج وقم بتعيين معلمات التصوير الحيوي. اضبط وقت التعرض على تلقائي. اضبط Binning Factor على 4.
    3. حقن الفئران داخل الصفاق ب 150 مجم من لوسيفيرين لكل كيلوغرام من الوزن.
    4. عند تصوير نموذج خلية سرطانية جديد لأول مرة ، قم بإجراء منحنى حركي لتحديد وقت امتصاص اللوسيفيرين الأمثل ، والذي يشار إليه بالوقت الذي يبلغ فيه التلألؤ ذروته قبل أن يبدأ في الاستقرار.
      1. حقن الفئران باللوسيفيرين. انتظر 3 دقائق حتى يتم امتصاص اللوسيفيرين.
      2. صور الفئران كل 5-10 دقائق لمدة 60 دقيقة.
        ملاحظة: يختلف وقت الامتصاص الأمثل لخطوط الخلايا المختلفة عادة من 5-15 دقيقة.
    5. لجميع جلسات التصوير اللاحقة، استخدم وقت امتصاص اللوسيفيرين الأمثل. تخدير الفئران استعدادا للتصوير خلال هذا الوقت. ضع الفئران في غرفة الحث بنسبة 2٪ أيزوفلوران بمعدل تدفق 2.0 لتر / دقيقة.
    6. بعد اكتمال الاستيعاب، التقط صورتين عن طريق تحديد اكتساب.
      1. الصورة الأولى للفأر وهو يوضع في وضع الاستلقاء الجانبي الأيمن. يسمح ذلك للكاميرا بالتقاط موقع الحقن الموجود في الجزء الجانبي الأيسر من الماوس. استخدم طريقة العرض هذه لتحديد نمو الورم. سيتم الإشارة إلى الصور الملتقطة في هذا الموضع من الآن فصاعدا على أنها عرض جانبي يسار.
      2. مباشرة بعد اكتمال الصورة الأولى ، التقط صورة ثانية للفأر في وضع ضعيف. يسمح هذا للكاميرا بالتقاط الفوتونات المنبعثة من الورم في تجويف الصدر من المنظر البطني. استخدم هذا العرض (المشار إليه هنا باسم المنظر البطني) لتقدير موقع السرطان داخل تجويف الصدر.
  3. لتحليل الصور ، قم بتغيير الوحدات من Counts إلى Radiance.
  4. افتح أداة الحنك. انتقل إلى ضبط الصورة ، وحدد يدوي. اختر الحد الأدنى والحد الأقصى لشريط الألوان الذي يناسب الصور الملتقطة.
  5. افتح أدوات عائد الاستثمار. حدد القائمة المنسدلة للدائرة لإضافة دائرة منطقة اهتمام (ROI) إلى الصورة. حرك الدائرة فوق الشق للرؤية الجانبية اليسرى وفوق منتصف الصدر للرؤية البطنية.
  6. حدد قياس عائد الاستثمار.

10. تقييم معايير الإدراج والاستبعاد

  1. أولا ، تأكد من وجود تلألؤ الورم في الرئة من خلال مراقبة صورة العرض الجانبي الأيسر.
  2. بعد ذلك ، تأكد من وجود تلألؤ الورم في تجويف الصدر الأيسر في صورة العرض البطني. بعد ذلك ، تأكد من وجود موقع واحد فقط للتلألؤ من صورة العرض البطني.
  3. إذا تم استيفاء هذين المعيارين (الخطوتين 10.1 ، 10.2) ، فقم بتقييم معايير الاستبعاد من خلال التأكد من أن اللمعان لا يعبر خط الوسط في تجويف الصدر في صورة الرؤية البطنية. إذا لم يكن من الممكن اكتشاف أي تلألؤ في صورة العرض الجانبي الأيسر بعد صورتين متتاليتين لجهاز IVIS على مدار 4 أيام بعد الجراحة ، فاستبعد هذا الفأر من مزيد من الدراسات ، حيث من المحتمل أن الخلايا السرطانية لم تأخذها.

11. تقييم الأورام في نهاية الدراسات

  1. عندما يصل التدفق الكلي لتلألؤ الورم إلى 1 × 108 فوتونات / ثانية (p / s) أو أكثر ، قم بحصاد الفئران لتقييمات نقطة النهاية.
  2. اجمع الورم للتحليل التشريحي الإجمالي أو علم الأنسجة عن طريق تنفيذ الخطوات التالية للتخدير والنضح في الرئة كما هو موضح سابقا37.
    1. ضع الفأر في حجرة الحث للتخدير باستخدام الأيزوفلوران. اضبط معدل تدفق الأكسجين على 2.0 لتر / دقيقة والمبخر عند 2٪ أيزوفلوران. راقب تنفس الفأر واستخدم منعكس سحب الدواسة لتأكيد التخدير المناسب.
      ملاحظة: يمكن ضبط تركيز الأيزوفلوران بناء على حجم الماوس.
    2. ضع الفأر في مخروط الأنف في وضع ضعيف. تحقق للتأكد من تخدير الماوس بشكل صحيح باستخدام منعكس سحب الدواسة قبل المتابعة.
    3. افتح تجويف صدر الفأر لتصور الرئتين والقلب خلف الحجاب الحاجز.
    4. قم بعمل قطع رأسي طويل بشكل أدنى على طول خط الوسط للماوس. حرك الأمعاء لتصور الشريان الكلوي الأيسر.
    5. اقطع الحجاب الحاجز لتصور القلب.
    6. قطع الشريان الكلوي الأيسر.
    7. حقن ما يقرب من 5-10 مل من 1x PBS من خلال البطين الأيمن للقلب بمعدل 5 مل / دقيقة تقريبا.
    8. قم بعمل شق على طول الرقبة. قم بإزالة أي دهون تحت الجلد تقع فوق القصبة الهوائية. احرص على عدم قطع القصبة الهوائية.
    9. ثقب القصبة الهوائية بالتوازي مع إبرة لحقن 10٪ فورمالين مباشرة في القصبة الهوائية لتضخيم الرئتين وإصلاحهما.
    10. شراء الرئتين من تجويف الصدر عن طريق قطع القصبة الهوائية فوق قمة الرئة ، وقطع غشاء الجنب والأربطة التي تربط الرئة بتجويف الصدر.
    11. ضع في 10٪ فورمالين لإصلاحه.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

في هذه الدراسة ، تم حقن الفئران C57BL6 / N وفقا للبروتوكول المقدم (الشكل 1). تم استخدام خلايا LLC المعدلة وراثيا للتعبير عن لوسيفيراز (LLC-luc). بالإضافة إلى ذلك ، تم حقن فأر زائف ب Matrigel بدون خلايا سرطانية. يمكن بدء BLI على IVIS في أقرب وقت بعد يوم واحد من الجراحة. تم تحسين دراسة LLC-luc هذه على BLI لتقييم سرطان الرئة في مراحله المبكرة. يحتوي نظام BLI المستخدم في هذه الورقة على حد أدنى للإشعاع القابل للاكتشاف (MDR) يبلغ 10 فوتونات∙s-1∙cm-...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يصف هذا البروتوكول إجراء محسنا طفيف التوغل يسمح بأوقات الشفاء السريعة ومراقبة الورم بشكل فوري تقريبا ، والذي يختلف عن الطرق الأكثر كثافة جراحيا الموصوفةسابقا 10،11،20،38،39،40،41،42،43

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

S.C.H. و CSC هما مؤسسان Geminii، Inc. تمت مراجعة شروط هذا الترتيب والموافقة عليها من قبل مكتب تضارب المصالح في الأبحاث بجامعة أيوا. جميع المؤلفين الآخرين ليس لديهم تضارب في المصالح للإعلان عنهم.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نود أن نشكر أعضاء مختبرات كارتر وشيفيلد ، وسوزان والش ، وبريان ألين ، وكرانتي مابوسكار على المناقشات القيمة. نود أيضا أن نشكر سامانثا إيكلي ، كبيرة الأطباء البيطريين السريريين في مكتب الموارد الحيوانية ، على توجيهاتها ومشورتها. نود أن نعرب عن تقديرنا لاستخدام نظام التصوير IVIS Lumina S5 في المرفق الأساسي لتصوير الصغيرة ، وهو مورد أساسي يدعمه قسم الأشعة في جامعة أيوا. الرسوم التوضيحية الرسومية من الأشكال التي تم إنشاؤها باستخدام Biorender (https://biorender.com). تم دعم هذا العمل من قبل منح المعاهد الوطنية للصحة NCI R21CA256301 (C.S.C. ، V.C.S.) ، برنامج بيولوجيا إشعاع الجذور الحرة NCI T32CA078586 (SCH) ، نظام التصوير IVIS Lumina S5 الذي تم شراؤه على 1S10OD026835.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
0.25٪ تريبسين-إيدتا (مرة واحدة)جيبكو25200-056
الفورمالين المحايد 10٪ مخزنVWR16004-112
أطباق معالجة بمزرعة الأنسجة بمقاس 100 مم × 20 ممشركة دوت ساينتيفك.667621
190 إثبات للإيثانول النقيمختبرات ديكون2801
حقنة الأنسولين 3/10 مل مع إبرة BD فائقة الدقة 31 جرام × 5/16 بوصة.بيكتون ديكنسون328438
3M فيتبوند3M1469SB
رابطة محترفي التنسسيغماA5394
محلول بيتادين 10٪ مطهر بوفيدون-يودشركة أرفيو هيلث إل.بي.67618-150-04
فئران C57BL6/Nمختبرات تشارلز ريفر
مصفاة خلوية 40 مم نايلون  صقر352340
آلة تخدير مدمجةتخدير فيتاماك  
لوحة تسخين الأشعة تحت الحمراء البعيدة مع وحدة تحكمشركة كنت العلمية  
مقبض شفرة جراحية تقليدية، مقاس 3براد-باركر371030
ملقط النقطة المتوسطة المنحنية متعددة الأغراضفيشربراند16-100-110
ديثيوثرايتولمنتجات البحث الدوليةD11000
دي-لوسيفيرين (ملح الصوديوم)شركة كايمان للكيماويات14682
درايب، جراحي 18" × 26" غير مزين، عقيمتم الاتفاق783410
دولبيكو' إس إيجل المعدلة متوسطة (مرة واحدة)جيبكو11965-092
دولبيكو' محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) مرة واحدةجيبكو14190-144
EGTAسيغماE3389
مصل الأبقار الجنينيجيبكوA5670402
مصدر ضوء المجهر البصري FL150ميجي  
محلول جنتامايسين كبريتاتIBI العلميIB02030
الجلسرينمنتجات البحث الدوليةG22025
إيزوفلورانشركة برايمال فارما المحدودة66794-013-25
IVIS لومينا S5بيركين إلمر  
برنامج الصور الحيةبيركين إلمر  
LL/2 (LLC1)ATCCCRL-1642استخدم خط الخلايا السرطانية الذي يناسب احتياجات الدراسة بشكل أفضل 
كبريتات المغنيسيومفيشر ساينتيفكM63
مصفوفة غشاء القبو في ماتريجيلكورنينج354234
حامل إبر مايو-هيغار، 6 إنش، فكوك مسننةميلتكس8-44TC
ملقط الميكرو-أدسونأدوات العلوم الدقيقة10018-12
آلة قص مخلب N5 مع شفرات مزدوجةOneisall 
إسفنج شاش غير معقم ب 12 طبقةNDCP157112
زيت العين Optixcareأفينتيكس5914304
البنسلين ستريبتوميسينجيبكو15140-122
خياطة حرير يدوية دائمة 6-0 1 × 18"إيثيكون K802H
حمض الفوسفوريك 85٪فيشر ساينتيفكA242
شفرة المشرط مقاس 10، من الفولاذ المقاوم للصدأ، معقمةسينسيناتي للجراحة110
أنبوب غطاء اللولب مخروطي 50 ملسارستيدت62.547.100
مقص الأنسجة 4.5" ستايت بريميومأونسونغSCT115
ترايتون X-100سيغماT6878
قاعدة تريزماسيغماT1503
صبغة تريبان الزرقاء (0.4٪)جيبكو15250-061
شريط رقائق الألمنيوم المخصص مع بطانةIPGALF150L
أجهزة تطبيق القطن ذات العمود الخشبيNDC76200

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Bray, F., et al. Global cancer statistics 2022: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA Cancer J Clin. 74 (3), 229-263 (2024).
  2. Luo, G., et al. Estimated worldwide variation and trends in incidence of lung cancer by histological subtype in 2022 and over time: a population-based study. Lancet Respir Med. 13 (4), 348-363 (2025).
  3. Zhou, J., et al. Global burden of lung cancer in 2022 and projections to 2050: incidence and mortality estimates from GLOBOCAN. Cancer Epidemiol. 93, 102693(2024).
  4. Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. ACancer statistics, 2023. CA Cancer J Clin. 73 (1), 17-48 (2023).
  5. Friedlaender, A., et al. Oncogenic alterations in advanced NSCLC: a molecular super-highway. Biomark Res. 12 (1), 24(2024).
  6. Li, S., et al. Emerging targeted therapies in advanced non-small-cell lung cancer. Cancers Basel. 15 (11), 2899(2023).
  7. Chavan, P. R., et al. Unravelling key signaling pathways for the therapeutic targeting of non-small cell lung cancer. Eur J Pharmacol. 998, 177494(2025).
  8. Wang, Y., et al. Survival trends among patients with metastatic non-small cell lung cancer before and after the approval of immunotherapy in the United States: a SEER database-based study. Cancer. 131 (1), e35476(2025).
  9. Doki, Y., et al. Mediastinal lymph node metastasis model by orthotopic intrapulmonary implantation of Lewis lung carcinoma cells in mice. Br J Cancer. 79 (7-8), 1121-1126 (1999).
  10. Wilson, A. N., et al. A method for orthotopic transplantation of lung cancer in mice. Methods Mol Biol. 2374, 231-242 (2022).
  11. Poczobutt, J. M., et al. Eicosanoid profiling in an orthotopic model of lung cancer progression by mass spectrometry demonstrates selective production of leukotrienes by inflammatory cells of the microenvironment. PLoS One. 8 (11), e79633(2013).
  12. Giannou, A. D., et al. Protocol for orthotopic single-lung transplantation in mice as a tool for lung metastasis studies. STAR Protoc. 4 (4), 102701(2023).
  13. Gan, W., et al. Establishment of an orthotopic model of lung cancer by transthoracic lung puncture using tumor fragments. J Thorac Dis. 15 (4), 2012-2021 (2023).
  14. Nakajima, T., et al. Orthotopic lung cancer murine model by nonoperative transbronchial approach. Ann Thorac Surg. 97 (5), 1771-1775 (2014).
  15. Moll, H. P., et al. Orthotopic transplantation of syngeneic lung adenocarcinoma cells to study PD-L1 expression. J Vis Exp. (143), e58101(2019).
  16. Kang, Y., et al. Development of an orthotopic transplantation model in nude mice that simulates the clinical features of human lung cancer. Cancer Sci. 97 (10), 996-1001 (2006).
  17. Im, G. H., et al. Improvement of orthotopic lung cancer mouse model via thoracotomy and orotracheal intubation enabling in vivo imaging studies. Lab Anim. 48 (2), 124-131 (2014).
  18. McDonald, J. A., et al. On target: an intrapulmonary transplantation method for modelling lung tumor development in its native microenvironment. Methods Mol Biol. 2691, 31-41 (2023).
  19. Liu, X., et al. Establishment of an orthotopic lung cancer model in nude mice and its evaluation by spiral CT. J Thorac Dis. 4 (2), 141-145 (2012).
  20. Liu, P., et al. In vivo imaging of orthotopic lung cancer models in mice. Methods Mol Biol. 2279, 199-212 (2021).
  21. Yamada-Hara, M., et al. In vivo bioluminescence imaging of tumor progression in the Lewis lung carcinoma orthotopic mouse model: a comparison between the tail vein injection and intranasal instillation methods. Curr Protoc. 4 (12), e70071(2024).
  22. Xu, H., et al. Unraveling the immune mechanisms and therapeutic targets in lung adenosquamous transformation. Front Immunol. 16, 1542526(2025).
  23. Ghasemi, K. Tiragolumab and TIGIT: pioneering the next era of cancer immunotherapy. Front Pharmacol. 16, 1568664(2025).
  24. Fortich, S., et al. Surgical management of oligometastatic non-small cell lung cancer. Cancers Basel. 17 (12), 2040(2025).
  25. Al-Showbaki, L., et al. Anti-programmed cell death-1 versus anti-programmed death-ligand 1 in PD-L1-negative advanced non-small cell lung cancer: a systematic review and meta-analysis. World J Oncol. 16 (3), 299-310 (2025).
  26. Close, D. M., et al. In vivo bioluminescent imaging (BLI): noninvasive visualization and interrogation of biological processes in living animals. Sensors Basel. 11 (1), 180-206 (2011).
  27. Driehuys, B., et al. Small animal imaging with magnetic resonance microscopy. ILAR J. 49 (1), 35-53 (2008).
  28. Jelicks, L. A., et al. Imaging of small-animal models of infectious diseases. Am J Pathol. 182 (2), 296-304 (2013).
  29. Klaunberg, B. A., Lizak, M. J. Considerations for setting up a small-animal imaging facility. Lab Anim. 33 (3), 28-34 (2004).
  30. Puaux, A. L., et al. A comparison of imaging techniques to monitor tumor growth and cancer progression in living animals. Int J Mol Imaging. 2011, 321538(2011).
  31. Yitbarek, D., Dagnaw, G. G. Application of advanced imaging modalities in veterinary medicine: a review. Vet Med Auckl. 13, 117-130 (2022).
  32. Saito-Moriya, R., et al. How to select firefly luciferin analogues for in vivo imaging. Int J Mol Sci. 22 (4), 1848(2021).
  33. Ramos-Gonzalez, M. R., et al. Establishment of translational luciferase-based cancer models to evaluate antitumoral therapies. Int J Mol Sci. 25 (19), 10418(2024).
  34. Young, M. R., et al. Monitoring tumor promotion and progression in a mouse model of inflammation-induced colon cancer with magnetic resonance colonography. Neoplasia. 11 (3), 237-246 (2009).
  35. Takeuchi, K., et al. Molecular structure and transcriptional function of the rat vascular AT1a angiotensin receptor gene. Circ Res. 73 (4), 612-621 (1993).
  36. Christian, S. L. Overview of the maintenance of authentic cancer cell lines. Methods Mol Biol. 2508, 1-7 (2022).
  37. Davenport, M. L., et al. Perfusion and inflation of the mouse lung for tumor histology. J Vis Exp. (162), e2020(2020).
  38. Helms, M. N., et al. Direct tracheal instillation of solutes into mouse lung. J Vis Exp. (42), e2010(2010).
  39. Kee, J. Y., et al. Antitumor immune activity by chemokine CX3CL1 in an orthotopic implantation of lung cancer model. Mol Clin Oncol. 1 (1), 35-40 (2013).
  40. Li, H. Y., et al. The tumor microenvironment regulates sensitivity of murine lung tumors to PD-1/PD-L1 antibody blockade. Cancer Immunol Res. 5 (9), 767-777 (2017).
  41. Morgan, K. M., et al. Patient-derived xenograft models of non-small cell lung cancer and their potential utility in personalized medicine. Front Oncol. 7, 2(2017).
  42. Oser, M. G., et al. Genetically-engineered mouse models of small cell lung cancer: the next generation. Oncogene. 43 (7), 457-469 (2024).
  43. Spiro, J. E., et al. Monitoring treatment effects in lung cancer-bearing mice: clinical CT and clinical MRI compared to micro-CT. Eur Radiol Exp. 4 (1), 31(2020).
  44. Weiss, I. D., et al. In the hunt for therapeutic targets: mimicking the growth, metastasis, and stromal associations of early-stage lung cancer using a novel orthotopic animal model. J Thorac Oncol. 10 (1), 46-58 (2015).
  45. Zhu, S., et al. Metabolomics study of ribavirin in the treatment of orthotopic lung cancer based on UPLC-Q-TOF/MS. Chem Biol Interact. 370, 110305(2023).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

مقالات ذات صلة