مقالة منهجية
أنشأنا مقايسة تهجين مزدوجة في الموقع لرسم خريطة للأشكال الإسوية لمستقبلات الأنسولين IR-A و IR-B في الضفيرة المشيمية الفئران ، والتغلب على قيود الطرق التقليدية. يكشف هذا النهج عالي الدقة عن تعبير خاص بالشكل الإسوي ، ويقدم رؤى جديدة حول إشارات الأنسولين في الدماغ والعلاجات المحتملة التي تستهدف الأشكال الإسوية للاضطرابات العصبية.
يتم التعبير عن مستقبلات الأنسولين (IRs) على نطاق واسع عبر جميع الأنسجة وجميع أنواع الخلايا. إنه موجود في شكلين إسويين متميزين وظيفيا - IR-A و IR-B - يختلفان بمقدار 12 من الأحماض الأمينية بسبب التضفير البديل. تظهر هذه الأشكال الإسوية أنماط تعبير خاصة بالأنسجة والخلايا ، مع اختلاف وفرة نسبية خلال النمو والشيخوخة والمرض. نظرا للتشابه العالي في التسلسل، فإن التمييز بين IR-A و IR-B باستخدام الطرق المناعية التقليدية كان أمرا صعبا. هنا ، نصف مقايسة التهجين المزدوج في الموقع (ISH) الجديدة التي تتيح تصور تعبير IR-A و IR-B في الأنسجة. باستخدام هذا النهج ، نوضح لأول مرة أنه بينما يتم التعبير عن كلا الشكلين الإسويين في الضفيرة المشيمية الفئران ، فإن IR-A هو السائد. توفر هذه الطريقة أداة قوية للتحقيق في التوزيع المكاني للأشكال الإسوية لمستقبلات الأنسولين في الموقع عبر الأنسجة المختلفة. في حين أن qPCR في الوقت الفعلي يمكنه اكتشاف نصوص IR-A و IR-B في الثقافات أحادية الخلية في المختبر ، إلا أنه يفتقر إلى القدرة على التوطين المكاني داخل الأنسجة المعقدة ، مما يسلط الضوء على الحاجة إلى تقنية Duplex ISH وفائدتها.
مستقبلات الأنسولين (IR) هي مستقبل إنزيمي عبر الغشاء أحادي التمرير يتوسط التأثيرات الفسيولوجية المتنوعة للأنسولين. إنه يعمل كبروتين ثنائي ، حيث يتكون كل مونومر من سلسلتين من الببتيد مرتبطتين برابطة ثاني كبريتيد: الوحدة الفرعية α خارج الخلية ، والتي تحتوي على مجال ربط الترابط ، والوحدة الفرعية β عبر الغشاء ، التي يمتلك تسلسلها داخل الخلايا نشاط التيروزين كينازالجوهري 1. من خلال التضفير البديل للإكسون 11 ، يؤدي نسخ جين الأشعة تحت الحمراء إلى ظهور نوعين مختلفين من الأشعة تحت الحمراء mRNA. يفتقر IR-A إلى exon 11 ، بينما يحتفظ به IR-B. وبالتالي ، يختلف IR-A و IR-B من خلال تسلسل من 12 حمض أميني بالقرب من الطرف C للوحد....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
تم إجراء جميع الإجراءات الحيوانية وفقا للبروتوكولات المعتمدة من قبل المعهد الوطني للشيخوخة (NIA) ، المعتمد بالكامل من قبل الجمعية الأمريكية لاعتماد رعاية المختبر (AAALAC). تمت مراجعة البروتوكولات والموافقة عليها من قبل لجنة رعاية واستخدامه التابعة لبرنامج البحوث الداخلية NIA (IRP / NIA). تم إيواء الفئران في منشأة يتم التحكم في درجة حرارتها تحت دورة الضوء / الظلام لمدة 12 ساعة ، مع إمكانية الوصول إلى الماء والطعام القياسي ما لم ينص على خلاف ذلك. تم الحصول على ذكور الفئران C57BL / 6J من مختبر جاكسون واستخدمت في التجارب في عمر 3-4 أشهر.
1. إعداد عينة مجمدة ثابتة
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
مستقبلات الأنسولين (IR) عبارة عن مستقبل تيروزين كيناز عبر الغشاء يتكون من وحدتين فرعيتين α خارج الخلية ووحدتين فرعيتين β غشائية ، مما يشكل غير متجانسة وظيفية. تتوسط الوحدات الفرعية α في ربط الأنسولين ، بينما تمتلك الوحدات الفرعية β نشاط التيروزين كيناز الجوهري الذي يبدأ إشارات المصب. يولد التضفير البديل للأشعة تحت الحمراء mRNA للإكسون 11 شكلين إسويين من الأشعة تحت الحمراء و IR-A و IR-B. على هذا النحو ، يشتمل IR-B على جزء من حمض أمينو 12 مشفرا بواسطة exon 11 داخل المنطقة الطرفية C للوحدة ا.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
داخل الدماغ ، يكون التعبير عن مستقبلات الأنسولين (IR) غير متجانس ، مع ملاحظة كثافات عالية في مناطق مثل البصلة الشمية ، وما تحت المهاد ، والحصين ، والضفيرةالمشيمية 10. سيوفر التوصيف الشامل لأنماط التعبير المتغيرة في مناطق وأنواع معينة من الدماغ معلومات مهمة ، مما يمكننا من دراسة وفهم الأدوار المحددة للأنسولين وإشارات IGF-II في اللدونة المشبكية والتعلم والذاكرة12. بالإضافة إلى ذلك ، فإن هذا من شأنه أن يعطينا رؤى أفضل للعمليات المرضية التي تنط.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للإفصاح عنه.
تم دعم هذا العمل من قبل برنامج البحوث الداخلية / المعهد الوطني للشيخوخة / المعاهد الوطنية للصحة.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| ماء الأمونيوم | علم المجهر الإلكتروني | هاتف: 26754-4 أ | |
| مجموعة كاشف الكشف BaseScope Dulplex | ACD Bio | 323810 | |
| مسبار التحكم الإيجابي BaseScope Dulplex Duplex- الماوس (مم) - C1-PPIB-1ZZ / C2-Polr2a-1ZZ | ACD Bio | 700121 | |
| مسبار التحكم الإيجابي BaseScope Dulplex Duplex-C1-DapB-1ZZ/C2-DapB-1ZZ | ACD Bio | 700141 | |
| جيلز هيماتوكسيلين الأول | سيجما ألدريتش | جي إتش إس 132-1 لتر | |
| الماعز المضاد للأرانب IgG (H + L) جسم مضاد ثانوي عالي الامتصاص ، Alexa Fluor Plus 488 | إنفيتروجين | أ 32731 | |
| فرن HybEZ ، صينية ، رف وصينية غسيل | ACD Bio | 321721, 310012, 321716, 321717 | |
| ImmEdge قلم حاجز مسعور | مختبر النواقل | إتش -4000 | |
| مجسات الشكل الإسوي INSR Aand B: BA-MM-INSR-tv1-E10E11 ، BA-MM-INSR-tv2-E11E12-C2 | ACD Bio | 717411 ، 717421-C2 | |
| الأجسام المضادة لمستقبلات الأنسولين | إشارات الخلية | 23413 | |
| RNAscope 10x الهدف Retrival | ACD Bio | 322000 | |
| RNAscope بيروكسيد الهيدروجين ، البروتياز بلس | ACD Bio | 322381 | |
| سترات الصوديوم المالحة (SSC) 20x | فيشر العلمية | BP1325-1 | |
| شرائح SuperFrost Plus | فيشر العلمية | 12-550-18 | |
| VectaMount التركيب الدائم المتوسط | مختبر النواقل | إتش-5000 |
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه
طلب إذن