مقالة منهجية

التصور الدقيق لمستقبلات الأنسولين A و B في دماغ الفئران باستخدام مقايسة التهجين في الموقع RNA

843 مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/68677

⸱

يوليو 15, 2025

 ,  ,  ,  , 
1Diabetes Section/Laboratory of Clinical Investigation, National Institute on Aging, National Institutes of Health

في هذه المقالة

ملخص

أنشأنا مقايسة تهجين مزدوجة في الموقع لرسم خريطة للأشكال الإسوية لمستقبلات الأنسولين IR-A و IR-B في الضفيرة المشيمية الفئران ، والتغلب على قيود الطرق التقليدية. يكشف هذا النهج عالي الدقة عن تعبير خاص بالشكل الإسوي ، ويقدم رؤى جديدة حول إشارات الأنسولين في الدماغ والعلاجات المحتملة التي تستهدف الأشكال الإسوية للاضطرابات العصبية.

الملخص

يتم التعبير عن مستقبلات الأنسولين (IRs) على نطاق واسع عبر جميع الأنسجة وجميع أنواع الخلايا. إنه موجود في شكلين إسويين متميزين وظيفيا - IR-A و IR-B - يختلفان بمقدار 12 من الأحماض الأمينية بسبب التضفير البديل. تظهر هذه الأشكال الإسوية أنماط تعبير خاصة بالأنسجة والخلايا ، مع اختلاف وفرة نسبية خلال النمو والشيخوخة والمرض. نظرا للتشابه العالي في التسلسل، فإن التمييز بين IR-A و IR-B باستخدام الطرق المناعية التقليدية كان أمرا صعبا. هنا ، نصف مقايسة التهجين المزدوج في الموقع (ISH) الجديدة التي تتيح تصور تعبير IR-A و IR-B في الأنسجة. باستخدام هذا النهج ، نوضح لأول مرة أنه بينما يتم التعبير عن كلا الشكلين الإسويين في الضفيرة المشيمية الفئران ، فإن IR-A هو السائد. توفر هذه الطريقة أداة قوية للتحقيق في التوزيع المكاني للأشكال الإسوية لمستقبلات الأنسولين في الموقع عبر الأنسجة المختلفة. في حين أن qPCR في الوقت الفعلي يمكنه اكتشاف نصوص IR-A و IR-B في الثقافات أحادية الخلية في المختبر ، إلا أنه يفتقر إلى القدرة على التوطين المكاني داخل الأنسجة المعقدة ، مما يسلط الضوء على الحاجة إلى تقنية Duplex ISH وفائدتها.

المقدمة

مستقبلات الأنسولين (IR) هي مستقبل إنزيمي عبر الغشاء أحادي التمرير يتوسط التأثيرات الفسيولوجية المتنوعة للأنسولين. إنه يعمل كبروتين ثنائي ، حيث يتكون كل مونومر من سلسلتين من الببتيد مرتبطتين برابطة ثاني كبريتيد: الوحدة الفرعية α خارج الخلية ، والتي تحتوي على مجال ربط الترابط ، والوحدة الفرعية β عبر الغشاء ، التي يمتلك تسلسلها داخل الخلايا نشاط التيروزين كينازالجوهري 1. من خلال التضفير البديل للإكسون 11 ، يؤدي نسخ جين الأشعة تحت الحمراء إلى ظهور نوعين مختلفين من الأشعة تحت الحمراء mRNA. يفتقر IR-A إلى exon 11 ، بينما يحتفظ به IR-B. وبالتالي ، يختلف IR-A و IR-B من خلال تسلسل من 12 حمض أميني بالقرب من الطرف C للوحدة الفرعية α ، مما يؤدي إلى ارتباط مميز لعوامل النمو إلى جانب الأنسولين الناضج ، وخصائص إشارات متباينة في اتجاه مجرى النهر. في حين أن كلا المتغيرين يظهران تقاربا مشابها للأنسولين ، فإن IR-A له تقارب أعلى مع عامل النمو الشبيه بالأنسولين II (IGF-II) والبروينسولين مقارنة بالأشعة تحت الحمراء B. تختلف أنماط التعبير عن IR-A و IR-B اعتمادا على الأنسجة ونوع الخلية وحالة المرض2.

يؤكد تعبيرها التفاضلي في الأنسجة والأمراض على مساهمتها الفريدة في علم وظائف الأعضاء وعلم الأمراض. تلعب الضفيرة المشيمية (CP) ، وهي بنية متخصصة تنتج السائل النخاعي (CSF) وتشكل جزءا من الحاجز الدموي النخاعي ، دورا مهما في نقل العناصر الغذائية وإزالة النفايات والحماية العصبية ، خاصة أثناء الالتهاب. يتم التعبير عن كلا الشكلين الإسويين للأشعة تحت الحمراء في CP ، حيث من المحتمل أن ينظموا حجم السائل الدماغي النخاعي وتكوينه. IR-A, من خلال ملزمها عالية التقارب بواسطة IGF-II, من المحتمل أن يعزز التكاثر الخلوي وإصلاح الأنسجة في ظهارة CP. من ناحية أخرى ، يتورط IR-B في نقل الأنسولين عبر حاجز الدم السائل الدماغي النخاعي ، مما يدعم توافر الأنسولين في الدماغ للخلايا النجمية والخلايا العصبية والدبقية وتوازن الجلوكوز3،4.

ارتبطت مستويات الأشعة تحت الحمراء قبل السكري بارتفاع السائل الدماغي النخاعي في الأفراد الذين لا تظهر عليهم أعراض معرضين لخطر وراثي لمرض الزهايمر (AD) 5 ، وقد تم ربط التغيرات في نسبة IR-A / IR-B بمقاومة الأنسولين والشيخوخة وزيادة عوامل النشاط التكاثري التي قد تساهم في الإصابة بالسرطان والأمراض الأخرى6. يمثل تحديد أنماط التعبير الخاصة بالشكل الإسوي ل IR-A و IR-B خطوة حاسمة نحو تطوير استراتيجيات علاجية جديدة لاضطرابات الجهاز العصبي المركزي المعقدة. ومع ذلك ، فإن الأساليب الحالية ، مثل التلوين المناعي و qPCR ، محدودة: لا يمكن تصنيف جميع البروتينات بشكل موثوق بسبب نقص الأجسام المضادة التي تم التحقق من صحتها ، وعلى الرغم من أن qPCR محدد للغاية ، إلا أنه يفتقر إلى الدقة المكانية.

للتغلب على هذه القيود ، استخدمنا التهجين المزدوج في الموقع (ISH) ، وهي تقنية متقدمة للكشف عن الحمض النووي الريبي تعتمد على منصة RNAscope BaseScope. يستخدم هذا الاختبار تصميما فريدا للمسبار مزدوج Z يتطلب ارتباطا ترادفيا بالحمض النووي الريبي المستهدف ، مما يتيح خصوصية وحساسية عالية ، حتى بالنسبة للنصوص منخفضة الوفرة. يتم تضخيم الإشارة الفلورية أو الكروموجينيك من خلال أحداث ربط المسبار المتعددة ، مما يعزز الكشف ويقلل من الخلفية7. على عكس RNAscope القياسي ، تم تحسين هذا الاختبار للكشف عن تسلسلات الحمض النووي الريبي القصيرة (50-300 قاعدة) ، مما يجعله مناسبا بشكل خاص لتحديد أحداث التضفير البديلة ، ومتغيرات النوكليوتيدات المفردة ، والنصوص النادرة في الأنسجة المعقدة مثل الدماغ8.

يصور هذا الاختبار الأهداف في وقت واحد كإشارات كروموجينيكية خضراء مميزة (C1) وحمراء (C2) تحت المجال الساطع. يضمن النجاح باستخدام الأنسجة المثبتة في 4٪ بارافورمالدهيد (PFA) أو 10٪ فورمالين محايد مخزن (NBF) ومقسمة عند 5 ميكرومتر -15 ميكرومتر (مجمدة / FFPE) ، تحتوي على الحمض النووي الريبي منخفض الوفرة إلى العالية. نظرا للحساسية لتدهور الحمض النووي الريبي ، والتثبيت المفرط ، وأخطاء التحقيق ، نحتاج إلى تحسين المعالجة المسبقة وتصميم المسبار وعناصر التحكم لزيادة الخصوصية وتقليل الخلفية. هنا ، قمنا بتطبيق اختبار ISH المزدوج هذا لتوصيف أنماط التعبير عن IR-A و IR-B في CP الفئران ، مما يوفر رؤى جديدة حول البيولوجيا المكانية للأشكال الإسوية للأشعة تحت الحمراء وأدوارها المحتملة في صحة الدماغ ومرضه.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

تم إجراء جميع الإجراءات الحيوانية وفقا للبروتوكولات المعتمدة من قبل المعهد الوطني للشيخوخة (NIA) ، المعتمد بالكامل من قبل الجمعية الأمريكية لاعتماد رعاية المختبر (AAALAC). تمت مراجعة البروتوكولات والموافقة عليها من قبل لجنة رعاية واستخدامه التابعة لبرنامج البحوث الداخلية NIA (IRP / NIA). تم إيواء الفئران في منشأة يتم التحكم في درجة حرارتها تحت دورة الضوء / الظلام لمدة 12 ساعة ، مع إمكانية الوصول إلى الماء والطعام القياسي ما لم ينص على خلاف ذلك. تم الحصول على ذكور الفئران C57BL / 6J من مختبر جاكسون واستخدمت في التجارب في عمر 3-4 أشهر.

1. إعداد عينة مجمدة ثابتة

  1. قم بتنقية الفأر باستخدام 4٪ PFA المحضر حديثا في 1x PBS وضع الدماغ كله في 4٪ PFA محضر طازجا لمدة 17-24 ساعة عند 4 درجات مئوية.
    ملاحظة: توضع الأنسجة في 4٪ PFA (10 مل لكل دماغ) لمدة لا تزيد عن 24 ساعة.
  2. اغمر الأنسجة في 10٪ (10 مل) من السكروز في 1x PBS عند 4 درجات مئوية حتى تغرق الأنسجة في قاع الحاوية. بعد ذلك ، قم بنقل الأنسجة بالتتابع إلى 20٪ سكروز وأخيرا إلى 30٪ سكروز ، مما يسمح لها بالغرق في كل خطوة.
    ملاحظة: يختلف الوقت اللازم لتغرق الأنسجة باختلاف نوع الأنسجة وحجمها. بالنسبة لأنسجة المخ ، يستغرق الأمر حوالي 18 ساعة.
  3. قم بتجميد الأنسجة في وسائط تضمين OCT وتخزين كتل المناديل في حاوية محكمة الإغلاق عند -80 درجة مئوية.
  4. قم بتقسيم أنسجة المخ المجمدة بالفورمالديهايد إلى شرائح 10 ميكرومتر وتخزينها في درجة حرارة -80 درجة مئوية حتى الاستخدام.
    ملاحظة: قم بتركيب الأقسام على شرائح مجهر موجبة الشحنة ؛ قد تؤدي أنواع الشرائح الأخرى إلى فقدان الأنسجة. إذا لم يتم استخدام الشرائح على الفور ، فقم بتخزينها عند -80 درجة مئوية لمدة تصل إلى 3 أشهر.

2. المعالجة المسبقة للقسم قبل فحص الكشف عن الازدواج

  1. في يوم الفحص ، اغسل الشرائح في 1x PBS لمدة 5 دقائق ، وحرك رف الشرائح برفق لأعلى ولأسفل لإزالة أي OCT متبقي.
  2. اخبزي الشرائح على حرارة 60 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
  3. قم بإصلاح الشرائح في 4٪ PFA المبرد مسبقا في 1x PBS لمدة 15 دقيقة عند 4 درجات مئوية.
  4. انقل الشرائح بالتتابع من خلال سلسلة EtOH: 50٪ EtOH لمدة 5 دقائق في RT ، و 70٪ EtOH لمدة 5 دقائق في RT ، و 100٪ EtOH لمدة 5 دقائق في RT ، و 100٪ EtOH مرة أخرى لمدة 5 دقائق في RT.
  5. ينزلق جاف بالهواء لمدة 5 دقائق في RT.
  6. ضع 2-4 قطرات من بيروكسيد الهيدروجين على كل قسم واحتضنه لمدة 10 دقائق في RT. اشطفه مرة واحدة بالماء المقطر.
  7. قم بإعداد 700 مل من محلول استرجاع الهدف الطازج 1x في دورق يغطى بورق القصدير ويغلى المزيج بشكل ثابت (99-100 درجة مئوية).
    ملاحظة: لا تغلي لأكثر من 30 دقيقة قبل الاستخدام. في هذه الأثناء ، سخني الفرن (انظر جدول المواد) إلى 40 درجة مئوية.
  8. اغمر رف الشرائح بعناية في محلول استرجاع الهدف المغلي واحتضنه لمدة 5 دقائق. حافظ على درجة الحرارة بين 98-102 درجة مئوية وراقب عن كثب.
    ملاحظة: قد يلزم تعديل وقت الغليان (5-15 دقيقة) حسب نوع الأنسجة.
  9. انقل رف الانزلاق الساخن على الفور إلى طبق به ماء مقطر ، وحرك الرف لأعلى ولأسفل 3-5 مرات. كرر مع الماء المقطر العذب.
  10. اشطف الشرائح بمقدار 100٪ EtOH الطازج ، وحركها لأعلى ولأسفل 3-5 أضعاف الشرائح الجافة بالهواء.
  11. استخدم قلم حاجز كاره للماء للرسم حول كل قسم من الأنسجة 2-3x. اترك الحاجز يجف تماما في RT.
  12. ضع الشرائح في درج الشرائح الدفعية. أضف البروتياز (انظر جدول المواد) إلى كل قسم ، مع التأكد من تغطية الأنسجة بالكامل. تحتضن في الفرن على حرارة 40 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.
    ملاحظة: قد يتطلب وقت حضانة البروتياز تعديلا اعتمادا على نوع الأنسجة والجين المستهدف.
  13. أخرجي صينية الانزلاق من الفرن وضعيها في الماء المقطر. اغسل الشرائح برفق عن طريق تحريكها لأعلى ولأسفل لمدة دقيقتين ، وكرر هذه الخطوة 2x بالماء المقطر العذب.

3. فحص الكشف على الوجهين

  1. المسابر
    1. قم بإعداد قسمين إضافيين لمجسات التحكم الإيجابية والسلبية.
    2. حدد مجسات التحكم بنفس عدد أزواج ZZ مثل المسبار المستهدف. بالنسبة إلى 1 زوج ZZ ، استخدم عنصر تحكم إيجابي وعنصر تحكم سلبي (انظر جدول المواد).
    3. قبل الاستخدام ، قم بتوازن المجسات عند 40 درجة مئوية لمدة 10 دقائق وإحضار كواشف AMP1-12 إلى RT.
  2. تهجين التحقيق
    1. قم بتدوير مسبار C2 لفترة وجيزة واخلطه بنسبة 1:50 مع مسبار C1. أضف كمية كافية من المسبار (100-200 ميكرولتر) لتغطية كل قسم بالكامل واحتضان الشرائح في الفرن عند 40 درجة مئوية لمدة ساعتين. اغسل الشرائح لمدة 2 × 2 دقيقة في 1x Wash Buffer في RT.
    2. قاعدة النطاق المزدوج AMP1 التطبيق
      1. قم بإزالة مخزن الغسيل الزائد من الشرائح وأضف AMP1 (100-200 ميكرولتر) لتغطية كل قسم بالكامل. يعاد إلى الفرن ويحتضن على حرارة 40 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
      2. اغسل 2 × 2 دقيقة في 1x Wash Buffer.
    3. تطبيق AMP2 مزدوج النطاق الأساسي
      1. قم بإزالة مخزن الغسيل الزائد من الشرائح وأضف AMP2 (100-200 ميكرولتر) لتغطية كل قسم بالكامل. يعاد إلى الفرن ويحتضن على حرارة 40 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
      2. اغسل 2 × 2 دقيقة في 1x Wash Buffer.
    4. تطبيق AMP3 مزدوج النطاق الأساسي
      1. قم بإزالة مخزن الغسيل الزائد من الشرائح وأضف AMP3 (100-200 ميكرولتر) لتغطية كل قسم بالكامل. يعاد إلى الفرن ويحتضن على حرارة 40 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.
      2. اغسل 2 × 2 دقيقة في 1x Wash Buffer.
        ملاحظة: لا تتجاوز 15 دقيقة من الحضانة.
    5. قاعدة النطاق المزدوج AMP4 التطبيق
      1. قم بإزالة عازلة الغسيل الزائدة من الشرائح وأضف AMP4 (100-200 ميكرولتر) لتغطية كل قسم بالكامل. يعاد إلى الفرن ويحتضن على حرارة 40 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.
      2. اغسل 2 × 2 دقيقة في 1x Wash Buffer.
    6. تطبيق النطاق الأساسي على الوجهين AMP5
      1. قم بإزالة مخزن الغسيل الزائد من الشرائح وأضف AMP5 (100-200 ميكرولتر) لتغطية كل قسم بالكامل. يعاد إلى الفرن ويحتضن على حرارة 40 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
      2. اغسل 2 × 2 دقيقة في 1x Wash Buffer.
    7. تطبيق AMP6 مزدوج النطاق الأساسي
      1. قم بإزالة مخزن الغسيل الزائد من الشرائح وأضف AMP6 (100-200 ميكرولتر) لتغطية كل قسم بالكامل. يعاد إلى الفرن ويحتضن على حرارة 40 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.
      2. اغسل 2 × 2 دقيقة في 1x Wash Buffer.
        ملاحظة: بالنسبة ل AMP3 ، لا تتجاوز 15 دقيقة من الحضانة.
    8. تطبيق النطاق الأساسي على الوجهين AMP7
      1. قم بإزالة عازلة الغسيل الزائدة من الشرائح وأضف AMP7 (100-200 ميكرولتر) لتغطية كل قسم بالكامل واحتضانه في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة.
        1. اغسل 2 × 2 دقيقة في 1x Wash Buffer.
          ملاحظة: احتضن باستخدام AMP7 في درجة حرارة الغرفة (RT) لمدة 30 دقيقة.
    9. قاعدة النطاق المزدوج AMP8 التطبيق
      1. قم بإزالة عازلة الغسيل الزائدة من الشرائح وأضف AMP8 (100-200 ميكرولتر) لتغطية كل قسم بالكامل واحتضانه في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة.
      2. اغسل 2 × 2 دقيقة في 1x Wash Buffer.
        ملاحظة: احتضن مع حضانة AMP8 لمدة 15 دقيقة في RT.
    10. كشف الإشارة الحمراء (C2)
      1. قم بتدوير Fast Red-B لفترة وجيزة واخلطه مع Fast Red-A بنسبة 1:60.
      2. ضعيه على كل قسم (100-200 ميكرولتر) ، وغطي الدرج ، واحتضنه لمدة 10 دقائق في RT في الظلام.
      3. اغسل 2x في 1x Wash Buffer.
        ملاحظة: استخدم محلول Fast Red المختلط في غضون 5 دقائق. حماية من الضوء (أشعة الشمس أو الأشعة فوق البنفسجية).
    11. قاعدة النطاق المزدوج AMP9 التطبيق
      1. قم بإزالة عازلة الغسيل الزائدة من الشرائح وأضف AMP9 (100-200 ميكرولتر) لتغطية كل قسم بالكامل. يعاد إلى الفرن ويحتضن على حرارة 40 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.
      2. اغسل 2 × 2 دقيقة في 1x Wash Buffer.
    12. تطبيق النطاق الأساسي على الوجهين AMP10
      1. قم بإزالة مخزن الغسيل الزائد من الشرائح وأضف AMP10 (100-200 ميكرولتر) لتغطية كل قسم بالكامل. يعاد إلى الفرن ويحتضن على حرارة 40 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.
      2. اغسل 2 × 2 دقيقة في 1x Wash Buffer.
    13. تطبيق النطاق الأساسي المزدوج AMP11
      1. قم بإزالة مخزن الغسيل الزائد من الشرائح وأضف AMP11 (100-200 ميكرولتر) لتغطية كل قسم بالكامل. احتضن في RT لمدة 30 دقيقة.
      2. اغسل 2 × 2 دقيقة في 1x Wash Buffer.
        ملاحظة: احتضن باستخدام AMP11 في RT لمدة 30 دقيقة.
    14. قاعدة النطاق دوبلكس AMP12 التطبيق
      1. قم بإزالة عازلة الغسيل الزائدة من الشرائح وأضف AMP12 (100-200 ميكرولتر) لتغطية كل قسم بالكامل. احتضن في RT لمدة 15 دقيقة.
      2. اغسل 2 × 2 دقيقة في 1x Wash Buffer.
        ملاحظة: لا تتجاوز 15 دقيقة من الحضانة.
    15. كشف الإشارة الخضراء (C1)
      1. قم بتدوير أنبوب Fast Green-B لفترة وجيزة واخلطه مع Fast Green-A بنسبة 1:50.
      2. ضع المحلول الأخضر على كل قسم (100-200 ميكرولتر) ، وقم بتغطية الدرج ، واحتضنه لمدة 10 دقائق في RT.
      3. يغسل لمدة 5 دقائق في 1x Wash Buffer ويشطف لفترة وجيزة بالماء المقطر.
        ملاحظة: استخدم محلول Fast Green المختلط في غضون 5 دقائق. حماية من الضوء. نسبة الأخضر B إلى A هي 1:50. كل من ركائز RED و GREEN حساسة للكحول. لا تستخدم أي كواشف تحتوي على الكحول.

4. Counterstain

  1. اغمر الشرائح في محلول تلطيخ الهيماتوكسيلين بنسبة 50٪ لمدة 1 دقيقة في RT حتى تظهر الأقسام باللون الأرجواني.
  2. اشطفها بماء الصنبور 3-5 مرات عن طريق التحرك لأعلى ولأسفل. كرر ذلك بماء الصنبور العذب حتى تختفي الخلفية ولكن تظل الأقسام أرجوانية.
  3. اغمس الشرائح في 0.02٪ من ماء الأمونيا لأعلى ولأسفل 3 مرات حتى تتحول الأقسام إلى اللون الأزرق.
  4. اشطفها مرة أخرى بماء الصنبور 3-5 مرات.

5. تصاعد

  1. تنزلق جافة تماما في فرن جاف 60 درجة مئوية لمدة ~ 15 دقيقة.
  2. اغمس الشرائح في الزيلين الطازج.
    ملاحظة: نظرا لأن وسط التركيب لزج تماما ، فإن الانخفاض القصير في الزيلين قبل التركيب يسهل الانتشار بشكل أكثر سلاسة للوسط عبر قسم الأنسجة ويقلل من تكوين فقاعات الهواء تحت الغطاء.
  3. قم بتطبيق وسيط التثبيت (انظر جدول المواد) على الشريحة والغطاء ، وتجنب الفقاعات.
  4. ينزلق الهواء لمدة 5 دقائق على الأقل.

6. تقييم العينات

  1. قم بتصوير الأقسام تحت مجهر المجال الساطع القياسي بتكبير 20x أو 40x. (الشكل 1).
    ملاحظة: يجب أن تظهر عناصر التحكم الإيجابية نقاطا متنققة في الخلايا. تكون عناصر التحكم السلبية مقبولة إذا لم يكن هناك أكثر من نقطة واحدة لكل 20 خلية بتكبير 20 ضعفا.

7. التسجيل (اختياري)

  1. استخدم برنامج تحليل الصور (على سبيل المثال ، Halo أو QuPath) لتحديد نقاط الحمض النووي الريبي لكل خلية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

مستقبلات الأنسولين (IR) عبارة عن مستقبل تيروزين كيناز عبر الغشاء يتكون من وحدتين فرعيتين α خارج الخلية ووحدتين فرعيتين β غشائية ، مما يشكل غير متجانسة وظيفية. تتوسط الوحدات الفرعية α في ربط الأنسولين ، بينما تمتلك الوحدات الفرعية β نشاط التيروزين كيناز الجوهري الذي يبدأ إشارات المصب. يولد التضفير البديل للأشعة تحت الحمراء mRNA للإكسون 11 شكلين إسويين من الأشعة تحت الحمراء و IR-A و IR-B. على هذا النحو ، يشتمل IR-B على جزء من حمض أمينو 12 مشفرا بواسطة exon 11 داخل المنطقة الطرفية C للوحدة ا...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

داخل الدماغ ، يكون التعبير عن مستقبلات الأنسولين (IR) غير متجانس ، مع ملاحظة كثافات عالية في مناطق مثل البصلة الشمية ، وما تحت المهاد ، والحصين ، والضفيرةالمشيمية 10. سيوفر التوصيف الشامل لأنماط التعبير المتغيرة في مناطق وأنواع معينة من الدماغ معلومات مهمة ، مما يمكننا من دراسة وفهم الأدوار المحددة للأنسولين وإشارات IGF-II في اللدونة المشبكية والتعلم والذاكرة12. بالإضافة إلى ذلك ، فإن هذا من شأنه أن يعطينا رؤى أفضل للعمليات المرضية التي تنط...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للإفصاح عنه.

شكر وتقدير

تم دعم هذا العمل من قبل برنامج البحوث الداخلية / المعهد الوطني للشيخوخة / المعاهد الوطنية للصحة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
ماء الأمونيومعلم المجهر الإلكتروني هاتف: 26754-4 أ
مجموعة كاشف الكشف BaseScope DulplexACD Bio323810
مسبار التحكم الإيجابي BaseScope Dulplex Duplex- الماوس (مم) - C1-PPIB-1ZZ / C2-Polr2a-1ZZACD Bio700121
مسبار التحكم الإيجابي BaseScope Dulplex Duplex-C1-DapB-1ZZ/C2-DapB-1ZZACD Bio700141
جيلز هيماتوكسيلين الأولسيجما ألدريتشجي إتش إس 132-1 لتر
الماعز المضاد للأرانب IgG (H + L) جسم مضاد ثانوي عالي الامتصاص ، Alexa Fluor Plus 488إنفيتروجينأ 32731
فرن HybEZ ، صينية ، رف وصينية غسيلACD Bio321721, 310012, 321716, 321717
ImmEdge قلم حاجز مسعورمختبر النواقلإتش -4000
مجسات الشكل الإسوي INSR Aand B: BA-MM-INSR-tv1-E10E11 ، BA-MM-INSR-tv2-E11E12-C2ACD Bio717411 ، 717421-C2
الأجسام المضادة لمستقبلات الأنسولينإشارات الخلية 23413
RNAscope 10x الهدف RetrivalACD Bio322000
RNAscope بيروكسيد الهيدروجين ، البروتياز بلسACD Bio322381
سترات الصوديوم المالحة (SSC) 20xفيشر العلميةBP1325-1
شرائح SuperFrost Plusفيشر العلمية12-550-18
VectaMount التركيب الدائم المتوسطمختبر النواقلإتش-5000

المراجع

  1. Häring, H. U. The insulin receptor: signalling mechanism and contribution to the pathogenesis of insulin resistance. Diabetologia. 34 (12), 848-861 (1991).
  2. Benecke, H., Flier, J. S., Moller, D. E. Alternatively spliced variants of the insulin receptor protein: expression in normal and diabetic human tissues. J Clin Invest. 89 (6), 2066-2070 (1992).
  3. Vella, V., Malaguarnera, R., Nicolosi, M. L., Morrione, A., Belfiore, A. Insulin/IGF signalling and discoidin domain receptors: an emerging functional connection. Biochim Biophys Acta Mol Cell Res. 1866 (11), 118522(2019).
  4. Galal, M. A., et al. Insulin receptor isoforms and insulin growth factor-like receptors: implications in cell signaling, carcinogenesis, and chemoresistance. Int J Mol Sci. 24 (19), 15006(2023).
  5. Starks, E. J., et al. Insulin resistance is associated with higher cerebrospinal fluid tau levels in asymptomatic APOEɛ4 carriers. J Alzheimers Dis. 46 (2), 525-533 (2015).
  6. Belfiore, A., et al. Insulin receptor isoforms in physiology and disease: an updated view. Endocr Rev. 38 (5), 379-431 (2017).
  7. Wang, F., et al. RNAscope: a novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues. J Mol Diagn. 14 (1), 22-29 (2012).
  8. BaseScope assays. , Advanced Cell Diagnostics, Inc. https://acdbio.com/basescope-duplex-assay (2025).
  9. Dani, N., et al. A cellular and spatial map of the choroid plexus across brain ventricles and ages. Cell. 184 (11), 3056-3074.e21 (2021).
  10. Schulingkamp, R. J., Pagano, T. C., Hung, D., Raffa, R. B. Insulin receptors and insulin action in the brain: review and clinical implications. Neurosci Biobehav Rev. 24 (8), 855-872 (2000).
  11. Milstein, J. L., Ferris, H. A. The brain as an insulin-sensitive metabolic organ. Mol Metab. 52, 101234(2021).
  12. Moruzzi, N., et al. Tissue-specific expression of insulin receptor isoforms in obesity/type 2 diabetes mouse models. J Cell Mol Med. 25 (10), 4800-4813 (2021).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

IR A IR B

مقالات ذات صلة