مقالة منهجية

طعم العصب الوركي التقويمي للأورام الليفية العصبية من النوع 1

1.1K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/68694

⸱

أكتوبر 10, 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Institut Cochin, Inserm U1016, CNRS UMR8104, Université Paris Cité, CARPEM, 2Institut Curie, INSERM U934/CNRS UMR 3215, Paris Sciences et Lettres Research University, Sorbonne University, 3Laboratory of preclinical investigation, Translational Research Department, Institut Curie, PSL Research University, 4Faculty of Pharmaceutical and Biological Sciences, Paris Cité University, 5Genetics Department, Institut Curie, 6Department of Plastic Surgery, Hôpital Ambroise Paré, APHP (Assistance Publique-Hôpitaux de Paris), 7Université Versailles Saint Quentin en Yvelines

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

يؤدي الورم العصبي الليفي من النوع 1 (NF1) إلى أورام غمد الأعصاب المحيطية الحميدة (الأورام الليفية العصبية) التي تتطلب بيئة مكروية عصبية محددة للنمو. تم تطوير نموذج xenograft تقويمي محسن ، باستخدام الحقن داخل الخلايا العصبية لخلايا شوان البشرية في فئران NSG. يلخص هذا النموذج الأورام الليفية العصبية البشرية ويوفر منصة قيمة لتقييم الاستراتيجيات العلاجية.

الملخص

الورم الليفي العصبي من النوع 1 (NF1) هو اضطراب وراثي ناتج عن المتغيرات المسببة للأمراض في جين NF1 ، مما يؤدي إلى فقدان وظيفة البرومين العصبي الليفي وتطور أورام غمد الأعصاب المحيطية الحميدة المعروفة باسم الأورام الليفية العصبية. في حين أن نماذج الفئران المعدلة وراثيا (GEMMs) قد طورت فهمنا للفيزيولوجيا المرضية NF1 ، إلا أنها غالبا ما تفشل في تكرار تكوين الأورام التلقائية والتعقيد البيئي الدقيق للأورام الليفية العصبية المشتقة من المريض. يتمثل التحدي الرئيسي في نمذجة الأورام الليفية العصبية الحميدة في اعتمادها على البيئة الدقيقة العصبية ، والتي لا تلخصها مناهج الطعم الغريب التقليدية. هنا ، تم تطوير نموذج xenograft تقويمي محسن للأورام الليفية العصبية المرتبطة ب NF1. باستخدام الحقن داخل العصب لخلايا شوان البشرية المشتقة من الورم الليفي العصبي الخليدة في العصب الوركي للفئران التي تعاني من نقص المناعة في NSG ، يلخص هذا النموذج السمات الرئيسية لبيولوجيا الورم الليفي العصبي البشري ، بما في ذلك النمو المعتمد على الأعصاب وتفاعلات البيئة المكروية للورم. يسمح هذا البروتوكول بالمراقبة الديناميكية في الوقت الفعلي لتطور الورم عبر التصوير الحيوي ، مما يوفر طريقة كمية قابلة للتكرار لتقييم نمو الورم الليفي العصبي. على عكس GEMMs ، يسمح هذا النموذج ببدء الورم المتحكم فيه والتقييم الدقيق للاستراتيجيات العلاجية قبل السريرية. بالإضافة إلى ذلك ، فهو بمثابة جسر بين GEMMs ونماذج الطعم الغريب المشتقة من المريض ، مما يعزز الأهمية الانتقالية لأبحاث الورم الليفي العصبي. من خلال تقديم بيئة ذات صلة من الناحية الفسيولوجية لدراسة تفاعلات الورم والأعصاب ، يوفر هذا النموذج منصة قيمة للتحقيق في بيولوجيا الورم الليفي العصبي وتقييم التدخلات العلاجية المحتملة. قد تؤدي التحسينات المستقبلية ، بما في ذلك دمج المكونات المناعية أو تقنيات التصوير المتقدمة ، إلى تعزيز تطبيقها على أبحاث NF1.

المقدمة

الورم الليفي العصبي من النوع 1 (NF1) هو اضطراب وراثي ناتج عن المتغيرات المسببة للأمراض في جين NF1 ، مما يؤدي إلى فقدان وظيفة البرومين الليفي العصبي ، وهو مثبط رئيسي للورم يقلل من تنظيم مسار إشارات بروتين كيناز المنشط ب RAS-mitogen (MAPK)1. NF1 هي متلازمة استعداد للورم2 مع مظاهر سريرية رئيسية تشمل الجهاز العصبي والجلد والجهاز الهيكلي ، وتؤثر بشكل أساسي على الأنسجة المشتقة من القمة العصبية. السمة المميزة ل NF1 هي تطور أورام الأعصاب المحيطية الحميدة المعروفة باسم الأورام الليفية العصبية. تتكون هذه الأورام بشكل أساسي من خلايا شوان التي تؤوي تعطيل NF1 ثنائي الأليلات (NF1- / -) 3 ، جنبا إلى جنب مع العناصر اللحمية الأخرى بما في ذلك الخلايا الليفية NF1 +/- ، والخلايا المحيطة بالعصاب ، والخلايا المناعية ، ومكونات المصفوفة خارج الخلية4.

النماذج الحيوانية ضرورية لفهم الفيزيولوجيا المرضية للورم الليفي العصبي ولاختبار الاستراتيجيات العلاجية. ماتت الفئران متماثلة الزيجوت لطفرة Nf1 بالضربة القاضية (KO) (Nf1-/-) في الرحم. Nf1 +/- الفئران قابلة للحياة وخصبة ومعرضة للسرطان ، مثل نظيراتها البشرية5. ومع ذلك ، فإن هذه لا تطور السمات المميزة لمرض NF1 البشري: Nf1 +/- لم تظهر الفئران تشوهات في التصبغ ولا الأورام الليفية العصبية. تم إنشاء مجموعة كبيرة ومتنوعة من نماذج الفئران المعدلة وراثيا (GEMMs) في العقد الماضي لنمذجة بعض الأعراض بشكل مستقل ، من خلال مناهج KO المشروطة. تم تطوير بعض GEMMs للحث على تكوين الورم الليفي العصبي عن طريق تعطيل Nf1 بشكل مشروط في سلائف خلايا شوان6،7،8.

في حين أن هذه GEMMs قد طورت بشكل كبير فهمنا ل NF19 ، فإن تعقيدها الظاهري وعدم تجانسها يتطلبان نماذج فئران بديلة وتكميلية للمقايسات العلاجية. توفر الطعوم الغريبة العظامية بديلا قيما من خلال السماح بزرع الخلايا البشرية مباشرة في مكانتها التشريحية الأصلية ، وبالتالي تقديم نموذج أكثر صلة من الناحية الفسيولوجية. ومع ذلك ، فقد ركزت معظم الدراسات القائمة على الطعم الغريب على أورام غمد الأعصاب المحيطية الخبيثة (MPNSTs) 10 ، ربما لأن الأورام الليفية العصبية لا يتم تطعيمها خارجيا ، مما يترك فجوة في نمذجة الأورام الحميدة.

تصف هذه الدراسة نموذجا جديدا للورم الليفي العصبي NF1 ، بناء على الحقن داخل العصب لخلايا شوان البشرية المشتقة من الورم الليفي العصبي الخالد (hTERT NF1 ipNF04.4 CVCL_UI78 خط الخلية) في العصب الوركي للفئران التي تعاني من نقص المناعة NOD SCID جاما. يستفيد هذا النهج بشكل كامل من البيئة الدقيقة للأعصاب الأصلية ، مما يسمح بتكوين ورم حميد ، مع السماح بالمراقبة الديناميكية من خلال تصوير التلألؤ البيولوجي (BLI).

يهدف هذا البروتوكول إلى: (1) إنشاء نموذج ورم ليفي عصبي تقويمي قابل للتكرار ل NF1 ، (2) توفير منصة قوية قبل سريرية لدراسة تفاعلات الورم والأعصاب وتقييم العلاجات الجديدة ، و (3) سد الفجوة بين GEMMs11،12 والطعوم الغريبة المشتقة من المريض (PDX) 13 من خلال تقديم نظام تجريبي وسيط خاضع للرقابة. يتيح هذا النموذج تطورا سريعا وفعالا من حيث التكلفة للورم - عادة في غضون 5 أيام بعد الحقن - دون الحاجة إلى توليد خطوط فئران معدلة وراثيا ، وبالتالي الجمع بين إمكانية الوصول إلى الطعوم الغريبة والأهمية التشريحية لوضع تقويم العظام.

يوفر نموذج فأر الورم الليفي العظامي المشتق من خط الخلايا العصبية (CDX) العديد من المزايا مقارنة بالطرق البديلة. على عكس GEMMs ، التي تعتمد على الاستعدادات الوراثية لدفع تكوين الأورام ، يسمح هذا النموذج بالتحكم المباشر في بدء الورم وتطوره.

تم تكييف بروتوكول الطعم التقويمي لأورام غمد الأعصاب المحيطية الخبيثة (MPNSTs)10 مع نماذج الأورام الليفية العصبية الحميدة. يمثل هذا خطوة مهمة إلى الأمام في أبحاث NF1 الانتقالية ، مع تطبيقات محتملة في تحديد أهداف علاجية جديدة واختبار استراتيجيات العلاج المبتكرة.

البروتوكول

تمت مراجعة جميع الإجراءات والموافقة عليها من قبل لجنة الأخلاقيات التابعة لمعهد كوري CEEA-IC # 118 (التفويض # 50186 الممنوح من قبل الهيئة الوطنية) وفقا للمبادئ التوجيهية الدولية وتم إجراؤها من قبل موظفين مدربين باتباع الإرشادات الأخلاقية للأبحاث الحيوانية. الفئران NOD SCID جاما (NSG) (NOD. تم اختيار Cg-Prkdc Il2rg/SzJ) لهذه الدراسة بسبب نقص المناعة الحاد ، مما يسمح بترقيع الخلايا البشرية بنجاح. يتم سرد الكواشف والمعدات المستخدمة في جدول المواد.

1. نموذج وإعداد خط الخلية

  1. قم بإجراء إزالة الشعر في موقع الجراحة باستخدام ماكينة حلاقة كهربائية في اليوم السابق للتطعيم لتبسيط الإجراء لمجموعات كبيرة من فئران NSG.
  2. لمنع ضعف الأطراف الخلفية الثنائية ، قم بحقن عصب وركي واحد فقط (الجانب الأيسر) لكل فأر في جميع التجارب. راقب الفئران بحثا عن علامات الضيق وفقدان الوزن والعجز الحركي.
  3. بعد العملية ، اسمح للفئران بالتعافي تماما على وسادة تدفئة في قفص بدون فراش لمنع الاستنشاق العرضي لمواد الفراش. بمجرد أن تصبح الفئران متحركة بالكامل ولا تظهر عليها أي علامات على الترنح ، أعد إدخالها في منشأة.
  4. بالنسبة إلى xenografting، استخدم خط خلية NF1 ipNF04.4 (CVCL_UI78)، وهو خط خلية شوان بشري خالد ب hTERT مشتق من مريض NF114. تم تحويل هذه الخلايا بثبات باستخدام بنية CMV-luciferase ، pLenti CMV Puro LUC (w168-1) ، مما يسمح بالتتبع الطولي عبر BLI باستخدام نظام فحص لوسيفيراز تجاري.
  5. الحفاظ على الخلايا في DMEM مع 5٪ مصل الأبقار الجنينية (FBS) و 1٪ البنسلين الستربتومايسين عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون2. قم بتوسيع الخلايا إلى 80٪ من التقاء للحفاظ على ظروف النمو المثلى.
  6. في يوم التطعيم ، قم بتربسين الخلايا (≤4 دقائق عند 37 درجة مئوية) ؛ عدها وأعد تعليقها عند 5 × 103 خلايا في 4 ميكرولتر لكل فأر.

2. الإجراء الجراحي لزراعة العظام

  1. تحضير ما قبل الجراحة
    1. قم بإعداد المحطة الجراحية قبل تحريض التخدير عن طريق تطهير منطقة العمل تماما. قم بتغطية جميع أسطح التلامس للمجهر الجراحي ونظام الإضاءة بغشاء شفاف معقم ، وتأكد من أن جميع الأدوات الجراحية قد تم تعقيمها مسبقا عن طريق التعقيم.
    2. عالج الفئران المصابة بتسكين الألم قبل الجراحة بالبوبرينورفين تحت الجلد (0.1 ملغ/كغ) قبل 30 دقيقة من الجراحة لضمان تسكين أولي كاف.
    3. تحفيز التخدير والحفاظ عليه عن طريق الحقن داخل الصفاق للكيتامين (80 مجم / كغ) وإزيلازين (15 مجم / كغ) ، محضر طازجا في محلول ملحي معقم وتعديله بناء على وزن الجسم (باتباع البروتوكولات المعتمدة مؤسسيا). تأكد من عمق التخدير عن طريق منعكس قرصة إصبع القدم قبل المتابعة.
    4. حافظ على درجة حرارة الجسم باستخدام وسادة تسخين طوال العملية بأكملها ، بما في ذلك التخدير والتطعيم والتعافي.
    5. ضع قطرات زيوت التشحيم على العينين لمنع جفاف القرنية.
  2. إجراء الحقن
    1. ضع الماوس على جانبه الأيمن ، مع انتشار الأرجل الخلفية برفق. قم بتغطية منطقة الجراحة بستارة معقمة قبل بدء الشق.
    2. تحضير حقل جراحي معقم باستخدام بوفيدون اليود.
    3. الشق والتشريح: قم بعمل شق صغير في الجلد (~ 5 مم) بالتوازي مع عظم الفخذ باستخدام مقص ناعم. افصل العضلة الأساسية بعناية لفضح العصب الوركي: استخدم ملقطا ناعما ومقصا دقيقا لفصل طبقات العضلات برفق ، مع الحرص على عدم تلف الأوعية الدموية. تحديد العصب الوركي على أنه بنية بيضاء تشبه الحبل الموجود في وسط عظم الفخذ.
    4. قم بتخزين تعليق الخلية في أنبوب سعة 1.5 مل وقم بنقر الغبار برفق لإعادة تعليق أي خلايا مستقرة. قم بتحميل 4 ميكرولتر من تعليق الخلية في حقنة هاميلتون سعة 10 ميكرولتر بإبرة 33 جيجا (والتي تم اختيارها لتقليل صدمة الأعصاب مع الحفاظ على بقاء الخلايا العالية).
      1. أدخل الإبرة بالتوازي مع محور العصب الوركي (لمنع الثقب) على عمق ~ 2 مم. ابدأ الحقن ببطء لخلق ضغط وفجوة بين العصب والغمد المحيطي. تقدم الإبرة ببطء لمدة 4 إلى 5 مم أخرى. ثم حقن المعلق ببطء أثناء سحب الإبرة من العصب. تجنب أي توتر أو حركة للعصب.
      2. قم بإجراء الإجراء دون شد العصب الوركي لمنع أي ضرر ، ولا تستخدم المشابك. انتظر 10-15 ثانية قبل سحب الإبرة ببطء لتقليل الارتجاع.
    5. بعد الحقن ، تأكد من أن العصب الوركي يبدو منتفخا قليلا في موقع الحقن ، دون تسرب أو تغير في اللون. يشار إلى الحقن الناجح من خلال مظهر عصبي مستقر دون تسرب
    6. أغلق الشق الجراحي باستخدام 3 إلى 4 خيوط بسيطة متقطعة بمادة غير قابلة للامتصاص (3-0 ، 30 مم ، 3/8 ج) لتجنب الالتهاب في موقع الجراحة. إذا استمرت الجراحة أكثر من 10 دقائق ، قم بتطبيق 1 مل من Ringer lactate (s.c.). تطبيق ميلوكسيكام (5 ملغ/كغ، تحت الجلد) في نهاية اليوم.
    7. ضع علامة على كل فأر لتحديد هويته بشكل فريد باستخدام لكمة أو علامة أذن مباشرة بعد الجراحة وقبل التعافي من التخدير.
    8. اسمح للفئران بالتعافي في بيئة يتم التحكم في درجة حرارتها ومراقبة مضاعفات ما بعد الجراحة.

3. تصوير التلألؤ البيولوجي لمراقبة النقش ونمو الورم

  1. لتقييم الطعم الناجح وتطور الورم ، قم بإجراء BLI في نقاط زمنية متعددة. للمراقبة في الجسم الحي ، استخدم نظام التصوير في الجسم الحي لالتقاط الضوء المنبعث من التفاعل الأنزيمي بين اليراع لوسيفيراز ، الذي تعبر عنه الخلايا السرطانية ، وركيزته ، D-Luciferin. قدم هذا النهج طريقة دقيقة لتصور نشاط الورم وقياسه ، مما يوفر رؤى قيمة حول ديناميكيات الورم بمرور الوقت.
  2. حدد إشارات التلألؤ البيولوجي في نقاط زمنية محددة بعد التطعيم ، بما في ذلك الأيام 5 و 12 و 19 و 26 و 30 و 33 بعد التطعيم (الشكل 1). عادة ما تقوم بتصوير خمسة فئران في وقت واحد لتبسيط العملية والحفاظ على الاتساق عبر القياسات.

4. إعداد التصوير

  1. قم بتخدير الفئران بنسبة 2٪ من الأيزوفلوران أثناء الحصول على الصورة واستخدم وسادة تسخين مدمجة في جهاز تصوير IVIS.
  2. ضع الفئران باستمرار في نفس الاتجاه وصورتها بعد 10 دقائق بعد الحقن داخل الصفاق ل D-Luciferin بجرعة 10 ميكرولتر / جم من وزن الجسم (تركيز المخزون: 15 مجم / مل في برنامج تلفزيوني ، طازج ومصفاة).
  3. احصل على صورة خلال 1 دقيقة ، باستخدام برنامج الحصول على البيانات ، مما يضمن عدم تشبع أي وحدات بكسل أثناء العملية.
  4. قم بقياس شدة إشارة الإضاءة الحيوية كعدد / ثانية نسبية للفوتون. استخدم نظام التصوير بالإعدادات التالية: وقت التعريض الضوئي: تلقائي; بنينج: متوسط. f / توقف: 1.2 ؛ مجال الرؤية: 12.5 سم ؛ البرنامج: برنامج Living Image v4.7.3.
  5. قم بقياس انبعاث الضوء من مناطق الورم ، التي تم الإبلاغ عنها على أنها عدد نسبي للفوتون في الثانية ، باستخدام برنامج احتكاري. تصور شدة التلألؤ البيولوجي باستخدام تحجيم الألوان الزائفة التي يتم تراكبها على الصور بالأبيض والأسود الملتقطة في وقت واحد.

5. معايير نجاح النقش

  1. استبعاد الفئران إذا لم تظهر تلألؤ بيولوجي يمكن اكتشافه أو إذا انخفضت الإشارة بمرور الوقت.
  2. قم بتضمين الفئران فقط مع زيادة تدريجية في اللمعان بين اليومين 5 و 12.
  3. انتقل إلى مراقبة الورم باستخدام تصوير التلألؤ البيولوجي كما هو موضح في قسم النتائج التمثيلية.

النتائج

باستخدام الإجراء الموضح أعلاه ، تم إنشاء نموذج ورم العصب الوركي التقويمي بنجاح في فئران NSG مع الخلايا المشتقة من الورم الليفي العصبي الخلود (ipNF04.4). كشف تصوير التلألؤ البيولوجي باستخدام D-luciferin عن توطين واضح للورم في العصب الوركي في وقت مبكر من اليوم 5 ، مع وجود دليل على النمو الأسي بمرور الوقت. كان النقش ناجحا في 90٪ (37/41) من الفئران المحقونة. تمت مراقبة تطور الورم في الأيام 5 و 12 و 19 و 26 و 30 و 33 (الشكل 1 أ) ، ولم يلاحظ أي إشارات غير محددة طوال فترة المراقبة. تم القتل الرحيم للفئران في اليوم 33 ، وفقا للإرشادات المؤسسية ، عند أول علامة على الضيق أو عبء الورم المفرط. عند التشريح ، بدا الورم متطورا ومتكاملا داخل العصب الوركي ، مع عدم وجود علامات على تكوين خراج (الشكل 1 ب). والجدير بالذكر أن الفئران أظهرت تجويرا طبيعيا فور التعافي من التخدير.

figure-results-1
الشكل 1: تصوير التلألؤ البيولوجي والتحليل العياني للطعوم الغريبة للعصب الوركي التقويمي في فئران NSG. (أ) التصوير الطولي للتلألؤ البيولوجي (BLI) لاثنين من فئران NSG تم حقنهما داخل الأعصاب بخلايا ipNF04.4 في العصب الوركي الأيسر. تم التقاط الصور في الأيام 5 و 12 و 19 و 26 و 30 و 33 بعد الحقن ، مما يوضح النمو التدريجي للورم بمرور الوقت في نفس الفئران. تعكس الزيادة في شدة الإشارة المضيئة بيولوجيا النقش الناجح وتوسع الورم داخل البيئة الدقيقة العصبية. (ب) منظر عياني للعصب الوركي في اليوم 33 بعد التطعيم ، يظهر ورما متطورا ومتكاملا بدون علامات تكوين الخراج. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-2
الشكل 2: صورة مجهرية لموقع الكسب غير المشروع من هذا الفأر توضح نمو الورم والغزو البؤري. أقسام الأنسجة المضمنة في البارافين ملطخة بالهيماتوكسيلين والإوزين (H & E). يتم عرض أمثلة على الأورام النموذجية من ثلاثة فئران. أشرطة المقياس: 2000 ميكرومتر. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الشكل التكميلي 1: تطور وزن الجسم التمثيلي لفئران NSG (ن = 15) على مدار تجربة xenograft. لم يلاحظ فقدان الوزن بشكل كبير. الرجاء النقر هنا لتنزيل هذا الرقم.

المناقشة

يمثل الإنشاء الناجح لنموذج الطعم الغريب المشتق من خط الخلايا الليفية العصبية العظامية (CDX) في فئران NSG تقدما كبيرا في أبحاث NF1 ، حيث يعالج القيود الرئيسية للنماذج الحالية. يؤكد البروتوكول أن خلايا شوان الخالدة البشرية المرتبطة ب NF1 (ipNF04.4) 14،15،16 يمكن تطعيمها بكفاءة في العصب الوركي للفئران التي تعاني من نقص المناعة ، مما يؤدي إلى تطور الورم القابل للتكرار داخل بيئة مكروية ذات صلة من الناحية الفسيولوجية. تم ذكر الطعوم الغريبة العظامية لخطوط خلايا شوان في الدراسات الأصلية التي أنشأت خطوط خلايا شوان البشرية14،15 ، ويتم توفير بروتوكول مفصل هنا.

كان مفتاح نجاح هذا البروتوكول هو الإعداد الدقيق والمراقبة لكل من المكونات الخلوية المضيفة. أثناء الإجراء ، تمت إدارة التخدير بعناية ، مما يضمن إبقاء الفئران في حالة تخدير مناسبة دون إجهاد كبير. لتقليل أي ضرر محتمل ، لم يتم شد العصب الوركي بالمشابك أو الملقط ، وتم توخي الحذر الشديد لتجنب الضغط الميكانيكي على الأنسجة. سمح استخدام BLI القائم على لوسيفيراز بالمراقبة الطولية غير الغازية لنمو الورم ، مما يوفر بيانات كمية وقابلة للتكرار. لم تؤكد استراتيجية التصوير هذه جدوى الكسب غير المشروع فحسب ، بل سمحت أيضا بتحديد الانحرافات المبكرة في ديناميكيات الورم. يسلط عدم وجود فقدان كبير للوزن (الشكل التكميلي 1) ، أو الخلل الحركي ، أو علامات الضيق الأخرى في الفئران الضوء على توافق هذا البروتوكول مع المبادئ الأخلاقية لرعاية و 3Rs (الاستبدال ، التقليل ، الصقل).

بالمقارنة مع GEMMs ، التي تعتمد على التعطيل الشرطي ل Nf1 6،7،9 ، يوفر هذا النهج العديد من المزايا المميزة. تتطلب GEMMs تعديلات جينية محددة ، لكنها قد لا تكرر بشكل كامل تفاعلات الورم والسدى المعقدة التي لوحظت في الأورام الليفية العصبيةالبشرية 1،17. يسمح هذا النموذج بالدراسة المباشرة لخلايا شوان البشرية في مكانتها العصبية الأصلية ، مع الحفاظ على العوامل الخارجية للخلايا4. على عكس GEMMs ، حيث تتطور الأورام بشكل غير متوقع بمرور الوقت ، يسمح نموذج xenograft بالتحكم الدقيق في الزمان المكاني على تكوين الورم. يوفر هذا النموذج منصة سريعة وقابلة للتكرار لاختبار العلاجات المرشحة ، حيث يتيح BLI المراقبة في الوقت الفعلي لتطور الورم والاستجابة للعلاج.

علاوة على ذلك ، تتوافق هذه النتائج مع الدراسات السابقة على MPNSTs ، حيث ثبت أن التحويل الغريب لتقويم العظام يعزز دقة نماذج الورم5. ومع ذلك ، فإن الأورام الليفية العصبية الحميدة تشكل تحديات فريدة ، حيث يعتمد نموها بشكل كبير على تفاعلات عصبية محددة ، والتي تفشل طرق التطعيم التقليدية تحت الجلد في تلخيصها6. تؤكد النتائج أن الحقن داخل العصب يوفر بيئة مثالية لتطور الورم الليفي العصبي المستدام.

وبالتالي ، يمكن اعتبار هذا النموذج في الجسم الحي بديلا تكميليا مناسبا ل GEMMs ، للاختبارات العلاجية قبل السريرية. ومع ذلك ، هناك قيود على النموذج. تم تخليد خلايا شوان البشرية المشتقة من الأورام الليفية العصبية وتظهر نمطا ظاهريا للورم يمكن اعتباره أكثر عدوانية من الورم الليفي العصبي الضفيري ، مع تكاثر الخلايا الكثيفة (الشكل 2). لم يلاحظ أي دليل على الانتشار البعيد في ، ولم يتم إثبات تحول خبيث كامل. هناك حاجة إلى مزيد من الدراسات لإظهار ما إذا كان النمط الظاهري للخلية يمكن أن يتوافق مع النمط الظاهري "المتوسط" الذي يذكرنا بالورم الليفي العصبي غير النمطي ، مثل الأورام العصبية الليفية غير النمطية ذات الإمكانات البيولوجية غير المعروفة (ANNUBP) 18. يكمن قيد حاسم آخر للنموذج في اعتماده على الفئران التي تعاني من نقص المناعة. يحد عدم وجود جهاز مناعي تكيفي في فئران NSG من دراسة تفاعلات الورم المناعي ، والتي يتم التعرف عليها بشكل متزايد كمساهمين رئيسيين في بيولوجيا الورم الليفيالعصبي 7،19،20،21. يمكن أن تتضمن التحسينات المستقبلية نماذج فئران متوافقة مع البشر أو استراتيجيات بديلة لالتقاط الجوانب المناعية للمرض بشكل أفضل. بالإضافة إلى ذلك ، فإن الاعتماد على تعبير لوسيفيراز لمراقبة الورم ، على الرغم من فعاليته العالية ، قد يحد من قابلية تطبيق هذا البروتوكول على الإعدادات التجريبية التي تفتقر إلى الوصول إلى معدات BLI. في حين أن BLI هي طريقة حساسة وغير جراحية ، إلا أنها لا توفر رؤى مباشرة للتغيرات النسيجية المرضية. يمكن للتحليلات التكميلية ، مثل التصوير بالرنين المغناطيسي أو الأنسجة المتقدمة ، أن تزيد من تحسين توصيف تطور الورم الليفي العصبي.

قد تتطلب العديد من الخطوات الإجرائية تحسينا لضمان تطعيم الورم بنجاح. يمكن أن ينتج فشل الحقن عن وضع الإبرة بشكل غير صحيح أو تسرب مفرط لتعليق الخلية. للتخفيف من ذلك ، يجب إدخال الإبرة بعناية بالتوازي مع العصب الوركي وسحبها ببطء بعد الحقن. قد ينشأ التباين في إشارات التلألؤ البيولوجي من جرعات لوسيفيرين غير متسقة أو محاذاة خاطئة أثناء التصوير. يوصى بتوحيد توقيت حقن ما بعد اللوسيفيرين (10 دقائق) والحفاظ على إعدادات تصوير متطابقة عبر جميع. إذا ظل التباين في نمو الورم مرتفعا ، فتأكد من بقاء الخلية قبل الحقن وقلل من إجهاد أثناء المناولة.

في الختام ، تؤسس هذه الدراسة نموذجا جديدا وقابلا للتكرار للورم الليفي العصبي التقويمي ، مما يوفر منصة فعالة قبل السريرية لدراسة الأورام الحميدة المرتبطة ب NF1. من خلال الاستفادة من خلايا شوان البشرية في بيئتها العصبية الطبيعية ، يحاكي هذا النموذج عن كثب بيولوجيا الورم الليفي العصبي البشري مع تمكين مراقبة الورم في الوقت الفعلي والتدخلات العلاجية الخاضعة للرقابة. يمثل هذا النموذج خطوة أساسية بين GEMMs والنماذج المشتقة من المريض (PDXs) ، مما يمهد الطريق لمزيد من الأساليب ذات الصلة سريريا لأبحاث الورم الليفي العصبي وعلاجه.

يجب أن تهدف التحسينات المستقبلية إلى دمج المكونات المناعية ، مثل نماذج الفئران المتوافقة مع البشر ، لدراسة دور البيئة المكروية للورم6. يمكن أن يؤدي توسيع طرائق التصوير ، بما في ذلك التصوير بالرنين المغناطيسي أو التصوير المقطعي بالإصدار البوزيتروني ، إلى استكمال BLI برؤى هيكلية وأيضية22. سيكون تمديد الجداول الزمنية التجريبية أمرا ضروريا للتحقيق في تطور الورم الليفي العصبي على المدى الطويل ومخاطر التحول الخبيث المحتملة. من خلال سد الفجوة بين نماذج GEMMs و PDX ، تعزز هذه المنصة البحث الانتقالي في NF1 ، مما يوفر فرصا جديدة للابتكار العلاجي في أورام غمد الأعصاب المحيطية الحميدة.

الإفصاحات

يعلن أصحاب البلاغ عدم وجود مصالح مالية متنافسة

شكر وتقدير

تم دعم هذا العمل من قبل المعهد الوطني للسرطان (Inca_18828). نود أن نشكر منصة HistIM (من إخراج ماريلين فافييه) وبيير سوهير ، في معهد كوشين.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
بوبرينورفينبوبريكيرلتسكينات الألم قبل العملية
حصائر التدفئةأنيفيVI-653246للحفاظ على النورثرميا الطبيعية أثناء جراحة الفئران
hTERT NF1 ipNF04.4 (CVCL_UI78) خط خلوي المواد البيولوجية التطبيقيةT0194سلالة خلية شوان البشرية الخالية من NF1
إيزوفلورانإيزو-فيتلتخدير الفئران أثناء تصوير التلألؤ الحيوي
آيفيس لومينا سيريز IIIالتجديدللتصوير الحيوي المضيء
الكيتامينكيتامين 1000 فيرباكللتخدير الجراحي في الفئران
برنامج الصور الحيةالتجديدمشمول مع IVISلاكتساب الصورة والقياس
نظام اختبار لوسيفرازبروميغاE1500لاكتشاف BLI
ميلوكسيكامميتاكامدواء مضاد للالتهابات غير الستيرويدية (مضاد التهاب غير ستيرويدي)
خيط أحادي الخيط غير قابل للامتصاصإثيلونF2419Hلخياطة الشق
إبرة للحقنةهاميلتونالعرفGA33/12، 7 ملم/PST4-12°؛
فئران NOD SCID غاما (NSG)  نهر تشارلز614NSG
بلينتي CMV بورو LUC (w168-1)أدجين17477للتعبير عن لوسيفيراز اليراعات
Povidone iodé إي ديرميك 10٪فياتريس330200775المطهر الموضعي لتعقيم الجلد
شفرة المشرطFST10015-00لشق الجلد أثناء الجراحة
المجهر الستيريو L125لايكالرؤية موقع حقن الخلية في العصب الوركي
الحقنة 10 وميكرو؛ lهاميلتون1701RNلحقن الخلايا في العصب الوركي
زيلازينرومبون 2٪للتخدير الجراحي في الفئران

المراجع

  1. Brems, H., Beert, E., De Ravel, T., Legius, E. Mechanisms in the pathogenesis of malignant tumours in neurofibromatosis type 1. Lancet Oncol. 10 (5), 508-515 (2009).
  2. Rasmussen, S. A., Friedman, J. M. NF1 gene and neurofibromatosis 1. Am J Epidemiol. 151 (1), 33-40 (2000).
  3. Gutmann, D. H., et al. Neurofibromatosis type 1. Nat Rev Dis Primers. 3 (1), 17004(2017).
  4. Mazuelas, H., et al. Modeling iPSC-derived human neurofibroma-like tumors in mice uncovers the heterogeneity of Schwann cells within plexiform neurofibromas. Cell Rep. 38 (7), 110385(2022).
  5. Jacks, T., et al. Tumour predisposition in mice heterozygous for a targeted mutation in Nf1. Nat Genet. 7 (3), 353-361 (1994).
  6. Radomska, K. J., et al. Cellular origin, tumor progression, and pathogenic mechanisms of cutaneous neurofibromas revealed by mice with Nf1 knockout in boundary cap cells. Cancer Discov. 9 (1), 130-147 (2019).
  7. Chen, Z., et al. Spatiotemporal loss of NF1 in Schwann cell lineage leads to different types of cutaneous neurofibroma susceptible to modification by the Hippo pathway. Cancer Discov. 9 (1), 114-129 (2019).
  8. Wu, J., et al. Plexiform and dermal neurofibromas and pigmentation are caused by Nf1 loss in desert hedgehog-expressing cells. Cancer Cell. 13 (2), 105-116 (2008).
  9. Li, S., Chen, Z., Le, L. Q. New insights into the neurofibroma tumor cells of origin. Neurooncol Adv. 2 (Suppl 1), i13-i22 (2020).
  10. Turk, A. N., Byer, S. J., Zinn, K. R., Carroll, S. L. Orthotopic xenografting of human luciferase-tagged malignant peripheral nerve sheath tumor cells for in vivo testing of candidate therapeutic agents. J Vis Exp. (49), e2558(2011).
  11. Jessen, W. J., et al. MEK inhibition exhibits efficacy in human and mouse neurofibromatosis tumors. J Clin Invest. 123 (1), 340-347 (2013).
  12. Jousma, E., et al. Preclinical assessments of the MEK inhibitor PD-0325901 in a mouse model of neurofibromatosis type 1: MEK inhibition in neurofibroma. Pediatr Blood Cancer. 62 (10), 1709-1716 (2015).
  13. Blanchard, Z., Brown, E. A., Ghazaryan, A., Welm, A. L. PDX models for functional precision oncology and discovery science. Nat Rev Cancer. 25, 153-166 (2024).
  14. Li, H., Chang, L. J., Neubauer, D. R., Muir, D. F., Wallace, M. R. Immortalization of human normal and NF1 neurofibroma Schwann cells. Lab Invest. 96 (10), 1105-1115 (2016).
  15. Muir, D., Neubauer, D., Lim, I. T., Yachnis, A. T., Wallace, M. R. Tumorigenic properties of neurofibromin-deficient neurofibroma Schwann cells. Am J Pathol. 158 (2), 501-513 (2001).
  16. Wu, M., Wallace, M. R., Muir, D. Tumorigenic properties of neurofibromin-deficient Schwann cells in culture and as syngrafts in Nf1 knockout mice. J Neurosci Res. 82 (3), 357-367 (2005).
  17. Rasmussen, S. A., Friedman, J. M. NF1 gene and neurofibromatosis 1. Am J Epidemiol. 151 (1), 33-40 (2000).
  18. Miettinen, M. M., et al. Histopathologic evaluation of atypical neurofibromatous tumors and their transformation into malignant peripheral nerve sheath tumor in patients with neurofibromatosis 1: A consensus overview. Hum Pathol. 67, 1-10 (2017).
  19. Pundavela, J., et al. Stimulator of interferon gene facilitates recruitment of effector CD8 T cells that drive neurofibromatosis type 1 nerve tumor initiation and maintenance. Sci Adv. 10 (42), eado6342(2024).
  20. Fletcher, J. S., Pundavela, J., Ratner, N. After Nf1 loss in Schwann cells, inflammation drives neurofibroma formation. Neurooncol Adv. 2 (Suppl 1), i23-i32 (2020).
  21. Le, L. Q., Parada, L. F. Tumor microenvironment and neurofibromatosis type I: Connecting the GAPs. Oncogene. 26 (32), 4609-4616 (2007).
  22. Wu, J. C., Sundaresan, G., Iyer, M., Gambhir, S. S. Non-invasive optical imaging of firefly luciferase reporter gene expression in skeletal muscles of living mice. Mol Ther. 4 (4), 297-306 (2001).

إعادة الطباعة والأذونات

استكشف المزيد من المقالات

نموذج الورم الليفي العصبيطعم أجنبي في الموضع الأصليخلايا شوان البشريةالبيئة الدقيقة للورمالتصوير بالتلألؤ البيولوجيورم العصب الطرفينموذج فأر قبل سريريتطعيم الورم
طعم العصب الوركي التقويمي للأورام الليفية العصبية من النوع 1
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.