يصف هذا البروتوكول إجراء البقاء على قيد الحياة لاستئصال الغدة اللمفاوية الكلوية الثنائية الثنائية الآمن والمحتمل.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
استئصال الوراثة الثنائية الثنائية للشدة الكلوية في الفأر
* These authors contributed equally
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
الأمراض المناعية الذاتية هي نتيجة استهداف الخلايا المناعية للأنسجة الذاتية بشكل غير مناسب، مما يؤدي إلى أمراض وتلف للأعضاء الحيوية. تعمل الأعضاء اللمفاوية الثانوية كموقع لتنشيط خلايا B وT وتحمل المناعة المحيطية، نتيجة لتصريف المستضد وانتقال الخلايا المقدمة للمستضد (APC) عبر اللمفاوات المحلية. تم وصف دور العقد اللمفاوية الموضعية المصابة كموقع أولي لتنشيط الخلايا اللمفاوية في حالات الأورام والعدوى وأمراض المناعة الذاتية الخاصة بالأعضاء، ولكن ليس في مناعة ذاتية جهازية. الذئبة الحمراء الجهازية، وهو أحد هذه الأمراض، هو مرض مناعي ذاتي واسع الانتشار مع تورط الكلى الشائع الذي يؤدي إلى إصابة الكلى والفشل في النهاية. الفهم الإضافي لدور العقد اللمفاوية الكلوية، التي تعد الموقع الأساسي لتصريف المستضدات وانتقال APC من الكلى، محدود بعدم القدرة على إزعاج هذه النسيج بشكل انتقائي. وصف هنا إجراء بقاء لاستئصال الوغدة الليمفاوية الكلوية الثنائية الآمنة والمحتملة جيدا في الفأر. تتضمن التعليمات التفصيلية، والمساعدات البصرية، ونصائح مفيدة لتحسين النجاح، وحل المشكلات الإجرائية. البقاء على المدى الطويل ممتاز وقد لوحظ لمدة لا تقل عن 4 أشهر بعد العملية. العقد اللمفاوية الكلوية المقطوعة سليمة وجاهزة فورا للمعالجة اللاحقة. هذا الإجراء مناسب بشكل أفضل لدراسات التأثير الموضعي للعقد اللمفاوية الكلوية.
المقدمة
تمتد أمراض المناعة الذاتية على جميع أعضاء الجسم من الأمراض التي تقيد الأعضاء نسبيا مثل التهاب الكبد المناعي الذاتي، والتهاب العنبية، والسكري من النوع الأول إلى أمراض واسعة مثل التصلب الجهازي ومرض شوغرن 1,2,3,4,5. يعد التحمل المناعي مرحلة حاسمة في تطور خلايا B وT لمنع التفاعل الذاتي6. بينما التحمل المركزي عبر الحذف النسيلي في الغدة الزعترية ضروري وفعال، إلا أن هذا وحده يترك فجوات في الدفاع ضد المناعة الذاتية 7,8
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
تجرى جميع الإجراءات وفقا لبروتوكولات لجنة رعاية واستخدام في مؤسسة ييل. لتطوير هذا الإجراء تم استخدام سلالة Balb/c التي تتراوح عمرها بين 8-12 أسبوعا، والفئران المعرضة للذئبة (MRL/MpJ-Faslpr/J/J)، ومجموعة تحكم وهمية مطابقة للعمر/جنس/النمطالجيني 15. بالإضافة إلى ذلك، تم اختبار فئران النوع البري C57BL/6 التي تبلغ من العمر 8-12 أسبوعا، وتم استئصال العقد بأمان. تم تضمين كل من الفئران الذكور والإناث. المواد المستخدمة والمواد المستخدمة مدرجة في جدول المواد.
1. تحضير الأدوات وغرفة العمليات
- قم بتعقيم جميع الأدوات الجراحية. تأكد من تنظيف ....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
يمكن إجراء هذه العملية في 15-20 دقيقة لكل فأرة. لتأكيد دقة هذا الإجراء، أجريت استئصالات ثنائية الجانب للشدة اللمفاوية الكلوية على خمسة أطفال تتراوح أعمارهم وجنسهم واثنينهم من النمط الجيني. تحملت جميع الفئران الإجراء جيدا مع بقاء كامل خلال فترة ما قبل العملية. تم وضع العينات المستخرجة في PBS على الثلج. غرقت جميع العينات فورا، مؤكدا انخفاض نسبة الدهون. ثم تم سحق العينات المستخرجة (وأربع عناصر تحكم دهنية حشوية منفصلة) عبر مصفاة خلية بحجم 100 ميكرومتر وغسلها باستخدام PBS. تم طرد الأقراص الخل.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
وصف هنا إجراء بقاء لاستئصال الوغدة الليمفاوية الكلوية الثنائية الآمنة والمحتملة جيدا في الفأر. القيد الرئيسي لهذا الإجراء هو صغر حجم العقد اللمفاوية الكلوية نسبيا، مما يتطلب استخدام مجهر تشغيلي. بدون مجهر عامل، قد يكون تحقيق الاستئصال الواثق صعبا. بعض نماذج الفئران الجينية لديها عقد لمفاوية متضخمة، مما يسهل التعرف على التعرف وتعلم التقنية17. في الفئران البرية السليمة، قد تكون العقد اللمفاوية صغيرة وصعبة التحديد. أثناء تعلم هذا الإجراء، أو في الفئران التي لديها غدد.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
R.A.F. هو مستشار لشركة غلاكسو سميث كلاين، وشركة بليثيرا، وفينتوس ثيرابيوتكس. جميع المؤلفين الآخرين يعلنون عدم وجود مصالح متنافسة.
شكر وتقدير
نشكر جي. ألدرمان، ب. كادوجان، إي. هيوز-بيكار، وج. هوروكس على المساعدة الإدارية، ولسي. هيوز لإدارة مستعمرات الفئران. H.N.B. زميل في برنامج تدريب علماء الجراح في جامعة ييل، الذي مول ودعم جزئيا هذا المشروع. وقد تم تمويل هذا العمل أيضا من معهد هوارد هيوز الطبي (لسلاح الجو الملكي) وجائزة الكلية الأمريكية للجراحين لأبحاث المقيمين (لجمعية الجراحين البريطانية).
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| دائرة التخدير | أي | أو مخدر قابل للحقن | |
| مقياس تدفق BD LSRII (أو ما يعادله) | بكالوريوس العلوم الحيوية | مزود ببرنامج FACS Diva | |
| بوبرينورفين XR | أي | لتخفيف الألم | |
| وسائط زراعة الخلايا | أي | (لتقنيات الخلايا الحية؛ أي. DMEM أو RPMI) | |
| DAPI | الأسطورة الحيوية | 422801 | تركيز العمل: 15 ميكروغرام/مل |
| مصابيح LED مزدوجة أو مزدوجة بمجهر عنق الإوزة | أي | ||
| الإيثانول (70٪ في الماء) | أي | للتنظيف | |
| CD45.2 (104) مضاد الفأر المقترن ب FITC | الأسطورة الحيوية | 109806 | تركيز العمل: 5 ميكروغرام/مل |
| الملقط: ملقط ذو طرف دقيق مائل (x2) | روبوز | RS-5058 | المادة: دوموكسل; النمط #5، زاوية 45 درجة؛ حجم الرأس 0.1 × 0.06 مم |
| الملقط: ملقط ذو طرف ناعم | روبوز | RS-4960 | المادة: دوموستار؛ النمط #1؛ حجم الرأس: 0.20 × 0.12مم |
| الملقط: ملقط ذو طرف ناعم | روبوز | RS-4966 | المادة: دوموستار، نصيحة بيولوجي؛ النمط #3؛ حجم الرأس: 0.08 ×0.04 مم |
| ليدوكائين | أي | لتخفيف الألم | |
| الفئران | جاكس | بالنسبة لسلالة C57BL/6، فئران النوع البري: مختبرات جاكسون #000664 | |
| محركات الإبر | روبوز | RS-6410 | حامل إبر كاستروفييخو؛ ستريت |
| المجهر التشغيلي | لايكا | MZ9.5 | مجهر تشغيل رأس ستيريو Leica Mz9.5 |
| <إم>اختياري: صبغة إيفانز بلو | سيغما | E2129-10G | لتتبع اللمفاو. |
| محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) | أي | ||
| محلول بوفيدون/اليود | أي | لتحضير الجلد/التعقيم | |
| المقص: مقص ذو طرف رفيع جدا | روبوز | RS-5605 | ماكفيرسون-فاناس؛ حافة قطع 3 مم؛ منحنية |
| المقص: مقص متوسط | روبوز | RS-5676 | نويس؛ حافة قطع 13 مم؛ مستقيم |
| الغراء الجراحي | أي | مثلا، لاصق الأنسجة 3M Vetbond | |
| الغرز: 6-0 بلو مونوفيلامينت بولي بروبيلين أزرق | أي | ||
| مثبت الأنسجة | أي | (للنسجة المخططة؛ أي الفورمالين المحايد المخزن 10٪ أو 4٪ بارافورمالديهايد) | |
| وسادة تسخين دائرية بالماء الدافئ | أي | ||
| الفئران | مختبرات جاكسون | بالنسبة لسلالة Balb/c، الفئران المعرضة للذئبة (MRL/MpJ-Fas-lpr/J): #000485 |
المراجع
- Amador-Patarroyo, M. J., Peñaranda, A. C., Bernal, M. T. Autoimmunity. Autoimmunity: From bench to bedside. Anaya, J. -M. , El Rosario University Press. Colombia. (2013).
- Echeverri, A. F., Tobón, G. J. Systemic autoimmune diseases. Autoimmunity: From bench to bedside. Anaya, J. -M. , El Rosario University Press. Colombia. (2013).
- García-Carrasco, ....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
