مقالة منهجية

إنشاء تذبذبات سريعة للأكسجين في تحليل نمو الخلية الميكروبية المفردة باستخدام جهاز مزدوج الطبقة Microfluidic

DOI:

10.3791/68697

⸱

يوليو 18, 2025

 , 
1IBG-1: Biotechnology, Institute of Bio- and Geosciences, Forschungszentrum Jülich GmbH, 2Computational Systems Biotechnology (AVT.CSB), RWTH Aachen University

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يقدم هذا البروتوكول طريقة لتصنيع شريحة موائع دقيقة مزدوجة الطبقة وتحليل النمو الميكروبي تحت تذبذبات الأكسجين السريعة. تم التحقق من صحة أداء الجهاز من خلال استشعار الأكسجين في قنوات السوائل والزراعة الميكروبية.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يبشر التحليل الميكروبي أحادي الخلية باستخدام الموائع الدقيقة إلى جانب الفحص المجهري بفاصل زمني بالتحقيق في سلوك النمو الميكروبي في ظل البيئات الضيقة بدقة زمانية مكانية ، مما يوفر رؤى لا يمكن اكتسابها من الزراعة التقليدية والمنصات التحليلية. يلعب الأكسجين دورا مهما في تحديد نمو الميكروبات. ومع ذلك ، لم يتم تنفيذ التحكم الزمني في نطاق الثواني في التحليل الميكروبي باستخدام الموائع الدقيقة. لقد قمنا مؤخرا بتطوير شريحة موائع دقيقة PDMS مزدوجة الطبقة تتيح التحكم في الأكسجين الزمني في نطاق عشرات الثواني. تتكون الرقاقة من طبقة علوية للغاز وطبقة سفلية للزراعة ونضح السوائل. يتم فصل الطبقتين بواسطة غشاء PDMS وسيط رفيع ، مما يسمح بتبادل الغاز السريع بين الطبقتين. في هذه الورقة المنهجية ، نوضح إجراء تصنيع الرقائق وتوصيفها وزراعتها الميكروبية باستخدام الشريحة. كنتائج تمثيلية ، نظهر قدرة التبديل السريع للأكسجين في عشرات الثواني ، والزراعة الميكروبية ، وتحليل النمو الذي تم حله بمرور الوقت في ظل ظروف الأكسجين المستمرة والمتذبذبة. يهدف هذا البروتوكول إلى مساعدة الباحثين المهتمين بتنفيذ التحكم في الأكسجين الزمني في إعداد الموائع الدقيقة الخاصة بهم.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يرتبط الأكسجين ارتباطا وثيقا بالنمو الميكروبي وعلم وظائف الأعضاء بين العوامل البيئية المختلفة ، ولا سيما التأثير على العمليات الخلوية مثل استجابة الإجهاد التأكسدي ، وتوازن الحديد ، والالتهابات المسببة للأمراض1،2،3. تقليديا ، تتم الزراعة الميكروبية في ظل الظروف المحيطة أو مع الحد الأدنى من التحكم عند مستويات أكسجين محددة. في السيناريوهات الواقعية ، من ناحية أخرى ، غالبا ما تكون بيئات الأكسجين غير ثابتة في كثير من الحالات ولكنها تتقلب بمرور الوقت. على سبيل المثال ، يمكن أن تتعرض الميكروبات لمستويات الأكسجين المتغيرة في غضون ثوان إلى دقائق في الأنظمة المائية أثناء تحركها في جميع أنحاء البيئة بسبب حركة السوائل والحركة الميكروبية4،5،6. وبالمثل ، تخلق المفاعلات الحيوية الصناعية أيضا بيئات أكسجين غير متجانسة بسبب عدم كفاية الخلط ، مما يؤثر على نمو الميكروبات والعائد النهائي7،8. تعد دراسة الاستجابات الميكروبية لمثل هذه الظروف الديناميكية أمرا حيويا لفهم العمليات البيئية وتحسين تطبيقات التكنولوجيا الحيوية.

يمكن للهوائط اللاهوائي الاختياري مثل الإشريكية القولونية (الإشريكية القولونية) التبديل بين المسارات الهوائية واللاهوائية اعتمادا على توافر الأكسجين9،10. على الرغم من أن الأبحاث السابقة قد استكشفت هذه القدرة على التكيف الأيضي ، إلا أن معظم الدراسات تركز على تحولات الأكسجين الفردية باستخدام أنظمة الزراعة التقليدية ، والتي تفشل في تكرار التغيرات السريعة التي تواجهها الميكروبات غالبا9،11،12،13،14. نتيجة لذلك ، هناك فهم محدود لكيفية استجابة الميكروبات من الناحية الفسيولوجية لمستويات الأكسجين المتغيرة بشكل متكرر.

كما ذكرنا ، تفتقر إعدادات المختبر التقليدية إلى الدقة والسرعة اللازمتين لتقليد تقلبات الأكسجين السريعة ولا تدعم المراقبة المستمرة عالية الدقة. لمعالجة هذا الأمر ، قمنا مؤخرا بتطوير منصة موائع دقيقة متخصصة بشريحة بولي ثنائي ميثيل سيلوكسان مزدوجة الطبقة (PDMS) ، مما يسمح بالتحكم السريع في الأكسجين والتصوير أحادي الخلية15. هنا ، نقدم بروتوكولات لتصنيع شريحة موائع دقيقة مزدوجة الطبقة تخلق تذبذبات سريعة للأكسجين وتمكن من تحليل نمو الخلية الميكروبية المفردة في ظل ظروف الأكسجين الخاضعة للرقابة. تتكون الرقاقة من طبقتين - طبقة علوية لتروية الغاز وطبقة سفلية لنضح السوائل والزراعة الميكروبية. يسمح الغشاء الرقيق الوسيط بين الطبقتين بالتبادل السريع للغازات. كعرض توضيحي ، بكتريا قولونية MG1655 تمت زراعته في الشريحة المطورة. تم تحليل النمو في ظل ظروف الأكسجين الثابتة والمتذبذبة.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. إعداد القالب

  1. قم بإعداد قالب للطبقة العليا عن طريق الطباعة ثلاثية الأبعاد. قم بتصنيع قالب الطبقة العليا بسطح أملس لضمان سطح أملس للطبقة العليا PDMS الناتجة. نوصي باستخدام الطباعة الحجرية المجسمة (SLA) ثلاثية الأبعاد.
    1. صمم القالب باستخدام برنامج 3D CAD (الشكل 1 أ). تأكد من أن التصميم يتضمن قنوات غاز تتداخل مع قنوات السوائل السفلية. قم بتنفيذ عملية التصميم هذه بالتوازي مع تصميم الطبقة السفلية (الخطوة 1.2.1).
    2. اطبع القالب باستخدام الطباعة ثلاثية الأبعاد SLA. قم بإزالة الراتنج المتبقي من القالب المطبوع واغسله في حمام كحول الأيزوبروبيل (IPA) لمدة 30 دقيقة (الشكل 1 ب).
    3. قم بإجراء المعالجة اللاحقة عن طريق تعريض القالب لضوء 405 نانومتر مع المدة ودرجة الحرارة المناسبة اعتمادا على نوع الراتنج والهندسة.
    4. دع القالب ينقع في IPA في حمام الموجات فوق الصوتية لمدة 15 دقيقة لإزالة الراتنج غير المعالج المتبقي في القالب ، مما قد يمنع علاج PDMS.
  2. قم بإعداد قالب رقاقة السيليكون للطبقة السفلية.
    1. صمم رقاقة الموائع الدقيقة باستخدام محرر تخطيط CAD (الشكل 1 ج). تأكد من أن التصميم يشتمل على مداخل وقنوات سوائل ومنافذ.
    2. قم بإنشاء قالب رقاقة السيليكون باستخدام الطباعة الحجرية الضوئية من طبقتين ، كما هو موضح في الورقة السابقة (الشكل 1 د) 16.
      ملاحظة: القنوات الموجودة في الطبقة السفلية بحجم ميكرومتر وتتطلب تصنيعا دقيقا ، في حين أن القنوات الموجودة في الطبقة العليا بحجم مم. نظرا لأن الطباعة ثلاثية الأبعاد لجيش تحرير السودان توفر وقت تصنيع أقصر وبالتالي نماذج أولية أسرع ، فقد تم استخدام طباعة جيش تحرير السودان لتصنيع هياكل كبيرة إلى حد ما لقالب الطبقة العليا. تم تصنيع الطبقة السفلية بواسطة الطباعة الحجرية الضوئية لضمان التصنيع الدقيق. في حالة وجود القنوات الموجودة في الطبقة العليا أيضا في نطاق ميكرومتر وتتطلب دقة ، ضع في اعتبارك تصنيع قالب باستخدام الطباعة الحجرية الضوئية أيضا.

2. تصنيع رقاقة الموائع الدقيقة ذات الطبقة المزدوجة PDMS

  1. قم بإعداد محلول المعالجة المسبقة PDMS عن طريق خلط القاعدة وعامل المعالجة جيدا بنسبة 10: 1. يزاز الخليط في مجفف لمدة 1 ساعة.
  2. نظف قالب الطبقة العلوية باستخدام IPA وجففه باستخدام الهواء المضغوط.
  3. صب PDMS في قالب الطبقة العليا ، متبوعا بالمعالجة الحرارية عند 80 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة (خطوة المعالجة الأولى ، الشكل 1E). تسمحخطوة المعالجة 1 بتقشير وقطع وتثقيب PDMS بينما لا يتم علاجه بالكامل.
  4. تحقق من الالتصاق PDMS باليد أو بالملاقط بعد 20 دقيقة من التسخين. إذا كان نظام إدارة الرسومات الرقمي لا يزال لزجا ، فاضبط وقت التسخين.
  5. انزع PDMS من قالب الطبقة العلوية وقطعه إلى قطع مفردة (هنا 20 مم × 18 مم). ثقوب ثقب (قطر = 0.75 مم) لمداخل الغاز (الشكل 1F). نظف السطح السفلي للطبقة العليا عن طريق الشطف باستخدام IPA والتجفيف بالهواء المضغوط وربط الشريط اللاصق.
  6. نظف قالب الطبقة السفلية باستخدام IPA وجففه باستخدام الهواء المضغوط. ثبت قالب الطبقة السفلية على طلاء الدوران وصب PDMS في وسط القالب. صب PDMS بالقرب من الرقاقة لتقليل فقاعات الهواء. إذا تم العثور على أي فقاعات هواء بعد صب PDMS ، فقم بنقلها إلى الجانب الخارجي باستخدام ملاقط أو إبر نظيفة.
  7. قم بتدوير PDMS على قالب الطبقة السفلية عند 1000 دورة في الدقيقة لمدة 60 ثانية ، متبوعا بالمعالجة الحرارية عند 80 درجة مئوية لمدة 10 دقائق (خطوة المعالجة الأولى ، الشكل 1G). تحقق من الالتصاق PDMS باليد أو بالملاقط بعد 10 دقائق واضبط وقت التسخين إذا لزم الأمر.
  8. ضع قطع PDMS من الطبقة العليا على طبقة PDMS السفلية على القالب واضغط بقوة من الأعلى لضمان ربط السطح بالطبقات العلوية والسفلية (الشكل 1H).
  9. عالج PDMS حراريا تماما عند 80 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة على الأقل (2 ثانية خطوة معالجة). تسمحخطوة المعالجة الثانية بمعالجة PDMS النهائية ، حيث ترتبط الطبقات العلوية والسفلية معا بشكل لا رجعة فيه (الشكل 1H).
  10. قطع الطبقة السفلية PDMS برفق إلى قطع. انزع شريحة PDMS بالكامل بعناية من القالب (الشكل 1H).
    ملاحظة: إذا كان من الصعب تقشير رقائق PDMS من القالب ، ففكر في مزيد من المعالجة السطحية لقالب الطبقة السفلية ، مثل السيلان وطلاء السطح الكيميائي ، لتسهيل إجراء التقشير. إذا انفصلت الطبقات العلوية والسفلية أثناء التقشير ، ففكر في تقصير الوقتلخطوة المعالجة الأولى .
  11. ثقب ثقوب (قطر = 0.5 مم) لمداخل ومخارج السوائل على طرفي قنوات السوائل (الشكل 1H). قم بتنظيف السطح السفلي للرقاقة بعناية عن طريق الشطف باستخدام IPA ، والتجفيف بالهواء المضغوط ، وربط الشريط اللاصق.
  12. اربط الرقاقة بغطاء زجاجي بسمك 0.175 مم بعد تنشيط السطح عن طريق أكسدة البلازما (25 ثانية ، الشكل 1H).
  13. بعد وضع الرقاقة على الركيزة الزجاجية ، اغسل الطبقة العليا بالهواء المضغوط للتأكد من أن الطبقة السفلية لغشاء PDMS متصلة بشكل صحيح بالزجاج.
  14. قم بتسخين الرقاقة المستعبدة عند 80 درجة مئوية لمدة 10 ثوان إلى 1 دقيقة لزيادة ثبات الترابط.
    ملاحظة: يمكن أن تتأثر خطوة معالجة PDMS المذكورة أعلاه ووقت المعالجة المطلوب بمعلمات مختلفة ، مثل سمك القالب والمعدات والظروف المحيطة. لذلك ، اضبط وقت المعالجة وفقا لذلك في حالة عدم ملاءمة البروتوكول المقترح للتطبيق.

3. الإعداد التجريبي

ملاحظة: يتم استخدام مجهر مقلوب مزود بكاميرا تكميلية لأشباه الموصلات بأكسيد المعادن (CMOS) ، وكاميرا مجهرية تصوير مدى الحياة الفلورية (FLIM) (مجال التردد) ، وحاضنة درجة الحرارة كإعداد تجريبي قياسي. يتم توصيل مصدر ليزر الإثارة المعدل (445 نانومتر ، 100 ميجاوات) بكاميرا FLIM. يتم استخدام ثلاثة أجهزة تحكم في تدفق الكتلة (النيتروجين والأكسجين وثاني أكسيد الكربون) للتحكم في الغاز. تستخدم مضخات الحقنة للتروية المتوسطة.

  1. تحضير الأنابيب للغاز (المدخل) والسوائل (المدخل والمخرج). قم بتشغيل الحاضنة للوصول إلى درجة الحرارة المطلوبة قبل التجربة (هنا 37 درجة مئوية).
  2. حدد العدسة الموضوعية المطلوبة (هنا ، 20x لاستشعار الأكسجين و 100x للمراقبة الميكروبية) وأضف زيت الغمر إذا لزم الأمر. ثبت الشريحة ذات الطبقة المزدوجة على حامل الرقائق بمواد لاصقة.

4. التحكم في الأكسجين على الرقاقة والاستشعار

  1. قم بإعداد محلول صبغة حساس للأكسجين بتركيز مناسب (هنا ، 3 ملي مولار تريس (2،2 '-بيبيريديل) ثنائي كلوروروثينيوم (II) سداسي هيدرات ، RTDP).
  2. قم بمعايرة كاميرا FLIM باستخدام شريحة مرجعية ذات عمر افتراضي معروف (هنا 3.75 نانوثانية). قم بقياس شدة الإشارة باستخدام كاميرا FLIM واضبط وقت التعرض أو فتحة المجهر لتحقيق شدة إشارة 0.68 - 0.72 لمعايرة أفضل.
  3. ثبت حامل الرقاقة على مرحلة المجهر. قم بتوصيل الأنابيب المناسبة بمدخل ومخرج السوائل. ابدأ في حشو محلول الصبغة الحساس للأكسجين بمعدل تدفق ثابت باستخدام مضخة حقنة (هنا 100 نانولتر / دقيقة).
  4. قم بتوصيل مدخل الغاز ووحدات التحكم في تدفق الكتلة بالأنابيب المناسبة. ابدأ في تنظيف الغاز بتركيز الأكسجين المتحكم فيه (هنا 0٪ أو 21٪ أكسجين ، معدل تدفق الكتلة الكلي 600 مل / دقيقة).
  5. قم بقياس عمر الطور في حالة عدم وجود الأكسجين (τ0) وبتركيز أكسجين آخر معروف (هنا عند 21٪). احسب ثابت التبريد (Kq) باستخدام معادلة ستيرن-فولمر على النحو التالي ، والتي تصف التبريد الفلوري في وجود الأكسجين. بدلا من ذلك ، يمكن استخدام شدة التألق (I) ؛ ومع ذلك ، قد يتأثر القياس المستند إلى الشدة بالاختلافات في شدة مصدر الضوء ، وتبييض الصور ، وما إلى ذلك.
    figure-protocol-1
    ملاحظة: يوصى بالانتظار لبضع دقائق بعد بدء شطف الغاز لضمان المعايرة الدقيقة ، خاصة عند استهداف مستويات استنفاد الأكسجين المنخفضة التي تصل إلى 0٪. لتحسين الدقة ، ضع في اعتبارك استكمال العملية بطرق إضافية لنضوب الأكسجين ، مثل استخدام كاسحات الأكسجين أو إعداد غرفة إضافية محكمة الغلق.
  6. قم بقياس عمر الطور وحساب تركيز الأكسجين المقابل باستخدام معادلة ستيرن-فولمر. لخلق ظروف الأكسجين المتذبذبة ، استخدم أي نظام تحكم في أداة لأتمتة ضبط معدلات تدفق الحجم للنيتروجين والأكسجين.

5. إعداد الثقافة البكتيرية

  1. . ابدأ الزراعة المسبقة عن طريق تلقيح الكائن الحي المطلوب (هنا ، الإشريكية القولونية MG1655 ، حبة واحدة جاهزة للاستخدام من قارورة التبريد لكل قارورة) في وسط مرغوب فيه (هنا ، وسط LB يتكون من 10 جم / لتر من البيبتون ، و 5 جم / لتر من مستخلص الخميرة ، و 10 جم / لتر كلوريد الصوديوم) واحتضانه طوال الليل (هنا ، 37 درجة مئوية عند 150 دورة في الدقيقة).
  2. قم بقياس الكثافة الضوئية الناتجة باستخدام مقياس ضوئي عند 600 نانومتر (OD600).
  3. ابدأ المزرعة التالية في وسط LB عن طريق تلقيح ما قبل الاستزراع (هنا ODالأولي 600 = 0.3 أو 0.0001). احتضان الثقافة حتى تصل إلى مرحلة النمو الأسي.
    ملاحظة: إذا كان وسيط الزراعة على الرقاقة يختلف عن وسط ما قبل الزراعة الأول ، فمن المستحسن إجراء استزراع مسبق ثان مع وسط الزراعة على الرقاقة للسماح للكائنات الحية بالتعرف على وسيط جديد16.
  4. قم بإعداد محلول البذر عن طريق تخفيف الثقافة إلى كثافة بصرية مناسبة. انقل محلول البذر إلى حقنة سعة 1 مل للخطوة التالية. بالنسبة للإشريكية القولونية ، كانت الكثافة الضوئية (OD600) لمحلول البذر حوالي 0.5.

6. زراعة الميكروبات على الرقاقة والتصوير بفاصل زمني في ظل ظروف الأكسجين الخاضعة للرقابة

  1. ثبت حامل الرقاقة على مرحلة المجهر. دع حامل الشريحة وشريحة PDMS يسخنان في الحاضنة (هنا 37 درجة مئوية) لعدة ساعات ، لأن هذا سيقلل من خطر إلغاء التركيز البؤري أثناء التصوير بفاصل زمني بسبب الإزاحة المرتبطة بدرجة الحرارة.
  2. قبل البدء في الزراعة ، ابدأ في الغاز بتركيز الأكسجين الأولي المطلوب عن طريق ضبط النسبة المئوية الحجمية لتدفق كتلة الأكسجين والنيتروجين مع الحفاظ على معدل التدفق الكلي ومعدل تدفق ثاني أكسيد الكربون ثابتا.
  3. قم بتوصيل مدخل الغاز للرقاقة ووحدات التحكم في التدفق الشامل.
  4. قم بزرع الكائن الحي في الرقاقة عن طريق توصيل المحقنة بمحلول البذر بمخرج السائل ودفع المحقنة يدويا. تحقق من خلال المجهر مما إذا كانت الخلايا محاصرة بنجاح في غرف الزراعة.
  5. بعد تلقيح الخلايا ، قم بإزالة المحقنة وقم بتوصيل حقنة أخرى بالوسط الطازج بمدخل السوائل. ادفع المحقنة يدويا لمسح أي خلايا متبقية في قناة الإمداد المتوسطة.
  6. ابدأ في تنقيب الوسط بمعدل تدفق ثابت (هنا 100 نانولتر / دقيقة) باستخدام مضخة المحقنة. تأكد من معدل تدفق كاف ، لأن المعدل غير الكافي قد يؤدي إلى جفاف الغرفة. يمكن أن يختلف معدل التدفق الكافي اعتمادا على عدة عوامل ، بما في ذلك هندسة قناة السائل ومعدل تدفق الغاز في قناة الطبقة العليا.
  7. ابدأ الحصول على الصور بفاصل زمني. للزراعة في ظل ظروف الأكسجين المتذبذبة ، ابدأ التحكم التلقائي في وحدات التحكم في التدفق الشامل في نفس الوقت الذي يبدأ فيه الحصول على الصورة. في حالة وجود أي تأخير في بدء التحكم في الغاز والحصول على الصور ، ضع التأخير في الاعتبار لتحليل بيانات الصورة لاحقا.

7. تحليل بيانات الصور

  1. احفظ صورة اللقطات المتتابعة كحزمة صور واحدة لكل موضع.
  2. قم بمعالجة الصورة مسبقا لتدوير المستعمرة المزروعة ومحاذاتها واقتصاصها باستخدام برامج تحليل الصور. أمثلة على المعالجة المسبقة . صور TIF متوفرة هنا: https://doi.org/10.5281/zenodo.1398274715
  3. قم بتقسيم الخلايا واستخلاص القيم ذات الصلة ، مثل رقم الخلية والطول والمساحة وشدة التألق وما إلى ذلك. تحليل سلوكيات النمو بشكل أكبر. تتوفر أمثلة على البرامج النصية Python هنا: https://github.com/JuBiotech/Supplement-to-Kasahara-et-al.-202515

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تصنيع رقائق PDMS مزدوجة الطبقة
تم تصوير الرقاقة المصنعة ذات الطبقة المزدوجة في الشكل 2 أ ، مع قنوات الغاز الملونة (الأحمر) وقنوات السوائل (الزرقاء) للتصور. تحتوي الشريحة على ثلاث قنوات سائلة متطابقة وقنوات غاز متداخلة للسماح بإجراء تجارب متوازية. تحتوي قناة السوائل على منطقة زراعة بها سلسلة من غرف الزراعة (الشكل 2 أ (ط)). يتم احتجاز الخلايا داخل غرف الزراعة ويسمح لها بالنمو بتنسيق أحادي الطبقة ، مما يتيح تصويرا عالي الدقة بفاصل زمني مع معدل عال للحصول على الصور. يوضح المقطع العرضي للرقاقة طبقة علوية بسمك 3 مم وطبقات سفلية بسمك 65 ميكرومتر ، مما يتيح انتشارا سريعا للغاز من قناة الغاز إلى قناة السائل عبر غشاء PDMS الوسيط (الشكل 2 أ (ii-ii')).

التحكم في الأكسجين على الرقاقة
تم اختبار قدرة تبادل الغاز للرقاقة المطورة باستخدام FLIM والصبغة الحساسةللأكسجين 15. كما هو موضح في الشكل 2 ب ، أظهر تركيز الأكسجين في قناة السائل إما انخفاضا أو زيادة مقابلة في غضون عشرات الثواني عندما تم تحويل تركيز الأكسجين بين 21٪ و 0٪. توضح نتائج قياس الأكسجين هذه أنه يمكن تكرار تذبذب الأكسجين السريع في عشرات الثواني في شريحة الموائع الدقيقة ذات الطبقة المزدوجة المطورة.

زراعة الميكروبات في ظل ظروف الأكسجين المستمرة
تم استخدام الرقاقة لأول مرة لتوصيف اللاهوائية الاختيارية بكتريا قولونية النمو في ظل ظروف غازية ثابتة بتركيزات مختلفة من الأكسجين. تمت إضافة ثاني أكسيد الكربون دائما إلى غاز الإمداد لأننا لاحظنا نموا مقيدا للإشريكية القولونية تحت استنفاد ثاني أكسيد الكربون في التجارب الأولية (البيانات غير معروضة). يصور الشكل 3 أ والشكل 3 ب صورا تمثيلية لتباين الطور للإشريكية القولونية في ظل الظروف الهوائية (21٪ إمدادات الأكسجين) واللاهوائية (0٪ إمداد بالأكسجين) ، على التوالي. بعد 3 ساعات من الزراعة ، نتج عن الإشريكية القولونية المزروعة في ظل الظروف الهوائية مستعمرات أكبر مقارنة بالظروف اللاهوائية. يظهر التحليل الكمي أيضا معدلات زيادة مختلفة في حجم المستعمرة (مستعمرة) تعتمد على توافر الأكسجين ، كما هو موضح في منحنيات النمو في الشكل 3C. لاحظ أن المستعمرة يتم تطبيعها حسب المنطقة الأولية للسماح بالمقارنة بين المستعمرات والظروف المختلفة. يمكن تحديد معدل النمو الأسي μ من منحنى النمو على النحو التالي وتلخيصه في الشكل 3D.

figure-results-1

تتحقق النتائج من قدرة الجهاز على التحكم في الأكسجين بتركيزات مستهدفة وتحليل النمو الميكروبي المقابل بشكل فعال من صور الفاصل الزمني المكتسبة.

الزراعة الميكروبية في ظل ظروف الأكسجين المتذبذبة
أخيرا ، الإشريكية القولونية تمت زراعتها في ظل ظروف الأكسجين المتذبذبة ، والتبديل بين مراحل الغازات الهوائية واللاهوائية مع فاصل تبديل T'. تم فحص T المختلفة بين 60 دقيقة إلى 1 دقيقة لاختبار القدرة على تحليل النمو الذي تم حله بمرور الوقت فيما يتعلق بظروف الأكسجين المتذبذبة. يوضح الشكل 4 نمو الإشريكية القولونية الكمي في ظل ظروف الأكسجين المتذبذبة مع T = 60 و 30 و 10 و 5 و 2 و 1 دقيقة. بالإضافة إلى منحنى النمو القائم على مستعمرة A ، فإن معدل النمو اللحظي μΔt محدد أيضا لاكتساب رؤى تم حلها بمرور الوقت على النحو التالي.

figure-results-2

تظهر معدلات النمو في ظل الظروف الهوائية واللاهوائية الثابتة أيضا بخطوط منقطة (μ21٪ ، μ0٪) في الشكل 4 كمراجع للنمو. قدم نمو الإشريكية القولونية ديناميكيات مميزة استجابة للظروف الغازية المتذبذبة. على سبيل المثال ، بعد تحويل مرحلة الغاز من الظروف الهوائية إلى الظروف اللاهوائية (T = 60 دقيقة) ، أظهر النمو (1) مرحلة الاستجابة: انخفاض مفاجئ في معدل النمو ، تليها (2) مرحلة التعافي: الزيادة التدريجية في معدل النمو ، و (3) مرحلة الاستقرار: استقرار النمو حوالي μ0٪. تم حل ديناميكيات نمو الإشريكية القولونية مؤقتا بنجاح في ظل T ' مختلفة تصل إلى دقيقة واحدة ، حيث أظهر الإشريكية القولونية معدل نمو رتيب صعودا وهبوطا بسبب الوقت المحدود لتكييف النمو مع الظروف الغازية المتغيرة. علاوة على ذلك ، يمكن تحليل سلوك النمو ليس فقط على مستوى المستعمرة ولكن أيضا على مستوى الخلية الواحدة. يوضح الشكل 5 تطور منطقة الخلية المفردة تحت تذبذبات الأكسجين على فترات تبديل مختلفة T'. يمكن الاستدلال على نمو الخلية المفردة باتباع قطع الأراضي المجاورة ، دون تتبع التحليل. يشبه سلوك النمو على مستوى الخلية المفردة ما لوحظ على مستوى المستعمرة في الشكل 4. زيادة أسرع في المنطقة خلال مرحلة الغاز الهوائي وتغيير واضح في سرعة النمو في حدث تبديل الغاز. توضح النتائج هنا القدرة على زراعة الميكروبات في ظل ظروف غازية متذبذبة وتحليل النمو الميكروبي بالارتباط بتوافر الأكسجين بطريقة يتم حلها بمرور الوقت.

figure-results-3
الشكل 1: إجراء تصنيع الرقائق مزدوجة الطبقة. يبدأ الإجراء بتصميم القوالب (A ، C) ، وتصنيع القوالب (B ، D) ، وقولبة PDMS (EG) ، و (H) تجميع الرقائق. تم تعديل هذا الرقم من15. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-4
الشكل 2: رقاقة مزدوجة الطبقة المصنعة وقدرتها على التحكم في الأكسجين. (أ) يتم تقديم الصورة التمثيلية للرقاقة المصنعة ، والتي تتميز بقنوات الغاز الملونة (الحمراء) وقنوات السوائل (الزرقاء) للتصور. تظهر صورة SEM في (i) ، تصور سلسلة من غرف الزراعة المتصلة بقنوات السوائل على كلا الجانبين (شريط المقياس 100 ميكرومتر). يظهر المقطع العرضي للرقاقة في (ii-ii') ، ويصور الطبقة العليا بسمك 3 مم والطبقة السفلية التي يبلغ سمكها 65 ميكرومتر. (ب) تركيز الأكسجين المقاس في قناة السوائل بعد التبديل بين الظروف الهوائية (21٪ أكسجين) واللاهوائية (0٪ أكسجين). تم تعديل هذا الرقم من15. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-5
الشكل 3: زراعة الإشريكية القولونية في ظل ظروف الأكسجين المستمرة. (أ) تتم زراعة الخلايا هوائية (21٪ من إمدادات الأكسجين) لمدة 3 ساعات ، ويتم الحصول على صور الفاصل الزمني باستخدام الفحص المجهري لتباين الطور. (ب) تزرع الخلايا في حالة لاهوائية (0٪ إمداد بالأكسجين) ، ويتم الحصول على صور الفاصل الزمني لمدة 3 ساعات. (ج) يتم رسم نمو الخلية في ظل ظروف الأكسجين الثابتة المختلفة بناء على مستعمرة. (د) يتم حساب وتلخيص معدل النمو الأسي. جميع أشرطة المقياس = 5 ميكرومتر. يتم التعبير عن البيانات بمتوسط ± SD n = 35 مستعمرة (0٪) ، 27 (0.1٪) ، 21 (0.5٪) ، 16 (1٪) ، 13 (5٪) ، 13 (10٪) ، 29 (21٪). تم تعديل هذا الرقم من15. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-6
الشكل 4: زراعة الإشريكية القولونية في ظل ظروف الأكسجين المتذبذبة. يتم فحص نمو الخلايا في ظل ظروف الأكسجين المتذبذبة المختلفة (T '، فاصل التبديل بين الظروف الهوائية واللاهوائية). يتم رسم نمو الخلية على أساس مستعمرة بمرور الوقت (أعلى) ، ويتم رسم μ Δt بمرور الوقت للسماح بتفسير البيانات التي تم حلها بمرور الوقت (أسفل). يتم التعبير عن البيانات بمتوسط ± SD n = 5 مستعمرات (60 دقيقة) ، 3 (30 دقيقة) ، 4 (10 دقائق) ، 4 (5 دقائق) ، 4 (2 دقيقة) ، 5 (1 دقيقة). تم تعديل هذا الرقم من15. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-7
الشكل 5: منطقة خلية واحدة (خلية واحدة ) من الإشريكية القولونية المزروعة في ظل ظروف الأكسجين المتذبذبة. البيانات من مستعمرة تمثيلية من كل فاصل تبديل T '. تم تعديل هذا الرقم من15. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم توفير بروتوكول تصنيع وتشغيل نظام موائع دقيقة مزدوجة الطبقة لمراقبة نمو الميكروبات في ظل ظروف الأكسجين المتذبذبة بسرعة مع دقة زمانية مكانية عالية. إلى جانب التصوير بفاصل زمني ، تتيح هذه المنصة الزراعة على الرقاقة والمراقبة في الوقت الفعلي للكائنات الحية الدقيقة في ظل ظروف الأكسجين الخاضعة للرقابة ، مما يسمح بتحليل النمو الميكروبي فيما يتعلق بتوافر الأكسجين.

في هذا البروتوكول ، يتم تحضير الطبقات العلوية والسفلية بشكل منفصل ثم تجميعها في شريحة واحدة. يسمح هذا المفهوم المعياري بتصميمات الرقائق المختلفة ببساطة عن طريق استبدال التكوينات المكونة من طبقتين. تم استخدام طرق تصنيع مختلفة لقوالب الطبقة العلوية والسفلية - الطباعة ثلاثية الأبعاد SLA للأعلى والطباعة الحجرية الضوئية للأسفل - بناء على متطلبات الحجم والدقة الخاصة بكل منها. يعمل هذا النهج على تحسين الكفاءة الإجمالية لعملية التصنيع. يتم تجميع الطبقتين من خلال عملية معالجة PDMS من خطوتين. من الضروري تحسين وقت التسخين لخطوة المعالجة الأولى وفقا للتصميم ، حيث يمكن أن يؤثر سمك القالب وظروف التسخين المحلية على نتائج معالجة PDMS.

نحن نستفيد من طبيعة PDMS كونه نفاذية عالية للهواء لتحقيق تبديل سريع للأكسجين. من ناحية أخرى ، قد تتأثر دقة التحكم في الأكسجين أيضا بالانتشار السلبي للأكسجين من خلال PDMS ، خاصة عند مستويات الأكسجين المنخفضة. للتعويض عن هذا القيد ، يمكن إضافة المزيد من التحسينات إلى البروتوكول. على سبيل المثال ، طريقة المعايرة لمستشعر الأكسجين لديها فرص للتحسين. في البروتوكول الموضح ، تتم معايرة المستشعر عند نقطتين مرجعيتين ، مستويات الأكسجين 0٪ و 21٪ ، باستخدام شريحة PDMS مزدوجة الطبقة. وبالتالي ، تعتمد دقة استشعار الأكسجين على القدرة على خلق ظروف دقيقة مستنفدة للأكسجين للمعايرة. كما هو مذكور في البروتوكول ، يوصى بالانتظار لبضع دقائق بعد بدء شطف الغاز لضمان المعايرة الدقيقة ، خاصة عند استهداف مستويات استنفاد الأكسجين المنخفضة التي تصل إلى 0٪. ومع ذلك ، فإن هذه المهمة تمثل تحديا بسبب التسريبات المحتملة أو احتباس الهواء في شريحة PDMS المنفذة للهواء. يمكن تحسين دقة المعايرة بشكل أكبر من خلال استخدام المواد الكيميائية لمسح الأكسجين أو إحاطة الشريحة في غرفة محكمة الغلق ومستنفدة للغاز17،18. يمكن أن تسمح هذه المكملات بتحليل أكثر قوة ودقة للسلوك الميكروبي في ظل ظروف اللاهوائية الصارمة ومنخفضة الأكسجين.

سيكون الجهاز المعروض ذا أهمية لمختلف مجالات البحث. على سبيل المثال ، سيكون من المفيد تكرار ظروف الأكسجين في المفاعلات الحيوية الصناعية ، حيث يفترض أن يكون توافر الأكسجين غير متجانس مكانيازمانيا 7،8،19،20. يسمح استخدام الشريحة ذات الطبقة المزدوجة للباحثين بتوصيف وفهم السلوك الميكروبي في ظل بيئات الأكسجين سريعة التقلب ، وهو ما لم يكن ممكنا في إعدادات الزراعة التقليدية.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

المؤلفون ليس لديهم ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم دعم KK من قبل برنامج دعم التبادل الطلابي التابع لمنظمة خدمات الطلاب اليابانية (G2130401003N JASSO) ومؤسسة البحوث الألمانية (DFG) - SFB1535 - معرف المشروع 458090666.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
كليوين 5برنامج WieWeb ، هولنداغير متاحمحرر التخطيط
كاميرا CMOSنيكون ، اليابانDS-Qi2
غطاء زجاجيSchott AG ، ألمانياD263 السيرة الذاتية39.5 مم × 34.5 مم × 0.175 مم
منظف البلازما فيمتودينر للإلكترونيات ، ألمانيا-رقاقة البلازما الترابط
نموذج 3 بFormlabs ، الولايات المتحدة-طابعة ثلاثية الأبعاد
مرجع مدى الحياةستارنا العلمية ، المملكة المتحدةUMM-SFG
وحدة التحكم في التدفق الشاملV & ouml; gtlin Instruments GmbH ، سويسراجي إس سي - A9SA - BB22النيتروجين والأكسجين
وحدة التحكم في التدفق الشاملV & ouml; gtlin Instruments GmbH ، سويسراجي إس سي - A9SA - BB21ثاني أكسيد الكربون
نموذج راتنج v3Formlabs ، الولايات المتحدةRS - F2 - DMBE - 03راتنج الطباعة ثلاثية الأبعاد
كلوريد الصوديومكارل روث ، ألمانيا3957.1مكون متوسط LB
نيكون إكليبس Ti-E 2نيكون ، اليابان-المجهر المقلوب
كاميرا pco.flimPCO AG ، ألمانيا-
ليزر pco.flimOmicron-Laserprodukte GmbH ، ألمانيا-
الببتونكارل روث ، ألمانيا8986.1مكون متوسط LB
خطة أبو & لامدا;نيكون ، اليابان-100x زيت ، 20x
بولي ديميثيل سيلوكسان (PDMS)شركة داو للكيماويات ، الولايات المتحدةSylgard 184 مجموعة مطاط صناعي من السيليكون
أداة التثقيب ، & 0.50 ملمالأدوات الدقيقة العالمية ، الولايات المتحدة504528
أداة التثقيب ، & 0.75 ملمالأدوات الدقيقة العالمية ، الولايات المتحدة504529
قارورة التبريد في متجر روتيكارل روث ، ألمانيا-
Solidworks 2016 x64 الإصدارداسو سيستمز ، فرنساغير متاح3D CAD
الركيزة تدور المغطيأتمتة APT ، ألمانياسبين150iPDMS spincoating
مضخة حقنةسيتوني ، ألمانيانيميسيس
حاضنة درجة الحرارةأوكولاب ، إيطاليا-معدات المجهر
تريس (2،2 '-بيبيريديل) ثنائي كلورو روثينيوم (II) سداسي هيدرات ، (RTDP)أكروس أورجانيكس ، بلجيكا208750010
انابيبSaint-Gobain, فرنساتيجون F-4040-Aأنابيب مدخل الغاز
انابيبSaint-Gobain, فرنساAAD04103 تيجونأنابيب السوائل
مستخلص الخميرةكارل روث ، ألمانيا2363.3مكون متوسط LB

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Cabiscol, E., Tamarit, J., Ros, J. Oxidative stress in bacteria and protein damage by reactive oxygen species. Int Microbiol. 3 (1), 3-8 (2000).
  2. Miethke, M., Marahiel, M. A. Siderophore-based iron acquisition and pathogen control. Microbiol Mol Biol Rev. 71 (3), 413-451 (2007).
  3. André, A. C., Debande, L., Marteyn, B. S. The selective advantage of facultative anaerobes relies on their unique ability to cope with changing oxygen levels during infection. Cell Microbiol. 23 (8), e13338(2021).
  4. Blackburn, N., Fenchel, T., Mitchell, J. Microscale nutrient patches in planktonic habitats shown by chemotactic bacteria. Science. 282 (5397), 2254-2256 (1998).
  5. Smriga, S., Fernandez, V. I., Mitchell, J. G., Stocker, R. Chemotaxis toward phytoplankton drives organic matter partitioning among marine bacteria. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (6), 1576-1581 (2016).
  6. Taylor, J. R., Stocker, R. Trade-offs of chemotactic foraging in turbulent water. Science. 338 (6107), 675-679 (2012).
  7. Enfors, S. O., et al. Physiological responses to mixing in large scale bioreactors. J Biotechnol. 85 (2), 175-185 (2001).
  8. Takors, R. Scale-up of microbial processes: Impacts, tools and open questions. J Biotechnol. 160 (1), 3-9 (2012).
  9. Partridge, J. D., Scott, C., Tang, Y., Poole, R. K., Green, J. Escherichia coli transcriptome dynamics during the transition from anaerobic to aerobic conditions. J Biol Chem. 281 (38), 27806-27815 (2006).
  10. Ren, T., et al. Oxygen sensing regulation mechanism of Thauera bacteria in simultaneous nitrogen and phosphorus removal process. J Cleaner Prod. 434, 140332(2024).
  11. Murashko, O. N., Lin-Chao, S. Escherichia coli responds to environmental changes using enolasic degradosomes and stabilized DicF sRNA to alter cellular morphology. Proc Natl Acad Sci. 114 (38), E8025-E8034 (2017).
  12. Yasid, N. A., Rolfe, M. D., Green, J., Williamson, M. P. Homeostasis of metabolites in Escherichia coli on transition from anaerobic to aerobic conditions and the transient secretion of pyruvate. Royal Soc Open Sci. 3 (8), 160187(2016).
  13. von Wulffen, J., RecogNice-Team,, Sawodny, O., Feuer, R. Transition of an Anaerobic Escherichia coli Culture to Aerobiosis: Balancing mRNA and Protein Levels in a Demand-Directed Dynamic Flux Balance Analysis. PloS one. 11 (7), e0158711(2016).
  14. Pedraz, L., Blanco-Cabra, N., Torrents, E. Gradual adaptation of facultative anaerobic pathogens to microaerobic and anaerobic conditions. FASEB J. 34 (2), 2912-2928 (2020).
  15. Kasahara, K., et al. Unveiling microbial single-cell growth dynamics under rapid periodic oxygen oscillations. Lab on a Chip. 25, 2234-2246 (2025).
  16. Gruenberger, A., et al. Microfluidic picoliter bioreactor for microbial single-cell analysis: fabrication, system setup, and operation. J Vis Exp. (82), e50560(2013).
  17. Wu, H. M., et al. Widefield frequency domain fluorescence lifetime imaging microscopy (FD-FLIM) for accurate measurement of oxygen gradients within microfluidic devices. Analyst. 144 (11), 3494-3504 (2019).
  18. Kasahara, K., et al. Enabling oxygen-controlled microfluidic cultures for spatiotemporal microbial single-cell analysis. Front Microbiol. 14, 1198170(2023).
  19. Bisgaard, J., et al. Characterization of mixing performance in bioreactors using flow-following sensor devices. Chem Eng Res Des. 174, 471-485 (2021).
  20. Nauha, E. K., Kálal, Z., Ali, J. M., Alopaeus, V. Compartmental modeling of large stirred tank bioreactors with high gas volume fractions. Chem Eng J. 334, 2319-2334 (2018).

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

PDMS

مقالات ذات صلة