مقالة منهجية

تحسين تحرير الجينوم عبر تقنية التثقيب الكهربائي في الجسم الحي القائمة على توصيل الأحماض النووية في الجسم الحي لتوليد الفئران بالضربة القاضية

1.2K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/68704

⸱

أغسطس 26, 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Center of Transgenesis and Genome Editing, St. Petersburg State University, 2Resource Center Molecular and Cell Technologies, St. Petersburg State University, 3Amyloid Biology Laboratory, St. Petersburg State University, 4DNA-Nanosensoric laboratory, ITMO University, 5Laboratory of Toxinology and Molecular Systematics, L.A. Orbeli Institute of Physiology, National Academy of Sciences of the Republic of Armenia

في هذه المقالة

ملخص

كفاءة تحرير الجينوم المحسن عبر طريقة توصيل الأحماض النووية لقناة البيض (I-GONAD) يمكن مقارنتها بالحقن المجهري التقليدي ، والذي يتطلب جمع البيضت البيضي من الإناث المتبرعات ونقله إلى الإناث الحوامل الزائفات. يوضح هذا البروتوكول فعاليته من خلال إدخال الطفرات التي يسببها CRISPR / Cas9 في موضع ROSA26 على الكروموسوم 6.

الملخص

تتضمن طرق إنشاء الفئران بالضربة القاضية عادة ثلاث خطوات رئيسية: (1) جمع الأجنة من الإناث المتبرعات ، (2) الحقن الدقيق للتركيبات الجينية في البيضة الملقحة خارج الجسم الحي ، و (3) نقلها جراحيا إلى قناة البيض للإناث الحوامل الزائفة. تتطلب هذه العملية عددا كبيرا من ، لأنها لا تشمل الإناث المانحة فحسب ، بل تشمل أيضا الذكور الدافقة والإناث الحوامل الزائفة. علاوة على ذلك ، فإن الحقن المجهري في السيتوبلازم أو نواة البيضة الملقحة للفأر تمثل تحديات مثل انسداد الإبرة ، ومشاكل نفاذية الغشاء بسبب المرونة العالية ، وموت الأجنة المحتمل. يوفر تطوير المثقوب الكهربائية المتقدمة ، مثل Nepa21 ، فرصة فريدة لتوليد الفئران ذات الضربة القاضية الجينية المستهدفة في خطوة واحدة من خلال طريقة تعرف باسم تحرير الجينوم المحسن عبر توصيل الأحماض النووية في قناة البيض (I-GONAD). تتضمن هذه التقنية الحقن الدقيق لمكونات CRISPR-Cas (بروتين Cas9 ودليل الحمض النووي الريبي) في قنوات البيض للإناث الحوامل بعد 0.7 يوم من الحمل ، متبوعا بالتثقيب الكهربائي في الجسم الحي لتوصيل هذه المكونات مباشرة إلى البيضة الملقحة. بعد إجراء I-GONAD ، تحمل الفأر الحامل وتلد صغارا مصابة بالضربة القاضية الجينية المستهدفة. توفر هذه المقالة بروتوكولا مفصلا خطوة بخطوة لتنفيذ طريقة I-GONAD في الفئران ، مما يوفر بديلا أكثر كفاءة ويمكن الوصول إليه لتقنيات توليد الماوس بالضربة القاضية التقليدية.

المقدمة

يعد فهم الأساس الجيني للأمراض أمرا بالغ الأهمية لتحديد الآليات الجزيئية الكامنة وراء مسببات الأمراض والتسبب في المرض. تتمثل إحدى الخطوات الرئيسية في هذا البحث في تطوير نماذج حيوانية مع ضربة قاضية جينية مستهدفة تحاكي الأمراض البشرية. تعتبر الفئران ذات قيمة خاصة لهذه الدراسات نظرا لتشابهها الجيني العام مع البشر ، وصغر حجمها ، وعمرها القصير ، والخصوبة العالية. تعتبر نماذج الفئران مهمة لكل من البحث الأساسي والاختبارات قبلالسريرية 1.

لإنشاء فأر بالضربة القاضية باستخدام نظام CRISPR-Cas9 ، يقوم الباحثون عادة بحقن مجموعة من دليل الحمض النووي الريبي و Cas9 nuclease في زيجوت ، مما يتسبب في كسر مزدوج الخيط في الحمض النووي المستهدف وبالتالي تنشيط نظام إصلاح الخلية لإحداث طفرة في موقع الكسر1،2. يظل الحقن المجهري في البياضات البيحة الملقحة هو المعيار الذهبي لهذا الغرض. ومع ذلك ، تتطلب هذه الطريقة عدة خطوات: عزل الأجنة عن الإناث المتبرعات ، وإجراء الحقن المجهري للتركيبات الجينية في البيضة الملقحة ، ونقلها جراحيا إلى قنوات البيض للإناث الحوامل الزائفة. نتيجة لذلك ، من الضروري الحفاظ على عدد كبير من ، بما في ذلك الإناث المانحة ، والذكور الذين تم قطع القناة الدافقة ، والإناث الحوامل الزائفة. بالإضافة إلى ذلك ، فإن عزل البيضة الملقحة يستلزم القتل الرحيم للإناث المتبرعات. لذلك ، يفضل استخدام البروتوكولات التي تقلل من استخدام ، بما يتماشى مع مبادئ 3Rs (الاستبدال ، التخفيض ، التحسين) 3.

توفر التطورات في تقنية التثقيب الكهربائي ، مثل استخدام نظام Nepa21 ، فرصة فريدة لتوليد فئران جينية مستهدفة بالضربة القاضية في خطوة واحدة باستخدام تقنية تعرف باسم تحرير الجينوم المحسن عبر توصيل الأحماض النووية لقناة البيض (I-GONAD) 4. يستخدم Super Electroporator NEPA21 Type II نظام التثقيب الكهربائي متعدد النبضات المكون من 4 خطوات ، مما يضمن كفاءة عالية للتثقيب الكهربائي مع الحفاظ على بقاء الأجنة العالية. يتضمن I-GONAD الحقن الدقيق لمكونات CRISPR-Cas (بروتين Cas9 (500-600 نانوغرام / ميكرولتر) وتوجيه الحمض النووي الريبي (80-100 نانوغرام / ميكرولتر)) في قنوات البيض للفئران الحامل بعد 0.7 أيام من الحمل ، متبوعا بالكهرباء في الجسم الحي لتوصيل هذه المكونات مباشرة إلى البيضة الملقحة5. بعد إجراء I-GONAD ، تلد الفأر الحامل صغارا مع الجين المستهدف بالضربة القاضية6،7،8. تختلف فعالية هذه الطريقة اعتمادا على الهدف المطلوب ، ولكنها يمكن مقارنتها بالتقنيات القياسية القائمة على الحقن المجهري (حوالي 50٪) 9،10. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن تكييف I-GONAD لتحرير الجينوم في الأنواع الأخرى.

تقدم هذه المقالة بروتوكولا خطوة بخطوة لتنفيذ طريقة I-GONAD لإنشاء فئران خروج المغلوب. على سبيل المثال ، تم إثبات فعاليته من خلال استهداف موضع جينوم ROSA26 على كروموسوم الفأر 6. تم اختيار هذا الموضع لأنه يخضع للنسخ التأسيسي دون ترجمة لاحقة. لذلك ، من غير المرجح أن يكون لإدخال طفرة في هذا الموضع تأثير سلبي على صحة الجراء الناتجة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

تمت الموافقة على جميع الدراسات التي أجريت على من قبل لجنة أخلاقيات البحوث الحيوانية بجامعة سانت بطرسبرغ الحكومية (الموافقة رقم 131-03-5 ، 11 أكتوبر 2022). التزمت جميع الإجراءات التزاما صارما بالمبادئ التوجيهية المبينة في دليل رعاية واستخدام المختبر. تم الحصول على الفئران CD1 الشائعة المختبرية من مركز الاستخدام الجماعي التابع لمعهد المركبات النشطة فسيولوجيا ، الأكاديمية الروسية للعلوم (IPAC RAS). تم استخدام إناث الفئران CD1 التي تتراوح أعمارها بين 2-3 أشهر (متوسط الوزن 27-30 جم) للتزاوج مع ذكور الفئران CD1 التي تتراوح أعمارها بين 2.5-4 أشهر (متوسط الوزن 35-37 جم). الكواشف والمعدات المستخدمة في هذه الدراسة مدرجة في جدول المواد.

1. تصميم الحمض النووي الريبي أحادي التوجيه (sgRNA) وإعداده للتعداء

  1. استخدم أدوات التحليل الحسابي مثل CHOPP أو SYNTHEGO Knockout Guide Design أو CRISPOR لتحديد تسلسلات sgRNA المحتملة التي تستهدف الجين المحدد محل الاهتمام.
    ملاحظة: يمكن للبرنامج تحديد تسلسلات sgRNA المحتملة في جميع أنحاء الجين بأكمله ويقترح متغيرات متعددة عند الإخراج. ستقترح هذه الأدوات أفضل خيارات sgRNA وستسمح للمستخدم بالاختيار من بين جميع المتغيرات المحددة إذا لزم الأمر. عند إجراء التحديد، ضع في اعتبارك المعايير التالية:
    1. قرب Exon: اختر التسلسلات الموجودة في exons القريبة قدر الإمكان من نقطة الطفرة المطلوبة. للحصول على نتائج أفضل ، ضع في اعتبارك الأشكال الإسوية البديلة للوصلة وحدد التسلسل المستهدف الموجود في معظم الأشكال الإسوية. ضع في اعتبارك متصفحات الجينوم (على سبيل المثال ، Ensembl) لاختيار exon بدقة.
    2. اعتبارات خارج الهدف: قم بتحليل التأثيرات المحتملة خارج الهدف باستخدام نظام تسجيل الأداة ، واختيار التسلسلات التي تعرض أقل نشاط متوقع خارج الهدف.
      ملاحظة: تعتبر الأدوات الحسابية مثل CHOPCHOP أو Synthego فعالة للغاية لتقييم القرب من exon والتأثيرات خارج الهدف ، مما يساعد على تحديد تسلسلات sgRNA المثلى لتحرير الجينوم بدقة. عند تصميم دليل الحمض النووي الريبي ، من المهم مراعاة التسلسل المحدد للجين ذي الأهمية في سلالة الفأر المستخدمة. بالنسبة لبعض سلالات الفئران (على سبيل المثال ، C57Bl و CBA و C3H) ، يتوفر التسلسل الجيني الكامل. إذا لم تكن هذه البيانات متوفرة ، فقد يكون من المستحسن إجراء تسلسل أولي للجين المستهدف في منطقة التحرير المخطط لها. قد يؤدي عدم التطابق الفردي في الحمض النووي الريبي الإرشادي ، الناجم عن تعدد الأشكال ، إلى الإضرار بكفاءة التحرير. تم استهداف موضع جينوم الفأر ROSA 26 بتسلسل sgRNA: 5'-ACTCCAGTCTTTCTAGAGA-3'.
  2. اطلب مجموعة من الاشعال لتضخيم قالب sgRNA PCR كما هو موضح في الجدول 1.
    ملاحظة: يمكن طلب gRNA في مكان آخر ، إما ك sgRNA أو ك crRNA: tracrRNA على الوجهين.
  3. إنتاج قالب dsDNA خطي.
    1. قم بإعداد المزيج الرئيسي كما هو موضح في الجدول 1. أضف البوليميراز في النهاية واحتفظ بالمزيج الرئيسي على الثلج للحفاظ على الاستقرار.
    2. قم بتشغيل PCR في ظل الظروف التالية: التمسخ الأولي: 30 ثانية عند 95 درجة مئوية ؛ 30 دورة من: 20 ثانية عند 95 درجة مئوية (تمسخ) ، 20 ثانية عند 55 درجة مئوية (صلب) ، 15 ثانية عند 72 درجة مئوية (تمديد) ؛ الاستطالة النهائية: 2 دقيقة عند 72 درجة مئوية ؛ امسك عند 4 درجات مئوية.
  4. استخدم خليط تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل في تفاعل النسخ في المختبر (IVT) أيضا.
    1. قم بإعداد مزيج IVT الرئيسي كما هو موضح في الجدول 2 واحتضانه لمدة 1.5 ساعة عند 37 درجة مئوية. استخدم جهاز تدوير حراري للتحكم المتسق في درجة الحرارة.
    2. أضف 2 ميكرولتر من DNase I واحتضن لمدة 30 دقيقة أخرى عند 37 درجة مئوية لإزالة قالب الحمض النووي.
    3. قم بتعطيل DNase I عن طريق احتضان خليط التفاعل عند 75 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
    4. تنقية الحمض النووي الريبي باستخدام كاشف TRIZOL وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة.
      ملاحظة: يجب وضع التخلص من كاشف TRIZOL و DNAse1 أو محاليله أو أي منتجات ثانوية في حاويات نفايات كيميائية مخصصة.
    5. قم بقياس تركيز الحمض النووي الريبي باستخدام مقياس الطيف الضوئي (العائد النموذجي لتفاعل واحد هو 3-5 ميكروجرام). تحقق من نسب A260 / A280 و A260 / A230. يجب أن يكون A260 / A280 2.0 على الأقل ، ويجب أن تكون نسبة A260 / A230 أيضا 2.0 على الأقل (مما يعني عدم وجود تلوث بالبروتينات أو المذيبات العضوية). قم بتخزين sgRNAs عند -80 درجة مئوية حتى الاستخدام.
  5. تحضير مزيج RNP للتعداء
    1. يتكون مزيج التعدي من مركب RNP ، وهو مزيج من بروتين Cas9 و sgRNA. اتبع هذه الخطوات لتحضير مزيج RNP:
    2. قم بتخفيف 1 M Tris-HCl (درجة الحموضة 7.5) إلى 100 ملي مولار باستخدام الماء الخالي من النوكلياز والفلتر باستخدام مرشح حقنة بحجم مسام 0.022 ميكرومتر ، وحصة في أجزاء 10 ميكرولتر ، وتخزينها في 4 درجات مئوية حتى الاستخدام.
    3. في أنبوب خال من النوكلياز ، قم بإعداد مزيج التعدي للمكونات التالية في التركيزات النهائية: 500 نانوغرام / ميكرولتر spCas9 nucleas9 ، 80 نانوغرام / ميكرولتر sgRNA ، 10 ملي مولار Tris-HCl مخفف بالماء المعالج ب DEPC.
      ملاحظة: مطلوب تركيزات عالية من مكونات مزيج RNP لضمان الكفاءة المناسبة للبروتوكول.
    4. احتضان مزيج التعداء عند 37 درجة مئوية لمدة 10 دقائق للسماح بتكوين مركب RNP.
    5. قم بتقسيم المزيج إلى أحجام صغيرة (2 ميكرولتر) مناسبة لجلسة I-GONAD واحدة.
    6. احتفظ بالحصص عند 4 درجات مئوية أثناء جلسة I-GONAD. يتم تحضير المزيج طازجا لكل جلسة تثقيب كهربائي I-GONAD للحفاظ على الاستقرار.
      ملاحظة: يجب تحضير مزيج RNP طازجا لكل جلسة I-GONAD لضمان النشاط والكفاءة الأمثل.

2. تحضير إناث الفئران لتحرير الجينوم عن طريق توصيل الحمض النووي في القناة البيضية

  1. التزاوج واختيار إناث الفئران: قم بتزاوج إناث الفئران CD1 مع ذكور الفئران CD1 ذات المنزل الواحد بين عشية وضحاها. في الصباح ، تحقق من وجود سدادات الجماع في إناث الفئران. اختر الإناث التي لديها سدادات جماع وانقلها إلى قفص جديد لمزيد من الإجراءات.
    ملاحظة: لتقليل الفسيفساء الجينية ، فإن الوقت الأمثل لتقديم البناء الجيني هو 0.7 يوم بعد التزاوج في مرحلة الخلية المفردة (البيضة الملقحة)10. هذا يتوافق تقريبا مع الساعة 16:00 مساء في اليوم الذي تم فيه اكتشاف سدادة الجماع. في هذه المرحلة ، يكشف تشريح قناة البيض أن البيضة الملقحة تحتوي على عدد أقل من الخلايا الركامية ، على الرغم من أنها تبقى في الأمبولة. والجدير بالذكر أن الخلايا الركامية يمكن أن تمتص أيضا الأحماض النووية الخارجية أو البروتينات أثناء التثقيب الكهربائي. إذا تم تنفيذ الإجراء في وقت مبكر ، على سبيل المثال ، بعد 10 ساعات من التزاوج ، فإن الخلايا الركامية لا تزال تحيط بالبيضة الملقحة بإحكام ، مما قد يعيق التوصيل الكهربائي الفعال للأحماض النووية إلى البيضات الملقحة. لا تستخدم الفئران المحفزة هرمونيا ، لأنها قد تعطي عددا زائدا من البويضات ، وقد يؤدي ذلك إلى الإجهاض.
  2. تحضير الأدوات الجراحية: قم بتعقيم جميع الأدوات الجراحية المصنوعة من الفولاذ المقاوم للصدأ لضمان العقم.
  3. تخدير وتحضير الفئران: قم بوزن إناث الفئران المختارة وتخديرها عن طريق الحقن داخل الصفاق باستخدام خليط من الكيتامين (100 مجم / كجم) والزيلازين (10 مجم / كجم) (باتباع البروتوكولات المعتمدة مؤسسيا).
    1. راقب الفئران بحثا عن فقدان منعكس قرصة إصبع القدم للتأكد من التخدير الكافي. ضع الفأر المخدر على وسادة تدفئة للحفاظ على درجة حرارة الجسم أثناء العملية. حماية عيون الفأر من الجفاف أثناء التخدير عن طريق وضع مرهم بيطري.

3. الإجراء الجراحي

  1. قم بتطهير المنطقة الظهرية (الخلفية) للفأر باستخدام 70٪ إيثانول.
  2. قم بعمل شق طولي في الجلد بطول 0.7 سم في منطقة أسفل الظهر.
  3. امسح موقع الشق بقطعة قطن مبللة ب 70٪ من الإيثانول وقم بإزالة أي شعر حول الشق.
  4. قم بتمديد الشق إلى 1.3 سم عن طريق الدفع بشكل جانبي بأطراف مقص مفتوحة قليلا.
  5. قم بعمل شق صغير بعناية (0.7 سم) في الصفاق للوصول إلى تجويف البطن.
  6. قم بتمديد الشق إلى 1.1 سم عن طريق الدفع بشكل جانبي بأطراف مقص مفتوحة قليلا.
  7. حدد موقع الوسادة الدهنية المتصلة بالمبيض واسحبها برفق باستخدام الملقط حتى يظهر المبيض وقناة البيض والرحم بوضوح.
  8. قم بتثبيت وسادة الدهون في مكانها باستخدام مشبك الوعاء.
  9. تصور قناة البيض تحت مجهر مجسمة للتلاعب الدقيق (الشكل 1).
  10. قم بتحميل 2 ميكرولتر من مزيج الحقن في شعرية بلاستيكية باستخدام ماصة متجرد.
    ملاحظة: يمكن أن يدعم ماصة المتجرد المزود بالشعيرات الدموية البلاستيكية ، المصممة في الأصل للتلاعب بالأجنة في عيادات التلقيح الاصطناعي ، تطبيقات متعددة ، بما في ذلك نقل الأجنة وتسليم بناء CRISPR / Cas9 في إجراءات I-GONAD. يعمل الماصة كموزع سائل دقيق. بالاقتران مع الشعيرات الدموية المرنة التي يمكن التخلص منها ، فإنه يسمح بالعقم ويمنع التلوث المتبادل. تفضل الشعيرات الدموية البلاستيكية على الزجاج لحقن مزيج RNP للتعداء في قناة البيض ، لأنها أقل صدمة للأنسجة الحساسة. على عكس الشعيرات الدموية الزجاجية ، لا تتطلب الشعيرات الدموية البلاستيكية التي تستخدم لمرة واحدة تلميعا باللهب لتنعيم الحواف الحادة قبل الإدخال ، مما يقلل من وقت التحضير وخطر التلف.
  11. باستخدام مقص دقيق ، قم بعمل شق صغير (0.2 سم) في جدار قناة البيض على بعد بضعة ملليمترات من الأمبولة.
  12. أدخل ماصة المتجرد بعناية مع الشعيرات الدموية البلاستيكية في الشق وطرد مزيج الحقن في قناة البيض.
    ملاحظة: تأكد من عدم دخول الهواء إلى قناة البيض ، لأن ذلك قد يؤثر على كفاءة التثقيب الكهربائي.
    لمنع ذلك ، املأ الشعيرات الدموية البلاستيكية بالحقن بمزيج حقن أكثر من اللازم وتجنب الحقن الكامل. الشعيرات الدموية البلاستيكية مناسبة لكل من نقل infundibulum والتشريح المباشر لجدار قناة البيض بين infundibulum و ampulla. قد تكون طريقة تشريح جدار قناة البيض المباشر أقل صدمة من نقل إنفونديبولوم لأن الأخير يتطلب شقا أوليا من خلال غشاء الجراب الرقيق الذي يغطي قناة البيض وإنفونديبولوم. في الفئران CD1 ، يكون هذا الغشاء شديد الأوعية الدموية ، وقد يتسبب قطعه في حدوث نزيف طفيف ، مما قد يعيق الرؤية ويعقد الحقن المجهري لمزيج RNP.
  13. قم بإزالة الشعيرات الدموية البلاستيكية برفق من قناة البيض.

4. التثقيب الكهربائي والخياطة

  1. قم بتشغيل المثقاب الكهربائي عن طريق الضغط على المفتاح الموجود على اللوحة الأمامية.
  2. تعيين معلمات التثقيب الكهربائي: نبض التثقيب: الجهد: 50 فولت ، طول النبض: 5 م ، فاصل النبض: 50 مللي ثانية ، عدد النبضات: 3 ، معدل الاضمحلال - 10٪ ، القطبية: +/- ؛ نبض النقل: الجهد: 10 فولت ، طول النبض: 50 مللي ثانية ، الفاصل الزمني للنبض: 50 مللي ثانية ، عدد النبضات: 3 ، معدل الاضمحلال - 40٪ ، القطبية: +/- ؛ الحد الحالي: في الجسم الحي.
  3. باستخدام الأقطاب الكهربائية من نوع الملقط ، أمسك قناة البيض بعناية وتحقق من قيمة المقاومة بالضغط على زر kΩ الموجود على المثقب الكهربائي. تأكد من ضغط الأقطاب الكهربائية بشكل كاف بحيث تظل المقاومة ضمن النطاق الأمثل من 350-400 Ω.
    ملاحظة: يمكن تحقيق ذلك عن طريق ضبط المسافة بين القطبين عندما تكون قناة البيض السليمة محصورة بينهما.
    1. مباشرة بعد قياس المقاومة ، اضغط على زر البدء لبدء التثقيب الكهربائي. هذه الخطوة ضرورية لضمان التوصيل الفعال لمكونات CRISPR-Cas إلى البيضاتالبيقحة 4. انتظر حتى يعرض الزر Ω إشارة "إنهاء". اكتب القيم المعروضة في إطار القياسات.
      ملاحظة: يجب أن تكون قيمة المعاوقة حوالي 250-400 Ω / 150-250 مللي أمبير من قيمة الجهد لضمان التوازن الأمثل بين الجدوى وكفاءة النقل. للحفاظ على هذا التوازن ، تجنب تغطية مناطق قناة البيض بقطعة من الورق المبلل المبللة في محلول ملحي معدل بالفوسفات (DPBS) من Dulbecco ، موصى به في بعض البروتوكولات ، حيث يمكن أن تقلل هذه الخطوة بشكل كبير من المقاومة إلى ما وراء النطاق الأمثل. يمكن أن تؤدي المقاومة المنخفضة إلى رفع الجهد إلى أكثر من 250 مللي أمبير ، مما يؤدي إلى موت الخلايا.
  4. بعد الانتهاء من التثقيب الكهربائي على قناة بيض واحدة ، ضع الجهاز التناسلي بحذر مرة أخرى في تجويف البطن. خياطة الشق باستخدام خياطة جراحية 4-0 حمض البولي جليكوليك.
  5. كرر العملية والتثقيب الكهربائي على قناة البيض الثانية. بمجرد الانتهاء ، أعد الجهاز التناسلي إلى تجويف البطن وخيط الشق كما هو موضح أعلاه.
  6. مراقبة ما بعد الإجراء: ضع الماوس في قفص دافئ (37 درجة مئوية) ونظيفا للتعافي وراقبه حتى يتعافى تماما من التخدير.
    ملاحظة: بعد الجراحة ، ضع الفئران في أقفاص تحتوي على فأرين لكل قفص. إذا خضع فأر واحد فقط لعملية جراحية ، فقم بتزويدها بأنثى مصاحبة. تساعد هذه الممارسة على تقليل الإجهاد غير الضروري للفأر الجراحي وتعزز بيئة اجتماعية أكثر طبيعية.

5. التنميط الجيني

  1. تصميم التمهيدي
    1. للتنميط الجيني ، صمم بادئات لتضخيم منتج تفاعل البوليميراز المتسلسل يتراوح طوله بين 300-600 نقطة أساس. يجب أن يتراوح طول البادئات من 18 إلى 21 نيوكليوتيد مع درجة حرارة انصهار (Tm) تبلغ حوالي 60 درجة مئوية.
    2. تجنب التسلسلات التي تشكل هياكل ثانوية أو ثنائيات أولية. استخدم أدوات برمجية مثل PerlPrimer 1.1.2111 أو In-Silico PCR V39x1 أو ما شابه ذلك لضمان جودة التمهيدي.
    3. قم بإجراء بحث BLAST مقابل قاعدة بيانات جينوم الفأر لتأكيد خصوصية التمهيدي وتجنب التضخيم غير المحدد11.
      ملاحظة: تم تصميم البادئات التالية للتنميط الجيني للتسلسل المستهدف: التمهيدي الأمامي: 5'-CTCTCCCAAAGTCGCTGA-3'; التمهيدي العكسي: - 5'-TCTGTGGGAAGTCTTGTCCC-3 '، طول منتج PCR المتوقع: 320 نقطة أساس ، و Tm 62 درجة مئوية. بالنسبة لتسلسل Sanger ، صمم برايمر تسلسل يلدن 150-200 نقطة أساس بعيدا عن موقع قطع Cas9.
  2. إجراء استخراج الحمض النووي. لاستخراج الحمض النووي السريع ، فإن بروتوكول عزل Hotshot12 هو أبسط بروتوكول.
    1. باستخدام لكمة الأذن ، اجمع جزءا صغيرا من الأنسجة (حوالي 2 مم) من أذن الفأر.
    2. أضف 100 ميكرولتر من محلول التحلل (25 ملي مولار هيدروكسيد الصوديوم ، 0.2 ملي EDTA ، الرقم الهيدروجيني = 12).
    3. احتضن عند 95 درجة مئوية لمدة 60 دقيقة ، مع تحريك الخليط كل 20 دقيقة.
    4. أضف 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت المحايد (40 ملي مولار Tris-HCl ، الرقم الهيدروجيني = 5) والدوامة جيدا.
    5. استخدم 1-5 ميكرولتر من المستحضر النهائي ل PCR.
  3. تضخيم وتسلسل تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR). قم بإعداد المزيج الرئيسي لتفاعل البوليميراز المتسلسل كما هو موضح في الجدول 3. استخدم تدقيق دقيق بوليميراز الحمض النووي لضمان دقة عالية. قم بإضافة المزيج الرئيسي إلى العدد المطلوب من الأنابيب وإضافة الحمض النووي الجيني.
    ملاحظة: قم دائما بتضمين عينة DNA من النوع البري كعنصر تحكم لتحليل التسلسل.
  4. قم بتشغيل تفاعل البوليميراز المتسلسل للتنميط الجيني ROSA26 . تم استخدام الشروط التالية: التمسخ الأولي: 30 ثانية عند 95 درجة مئوية ؛ 28 دورة من: 20 ثانية عند 95 درجة مئوية (تمسخ) ، 20 ثانية عند 62 درجة مئوية (صلب) ، 20 ثانية عند 72 درجة مئوية (تمديد) ؛ الاستطالة النهائية: 2 دقيقة عند 72 درجة مئوية ؛ امسك عند 4 درجات مئوية.
    ملاحظة: البروتوكول المقدم دقيق لتضخيم جزء موضع ROSA26 (الحجم المقدر 320 نقطة أساس) باستخدام البادئات من الخطوة 1.1.2. للحصول على تضخيم أكثر تحديدا ودقة ، حدد عدد دورات التضخيم إلى 28-30.
  5. التسلسل والتحليل
    1. إجراء تسلسل Sanger لشظايا PCR التي تم الحصول عليها (الخطوة 5.4).
    2. تحليل نتائج التسلسل
      ملاحظة: سيؤدي التعدي الناجح إلى فسيفساء ، يمكن التعرف عليها من خلال ظهور تسلسلات DNA إضافية بالقرب من موقع قطع النوكلياز في مخطط الكروماتومات التسلسلي. استخدم الأدوات الحسابية مثل EditCo ICE Analysis أو TIDE13 لتحديد وتحديد الأجزاء الدقيقة في الجينوم.
      1. لاستخدام تحليل ICE ، ما عليك سوى تحميل ملفات تسلسل Sanger التي تم الحصول عليها (ملف التحكم .ab1 لتسلسل منتج PCR بالماوس مع عدم وجود تحرير وتجربة ملف .ab1 لتسلسل منتج PCR للماوس التجريبي) ، وأدخل تسلسل RNA الإرشادي ، وحدد النوكلياز المستخدم في تجربة CRISPR.
        ملاحظة: ستقوم أداة تحليل ICE بحساب كفاءة التحرير الإجمالية، وتحديد ملفات التعريف والوفرة النسبية لجميع أنواع التعديلات المختلفة الموجودة في العينة.
      2. لاستخدام TIDE ، أدخل تسلسل RNA الدليل ، وقم بتحميل ملفات تسلسل Sanger التي تم الحصول عليها (ملف التحكم .ab1 لتسلسل منتج PCR للماوس مع عدم وجود تحرير وملف تجريبي .ab1 لتسلسل منتج PCR للماوس التجريبي) ، وتحقق من المعلمات (في بعض الحالات ، يمكن أن تساعد الإعدادات المتقدمة في العثور على indels أكبر من 10 نقطة أساس).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

إذا نجح التثقيب الكهربائي ، فستقوم الفئران التجريبية بما يلي: (1) تلد حفنة من الجراء ، و (2) سيكون لبعض إندلات مختلفة في الجينوم. إذا كانت بادئات التنميط الجيني مصممة جيدا ، وكان برنامج تفاعل البوليميراز المتسلسل هو الأمثل ، فسيكون منتج تفاعل البوليميراز المتسلسل موجودا على هلام الاغاروز كشريط واحد واضح بالحجم المطلوب. إذا نجح النوكلياز في قطع الحمض النووي المستهدف ، فمن المحتمل أن تكون التي تم الحصول عليها عبارة عن فسيفساء ولديها مجموعة من الإنديلات في الجينوم. تم استخدام الأدوات الحساب...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

كفاءة توليد الفئران بالضربة القاضية باستخدام طريقة I-GONAD قابلة للمقارنة مع تلك الخاصة بتقنيات الحقن المجهري التقليدية. ومع ذلك ، فإن الطرق التقليدية تتضمن عزل البيضة الملقحة عن الإناث المتبرعات ، وإجراء الحقن المجهري ، وزرع الأجنة في قنوات البيض للإناث الحوامل الزائفة. في المقابل ، تعمل طريقة I-GONAD على تبسيط هذه العملية عن طريق توصيل مكونات تحرير الجينوم مباشرة إلى قنوات البيض للإناث الحوامل ، مما يلغي الحاجة إلى عزل البيضة الملقحة وزرعها. يسلط البروتوكول المقدم الضوء على فعالية طريق...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

يعلن أصحاب البلاغ عدم وجود تضارب في المصالح.

شكر وتقدير

يعرب المؤلفون عن امتنانهم لمجمع أبحاث جامعة سانت بطرسبرج ، مركز التقنيات الجزيئية والخلوية. تم إجراء التسلسل باستخدام محلل جيني ABI 3500 xL (Thermo Fisher Scientific ، الولايات المتحدة الأمريكية) في مركز موارد التقنيات الجزيئية والخلوية ، الحديقة العلمية بجامعة ولاية سانت بطرسبرغ. يعرب المؤلفون عن امتنانهم لماريا روبيل لمساعدتها في تحرير الوثائق وتقديمها. تم تمويل هذا البحث من قبل جامعة سانت بطرسبرغ الحكومية ، معرف المشروع البحثي: 129658320 ، وتم دعم Luibov Shkodenko من قبل المؤسسة العلمية الروسية (المشروع 25-26-00247).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
0.5– 5 uL pipette ثيرمو ساينتفيك4642020
أنبوب 1.5 ملأبتاكا1003/G
100-1000 ميكرو لتر معصمة ثيرمو ساينتفيك4642090
أنبوب 200 ميكرولترأكسجينPCR-02-C
20-200 ميكرو لتر مقطع ثيرمو ساينتفيك4642080
2-20 ميكرولتر مقطع ثيرمو ساينتفيك4642060
صبغة تحميل الجل 4xبيولابميكسD-3002
أغاروزAppliChemA8963,0500
DNase I، خال من RNase (1 U/μ L)ثيرمو فيشرEN0521
مجموعة dNTP، محلول 100 مللي مولثيرمو ساينتفيكR0181
بوليميراز دريم تاك الأخضر للحمض النووي (5 U/μ L)ثيرمو ساينتفيكEP0713
دولبيكو' s محلول ملحي مخزن بالفوسفات معدلسيغما ألدريتشD8537
تحليل EditCo ICEhttps://ice.editco.bio/#/تم الوصول إليه في 04.06.2025
محلول EDTA 0.5M، الرقم الهيدروجيني = 8AppliChemA4892,0500
الفرقة  https://www.ensembl.org/index.htmlتم الوصول إليه في 09.06.2025
إيثيديوم بروميدبيولابميكسEtBr-10
قطرات جل العين " أوفتاجيل"URSAPHARM204604
نظام التوثيق الجيلي ChemiDoc XRS+بيو-راد1708265
In-Silico PCR V39x1 https://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgPcr  تم الوصول إليه في 09.06.2025
تقنيات الحمض النووي المتكاملة https://eu.idtdna.comتم الوصول إليه في 09.06.2025
المقص الجراحي الدقيقيمدين أورالM124
معطر NEPA21 الكهربائينيبا جينNEPA21مع قطب CUY652P2.5X4
مجموعة NTP، محلول 100 مللي مولثيرمو ساينتفيكR0481
الأوليجونكليوتيداتإيفروجينالترتيب المباشر، تنقية إزالة الأملاح القياسية
أوبتي-مم I متوسط مصل مخفضثيرمو فيشر31985070
بيرل برايمرhttps://perlprimer.sourceforge.netالإصدار 1.1.21.
بوليميراز DNA عالي الدقة Phusion (2 U/μ L)ثيرمو ساينتفيكF530L
رؤوس الماصة بحجم 10 ميكرولترأولبلاستHT-10-960
رؤوس الماصة بحجم 1000 ميكرولترأولبلاستHT-1000-576
أطراف الماصة بحجم 200 ميكرولترأولبلاستHT-200-960
مصدر الطاقة " إلف-4"تقنية الحمض النوويPS-400 نيو
ماء خال من RNAse/DNAseإنفيتروجين10977049
محلول ملحيبانإيكوP011n
نظام الرحلان الكهربائي الهوريزونتالي SE-1هيليكونSE-1
هيدروكسيد الصوديومسيغما-ألدرتشS5881-500G
سلم الحمض النووي Step100بيولابميكسS-8100
المجهر المجسم SMZ1000نيكون5-363376
ماكينة الجرد الدقيقةكوبر سريجاليكالMXL3-STR
نصائح للراقصينأوريجيوMXL3-125
الإبرة الجراحية  KMIZ4A1- 0,6&x; 20
خياطة الملقطمدين أورالM302.2
خياطة الملقطمدين أورالM303
خياطة الخيط POLYCON Nfigure-materials-10تونزوس 95234
تصميم دليل SYNTHEGO Knockout https://design.synthego.com/#/تم الوصول إليه في 09.06.2025
مضخم T100بيوراد10014822
بوليميراز T7 RNA  ثيرمو ساينتفيكEP0111
مخزن TBE 10xبيولابميكسTBE-500
تايد  https://tide.nki.nl/تم الوصول إليه في 04.06.2025 
تريس هيدروكلوريدجامعة سوتشو ياكو للعلومSYS-S0005-0.5
محلول هيدروكلوريد تريزماسيغما ألدريتشT2663
واشع تريزولإنفيتروجين15596026
بروتين TrueCut Cas9إنفيتروجينA36499
المقص الشاملمدين أورالM147
زيلازينInterchemie Werken de AdelaarIX2
زوليتيلمختبر فيرباك2000443714739.00

المراجع

  1. Fujihara, Y., Ikawa, M. CRISPR/Cas9-Based Genome Editing in Mice by Single Plasmid Injection. Methods Enzymol. 546, 319-336 (2014).
  2. Zuo, E., et al. One-step generation of complete gene knockout mice and monkeys by CRISPR/Cas9-mediated gene editing with multiple sgRNAs. Cell Res. 27 (7), 933-945 (2017).
  3. Hubrecht, R. C., Carter, E. The 3Rs and humane experimental technique: Implementing change. Animals. 9 (10), 754(2019).
  4. Kobayashi, Y., et al. Modification of i-GONAD suitable for production of genome-edited C57BL/6 inbred mouse strain. Cells. 9 (4), 957(2020).
  5. Takabayashi, S., et al. Successful i-GONAD in mice at early zygote stage through in vivo electroporation three minutes after intra-oviductal instillation of CRISPR-ribonucleoprotein. Int J Mol Sci. 23 (18), 10678(2022).
  6. Sato, M., et al. Sequential i-GONAD: An improved in vivo technique for CRISPR/Cas9-based genetic manipulations in mice. Cells. 9 (3), 546(2020).
  7. Kessler, S., et al. A multiple super-enhancer region establishes inter-TAD interactions and controls Hoxa function in cranial neural crest. Nat Commun. 14 (1), 3242(2023).
  8. Kaneko, T., Tanaka, S. Improvement of genome editing by electroporation using embryos artificially removed cumulus cells in the oviducts. Biochem Biophys Res Commun. 527 (4), 1039-1042 (2020).
  9. Gurumurthy, C. B., et al. Creation of CRISPR-based germline-genome-engineered mice without ex vivo handling of zygotes by i-GONAD. Nat Protoc. 14 (8), 2452-2482 (2019).
  10. Ohtsuka, M., et al. i-GONAD: A robust method for in situ germline genome engineering using CRISPR nucleases. Genome Biol. 19 (1), 25(2018).
  11. Marshall, O. J. PerlPrimer: Cross-platform, graphical primer design for standard, bisulphite and real-time PCR. Bioinformatics. 20 (15), 2471-2472 (2004).
  12. Truett, G. E., et al. Preparation of PCR-quality mouse genomic DNA with hot sodium hydroxide and Tris (HotSHOT). BioTechniques. 29 (1), 52-54 (2000).
  13. Brinkman, E. K., Van Steensel, B. Rapid quantitative evaluation of CRISPR genome editing by TIDE and TIDER. CRISPR Gene Editing. 1961, 29-44 (2019).
  14. Imai, Y., Tanave, A., Matsuyama, M., Koide, T. Efficient genome editing in wild strains of mice using the i-GONAD method. Sci Rep. 12 (1), 13821(2022).
  15. Iwata, S., et al. Simple and large-scale chromosomal engineering of mouse zygotes viain vitro and in vivo electroporation. Sci Rep. 9 (1), 14713(2019).
  16. Abe, M., et al. A novel technique for large-fragment knock-in animal production without ex vivo handling of zygotes. Sci Rep. 13 (1), 2245(2023).
  17. Meyer-Dilhet, G., Courchet, J. In utero cortical electroporation of plasmids in the mouse embryo. STAR Protocols. 1 (1), 100027(2020).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

9

مقالات ذات صلة