Method Article

تقنية فرز الخلايا السرطانية المنتشرة عالية الإنتاجية القائمة على الموائع الدقيقة وتقنية تسلسل الخلية الواحدة

DOI:

10.3791/68708

⸱

November 14th, 2025

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Urology, Ren Ji Hospital, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine, 2Shanghai Jiao Tong University School of Medicine, 3Institute of Molecular Medicine, Ren Ji Hospital, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تعتبر الخلايا السرطانية المنتشرة (CTCs) أمرا بالغ الأهمية لدراسة تطور السرطان والورم الخبيث. تقدم هذه المقالة بروتوكولا متكاملا عالي الإنتاجية لتخصيب CTC وتسلسل CTC أحادي ، مما يحسن كفاءة الالتقاط ونقاء CTC مع تقليل تكاليف التلوث والتسلسل ، وبالتالي تطوير أبحاث الأورام الدقيقة والتطبيقات السريرية.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تعمل الخلايا السرطانية المنتشرة (CTCs) كمؤشر حيوي واعد لتتبع ورم خبيث للسرطان وتطوره وتكراره. أظهرت تقنيات الخزعة السائلة التي تركز على اكتشاف CTC إمكانات كبيرة نظرا لطبيعتها غير الغازية وقدرتها على توفير مراقبة ديناميكيات الورم في الوقت الفعلي. ومع ذلك ، فإن تحليلات CTC السائبة التقليدية تفشل في التقاط عدم التجانس الجوهري بين مجموعات CTC ، مما يحجب رؤى مهمة في بيولوجيا الورم. يتيح تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية (scRNA-seq) توصيفا عالي الدقة لعدم تجانس CTC ، مما يوفر فرصا جديدة لعلم الأورام الدقيق والدراسات الميكانيكية لتطور الورم. على الرغم من هذه المزايا ، تميل المنهجيات الحالية لتسلسل CTC أحادي إلى المعاناة من أوجه القصور ، بما في ذلك معدلات الاسترداد المنخفضة ، وسير العمل كثيف العمالة ، ومخاطر التلوث المرتبطة بخطوات المناولة اليدوية المتعددة. لمعالجة هذه القيود ، نقدم بروتوكولا متكاملا للموائع الدقيقة يدمج إثراء CTC وتنقيته وتسلسل الخلية المفردة في سير عمل موحد. تستخدم الطريقة الالتقاط المغناطيسي الذي يتم التحكم فيه ديناميكيا داخل شريحة هيكلية من عظم السمكة ، حيث يتيح خلط الدوامة وربط الخرزة المغناطيسية المناعية التراكمي عزل CTC قوي وعالي الإنتاجية مع الحد الأدنى من تلف الخلايا. يزيل التنقية اللاحقة باستخدام شريحة الموائع الدقيقة المغلفة بالأجسام المضادة للكريات البيض الخلايا غير المستهدفة بشكل فعال ، مما يزيد من تعزيز نقاء CTC من خلال الانتقاء السلبي. أخيرا ، تسهل شريحة التسلسل أحادية الخلية عالية الدقة ، المصممة بناء على مبادئ مقاومة التدفق التفاضلي ، الالتقاط الفعال للخلية الواحدة والاقتران مع الميكروبيدات المشفرة بشكل فريد. تتغلب هذه المنصة الجديدة على قيود الأساليب القائمة على التوزيع من Poisson ، مما يحسن استخدام CTC مع تقليل استهلاك الميكروبيدات وتكاليف التسلسل. يعزز بروتوكولنا المتكامل بشكل كبير كفاءة التقاط CTC ونقاوته وإنتاجية تسلسل الخلية الواحدة ، مما يجعله مناسبا تماما للتطبيقات السريرية وأبحاث السرطان على نطاق واسع. من خلال تمكين تحليل أكثر دقة وقابلية للتطوير لعدم تجانس CTC ، فإن هذه الطريقة لديها القدرة على تحسين التشخيص المبكر للسرطان ، ومراقبة العلاج ، والدراسات الميكانيكية للورم الخبيث ، مما يؤدي في النهاية إلى تطوير مجال الأورام الدقيقة.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ورم خبيث الورم هو عملية معقدة ومتعددة المراحل تبدأ بالانتشار ثم تخضع للسكون والاستعمار بواسطة الخلايا السرطانية داخل الورم الأساسي. تغزو هذه الخلايا تدريجيا من خلال الغشاء القاعدي إلى الأنسجة العميقة ، وبالتالي تنتقل إلى الأوعية الدموية أو اللمفاويات. بمجرد دخولها إلى الدورة الدموية ، تصبح هذه الخلايا خلايا سرطانية منتشرة (CTCs) ، والتي يمكن أن تنتقل إلى الأعضاء البعيدة1. يعد ظهور CTCs خطوة حاسمة في الشلال النقيلي ، لأنها تعمل كبذور للورم الخبيث البعيد1. في السنوات الأخيرة ، حظيت تقنية الخزعة السائلة القائمة على CTC باهتمام كبير نظرا لمزاياها ، بما في ذلك الطبيعة غير الغازية والمريحة للإجراء ، فضلا عن القدرة على المراقبة الديناميكية في الوقت الفعلي. تسهل هذه التقنية التقييم الدقيق والشامل في الوقت الفعلي لبيولوجيا الورم ، مما يوفر مزايا فريدة في مراقبة فعالية العلاج ، والتنبؤ بالتكرار ، وتوجيه العلاج2،3،4. علاوة على ذلك ، أظهرت الدراسات أن CTCs موجودة في الدم المحيطي حتى أثناء مراحل عبء الورم المنخفض ، مثل السرطان المبكر أو ورم خبيث مبكر أو تكرار5،6. وبالتالي ، تتغلب الخزعة السائلة CTC على قيود خزعات الأنسجة التقليدية ، والتي تقتصر على الأورام الصلبة التي يمكن اكتشافها بالتصوير7. يوفر منظورا جديدا ودعما تقنيا للتشخيص المبكر للسرطان ، ومراقبة التكرار والورم الخبيث ، وإرشادات العلاج ، بالإضافة إلى توضيح آليات بدء الورم وتطوره والورم الخبيث. على سبيل المثال ، ثبت أن عدد CTCs في الدم المحيطي يعمل كمؤشر مستقل لكل من البقاء على قيد الحياة بدون تقدم والبقاء على قيد الحياة بشكل عام لدى مرضى السرطان ، مع ارتفاع عدد CTC يشير إلى سوء التشخيص8. ترتبط التغييرات الديناميكية في أعداد CTC ارتباطا وثيقا أيضا بتطور المرض وعبء الورم بعد العلاج9،10.

سلطت الدراسات الحديثة الضوء على التقنيات القائمة على الموائع الدقيقة كأدوات تحويلية لعزل سرطانات الكربون الكربونية. يمكن تصنيف هذه التقنيات على نطاق واسع إلى مناهج فيزيائية وبيولوجية ، ويقدم كل منها مزايا مميزة أثناء مواجهة تحديات محددة. تعتمد الطرق المستندة إلى الفيزياء على الاختلافات في الحجم وقابلية التشوه لفصل CTCs ، مما يتيح الفرز الخالي من الملصقات مع إنتاجية عالية. ومع ذلك ، فإن استراتيجية الفصل غير المحددة هذه قد تضر بكل من كفاءة الالتقاط والنقاء بسبب عدم التجانس المتأصل في CTCs. على سبيل المثال ، لو وآخرون أبلغوا عن شريحة موائع دقيقة دمجت تصميم فصل التركيز وتقليل السرعة مع مصفوفات المصيدة ، والتي تفوقت على معظم التقنيات التقليدية القائمة على الفيزياء من حيث تخصيب وتنقية CTC11. ومع ذلك ، حققت الشريحة استنفادا فقط من 3-4 لوغاريتما لخلايا الدم البيضاء (WBCs) ، والتي لا تزال غير كافية للتطبيقات السريرية. من ناحية أخرى ، توفر استراتيجيات عزل CTC القائمة على التقارب المناعي عادة معدل استرداد الخلايا المستهدفة ونقائها أعلى. ومع ذلك ، فإن التفاعل الملزم بين جزيئات الالتقاط و CTCs غالبا ما يحد من إنتاجية هذه الأساليب12،13. وفقا لذلك ، فإن طريقة العزل التي توازن بين كفاءة التخصيب العالية والإنتاجية ضرورية للمعالجة الفعالة للعينات السريرية مع مجموعات CTC النادرة.

علاوة على ذلك ، فإن عدم التجانس الكبير بين CTCs يشكل تحديا كبيرا للتحليلات النهائية10،14،15 ، حيث أن تحليلات CTC السائبة التقليدية غالبا ما تحجب الفروق الخلوية الفردية. يسهل تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية (scRNA-seq) التوصيف الشامل على المستوى الجزيئي لعدم تجانس التعبير الجيني ل CTC ، مما يوفر نظرة ثاقبة حول تصنيف وحالة ووظيفة CTCs. تقدم هذه التقنية طرقا جديدة لطب الأورام الدقيق وتسهل البحث في آليات بدء الورم وتطوره ورم خبيث16. على سبيل المثال ، فان وآخرون أنشأ أطلس نسخ أحادي CTC من مواقع الأوعية الدموية المختلفة في مرضى سرطان الخلايا الكبدية ، مما يكشف عن عدم التجانس المكاني بين CTCs ويحدد الوسطاء الرئيسيين للتهرب المناعي17. في الوقت نفسه ، Miyamoto et al. حدد الطفرات الجينية لمستقبلات الأندروجين ومتغيرات لصق في CTCs لمرضى سرطان البروستاتا ، وبالتالي توضيح الآليات الكامنة وراء مقاومة الأدوية18.

ومع ذلك ، فإن تطوير تسلسل النسخ أحادي CTC يتقدم ببطء. تعاني المنهجيات الحالية من أوجه قصور في الأتمتة والتكامل ، مما يؤدي إلى انخفاض كفاءة استرداد CTC ، والإجراءات المعقدة ، ومعدلات نجاح تجريبية منخفضة19. على سبيل المثال ، تتطلب البروتوكولات الحالية عملية متسلسلة تتضمن تخصيب CTC ، والتنقية ، وعزل الخلية الواحدة ، وتضخيم الحمض النووي. يتم تنفيذ هذه الخطوات في أنابيب طرد مركزي منفصلة ، مما يستلزم خطوات متعددة للسحب والنقل لا تقلل الإجراءات كثيفة العمالة من الكفاءة فحسب ، بل تزيد أيضا من خطر فقدان CTC والتلوث20. الأساليب التقليدية ، مثل انتقاء الخلايا القائمة على الشعيرات الدموية ، تحد من الإنتاجية والكفاءة التحليلية أثناء عزل الخلية الواحدة21. علاوة على ذلك ، فإن الطرق التقليدية مقيدة أيضا بتوزيع بواسون ، وهي ظاهرة إحصائية تصف التغليف العشوائي للخلايا. ينتج عن هذا نسبة عالية من القطرات الفارغة أو خلايا متعددة لكل قطرة ، مما يحد من كفاءة الالتقاط. لمواجهة هذه التحديات ، طور الباحثون رقائق موائع دقيقة متكاملة لتحليل النسخ CTC أحادي الخلية. تعمل هذه المنصات على دمج خطوات متعددة في سير عمل أحادي الرقاقة ، مما يقلل من مخاطر التلوث ويحسن الكفاءة التحليلية. على سبيل المثال ، Euisik Yoon et al. طور طريقة Hydro-Seq ، والتي تستخدم اختيار الحجم القائم على ديناميكيات السوائل لعزل CTCs في غرف دقيقة وإقران CTCs الفردية بكفاءة مع الميكروبيدات المشفرة بشكل فريد22. يتيح هذا النهج تحليلا أحادي الخلية متوازيا عالي الإنتاجية لمراكز الكربون السرطانية المتعددة. ومع ذلك ، تعتمد هذه الطريقة على فصل CTC القائم على الحجم ، والذي غالبا ما يؤدي إلى انخفاض نقاء CTC وإنتاجية محدودة (10 ميكرولتر / دقيقة) ، مما يجعلها غير مناسبة لمعالجة العينات السريرية ذات الحجم الكبير. لذلك ، هناك حاجة ملحة لتطوير نظام تحليل CTC أحادي الخلية متكامل وعالي الإنتاجية ومنخفض الحجم ومقاوم للتلوث.

هنا ، نصف بروتوكولا عالي الإنتاجية وفعال لإثراء CTC وتسلسل الخلية المفردة ، والذي يتألف من ثلاثة مكونات رئيسية: فرز CTC ، والتنقية ، وشريحة تسلسل أحادية الخلية (الشكل 1). تم تصميم رقاقة الموائع الدقيقة لفرز CTC بناء على مبدأ قوى الالتقاط المغناطيسي المنظمة ديناميكيا (الشكل 2 أ). إنه يتيح إثراء CTC عالي الإنتاجية من خلال خلط الدوامة داخل بنية عظم السمكة ، بالإضافة إلى الالتقاط التراكمي بواسطة الخرز المغناطيسي المناعي. يتم تحقيق الإطلاق غير المدمر لسرطانات الكربون الكربونية لاحقا من خلال التعديل الدقيق للمجال المغناطيسي. ثم يتم استخدام شريحة تنقية ، حيث يتم استخدام القنوات الدقيقة المغلفة بالأجسام المضادة للكريات البيض للاختيار السلبي ، مما ينتج عنه سرطانات سرطانية الكربون عالية النقاء (الشكل 2 ب). أخيرا ، تم استخدام منصة معالجة أحادية الخلية عالية الكفاءة تعتمد على مقاومة التدفق التفاضلي ، مما أدى بنجاح إلى التغلب على قيود توزيع بواسون وتمكين الاقتران والالتقاط الفعال للمحيط المجهري أحادي الخلية / المشفر (الشكل 3 أ). إنه يعزز بشكل كبير استخدام CTC مع تقليل استهلاك الميكروبيدات وتكاليف التسلسل.

figure-introduction-1
الشكل 1: تخطيطي لفرز CTC القائم على الموائع الدقيقة وتقنية التسلسل أحادي الخلية. يوضح سير العمل هذا العملية التي تنفصل بها الخلايا السرطانية عن آفات الورم ، وتدخل مجرى الدم ، وتشكل CTCs. تتم معالجة عينات الدم المحيطي أو الطلاوة التي تحتوي على CTCs بالتتابع من خلال التقاط CTC ، والتنقية ، ورقائق scRNA-seq ، مما يتيح في النهاية تسلسل النسخ وتحليل المعلوماتية الحيوية ل CTCs. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. الطريقة 1: عزل CTC القائم على الموائع الدقيقة

  1. تصنيع رقاقة متعرجة (HB-chip)
    1. تحضير القالب الرئيسي
      1. حضري رقاقة سيليكون نظيفة واخبزيها على حرارة 135 درجة مئوية طوال الليل لإزالة الرطوبة. بعد التبريد إلى درجة حرارة الغرفة ، عالج الرقاقة باستخدام منظف بلازما الأكسجين بقوة 150 واط لمدة 1 دقيقة لتنشيط السطح.
      2. قم بتصميم الطبقة الأولى من الشريحة لتشكيل مصفوفة أعمدة دعم (28 عمودا × 7 صفوف ، مرقمة من # 1 إلى # 28 على طول اتجاه التدفق) باستخدام مقاومة الضوء SU-8. اضبط أداة طلاء الدوران لتعمل بالتتابع عند 500 دورة في الدقيقة لمدة 10 ثوان ، و 2350 دورة في الدقيقة لمدة 55 ثانية ، و 500 دورة في الدقيقة لمدة 10 ثوان. تأكد من ارتفاع هذه الطبقة 50 ميكرومتر.
      3. اخبزي الطبقة الأولى على حرارة 65 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة ، تليها 95 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة لتبخر المذيب. تبرد إلى درجة حرارة الغرفة.
      4. قم بتعريض الطبقة الأولى باستخدام قناع ضوئي بتصميم عمود الدعم المقابل. اضبط جرعة التعرض على 130 مللي جول / سم2.
      5. قم بإجراء الخبز بعد التعرض عند 65 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة ، متبوعا ب 95 درجة مئوية لمدة 6 دقائق.
      6. بعد التبريد ، قم بتوزيع مطور SU-8 على سطح الرقاقة لإزالة مقاومة الضوء غير المتشابكة والحصول على الطبقة السفلية. اتركه في البركة لمدة 30 ثانية ، ثم اشطفه بالماء منزوع الأيونات.
      7. قم بتغطية طبقة SU-8 الثانية أعلى الطبقة الأولى باستخدام نفس معلمات الدوران كما في الخطوة 1.1.1.2. قم بتصميم الطبقة الثانية لتشكيل هياكل متعرجة بزاوية 45 درجة على جدار القناة ، بعرض أخدود 100 ميكرومتر ، ودرجة 200 ميكرومتر ، وستة حواف لكل دورة. تأكد من أن ارتفاع هذه الطبقة هو أيضا 50 ميكرومتر.
        ملاحظة: تم توفير رسم تخطيطي يوضح جميع الأبعاد ذات الصلة لميزات البنية المجهرية (بما في ذلك مصفوفة أعمدة الدعم وأخاديد عظم السمكة) في الشكل التكميلي 1.
      8. اخبزي الطبقة الأولى على حرارة 65 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة ، تليها 95 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة لتبخر المذيب. تبرد إلى درجة حرارة الغرفة.
      9. كشف الطبقة الثانية باستخدام قناع ضوئي بتصميم متعرجة. اضبط جرعة التعرض على 130 مللي جول / سم2.
      10. قم بإجراء الخبز بعد التعرض عند 65 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة ، متبوعا ب 95 درجة مئوية لمدة 6 دقائق.
      11. بعد التبريد ، استخدم مطور SU-8 لإزالة المناطق غير المتشابكة والكشف عن البنية المجهرية الكاملة المكونة من طبقتين.
    2. إعداد نسخة متماثلة من PDMS
      1. قم بصياغة خليط PDMS عن طريق الجمع بين البوليمر المسبق والرابط المتشابك بنسبة وزن 10: 1. تحضير 10-15 مل من الخليط لشريحة واحدة.
      2. صب الخليط في القالب الرئيسي وتخلص من الهواء المحبوس عن طريق التفريغ. عالج PDMS عن طريق وضع القالب في فرن على حرارة 95 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
      3. قم بإزالة نسخة PDMS المتماثلة المعالجة من القالب. قم بإنشاء مدخل واحد ومخرج واحد باستخدام مثقب PDMS بقطر 1 مم.
    3. تجميع رقاقة HB
      1. اضبط منظف بلازما الأكسجين على قوة 150 واط لمدة 3 دقائق. قم بتنشيط الأسطح عن طريق معالجة كل من نسخة PDMS المتماثلة وطبقة PDMS المستعبدة مسبقا على شريحة زجاجية نظيفة.
        ملاحظة: نظرا لوفرة روابط Si-O في سلاسل بوليمر PDMS ، يتيح تنشيط البلازما الترابط التساهمي بين PDMS والركائز مثل الزجاج والسيليكون ، وبالتالي تسهيل ختم الرقائق.
      2. قم بمحاذاة هياكل PDMS المعالجة واربطها معا بإحكام. تأكد من أن مجموعة أعمدة الدعم وميزات عظم السمكة مدمجة تماما مع الركيزة الزجاجية لإنهاء رقاقة HB.
  2. تحضير الخرز المغناطيسي المناعي (IMBs)
    1. احتضان 25 ميكرولتر من الخرزات المغناطيسية المعدلة بالستربتافيدين المغسولة والمعاد تعليقها (SA-MBs) (1 ميكرومتر) (≈4 × 108 حبات لكل مل) مع 1 ميكروغرام من الجسم المضاد EpCAM (جزيء التصاق الخلايا الظهارية) البيوتينيل في درجة حرارة الغرفة مع الدوران عند 20 دورة في الدقيقة لمدة 40 دقيقة لتحضير IMBs.
    2. بعد الفصل المغناطيسي على رف مغناطيسي ، قم بإزالة المادة الطافية وأعد تعليق الخرزات في 25 ميكرولتر من المخزن المؤقت للعزل (1٪ BSA ، 2 ملي EDTA ، D-PBS).
  3. عملية رقاقة العزل
    1. ماصة 20 ميكرولتر من تعليق الخرزة المغناطيسي في غضون 1-2 ثانية ، مما يضمن عدم إدخال فقاعات هواء.
    2. ضع الرقاقة عموديا على الفور على مغناطيس واترك الخرزات تستقر لمدة 5 دقائق دون إزعاج.
    3. اجمع عينة الدم (عينات الدم المحيطية أو عينات الطلاوة التجريبية) واسحب على الفور 4 مل في حقنة ، مما يضمن إزالة فقاعات الهواء. أغلق مدخل ومخرج الرقاقة بالسائل للتخلص من فقاعات الهواء. أدخل أنابيب مدخل ومخرج العينة في الشريحة.
      ملاحظة: تأكد من وجود تدابير الحماية الشخصية الأساسية عند التعامل مع العينات البيولوجية.
    4. حقن العينة بواسطة مضخة حقنة بمعدل تدفق 1.5 مل / ساعة.
    5. بعد تحميل العينة ، قم بحقن 60 ميكرولتر من D-PBS في رقاقة HB بمعدل تدفق 0.2 مل / ساعة لغسل الخلايا غير المرتبطة.
    6. قم بإزالة المغناطيس وحقن 1.5 مل يدويا من BSA (5٪ وزن / حجم في D-PBS) لغسل الرقاقة وتحرير الخلايا السرطانية التي تم التقاطها من رقاقة HB.

2. الطريقة 2: تنقية CTC القائمة على الموائع الدقيقة

  1. تعديل رقاقة HB
    1. قم بإعداد محلول (3-ميركابتوبروبيل) تريميثوكسيسيلان (MPTS) في الإيثانول بجزء حجمي (حجم/حجم) بنسبة 10٪. أدخل على الفور 20 ميكرولتر من محلول MPTS إلى رقاقة HB واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة.
    2. اشطفيه مرة واحدة بالإيثانول اللامائي وجففيه عند 100 درجة مئوية لمدة 1 ساعة.
    3. قم بإعداد محلول N-γ-maleimidobutyryl-oxysuccinimide ester (GMBS) في الإيثانول بتركيز 0.5 مجم / مل. قم بتبريد الرقاقة إلى 37 درجة مئوية ، وأدخل محلول GMBS ، واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة.
      ملاحظة: عند استخدام MPTS و GMBS ، ارتد دائما قفازات ومعطف مختبر وقناع. تمتلك هذه الكواشف خصائص سامة ومهيجة للغشاء المخاطي ويجب التعامل معها بعناية في منطقة جيدة التهوية.
    4. اشطفيه مرتين باستخدام ddH2O ، متبوعا بشطفتين باستخدام D-PBS.
    5. أضف على الفور 15 ميكروغرام / مل ستريبتافيدين (SA) ، واحتضنه في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة أو طوال الليل عند 4 درجات مئوية.
    6. اشطفيه مرتين باستخدام D-PBS.
    7. قم بإعداد المخزن المؤقت للأجسام المضادة CD45: 0.2٪ (وزن / حجم) BSA و 20 ميكروغرام / مل من الجسم المضاد CD45 البيوتينيل ، مخفف إلى الحجم باستخدام D-PBS.
    8. حقن 20 ميكرولتر من المخزن المؤقت للأجسام المضادة CD45 في شريحة HB للاختيار السلبي لخلايا الدم البيضاء. احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة ، ثم اشطفها باستخدام D-PBS.
    9. أضف محلول حجب يحتوي على 3٪ (وزن / حجم) BSA و 0.05٪ (وزن / حجم) Tween-20 ، احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة. اشطفها باستخدام D-PBS قبل تحميل العينة.
  2. تحميل العينة
    1. استنشق العينة باستخدام حقنة ، مع ضمان إزالة فقاعات الهواء. أغلق مدخل ومخرج الرقاقة بالسائل للتخلص من فقاعات الهواء. أدخل أنابيب مدخل ومخرج العينة في الشريحة.
    2. قم بحقن العينة بواسطة مضخة حقنة واضبط معدل التدفق على 0.6 مل / ساعة.
    3. اجمع الخلايا السرطانية المنقاة من المخرج للعد وتسلسل الخلية الواحدة.

3. الطريقة 3: تقنية الترميز الشريطي والتسلسل أحادية الخلية القائمة على Microwell

  1. تحضير الكواشف والمواد
    1. المعالجة المسبقة للرقاقة
      1. أضف 200 ميكرولتر من محلول 1x D-PBS و 0.5٪ F-68 إلى مدخل الرقاقة.
      2. أداء صوتنة حمام الماء مع عقد شريحة. عندما تكون الفقاعات مرئية عبر المنطقة الصغيرة التي يسهل اختراقها بأكملها ، استمر في الصوتنة لمدة 30 ثانية لإزالة الفقاعات من الآبار المزدوجة.
    2. إعداد الخرز الباركود
      1. امزج جيدا محلول مخزون الخرز المغناطيسي المشفر جيدا وانقل 200 ميكرولتر إلى أنبوب الطرد المركزي. ضع الفصل المغناطيسي حتى يتضح المحلول ، وتخلص من المادة الطافية.
      2. اغسل الخرزات المشفرة مرتين باستخدام 500 ميكرولتر من TE-TW (10 ملي مولار Tris-HCl pH = 8.0 ، 1 ملي EDTA ، 0.01٪ Tween-20).
      3. اغسل وأعد تعليق الخرزات المشفرة في 200 ميكرولتر من 20x TE (10 ملي مولار Tris-HCl pH = 7.5 ، 1 ملي مولار EDTA) و 50 ملي مولار محلول DTT ، ثم ضعه على الثلج.
    3. تحضير تعليق أحادي الخلية
      1. نقل الخلايا السرطانية المنقاة إلى أنبوب طرد مركزي سعة 1.5 مل وجهاز طرد مركزي عند 400 × جم لمدة 3 دقائق في درجة حرارة الغرفة. اغسل وأعد تعليق الحبيبات في 1 مل من 1x D-PBS.
      2. قم بإجراء عد الخلايا وإعداد معلق الخلية المفردة وفقا لذلك. يجب أن يكون حجم تحميل العينة 200 ميكرولتر ، بإجمالي 80,000 خلية (400 خلية / ميكرولتر).
    4. قم بإعداد المخزن المؤقت لتحلل الخلية ، والذي يتضمن 1x سترات الصوديوم المالحة (SSC) ، و 0.5 M LiCl ، و 0.6٪ Triton X-100 ، و 10 mM EDTA ، و 5 mM DTT ، و 1 مثبط U / μL RNase.
  2. عملية رقاقة الموائع الدقيقة
    1. التقاط الخلية
      1. حقن 200 ميكرولتر من معلق الخلية السرطانية في الرقاقة (60000 بئر مزدوج) ، ثم رجها عند 10 دورات في الدقيقة على شاكر مزيل اللون لمدة 5 دقائق للسماح للخلايا بالاستقرار في آبار الالتقاط عن طريق الجاذبية.
      2. قم بسحب تعليق الخلية برفق في الرقاقة لأعلى ولأسفل مرتين. بعد ذلك ، ضع الشريحة على شاكر مزيل اللون بسرعة 10 دورات في الدقيقة لمدة 5 دقائق لإعادة تعليق الخلايا غير الملتقطة والسماح لها بالاستقرار مرة أخرى.
      3. أضف 200 ميكرولتر من محلول 1x D-PBS و 0.5٪ F-68 من خلال المدخل واستنشاق المحلول من المخرج. كرر مرتين ليصبح المجموع ثلاث غسلات للرقاقة.
    2. التقاط حبة باركود
      1. أعد تعليق تعليق حبة الباركود ، ثم قم على الفور بحقن 200 ميكرولتر من المعلق في الرقاقة من خلال المدخل. رج العبوة عند 10 دورات في الدقيقة لمدة 20 ثانية.
      2. قم بماصة تعليق الخرزة برفق مرتين ، ثم رجها عند 10 دورات في الدقيقة لمدة 20 ثانية. كرر هذه الخطوة مرة واحدة.
      3. اسحب معلق الخرزة المشفر من المخرج ، وأضف 200 ميكرولتر من محلول 20x TE (الرقم الهيدروجيني = 7.5) و 50 ملي مولار DTT ، ثم اسحب السائل من المخرج. كرر هذه الخطوة مرتين ، ليصبح المجموع ثلاث غسلات.
    3. تحلل الخلايا والتقاط mRNA
      1. أضف ببطء 200 ميكرولتر من مخزن تحلل الخلية إلى الرقاقة من خلال المدخل. بعد ذلك مباشرة ، أضف ببطء 200 ميكرولتر من الزيت المعدني لإغلاق الآبار المزدوجة.
        ملاحظة: يجب أن يتم الختم على الفور لمنع التلوث.
      2. قم بإزالة المحلول المتدفق من مخرج الرقاقة إلى خزان النفايات. ضع الشريحة أفقيا واتركها في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق.
    4. استعادة الخرز المشفر
      1. بعد التحلل ، أضف ببطء 200 ميكرولتر من 6x SSC من خلال المدخل ، وقم بإزالة سائل النفايات ، واستنشق المحلول المتبقي من مخرج الرقاقة.
      2. أضف ببطء 200 ميكرولتر من 6x SSC لملء الشريحة. أمسك مغناطيسا بالقرب من سطح الرقاقة وانقله ببطء من المدخل إلى المخرج لجمع الخرز المشفرة من آبار الالتقاط. بعد ذلك ، قم بشفط المحلول بسرعة بالإضافة إلى الخرز المشفر من الرقاقة في أنبوب طرد مركزي محمل مسبقا ب 6x SSC.
      3. اغسل ثلاث مرات بسعة 200 ميكرولتر من 6x SSC، متبوعا مرة واحدة باستخدام مخزن مؤقت 1x RT (انظر جدول المواد).
  3. النسخ العكسي (RT) ، وعلاج نوكلياز خارجي I ، و PCR
    1. RT
      1. أعد تعليق الخرزات المشفرة في 100 ميكرولتر من مزيج تفاعل النسخ العكسي ، الذي يحتوي على 1× مخزن مؤقت RT ، و 1 ملي مولار GTP ، و 1 ملي مولار dNTP ، و 5٪ PEG 8000 ، و 2.5 ميكرومتر من مفتاح القالب Oligo (انظر جدول المواد) ، و 1 مثبط RNase ، و 10 U / μL النسخ العكسي. احتضان المحلول عند 42 درجة مئوية لمدة 120 دقيقة.
    2. معالجة نوكلياز خارجي
      1. بعد النسخ العكسي ، اغسل الخرزات مرة واحدة ب 200 ميكرولتر من 1x TE-SDS (10 ملي مولار Tris-HCl pH = 8.0 ، 1 ملي EDTA ، 0.5٪ SDS) ، مرة مع 200 ميكرولتر من 1x TE-TW ، ومرة مع 200 ميكرولتر من 10 ملي Tris-HCl (الرقم الهيدروجيني = 8.0).
      2. أعد تعليق الخرزات في 100 ميكرولتر من مزيج نوكلياز خارجي ، يحتوي على 1x نوكلياز خارجي I Buffer و 1 U / μL Exonuclease I ، واحتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 45 دقيقة.
    3. توليف الخيط الثاني
      1. اغسل الخرزات مرة واحدة ب 200 ميكرولتر من 1x TE-SDS. أعد تعليق الخرزات في 200 ميكرولتر من 0.1 M هيدروكسيد الصوديوم واحتضان لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة مع الدوران عند 30 دورة في الدقيقة لإبطال طبيعة المنتج الهجين mRNA-cDNA. ثم اغسل الخرزات مرة واحدة ب 200 ميكرولتر من 1x TE-TW ومرة ب 200 ميكرولتر من 10 ملي Tris-HCl (الرقم الهيدروجيني = 8.0).
      2. أعد تعليق الخرزات في 100 ميكرولتر من مزيج التفاعل ، الذي يحتوي على 1x RT buffer ، و 1 ملي مولار dNTP ، و 5٪ PEG 8000 ، و 0.5 ميكرومتر من التمهيدي لتخليق الخيوط الثانية (انظر جدول المواد) ، و 0.125 وحدة / ميكرولتر من جزء كلينو. احتضن المحلول عند 37 درجة مئوية لمدة 60 دقيقة.
    4. تضخيم (كدنا)
      1. اغسل الخرزات مرة واحدة ب 200 ميكرولتر من 1x TE-SDS ، ومرة ب 200 ميكرولتر من 1x TE-TW ، ومرة واحدة ب 200 ميكرولتر من 10 ملي Tris-HCl (الرقم الهيدروجيني = 8.0).
      2. أعد تعليق الخرزات في 150 ميكرولتر من مزيج تفاعل البوليميراز المتسلسل بما في ذلك 1x PCR Reaction Mix و 0.8 ميكرومتر من oligo ISPCR (انظر جدول المواد). اضبط برنامج PCR على النحو التالي: 95 درجة مئوية لمدة 3 دقائق ؛ أربع دورات من 98 درجة مئوية لمدة 20 ثانية ، و 65 درجة مئوية لمدة 30 ثانية ، و 72 درجة مئوية لمدة 3 دقائق ؛ ثماني دورات من 98 درجة مئوية لمدة 20 ثانية ، و 67 درجة مئوية لمدة 20 ثانية ، و 72 درجة مئوية لمدة 3 دقائق ؛ 72 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
      3. قم بتنقية منتج تفاعل البوليميراز المتسلسل مرتين باستخدام حبات مغناطيسية 0.6x لتثبيت الطور الصلب القابل للانعكاس (SPRI) لتنقية الحمض النووي وفقا لتعليمات الشركة المصنعة وقم بتخزينها في 20.5 ميكرولتر من H2O. قم بقياس تركيز منتج تفاعل البوليميراز المتسلسل المنقى باستخدام مقايسة القياس الكمي للحمض النووي القائم على التألق.
      4. قم بإجراء تضخيم ثان لمنتج تفاعل البوليميراز المتسلسل المنقى باستخدام مزيج تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل يحتوي على مزيج تفاعل تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل 1x و 0.8 ميكرومتر من قلة ISPCR (انظر جدول المواد). اضبط برنامج PCR على النحو التالي: 98 درجة مئوية لمدة 3 دقائق ؛ خمس دورات من 98 درجة مئوية لمدة 20 ثانية ، و 67 درجة مئوية لمدة 20 ثانية ، و 72 درجة مئوية لمدة 3 دقائق ؛ 72 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
      5. قم بتنقية منتج تفاعل البوليميراز المتسلسل مرتين باستخدام حبات مغناطيسية 0.6x SPRI لتنقية الحمض النووي وفقا لتعليمات الشركة المصنعة وقم بتخزينها في 20.5 ميكرولتر من H2O. قم بقياس تركيز منتج تفاعل البوليميراز المتسلسل المنقى باستخدام مقايسة الحمض النووي القائمة على التألق23.
    5. بناء مكتبة (كدنا)
      1. قم ببناء المكتبة باستخدام مجموعة إعداد مكتبة الحمض النووي القياسية (انظر جدول المواد) وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
      2. قم بتضخيم المكتبة بواسطة PCR باستخدام زوج التمهيدي N70X / P5 (انظر الجدول التكميلي). اضبط برنامج PCR على النحو التالي: 72 درجة مئوية لمدة 3 دقائق ؛ 98 درجة مئوية لمدة 30 ثانية ؛ اثنتا عشرة دورة من 98 درجة مئوية لمدة 15 ثانية ، و 58 درجة مئوية لمدة 30 ثانية ، و 72 درجة مئوية لمدة 3 دقائق ؛ 72 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
      3. قم بتنقية المكتبة بحبيبات مغناطيسية 0.6x SPRI لتنقية الحمض النووي وفقا لتعليمات الشركة المصنعة وقم بإخماد 20 ميكرولتر من H2O. قم بقياس تركيز منتج PCR المنقى باستخدام مقايسة القياس الكمي للحمض النووي القائم على التألق.
        ملاحظة: بشكل عام ، يعتبر تركيز مكتبة الحمض النووي النهائي البالغ ≥ 2 نانوغرام / ميكرولتر وكمية إجمالية قدرها ≥ 50 نانوغرام مقبولا24.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يمكن تقييم تجميع وإطلاق واجهة التقاط CTC عن طريق الفحص المجهري. يشير التوزيع المنتظم للحبات المغناطيسية (MBs) في الجزء السفلي من شريحة HB تحت مجال مغناطيسي إلى التجميع الناجح ، بينما يؤكد الحد الأدنى من MBs المتبقية أو معدومة التحرير الناجح (الشكل 2C). هذه الخطوة ضرورية لتحديد إنتاجية ونقاء مركبات الكربون الملتقطة. للتحقق من كفاءة الالتقاط لشريحة عزل CTC ، أجرينا تجربة تصاعد. تم رفع عدد صغير من الخلايا السرطانية ذات التعبير العالي عن EpCAM (PC3 أو LNCaP) إلى PBS يحتوي على عدد كبير من خلايا Jurkat ، والتي تظهر تعبيرا منخفضا عن EpCAM ، مما يحاكي وجود خلايا دم وفيرة في الدورة الدموية. التقطت شريحة عزل CTC الخلايا السرطانية بكفاءة من عينات 1 مل و 10 مل ، مما يدل على قدرتها العالية على فرز CTC عالية الإنتاجية والفعالة (الشكل 2 د). لتقييم خصوصية الالتقاط المستند إلى IMB ، استخدمنا شريحة تحكم معدلة باستخدام SA-MBs تفتقر إلى اقتران الأجسام المضادة EpCAM. أكد عدم وجود التقاط كبير للخلايا السرطانية خصوصية عزل CTC بوساطة IMB (الشكل 2 د).

بالإضافة إلى كفاءة الالتقاط ، يعد النقاء معلمة مهمة أخرى لتقييم منصات عزل CTC. قارنا نقاء الخلايا السرطانية المعزولة باستخدام شريحة الالتقاط أو رقاقة التنقية وحدها ، بالإضافة إلى النقاء الذي تم تحقيقه من خلال الاختيار الإيجابي والسلبي المتسلسل (الشكل 2E). حسنت كلتا الشريحتين بشكل كبير نقاء الخلايا السرطانية مقارنة بالمجموعة الضابطة ، مما يدل على فعاليتهما في عزل الخلايا السرطانية السرطانية. والأهم من ذلك ، أن الاستخدام المشترك لكل من الاختيار الإيجابي والسلبي زاد من نقاء وإنتاجية الخلايا السرطانية مقارنة باستخدام طريقة واحدة.

لمزيد من التقييم لأداء رقائق التقاط وفرز CTC في البيئات السريرية ، جمعنا عينات الدم المحيطي (PB) من ستة متبرعين أصحاء وأجرينا تجارب تصاعد. نظرا للوفرة المنخفضة للغاية من الخلايا السرطانية السرطانية في العينات السريرية ، تم رفع ما يقرب من 500-1000 خلية LNCaP في كل 10 مل من عينة PB. كانت أعداد كرات الدم البيضاء في جميع عينات PB التي تم جمعها ضمن المعدل الطبيعي (4-10 × 106 خلايا / مل). أظهرت النتائج أن نظام فرز CTC حافظ على كفاءة التقاط عالية ونقاء الخلايا السرطانية ، حتى عند معالجة العينات السريرية (الشكل 2F-G ، والشكل التكميلي 2).

figure-results-1
الشكل 2: منصة التقاط وتنقية CTC ذات هيكل متعرج. (أ) سير عمل رقاقة عزل CTC. أولا ، يقوم المجال المغناطيسي المستقر و IMBs المقترنة بالأجسام المضادة EpCAM بتجميع واجهة الالتقاط. بعد ذلك ، يعزز خلط الدوامة داخل رقاقة HB كفاءة نقل الكتلة بين CTCs و IMBs ، مما يسهل الالتقاط المتراكم. أخيرا ، يتم تحقيق الإطلاق اللطيف لسرطانات الكربون السرطانية عن طريق إزالة المجال المغناطيسي. (ب) سير عمل رقاقة تنقية CTC. يتم تعديل رقاقة HB بأجسام مضادة سلبية الاختيار ، ويسهل خلط الدوامة تفاعلات الكريات البيض والأجسام المضادة ، مما ينتج عنه في النهاية CTCs عالية النقاء. شريط المقياس ، 100 ميكرومتر. (ج) يوضح التصوير المجهري التجميع الناجح وإطلاق رقاقة الالتقاط. (د) تقارن المخططات الشريطية كفاءة التقاط CTC لمنصة العزل عبر أحجام عينات مختلفة ، باستخدام SA-MBs غير الوظيفية كعنصر تحكم. أشرطة الخطأ ، تعني ± SD ، n = 3. (ه) تقارن المخططات الشريطية نقاء الخلايا السرطانية (CTCs) التي تم الحصول عليها باستخدام شريحة HB واحدة فقط مقابل تلك التي تخضع للالتقاط والتنقية المتسلسلة. تمثل المجموعة الضابطة نقاء CTC غير المعالج. أشرطة الخطأ ، تعني ± SD ، n = 3. (و) تحديد الخلايا في رقاقة عزل CTC. تم تلطيخ خلايا LNCaP ب Hoechst و Calcein AM ، بينما تم تلطيخ خلايا الدم ب Hoechst فقط. شريط المقياس ، 100 ميكرومتر. (ز) نقاء الخلايا السرطانية وكفاءة الالتقاط في تجارب الارتفاع باستخدام 1 مل أو 10 مل من الدم المحيطي. أشرطة الخطأ ، تعني ± SD ، n = 3. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

تعرضت الخلايا السرطانية المعزولة لاحقا لتسلسل خلية واحدة عالي الإنتاجية. يشتمل بروتوكولنا على نظام تشفير شريطي أحادي الخلية يتكون من 60,000 بئر صغير متداخل (الشكل 3A-B). تعمل الآبار الدقيقة السفلية ذات الشكل المربع على التقاط الخلايا الفردية ، بينما تم تصميم الآبار الصغيرة العلوية لتحميل الخرز. يبلغ طول كل بئر صغير سفلي 25 ميكرومتر في الطول والعرض والارتفاع ، وهو مناسب لمعظم أنواع الخلايا. يبلغ قطر دائرة الأضلاع للآبار السداسية العلوية وارتفاعها 50 ميكرومتر لاستيعاب الخرز الذي يتراوح عادة من 30 إلى 50 ميكرومتر. يعزز النظام كفاءة التقاط الخلايا بناء على الالتقاط التراكمي مع تجنب تضاعفات الخلايا من خلال الآبار الدقيقة لاستبعاد الحجم. لتحسين بروتوكول تحميل الخلية ، قمنا بالتحقيق في كفاءة التقاط الخلية ونسبة إشغال البئر الصغير في ظل ظروف إدخال الخلية المختلفة (الشكل 3 ج). أظهرت النتائج أن زيادة مدخلات الخلية لم تقلل من كفاءة الالتقاط. بدلا من ذلك ، عزز بشكل كبير نسبة الإشغال. بالنسبة لشريحة التقاط 60,000 بئر ، استقرت نسبة إشغال البئر الصغير عندما وصلت مدخلات الخلية إلى 80,000 ، مما لم يظهر أي زيادة أخرى مع المدخلات الإضافية. لتقليل حدوث الدوائيات بسبب التحميل المفرط للخلايا ، اخترنا 80,000 خلية كمدخل مثالي. كما هو موضح في الشكل 3D ، حققت شريحة التشفير الشريطي أحادية الخلية نسبة إشغال حبة 85.6٪ و 95.7٪ من الباركود ، مما أدى إلى معدل اقتران قدره 81.9٪. بالإضافة إلى ذلك ، تم إجراء عمليات تثبيت متعددة وفقا للبروتوكول ، مما أدى إلى تحسين كفاءة الالتقاط ومعدل الاقتران بشكل كبير من خلال تأثير الالتقاط التراكمي (الشكل 3D). والجدير بالذكر أن الاختلاف الملحوظ في نسب الإشغال بين الخلايا والخرز يعزى إلى زيادة كثافة وكتلة الخرز مقارنة بالخلايا ، مما يسمح لها بالاستقرار بكفاءة أكبر في الآبار الصغيرة تحت الجاذبية. لذلك ، في ظل ظروف التحميل المحسنة ، يعتبر معدل إشغال الاقتران البالغ حوالي 80٪ مثاليا بشكل عام.

figure-results-2
الشكل 3: تقنية التشفير الشريطي والتسلسل أحادية الخلية عالية الإنتاجية القائمة على Microwell. (أ) سير عمل بروتوكول التسلسل الفردي للجنة مكافحة الإرهاب. (ب) يوضح النسخ المجهري هياكل الآبار لالتقاط حبة أحادية الخلية / الباركودية. يتم عرض عمليات التقاط الخلايا والتقاط الخرزة واسترداد الخرز من اليسار إلى اليمين. شريط المقياس 30 ميكرومتر. (ج) توضح مخططات الخط كفاءة التقاط الخلية ونسبة إشغال البئر الصغير لشريحة الترميز الشريطي أحادية الخلية (60000 بئر مزدوج) في ظل ظروف إدخال الخلية المختلفة. (د) معدلات إشغال الخلايا والخرز الشريطي في ظل ظروف إدخال الخلية المحسنة ، جنبا إلى جنب مع نسبة الاقتران المقابلة بين الخلية والحرزة. تظهر اللوحتان اليمنى واليسرى نهج الالتقاط باستخدام محاولات تسوية متعددة وتسوية فردية فقط ، على التوالي. أشرطة الخطأ ، تعني ± SD ، n = 3. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

أخيرا ، للتحقق من صحة البروتوكول المتكامل لفرز CTC و scRNA-seq ، قمنا بخلط خلايا PC3 و LNCaP و Jurkat بنسبة تقديرية تبلغ 1: 3: 4000 وقمنا بتحميلها على رقائق الموائع الدقيقة لالتقاط الخلايا السرطانية وتنقيتها وتسلسل الخلية الواحدة. من خلال منصة عزل الخلايا السرطانية الفعالة ، حصلنا على خلايا سرطانية عالية النقاء إيجابية EpCAM (الشكل 4 ب). في الوقت نفسه ، أظهرت شريحة scRNA-seq القائمة على الموائع الدقيقة قدرة دقيقة على التنميط من نوع الخلية ، مع تصور النتائج من خلال تحليل تضمين الجار العشوائي الموزع (t-SNE) (الشكل 4 أ). لقد نجحنا في تحديد ثلاثة مجموعات خلايا متميزة ، يمكن تمييز كل منها بعلامات فريدة (الشكل 4 ج). بالإضافة إلى ذلك ، تطابقت نسب الخلايا في المخرجات النهائية بشكل وثيق مع نسب المدخلات المنقاة ، مما يؤكد أن عملية الترميز الشريطي أحادية الخلية كانت غير متحيزة وخالية من التلوث (الشكل 4 ب). تم تحديد مجموعة واحدة على أنها خلايا Jurkat بناء على التعبير المحدد ل TRBC1 و IGLL1 و CD1E و CD3D (الشكل 4 د). أكد تحليل تخصيب المسار أيضا متانة هذا التصنيف (الشكل 4E). علاوة على ذلك ، تم فصل خطي خلايا سرطان البروستاتا بشكل واضح إلى مجموعات فردية وفقا للجينات المعبر عنها بشكل تفاضلي (DEGs) (الشكل 4F-G). تميزت مجموعة PC3 بالتعبير العالي عن البروتين السميني الدقيق (MSMP) ، المعروف أيضا باسم البروتين الدقيق الذي يفرزه PC3. من ناحية أخرى ، عبرت مجموعة LNCaP بشكل فريد عن العلامات المتعلقة بالتصاق الخلية والتكاثر وتعدد القدرات ، مثل NEDD4 و CTNNA1 (α-catenin 1) و RBBP7.

figure-results-3
الشكل 4: التحقق من صحة فرز CTC وتسلسل الخلية المفردة باستخدام تجربة سبايك. (أ) مخطط t-SNE يوضح تنميط نوع الخلية للخلايا الملتقطة والمنقية. (ب) مخطط شريطي يصور نسب أنواع الخلايا الثلاثة على ثلاث مراحل: المدخلات الأولية ، وما بعد التنقية ، ومخرجات التسلسل النهائي. (ج) مخطط نقطي يوضح التعبير عن جينات العلامات الفريدة عبر مجموعات الخلايا المختلفة. (د) مستويات التعبير عن TRBC1 و IGLL1 و CD1E و CD3D عبر جميع الخلايا. (ه) تحليل إثراء مسار GO و KEGG للجينات المعبر عنها تفاضليا (DEGs) في مجموعة Jurkat. (و) أنماط التعبير عن NEDD4 و MSMP في جميع الخلايا. (ز) مخطط بركان يوضح DEGs بين مجموعات PC3 و LNCaP. تمثل النقاط الحمراء الجينات التي تم تنظيمها في PC3. تمثل النقاط الزرقاء تلك التي تم تنظيمها في LNCaP. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

ماستر ميكسالكاشفالتخفيف النهائينوع المخزن المؤقت
0.5٪ إف -68إف-680.50%المياه المعالجة DEPC
برنامج تلفزيوني1×
تي تي دبليوTris-HCl (الرقم الهيدروجيني = 8.0)10 ممالمياه المعالجة DEPC
إيدتا1 ملي
توين -200.01%
20× TE (الرقم الهيدروجيني = 7.5)Tris-HCl (الرقم الهيدروجيني = 7.5)200 مليالمياه المعالجة DEPC
إيدتا20 ملي
TE-SDSTris-HCl (الرقم الهيدروجيني = 8.0)10 ممالمياه المعالجة DEPC
إيدتا1 ملي
الحزب الديمقراطي الصربي0.50%

الجدول 1: تكوين مزيج الكاشف لإعداد تسلسل CTC الفردي. تظهر أجزاء من الكواشف المطلوبة ل scRNA-seq ، والتي يمكن تحضيرها مسبقا لتشغيل الرقاقة لضمان عملية سريعة وسلسة.

الشكل التكميلي 1: تصميم رقاقة HB. (أ) رسم تخطيطي للهيكل الموائع الدقيقة المكون من طبقتين. أعلى: الطبقة العليا تتميز ببنية متعرجة. يظهر الجزء الداخلي الموسع الهندسة التفصيلية لعظم المتعرجة ، والذي يتم توجيهه بزاوية 45 درجة بالنسبة لجدار القناة ، بعرض أخدود يبلغ 100 ميكرومتر ودرجة 200 ميكرومتر. أسفل: الطبقة السفلية تتكون من مصفوفة أعمدة دعم (28 عمودا × 7 صفوف) ، مرقمة من # 1 إلى # 28 على طول اتجاه التدفق. (ب) منظر جانبي لشريحة متعرجة. يبلغ عرض أخاديد عظم السمكة 100 ميكرومتر. يبلغ ارتفاع كل من هياكل عظم السمكة وأعمدة الدعم 50 ميكرومتر. يبلغ عرض كل عمود دعم 500 ميكرومتر وطوله 1150 ميكرومتر ، مع فجوة 550 ميكرومتر بين الأعمدة المجاورة. (د) صورة فوتوغرافية لشريحة HB المصنعة. الرجاء النقر هنا لتنزيل هذا الملف.

الشكل التكميلي 2: صورة تمثيلية تظهر الخلايا السرطانية الملطخة بالفلورسنت وخلايا الدم الموجودة في سائل النفايات الذي تم جمعه من مخرج شريحة عزل CTC. تم تلطيخ خلايا LNCaP ب Hoechst و Calcein AM ، بينما تم تلطيخ خلايا الدم ب Hoechst فقط. شريط المقياس 100 ميكرومتر. الرجاء النقر هنا لتنزيل هذا الملف.

الجدول التكميلي: تسلسل قليل النوكليوتيدات المستخدم في النسخ العكسي وإعداد المكتبة الرجاء النقر هنا لتنزيل هذا الملف.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تعمل CTCs كمؤشرات حيوية قيمة لتشخيص السرطان ، وإرشادات العلاج ، والدراسات حول بدء الورم وتطوره والورم الخبيث25. ومع ذلك ، فإن طرق عزل CTC الحالية تفشل في تحقيق كل من الكفاءة العالية والإنتاجية العالية26. بالإضافة إلى ذلك ، غالبا ما تؤدي كفاءة الإطلاق المنخفضة ل CTCs إلى نقاء منخفض وتلف عالي للخلايا ، مما يحد من توافقها مع التحليلات النهائية27. هنا ، اقترحنا بروتوكولا متكاملا لفرز CTC عالي الإنتاجية وتسلسل CTC أحادي ، يتكون من ثلاثة إجراءات رئيسية: التقاط CTC ، والتنقية ، و scRNA-seq.

توفر هذه المنصة القائمة على الموائع الدقيقة المرونة وقابلية التوسع. يمكن تعديل عدد القنوات المتوازية في رقائق HB ، بالإضافة إلى آبار الالتقاط في شريحة الترميز الشريطي ، وفقا لمتطلبات العينة المختلفة ، وبالتالي تلبية متطلبات الإنتاجية العالية. في شريحة التقاط CTC ، يمكن تحسين IMBs وفقا لنوع السرطان المحدد. على سبيل المثال ، في عينات من مرضى سرطان البروستاتا ، يمكن تشغيل IMBs بمزيج من الأجسام المضادة EpCAM و PSMA لتعزيز كفاءة الالتقاط. علاوة على ذلك ، قد يؤدي الاعتماد فقط على الالتقاط المستند إلى EpCAM إلى فقدان CTCs الوسيطة التي خضعت للانتقال الظهاري إلى اللحمة المتوسطة (EMT). لمعالجة هذه المشكلة ، يمكن دمج أجسام مضادة إضافية ضد بروتين الصدمة الحرارية 70 (HSP-70) أو الفيمنتين السطحي الخلوي (CSV) لالتقاط CTCs في مراحل EMT المختلفة.

نظرا لأن رقائق HB لالتقاط وتنقية CTC تعتمد على الموائع الدقيقة ، فإن التعامل الدقيق ضروري أثناء التجارب. قبل إدخال الكواشف في مدخل الرقاقة ، يجب إزالة جميع فقاعات الهواء ، ويمكن إغلاق كل من المدخل والمخرج للتخلص من الهواء المحبوس. بالإضافة إلى ذلك ، يجب إدخال الكواشف بسرعة (في غضون 1-2 ثانية) ، حيث يمكن لفقاعات الهواء المحاصرة أن تعيق مرور IMBs والخلايا ، مما يقلل بشكل كبير من كفاءة الالتقاط والنقاء. علاوة على ذلك ، كما ذكرنا سابقا ، فإن التوزيع الموحد ل IMBs أمر بالغ الأهمية لالتقاط CTC بنجاح. بعد تحميل IMBs ، يجب وضع الشريحة عموديا على المغناطيس وتثبيتها في موضعها لمدة خمس دقائق على الأقل لمنع التغييرات في المجال المغناطيسي من تعطيل توزيع IMB. والجدير بالذكر أنه يجب تحسين معدل تدفق تحميل الخلية المحدد في البروتوكول بناء على أنواع العينات المختلفة. على سبيل المثال ، تظهر عينات الطلاوة مستويات مرتفعة من تركيز الكريات البيض واللزوجة. إذا كان معدل التدفق سريعا جدا ، فقد يعيق التفاعلات الفعالة بين CTCs و IMBs ، مما يمنع الالتقاط المغناطيسي المتراكم وبالتالي يقلل من نقاء CTC. لتقييم أداء منصة عزل وتنقية CTC الخاصة بنا في معالجة عينات الدم السريرية ، قمنا بجمع PB من العديد من المتبرعين الأصحاء وقمنا بزيادة عدد صغير من خلايا LNCaP (حوالي 50-100 خلية لكل مل) في العينات. والجدير بالذكر أنه على الرغم من أن المنصة أظهرت كفاءة التقاط ونقاء عاليين للخلايا السرطانية في عينات PB ، إلا أن أدائها كان أقل قليلا من ذلك الذي لوحظ في عينات الخلايا القائمة على PBS (الشكل 2D ، الشكل 2E ، والشكل 2G). نتوقع أن هذا التناقض يرجع إلى ارتفاع لزوجة الدم ووجود خلايا الدم الحمراء والصفائح الدموية الوفيرة مقارنة ب PBS. لذلك ، عند التعامل مع عينات الدم السريرية ، يمكن النظر في خطوات المعالجة المسبقة مثل تحلل خلايا الدم الحمراء أو استخراج PBMC لتحسين الأداء.

على غرار رقائق HB ، تتطلب شريحة التشفير الشريطي أحادية الخلية القائمة على الموائع الدقيقة معالجة دقيقة لمنع تكون فقاعة الهواء. نظرا لتنوع الكواشف المعنية ، يمكن تحضير بعض الكواشف مسبقا قبل بدء عمليات الرقاقة (الجدول 1). عند تحميل الخلايا والخرز ، يعد التحكم الدقيق في سرعة الحقن ضروريا لضمان التوزيع المنتظم ، حيث أن الخلايا لها كثافة أقل بينما تكون الخرز الشريطي أكثر كثافة. عادة ، يجب إضافة تعليق الخلية ببطء على مدى 3 ~ 5 ثوان ، متبوعا بالإضافة السريعة لتعليق الخرزة في غضون 1 ~ 2 ثانية. بعد تحميل الخلايا والخرز ، قم بإجراء جولتين من الشفط والتوزيع ، ثم ضع الرقاقة على شاكر لإكمال عملية الالتقاط التراكمية. هذه الخطوة ضرورية لتحسين نسبة الإشغال ومعدل الاقتران. أثناء تحلل الخلية ، يتم استخدام طريقة ختم الزيت لعزل أسطح الآبار الصغيرة ، ومنع التلوث المتبادل بين الآبار. والجدير بالذكر أنه يجب إضافة الزيت المعدني مباشرة بعد التحلل دون تأخير. بعد التحلل ، يتم إجراء استرداد الخرزة المشفرة عن طريق تحريك المغناطيس ببطء من المدخل إلى المخرج لضمان معدل استرداد مرتفع للحبة. إذا لزم الأمر ، يمكن تكرار هذه الخطوة عدة مرات. أخيرا ، تخضع الخرزات المغناطيسية المستردة في أنبوب الطرد المركزي ل RT ، وتوليف الخيط الثاني ، وتضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل ، وبناء المكتبة ، متبوعا بتسلسل الجيل التالي (NGS).

تتمتع هذه المنصة المدمجة بالموائع الدقيقة بإمكانيات كبيرة للتطبيقات السريرية. من خلال تعزيز كفاءة وإنتاجية عزل CTC ، فإنه يزيد من اكتشاف CTC في مراحل عبء الورم المنخفضة ، مما يتيح إنشاء نموذج تصنيف يربط عدد CTC بتحديد مراحل الورم. يوفر هذا التقدم نهجا جديدا لتشخيص السرطان ومراقبة العلاج وتقييم التشخيص والتنبؤ بالتكرار. بالإضافة إلى ذلك ، يتيح تحليل النسخ أحادي الخلية ل CTCs تحديد السمات الجزيئية الرئيسية ، بما في ذلك مسارات الجينات الأساسية وشبكات التفاعل وجينات المؤشرات الحيوية. يوفر هذا التحليل نظرة ثاقبة للعوامل الحاسمة التي تؤدي إلى ورم خبيث مبكر للسرطان ويكشف النقاب عن الآليات الجزيئية الكامنة وراء تكوين الآفة النقيلية ، مما يوفر أهدافا علاجية محتملة للمرضى الذين يعانون من السرطان المتكرر أو النقيلي. علاوة على ذلك ، فإن هذه المنصة قابلة للتطوير بدرجة كبيرة. يمكن تكييفها لتلبية متطلبات تحليلية محددة وتوسيعها لدعم تحليلات omics المتعددة ، بما في ذلك علم النسخ وعلم الجينوم.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم دعم هذه الدراسة من قبل المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (المنحة رقم 82227801).

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
(3-ميركابتوبروبيل) تريميثوكسيسيلان سيغما ألدريتش175617-100Gحل MPTS
20&00; مخزن SSCسانغون بيوتيكB548109-0200
5×؛ مخزن RTسانغون بيوتيكB610020-0500
الأجسام المضادة وحيدة النسيلة CD45 البيوتينيليةالعلوم الحيوية الإلكترونية13-0459-82التخزين عند 2&00; C إلى 8&00; C 
الأجسام المضادة وحيدة النسيلة EpCAM البيوتينيليةالعلوم الحيوية الإلكترونية13-9326-82التخزين عند 2&00; C إلى 8&00; C 
ألبومين مصل البقر (BSA)سانغون بيوتيكA600332-0100التخزين عند 2&00; C إلى 8&00; C 
شريحة خرطوشة ديكودرأنظمة حيوية ديناميكية2203106التخزين عند 2&00; C إلى 8&00; C 
مجموعات كواشف خرطوشة ديكودرأنظمة حيوية ديناميكية2203206التخزين عند 2&00; C إلى 8&00; C 
المياه المعالجة من DEPCسانغون بيوتيكB501005-0500
D-PBSسانغون بيوتيكE607009-0500يحتوي على: NaCl 136.89 مللي مول؛ KCl 2.67 م; Na2HPO4 8.10 ملم متر؛ KH2PO4 1.47 ملم. pH=7.2-7.4 
DTTثيرمو ساينتفيكR0861التخزين عند 2&00; C إلى 8&00; C 
داينابيدز MyOne SA T1إنفيتروجين65602SA-MBs، 1 & mu; m
EDTAسانغون بيوتيكB540625-05000.5 M، pH=8.0
KAPA هاي فاي هوت ستارت ريديميكسروشKK26012×؛ مزيج تفاعل PCR
سولن لترسيب كلوريد الليثيوم.إنفيتروجينAM94800.2 & m مفلتر
إستر N-γ-ماليميدوبوتيريل-أوكسيسوكسنيميدثيرمو ساينتفيك22309حل GMBS
بلورونيك F-68سانغون بيوتيكA600749-0025
كيوبت 1&00; مجموعة اختبار dsDNA HSثيرمو ساينتفيكس33231
حل SDSسانغون بيوتيكB648118-010010٪ SDS
ستريبتافيدينسيغما ألدريتش189730التخزين عند 2&00; C إلى 8&00; C 
SU-8 فوتوريستالميكروكيمياءSU-8 3050
مجموعة سيلغارد 184 سيليكون إيلاستومرداو كورنينغ4019862
تريس-HCl (درجة الحموضة 7.5)ليجينNR00721 مول/لتر، pH=7.5، خالي من RNase
تريس-HCl (درجة حموضة 8.0)ليجينNR00731 مول/لتر، pH=8.0، خالي من الرينازيم
ترايتون X-100سانغون بيوتيكA600198-0500
مجموعة Trueprep لتحضير مكتبة الحمض النووي V2 ل Illumina فازيمTD502مجموعة تحضير مكتبة الحمض النووي
توين-20سانغون بيوتيكA600560-0500
خرز الحمض النووي النظيف ل VAHTSفازيمN411خرزات التثبيت المغناطيسي ذات الطور الصلب القابل للعكس (SPRI) لتنقية الحمض النووي

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Metastasis. Cell. 186 (8), 1564-1579 (2023).">Gerstberger, S., Jiang, Q., Ganesh, K. Metastasis. Cell. 186 (8), 1564-1579 (2023).
  2. Circulating tumor cell number as a response measure of prolonged survival for metastatic castration-resistant prostate cancer: A comparison with prostate-specific antigen across five randomized phase iii clinical trials. J Clin Oncol. 36 (6), 572-580 (2018).">Heller, G., et al. Circulating tumor cell number as a response measure of prolonged survival for metastatic castration-resistant prostate cancer: A comparison with prostate-specific antigen across five randomized phase iii clinical trials. J Clin Oncol. 36 (6), 572-580 (2018).
  3. Digital circulating tumor cell analyses for prostate cancer precision oncology. Cancer Discov. 8 (3), 269-271 (2018).">Heitzer, E., Speicher, M. R. Digital circulating tumor cell analyses for prostate cancer precision oncology. Cancer Discov. 8 (3), 269-271 (2018).
  4. Efficacy of circulating tumor cell count-driven vs clinician-driven first-line therapy choice in hormone receptor-positive, erbb2-negative metastatic breast cancer: The stic ctc randomized clinical trial. JAMA Oncol. 7 (1), 34-41 (2021).">Bidard, F. C., et al. Efficacy of circulating tumor cell count-driven vs clinician-driven first-line therapy choice in hormone receptor-positive, erbb2-negative metastatic breast cancer: The stic ctc randomized clinical trial. JAMA Oncol. 7 (1), 34-41 (2021).
  5. Combination of circulating tumor cell enumeration and tumor marker detection in predicting prognosis and treatment effect in metastatic castration-resistant prostate cancer. Oncotarget. 6 (39), 41825-41836 (2015).">Chang, K., et al. Combination of circulating tumor cell enumeration and tumor marker detection in predicting prognosis and treatment effect in metastatic castration-resistant prostate cancer. Oncotarget. 6 (39), 41825-41836 (2015).
  6. Analysis of circulating tumor cells in prostate cancer patients at psa recurrence and review of the literature. Anticancer Res. 36 (6), 2975-2981 (2016).">Grisanti, S., et al. Analysis of circulating tumor cells in prostate cancer patients at psa recurrence and review of the literature. Anticancer Res. 36 (6), 2975-2981 (2016).
  7. Liquid biopsy for cancer: Review and implications for the radiologist. Radiology. 294 (1), 5-17 (2020).">Underwood, J. J., et al. Liquid biopsy for cancer: Review and implications for the radiologist. Radiology. 294 (1), 5-17 (2020).
  8. Circulating tumor cells (ctc) detection: Clinical impact and future directions. Cancer Lett. 253 (2), 180-204 (2007).">Paterlini-Brechot, P., Benali, N. L. Circulating tumor cells (ctc) detection: Clinical impact and future directions. Cancer Lett. 253 (2), 180-204 (2007).
  9. Circulating tumor cells predict survival benefit from treatment in metastatic castration-resistant prostate cancer. Clin Cancer Res. 14 (19), 6302-6309 (2008).">De Bono, J. S., et al. Circulating tumor cells predict survival benefit from treatment in metastatic castration-resistant prostate cancer. Clin Cancer Res. 14 (19), 6302-6309 (2008).
  10. Characterising the phenotypic evolution of circulating tumour cells during treatment. Nat Commun. 9 (1), 1482(2018).">Tsao, S. C., et al. Characterising the phenotypic evolution of circulating tumour cells during treatment. Nat Commun. 9 (1), 1482(2018).
  11. A novel microfluidic device integrating focus-separation speed reduction design and trap arrays for high-throughput capture of circulating tumor cells. Lab Chip. 20 (22), 4094-4105 (2020).">Lu, C., et al. A novel microfluidic device integrating focus-separation speed reduction design and trap arrays for high-throughput capture of circulating tumor cells. Lab Chip. 20 (22), 4094-4105 (2020).
  12. Microfluidic-based technologies for ctc isolation: A review of 10 years of intense efforts towards liquid biopsy. Int J Mol Sci. 23 (4), (2022).">Descamps, L., Le Roy, D., Deman, A. L. Microfluidic-based technologies for ctc isolation: A review of 10 years of intense efforts towards liquid biopsy. Int J Mol Sci. 23 (4), (2022).
  13. All-in-one microfluidic chip for online labeling, separating, and focusing rare circulating tumor cells from blood samples followed by inductively coupled plasma mass spectrometry detection. Anal Chem. 95 (37), 14061-14067 (2023).">Xu, Y., Chen, B., He, M., Cui, Z., Hu, B. All-in-one microfluidic chip for online labeling, separating, and focusing rare circulating tumor cells from blood samples followed by inductively coupled plasma mass spectrometry detection. Anal Chem. 95 (37), 14061-14067 (2023).
  14. In situ single cell proteomics reveals circulating tumor cell heterogeneity during treatment. ACS Nano. 15 (7), 11231-11243 (2021).">Reza, K. K., et al. In situ single cell proteomics reveals circulating tumor cell heterogeneity during treatment. ACS Nano. 15 (7), 11231-11243 (2021).
  15. Nanoparticle-mediated binning and profiling of heterogeneous circulating tumor cell subpopulations. Angew Chem Int Ed Engl. 54 (1), 139-143 (2015).">Mohamadi, R. M., et al. Nanoparticle-mediated binning and profiling of heterogeneous circulating tumor cell subpopulations. Angew Chem Int Ed Engl. 54 (1), 139-143 (2015).
  16. Single-cell transcriptomic analysis of tumor heterogeneity. Trends Cancer. 4 (4), 264-268 (2018).">Levitin, H. M., Yuan, J., Sims, P. A. Single-cell transcriptomic analysis of tumor heterogeneity. Trends Cancer. 4 (4), 264-268 (2018).
  17. Dissecting spatial heterogeneity and the immune-evasion mechanism of ctcs by single-cell rna-seq in hepatocellular carcinoma. Nat Commun. 12 (1), 4091(2021).">Sun, Y. F., et al. Dissecting spatial heterogeneity and the immune-evasion mechanism of ctcs by single-cell rna-seq in hepatocellular carcinoma. Nat Commun. 12 (1), 4091(2021).
  18. RNA-seq of single prostate ctcs implicates noncanonical wnt signaling in antiandrogen resistance. Science. 349 (6254), 1351-1356 (2015).">Miyamoto, D. T., et al. RNA-seq of single prostate ctcs implicates noncanonical wnt signaling in antiandrogen resistance. Science. 349 (6254), 1351-1356 (2015).
  19. Single-cell DNA and RNA sequencing of circulating tumor cells. Sci Rep. 11 (1), 22864(2021).">Kojima, M., et al. Single-cell DNA and RNA sequencing of circulating tumor cells. Sci Rep. 11 (1), 22864(2021).
  20. A facs-based novel isolation technique identifies heterogeneous ctcs in oral squamous cell carcinoma. Front Oncol. 14, 1269211(2024).">Chauhan, A., et al. A facs-based novel isolation technique identifies heterogeneous ctcs in oral squamous cell carcinoma. Front Oncol. 14, 1269211(2024).
  21. New method for counting and picking out single circulating tumor cells from microliter-volume samples for tumor progression surveillance and single-cell heterogeneity analysis. Anal Chem. 95 (12), 5232-5239 (2023).">Yu, H., Yang, C., Tai, Q., Gao, M., Zhang, X. New method for counting and picking out single circulating tumor cells from microliter-volume samples for tumor progression surveillance and single-cell heterogeneity analysis. Anal Chem. 95 (12), 5232-5239 (2023).
  22. Hydro-seq enables contamination-free high-throughput single-cell rna-sequencing for circulating tumor cells. Nat Commun. 10 (1), 2163(2019).">Cheng, Y. H., et al. Hydro-seq enables contamination-free high-throughput single-cell rna-sequencing for circulating tumor cells. Nat Commun. 10 (1), 2163(2019).
  23. DNA qualification workflow for next generation sequencing of histopathological samples. PLoS One. 8 (6), e62692(2013).">Simbolo, M., et al. DNA qualification workflow for next generation sequencing of histopathological samples. PLoS One. 8 (6), e62692(2013).
  24. Protocol for high-quality single-cell rna-seq from tissue sections with draql. STAR Protoc. 5 (2), 103050(2024).">Ikeda, H., et al. Protocol for high-quality single-cell rna-seq from tissue sections with draql. STAR Protoc. 5 (2), 103050(2024).
  25. Circulating tumor cells from enumeration to analysis: Current challenges and future opportunities. Cancers (Basel). 13 (11), (2021).">Yang, Y. P., Giret, T. M., Cote, R. J. Circulating tumor cells from enumeration to analysis: Current challenges and future opportunities. Cancers (Basel). 13 (11), (2021).
  26. Circulating tumor cell isolation for cancer diagnosis and prognosis. EBioMedicine. 83, 104237(2022).">Deng, Z., Wu, S., Wang, Y., Shi, D. Circulating tumor cell isolation for cancer diagnosis and prognosis. EBioMedicine. 83, 104237(2022).
  27. Aptamer-based detection of circulating targets for precision medicine. Chem Rev. 121 (19), 12035-12105 (2021).">Wu, L., et al. Aptamer-based detection of circulating targets for precision medicine. Chem Rev. 121 (19), 12035-12105 (2021).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Circulating Tumor CellsMicrofluidic CTC IsolationSingle Cell SequencingLiquid BiopsyImmunomagnetic BeadsTumor Cell PurificationBarcoded MicrobeadsNegative SelectionHerringbone ChipPrecision Oncology

Related Articles