مقالة منهجية

التمثيل الغذائي المكاني متعدد الوسائط مع تصوير الطيف الكتلي الموجه بالمجهر المتوسط بالأشعة تحت الحمراء

DOI:

10.3791/68709

⸱

يوليو 25, 2025

 ,  ,  ,  ,  , 
1Institutes of Biomedical Sciences, Fudan University, 2Shanghai Xuhui Central Hospital, Zhongshan-Xuhui Hospital, 3Children's Hospital of Fudan University

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نقدم سير عمل التمثيل الغذائي المكاني متعدد الوسائط الذي يدمج تصوير قياس الطيف الكتلي (MSI) والتصوير بالأشعة تحت الحمراء المتوسطة (MIR) على نفس قسم الأنسجة لتحليل التمثيل الغذائي والكيميائي الحيوي الذي تم حله مكانيا.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

التمثيل الغذائي المكاني هو مجال سريع التطور لرسم خريطة لتوزيع المستقلبات داخل الأنسجة والأعضاء وحتى الخلايا المفردة. يوفر هذا النهج معلومات أيضية سياقية ، وهو أمر بالغ الأهمية لفهم عدم التجانس الكيميائي الحيوي للأنظمة البيولوجية. ظهر التصوير بالأشعة تحت الحمراء المتوسطة (MIR) والتصوير اللطيفي الكتلي (MSI) كأساليب قوية لعمليات التمثيل الغذائي المكانية ، ويقدم كل منها مزايا فريدة ومتكاملة. في هذه الدراسة ، نقدم سير عمل لإجراء تصوير MIR وتأين الامتصاص بالليزر بمساعدة المصفوفة MSI (MALDI-MSI) على نفس قسم الأنسجة ، بما في ذلك الإجراءات التجريبية ، والتسجيل المشترك للتصوير ، وتكامل البيانات ، وتحليل المعلوماتية الحيوية. يتم استخدام تصوير MIR كطريقة أولية ، مما يسمح بالتحليل الكيميائي الحيوي غير المدمر للأنسجة. بعد ذلك ، يتم ترسيب مصفوفة في أنسجة MALDI-MSI ، مسترشدة بالمعلومات المكانية التي تم الحصول عليها من تصوير MIR. يتم دمج الصور بعد التسجيل المشترك ، مما يتيح تحليل الأيض المكاني متعدد الوسائط باستخدام أدوات المعلوماتية الحيوية المتقدمة مثل Seurat. يمثل دمج تصوير MIR و MSI تقدما تحويليا في التمثيل الغذائي المكاني ، مما يوفر فرصا غير مسبوقة لاستكشاف التعقيد المكاني والكيميائي لعمليات التمثيل الغذائي في كل من الصحة والمرض. ينطوي هذا النهج متعدد الوسائط على إمكانات كبيرة لدفع الابتكارات في اكتشاف المؤشرات الحيوية وتشخيص الأمراض والتطوير العلاجي.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تتضمن التمثيل الغذائي المكاني رسم خرائط للمستقلبات في سياق الأنسجة الأصلية من خلال دمج تصوير قياس الطيف الكتلي (MSI) ، أو غيرها من التقنيات التي تم حلها مكانيا ، مع تحليل التمثيل الغذائي ، مما يوفر رؤى حول عملية التمثيل الغذائي بدقة الأنسجة الفرعية أو الخلوية أو تحت الخلوية1،2،3،4،5،6،7،8. من بين طرق التصوير هذه ، يكتسب الفحص المجهري بالأشعة تحت الحمراء المتوسطة (MIR) اهتماما متزايدا لقدرته على رسم خريطة كيميائية للجزيئات الحيوية بناء على التباين الاهتزازي الجزيئي4،7،9،10،11،12. تجعل الطبيعة غير المدمرة والخالية من الملصقات وعالية السرعة والفعالة من حيث التكلفة4،7،9،10،11،12 تصوير MIR مناسبا بشكل خاص للتكامل مع MSI ، مما يشكل نهجا واعدا متعدد الوسائط للتحليل المكاني الشامل.

يعد تأين الامتصاص بالليزر بمساعدة المصفوفة MSI (MALDI-MSI) أحد أكثر التقنيات استخداما في التمثيل الغذائي المكاني (الشكل 1 أ) 13. إنه يتيح الكشف عن مجموعة واسعة من المستقلبات ، بما في ذلك الدهون والأحماض الأمينية والسكريات والنيوكليوتيدات والمستقلبات الثانوية ، بحساسية عالية1. وقد أدى التقدم في اختيار المصفوفة (على سبيل المثال، حمض ثنائي هيدروكسي بنزويك 2،5 [DHB]، أو 9-أمينوأكريدين [9AA]، أو N- (1-نفثيل) إيثيلين ديامين ثنائي هيدروكلوريد [NEDC]) وتقنيات التأين (مثل طرق ما بعد التأين) إلى زيادة توسيع تغطية الكشف، لا سيما بالنسبة للأنواع منخفضة الوفرة وضعيفة التأين14. تدعم أنظمة MALDI-MSI الحديثة سرعات التصوير التي تتراوح عادة من 5 إلى 50 بكسل في الثانية ، اعتمادا على الدقة المكانية ونوع محلل الكتلة المستخدم (على سبيل المثال ، وقت الرحلة [TOF] أو أوربيتراب أو رنين سيكلوترون أيون تحويل فورييه [FT-IRC]). والجدير بالذكر أن أدوات MALDI-TOF عالية السرعة حققت معدلات تتجاوز 100 بكسل في الثانية ، مما يتيح التصوير بمساحة كبيرة في غضون ساعاتقليلة 15. تقع الدقة المكانية ل MALDI-MSI بشكل عام في حدود 5 إلى 50 ميكرومتر ، وهو ما يكفي لحل الهياكل الخلوية وحتى تحت الخلوية16،17. ومع ذلك ، فإن الدقة المكانية الأعلى تأتي عادة على حساب أوقات اكتساب أطول ، وانخفاض نسبة الإشارة إلى الضوضاء ، وزيادة المتطلبات الحسابية أثناء معالجة البيانات.

على عكس MSI ، يعد تصوير MIR نهجا بصريا واسع المجال4 ، مما يجعله بطبيعته غير مدمر وعالي الإنتاجية. تتيح التطورات الحديثة في الليزر المتتالي الكمي عالي الطاقة (QCLs) إطارا جديدا يعرف باسم التصوير بالأشعة تحت الحمراء ذات التردد المنفصل (DFIR) ، مما يزيد بشكل كبير من سرعة التصوير حتى معدل الفيديو (الشكل 1 ب) 12،18. بالإضافة إلى ذلك ، جعلت مصادر QCL كاشفات مقياس الميكروبولومتر غير المبردة قابلة للتطبيق لتصوير MIR ، مما يتيح استخدام كاشفات مصفوفة المستوى البؤري الأكبر (FPA)12. نتيجة لذلك ، يمكن الحصول على صورة MIR أحادية التردد على مساحة 1 سم2 بدقة خلوية (~ 5 ميكرومتر) في بضع ثوان فقط. يمكن أن يعمل تصوير MIR في كل من الوضعين الخالي من الملصقات ووضع التصنيفات. في الدراسات السابقة4،19،20 ، تم إدخال مجسات اهتزازية صغيرة نشطة بالأشعة تحت الحمراء لمراقبة حركية الأنشطة الأيضية المختلفة في الموقع. تتيح هذه المجسات التتبع في الوقت الفعلي لمسارات التمثيل الغذائي من خلال الإبلاغ عن التحولات الكيميائية العالمية من خلال النطاقات الطيفية MIRالفريدة 4. وبالتالي ، يوفر تصوير MIR كلا من التنميط الكيميائي الحيوي الثابت والمراقبة الأيضية الديناميكية بدقة مكانية عالية وسرعة اكتساب سريعة.

في هذه المخطوطة ، نقدم سير عمل شاملا لإجراء التمثيل الغذائي المكاني MALDI-MSI الموجه ب MIR ، مما يدل على جدوى الحصول على كلتا الطريقتين من نفس العينة (الشكل 2 ، الشكل 3). من خلال دمج تصوير MIR مع MSI ، نؤسس نهجا متعدد الوسائط يستفيد من نقاط القوة التكميلية لكل تقنية. يوفر تصوير MIR تخطيطا كيميائيا حيويا سريعا وخاليا من الملصقات للشريحة بأكملها بدقة خلوية ، ويعمل كدليل قيم لاختيار منطقة الاهتمام (ROI) في الاستحواذ اللاحق على MSI. تتيح هذه الاستراتيجية سير عمل MSI أكثر استهدافا وكفاءة، مما يقلل من وقت الاستحواذ وتكلفته، مع تعزيز قابلية التفسير والأهمية البيولوجية لبيانات التمثيل الغذائي المكاني. في المقابل ، يوفر MSI تعليقات توضيحية جزيئية مفصلة للغاية لصور MIR الفائقة الطيفية ، مما يتيح فهما أعمق للكيمياء الحيوية للأنسجة. بشكل عام ، ينطوي هذا النهج المتكامل على إمكانات كبيرة لتعزيز اكتشاف المؤشرات الحيوية وتشخيص الأمراض والتطوير العلاجي.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم إجراء البروتوكول وفقا لبروتوكول التجارب الحيوانية (DSF-2024-004) المعتمد من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدامه (IACUC) التابعة لمركز الموارد الحيوانية المختبرية في جامعة فودان.

ملاحظة: توفر هذه الدراسة سير عمل لإجراء تصوير MIR و MALDI-MSI على نفس قسم الأنسجة. يشمل هذا النهج المتكامل الإجراءات التجريبية ، والتسجيل المشترك للصور ، ودمج البيانات ، وتحليل المعلوماتية الحيوية النهائية (الشكل 1 ج). يتم استخدام تصوير MIR كطريقة أولية ، مما يتيح رسم خرائط كيميائية حيوية غير مدمرة وخالي من الملصقات للأنسجة. مسترشدا بالمعلومات المكانية من تصوير MIR ، يتم تطبيق مصفوفة لاحقا للحصول على MALDI-MSI. بعد التسجيل المشترك الدقيق ، يتم دمج مجموعات البيانات للتحليل المشترك متعدد المتغيرات (الشكل 4) ، مما يتيح التمثيل الغذائي المكاني الشامل من خلال أدوات حسابية متقدمة.

1. تحضير العينة

  1. تحضير عينة الأنسجة
    1. جمع أنسجة الفئران
      1. فئران House C57BL / 6J (20 أسبوعا ، 40 جم) في ظل ظروف محددة خالية من مسببات الأمراض (SPF) ، يتم الحفاظ عليها في دورة ضوء / ظلام مدتها 12 ساعة ، ومزودة بإمكانية الوصول إلى الطعام والماء لضمان الصحة المثلى قبل التجربة.
      2. تخدير الفأر عن طريق الحقن داخل الصفاق من الصوديوم البنتوباربيتال بجرعة 50 مجم / كجم من وزن الجسم لضمان التخدير العميق. راقب وتأكد من عدم وجود ردود أفعال الدواسة والقرنية قبل الشروع في التروية.
      3. قم بنشر ما يقرب من 20-30 مل من PBS البارد الذي يحتوي على الهيبارين (5 وحدة دولية / مل) عبر البطين الأيسر عند ضغط متحكم فيه يبلغ 150 مم زئبق لمدة 6 دقائق لطرد الدم وإخراج العضو قبل الإزالة.
      4. قم بإخماد جميع الأنسجة المجمعة على الفور بالنيتروجين السائل وتخزينها عند -80 درجة مئوية لمزيد من التحليل.
        ملاحظة: التجميد السريع ضروري لمنع تكوين بلورات الجليد ، والتي يمكن أن تشوه مورفولوجيا الأنسجة.
    2. تضمين الأنسجة والتقطيع بالتبريد
      1. اضبط الميكروتوم على -20 درجة مئوية وقم بتطهير الغرفة والشفرة بالإيثانول (EtOH) للتخلص من وسط التضمين المتبقي. اسمح لشرائح CaF2 وبريد الشرائح وحامل العينة وعينة الأنسجة بالتوازن داخل ناظم التبريد.
      2. تقليم الأنسجة إلى حوالي 5 مم × 5 مم × 3 مم. قم بتضمينه في 10٪ جيلاتين داخل CROMOLD قياسي عند -20 درجة مئوية ، مما يضمن التوجيه المناسب للتقسيم. قم بتجميد العينة المضمنة على الثلج الجاف وتخزينها في درجة حرارة -80 درجة مئوية حتى التقطيع بالتبريد.
      3. استخرج الأنسجة من قالبها ، وقم بقص المواد الزائدة لتحسين التقسيم ، وقم بتثبيتها على حامل العينة باستخدام الماء عالي النقاء لضمان التصاق مستقر.
      4. قم بقص الأقسام بسمك 10 ميكرومتر وشل حركة الأقسام على ركائز CaF2 المطلية مسبقا وتخزينها عند -80 درجة مئوية.
      5. ضع أقسام المناديل المركبة في مجفف تجميد فراغ قبل التصوير بالأشعة تحت الحمراء المتوسطة. اضبط ضغط الغرفة على 0.1 ميجا باسكال ودرجة الحرارة على -100 درجة مئوية. جفف العينات لمدة 30 دقيقة.
  2. تحضير عينة الخلية
    1. البذور 1.25 × 105 خلايا HeLa على ركائز CaF2 دائرية قطرها 13 مم موضوعة في ألواح الاستزراع القياسية. استخدم Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) عالي الغلوكوز مع 10٪ مصل بقري جنيني (FBS) و 1٪ بنسلين ستربتومايسين. احتضان الخلايا في ظل ظروف الاستزراع القياسية (37 درجة مئوية ، 5٪ ثاني أكسيدالكربون 2) لمدة 24 ساعة.
    2. بعد 24 ساعة ، قم بإزالة الوسائط بعناية وإصلاح الخلايا عن طريق احتضانها في 4٪ بارافورمالدهيد (PFA) المذاب في مخزن مؤقت PBS لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة (RT).
    3. اشطف الخلايا الثابتة ثلاث مرات باستخدام المخزن المؤقت HBSS ، ثم اغسلها ثلاث مرات إضافية باستخدام ddH2O.
    4. جفف ركائز CaF2 بالهواء تماما في RT قبل الشروع في تصوير MIR.

2. الحصول على صور متعددة الوسائط

  1. الحصول على صورة MIR بالليزر المتتالي الكمي (QCL)
    1. قم بإجراء الفحص المجهري للتصوير QCL MIR باستخدام مجهر QCL-MIR المجهز بمقياس ميكروبولومتر غير N2 مبرد بالسائل 520 × 480 مصفوفة المستوى البؤري (FPA) وتقنية تقليل التماسك المكاني.
    2. حدد النطاق الطيفي من 950 سم -1 إلى 1800 سم -1.
    3. استخدم هدف 4× بفتحة عددية 0.6 (NA) ، مما ينتج عنه حجم بكسل اسمي يبلغ 4.25 ميكرومتر.
    4. اجمع طيف الخلفية على ركيزة CaF2 نظيفة بدقة طيفية 4 سم -1 .
    5. حدد منطقة الاستحواذ بناء على مورفولوجيا الأنسجة واجمع البيانات الطيفية بدقة طيفية تبلغ 4 سم -1. عند هذه الدقة الطيفية ، تبلغ سرعة الحصول على الصورة حوالي 0.3 مم2 / ثانية.
      ملاحظة: يتم إجراء جميع القياسات في وضع ناقل الحركة باستخدام شرائح CaF2 ، مع ضبط التركيز البؤري اليدوي.
  2. الحصول على صورة قياس الطيف الكتلي
    1. تطبيق المصفوفة
      1. استخدم أقسام الأنسجة بعد MIR ل MALDI-MSI ، وقم بتطبيق العلامات الإيمانية حول الأنسجة باستخدام قلم Tippex ، والتقط صورة بصرية قبل MSI باستخدام ماسح ضوئي مسطح لتسجيل الصور.
      2. قم بإعداد مصفوفة NEDC عند 7 مجم / مل في الميثانول / الأسيتونيتريل / الماء منزوع الأيونات (V / V / V = 75: 25: 5) ، ثم قم بالتصفية من خلال غشاء 0.2 ميكرومتر لإزالة الجسيمات.
      3. قم بتحميل شرائح الأنسجة المحددة في بخاخ مصفوفة آلي. استغناء مصفوفة NEDC على العينة باستخدام المعلمات المحددة مسبقا.
    2. قياس MALDI-MSI
      1. قم بإيداع 0.2 ميكرولتر من تعليق الفوسفور الأحمر على شريحة CaF2 لتكون بمثابة معيار معايرة الكتلة الخارجية.
      2. قم بتأمين الشريحة المطلية بالمصفوفة في محول الشريحة ، مما يضمن الاتصال الكهربائي الأمثل مع الحامل. قم بتحميل اللوحة في نظام MALDI-MSI.
      3. قم بمحاذاة الصورة البصرية للشريحة مع إحداثيات محرك XY لمرحلة MALDI باستخدام علامات إيمانية حدد عائد الاستثمار لتحليل الأنسجة وقم بتضمين منطقة "المصفوفة فقط" كعنصر تحكم سلبي.
      4. قم بتكوين الجهاز في وضع الأيونات السالبة بحجم بكسل 20 × 20 ميكرومتر2 ، يغطي نطاق m / z من 50-1000. قم بإجراء معايرة جماعية باستخدام بقعة الفوسفور الأحمر قبل البدء في الحصول على البيانات. إجراء الحصول على البيانات باستخدام منصة تحليل البيانات التجارية.

3. المعالجة المسبقة لبيانات الصورة وتحليلها

ملاحظة: يتم تحميل رموز MATLAB المخصصة كملف تكميلي 1.

  1. المعالجة المسبقة لبيانات QCL-MIR وتحليلها
    1. المعالجة المسبقة للبيانات
      1. تصدير البيانات الفائقة الطيفية بتنسيق مناسب لمزيد من التحليل.
      2. قم بإجراء المعالجة المسبقة للبيانات باستخدام CytoSpec و MATLAB ، باتباع الخطوات التالية 3.1.1.3-3.1.1.8
      3. قم باستيراد البيانات الطيفية MIR إلى CytoSpec v2.00.07 للمعالجة المسبقة.
      4. قم بتقييم الجودة الطيفية باستخدام وحدة اختبارات الجودة المضمنة في CytoSpec. حدد المعيار 2 (سمك العينة) لتقييم تناسق العينة. اضبط نطاق التكامل الطيفي على 950-1800 سم -1. حدد عتبات الامتصاص بين 50 و 1000 وحدة لاستبعاد الأطياف من المناطق الرقيقة أو السميكة بشكل مفرط.
      5. تقليل الضوضاء باستخدام التصفية المستندة إلى PCA في CytoSpec. احتفظ بأول 10 مكونات رئيسية (PCs) للتخلص من الضوضاء عالية التردد مع الحفاظ على التباين الكيميائي الحيوي الرئيسي.
      6. قم بتصدير البيانات الطيفية المعالجة مسبقا من CytoSpec بتنسيق .mat لمزيد من التحليل في MATLAB.
      7. قم بإجراء تصحيح خط الأساس في MATLAB باستخدام خوارزمية تصحيح الشريط المطاطي عبر النطاق الطيفي 950-1800 سم -1 للتخلص من انحراف خط الأساس وتحسين الدقة الطيفية.
      8. تطبيق التطبيع الطيفي باستخدام الحد الأدنى للقياس على نفس النطاق الطيفي لتوحيد الشدة عبر جميع الأطياف وضمان قابلية المقارنة في جميع أنحاء مجموعة البيانات.
    2. تحليل البيانات
      1. تحديد السمات المرتبطة بالبروتين عند 1,550 سم -1 و 1,650 سم -1 ، المقابلة لنطاقي أميد II و amide I ، على التوالي. تحديد السمات المرتبطة بالدهون عند 1,740 سم -1 ، والتي تمثل إستر C = O امتد الاهتزاز.
      2. احسب نسبة شدة نطاق Amide I (1650 سم -1) إلى امتداد الإستر C = O (1740 سم -1) وقم بإنشاء خرائط نسبة لتصور التوزيع المكاني للدهون إلى البروتين.
      3. تحليل الكتلة غير الخاضع للإشراف: إجراء تحليل التجميع الهرمي (HCA) على البيانات الفائقة الطيفية باستخدام المسافة الإقليدية وارتباط وارد لتصنيف المناطق بناء على التشابه الطيفي. قم بإنشاء خرائط عنقودية لتحديد المناطق المتميزة كيميائيا حيويا والكشف عن الاختلافات الهيكلية أو المرضية.
  2. المعالجة المسبقة لبيانات MSI وتحليلها
    1. قم باستيراد بيانات MSI الأولية إلى نظام أساسي لتحليل البيانات التجارية.
    2. قم بإجراء الانتقاء الأقصى بكثافة نسبية > 0.01٪.
    3. استبعاد القمم المشتقة من المصفوفة من قائمة الذروة التجريبية بمقارنتها بالطيف الذي تم الحصول عليه من منطقة تحكم المصفوفة فقط. قم بإزالة أي قمم تظهر في طيف التحكم وتكون نسبة الإشارة إلى الضوضاء (SNR) أقل من 3.
    4. قم بتطبيع مجموعة البيانات إلى مربع متوسط الجذر (RMS) لحساب التباين في شدة الإشارة الأيونية عبر وحدات البكسل والعينات.
    5. صقل تحديد المستقلب عن طريق تصفية الميزات بناء على توزيع الأنسجة ، والمطابقة مع الإدخالات في قاعدة بيانات التمثيل الغذائي البشري (HMDB) ، والاتفاق مع قيم m / z النظرية.
    6. حدد المستقلبات ذات الصلة بناء على الأهداف التجريبية وسياق الأنسجة.
    7. قم بتصدير شدة الميزات المحددة لجميع وحدات البكسل كملف CSV.
    8. تطبيق تقنيات تقليل الأبعاد (على سبيل المثال ، PCA أو t-SNE أو UMAP) لتقليل تعقيد البيانات وتحديد مجموعات وحدات البكسل ذات التوقيعات الأيضية المماثلة باستخدام أدوات المعلوماتية الحيوية مثل Seurat و Banksy ، مما يسهل تصور عدم تجانس التمثيل الغذائي المكاني.

4. التسجيل المشترك للصور متعددة الوسائط والتحليل المشترك

  1. حدد صورة MIR التي تم الحصول عليها عند 1650 cm-1 كمرجع مكاني للتسجيل المشترك. يسلط هذا الرقم الموجي المحدد الضوء على نطاق بروتين الأميد الأول ، مما يوفر تباينا قويا في الأنسجة.
  2. تطبيع قيم الشدة لكل من صور MIR و MSI لتعزيز قابلية المقارنة البصرية. قم بتطبيق تقنيات تحسين التباين، مثل معادلة الرسم البياني باستخدام وظيفة histeq في MATLAB، لإعادة توزيع كثافة الصورة وتحسين رؤية الميزات الهيكلية الضرورية لاختيار المعالم المعلمة.
  3. قم بتحميل كل من صور MIR و MSI في MATLAB باستخدام وظيفة cpselect من Image Processing Toolbox. تفتح هذه الوظيفة واجهة تفاعلية لاختيار المعالم المميزة.
  4. قم بالتعليق التوضيحي يدويا من خمس إلى عشر نقاط تحكم ذات صلة تشريحيا وموزعة جيدا على كل من صور MIR و MSI باستخدام وظيفة cpselect . يجب أن تتوافق هذه المعالم مع السمات المورفولوجية المميزة مثل حدود الأنسجة.
    ملاحظة: قم بتوزيع نقاط التحكم بالتساوي عبر حقل الصورة لتقليل التشوه الموضعي.
  5. تصدير وإحداثيات نقاط التحكم المشروحة وتسجيلها من كلتا الصورتين. قم بتخزينها كمصفوفتين متطابقتين لحساب التحويل (على سبيل المثال ، movingPoints و fixedPoints).
  6. احسب مصفوفة تحويل affine باستخدام وظيفة MATLAB fitgeotrans في وضع Affine . يفسر هذا التحويل التحجيم والتدوير والترجمة والقص.
  7. قم بتطبيق التحويل المحسوب على صورة MSI باستخدام الدالة imwarp في MATLAB. تقوم هذه الخطوة بإنشاء صورة MSI مسجلة مكانيا تتم محاذاة هندسيا مع الإطار المرجعي MIR.
  8. افحص المحاذاة بصريا باستخدام وظيفة imshowpair في وضع المزج لتراكب صور MSI و MIR وتأكيد التسجيل الصحيح للميزات الهيكلية.
  9. قم بتحويل كل من صورة MSI المسجلة وصورة MIR المرجعية إلى أقنعة ثنائية باستخدام وظيفة imbinarize في MATLAB.
  10. احسب معامل تشابه النرد (DSC) لتحديد التداخل المكاني بين القناعين الثنائيين. يتم تعريف DSC على النحو التالي: DSC = 2 × (منطقة التداخل)/(المساحة الإجمالية لكلا القناعين). تشير قيمة DSC التي تقترب من 1.0 إلى ارتفاع التداخل المكاني ودقة التسجيل.
    ملاحظة: إذا لزم الأمر، قم بتنقيح التسجيل عن طريق ضبط عدد نقاط التحكم أو موضعها وتكرار عملية التحويل. ضع في اعتبارك طرق التسجيل غير الصارمة إذا استمرت الاختلالات المحلية.
  11. احفظ الصورة المسجلة ومعلمات التحويل وإحداثيات المعالم لتحليل الصور متعددة الوسائط في اتجاه المصب ، مثل الارتباط المكاني للسمات الكيميائية الحيوية والهيكلية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

للتحقق من صحة استراتيجية التمثيل الغذائي المكاني متعدد الوسائط الموصوفة أعلاه ، قمنا بتنفيذها في نموذج فأر للسرطان. تم تعديل الخلايا السرطانية وراثيا للتعبير عن البروتين الفلوري الأخضر (GFP) ، مما يتيح توطين دقيق لمنطقة الورم من خلال التصوير الفلوري. يوضح الشكل 2 أ نتائج تصوير QCL-MIR الخالية من الملصقات بتغطية طيفية تبلغ 950-1800 سم -1 ، والمعروفة باسم "منطقة بصمات الأصابع". تم تمييز نطاقات MIR التمثيلية في الشكل 2 أ ، مثل تمدد P = O (1240 سم -1...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هنا ، نقدم استراتيجية الأيض المكاني متعدد الوسائط التي تدمج تصوير MSI و MIR لتمكين التنميط الأيضي عالي الإنتاجية والمحدد جزيئيا على نفس العينات. يتيح تصوير MIR رسم خرائط كيميائية خالية من الملصقات وغير مدمرة بناء على الاهتزازات الجزيئية ، مما يوفر معلومات هيكلية ووظيفية مفصلة عن المجموعة. في المقابل ، يوفر MSI حساسية عالية وخصوصية لتحديد المستقلب وقياسه ، مما يجعله حجر الزاوية في أبحاث التمثيل الغذائي. من خلال دمج هاتين الطريقتين ، يمكن أن يوفر فهما أكثر شمولا لعدم التجانس الأيضي ، والاس...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

المؤلفون ليس لديهم ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نشكر الدكتور ييلونغ زو من جامعة ويستليك على الدعم في تصوير MALDI2-MSI ، ومكتب Bruker Scientific Technology Co.، Ltd. Shanghai للمساعدة في تصوير MIR المستند إلى QCL. نشكر أيضا الدكتور Shuguo Sun ، جامعة Huazhong للعلوم والتكنولوجيا على التفضل بتقديم فئران KrasLSL-G12D /+ Tp53fl / fl Rb1fl / fl ZsgreenLSL . هذه الدراسة مدعومة بمنح من البرنامج الوطني للعلوم والتكنولوجيا للأمراض المزمنة غير السارية (2023ZD0500400 إلى LS و GW و D.Y.) ، والمؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (رقم 22377016 إلى LS) ، وصندوق جامعة فودان وأبحاث Cao'ejiang الأساسية (رقم 24FCA08 إلى L.S.). كما نشكر المنشأة الأساسية لكلية شنغهاي الطبية بجامعة فودان.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
4٪ بارافورمالدهايد ، محلول تثبيت الأنسجةSangon Biotech  ؛ E672002
ألبومين مصل الأبقارسيجما ألدريتش126615
C57BL / 6JNifdc الفئرانتشارلز ريفر219
CaF2< / sub> شرائحCrystranCAFP25-1
Cryostat microtomeDakewe BiotechCT520
CytospecPeter Laschالإصدار 2.10.01برنامج لتحليل بيانات MIR ، بما في ذلك تصحيح خط الأساس ، والتطبيع ، وتوليد الصور ، والتحليل الفائق الطيفي.
عازلة DPBSفيشر العلمية 14-190-250
مصل الأبقار الجنينجيبكومجففات التجميد 10270106
LABCONCOFreeZone
Gelatin Sigma-AldrichG1890النوع A ، من جلد الخنازير
HBSS العازلةSangon Biotech  ؛ A003210
عالي الجلوكوز DMEMThermoFisher Scientific 10564011
MatlabMathWorksMatlab R2024aلتحليل بيانات MIR ، بما في ذلك تصحيح خط الأساس ، والتطبيع ، وإنشاء الصور ، والتحليل الفائق الطيفي.
الكتلي بالتأين بالامتصاص بالليزر بمساعدة المصفوفة (MALDI-MSI)Bruker Daltonics GmbH timsTOF fleX MALDI-2
الكاشف الكيميائيللميثانول10014108
mMassلعلم الحشرات ، مركز الأحياء التابع للأكاديمية التشيكية للعلوم ، جمهورية التشيكالإصدار 5.5.0برامج لتحليل بيانات MSI. استيراد بيانات MSI الأولية إلى مختبر SCILS للمعالجة المسبقة. قم بإجراء التقاط الذروة في mMass بكثافة نسبية > 0.01٪.
N- (1-naphthyl) إيثيلين ديامين ثنائي هيدروكلوريد (NEDC) مصفوفة   ;سيجما ألدريتش222488
البنسلين الستربتومايسينThermoFisher Scientific  15140122
الفحص المجهري للأشعة تحت الحمراء المتوسطة (QCL-MIR برامج Bruker Optics GmbHLUMOS II ILIM
الفوسفور الأحمرSigma-Aldrich8.0727
SCiLS LabBruker DaltonicsSCiLS Lab 2024bلتحليل بيانات MSI. استيراد بيانات MSI الأولية إلى مختبر SCILS للمعالجة المسبقة. قم بإجراء التقاط الذروة في mMass بكثافة نسبية > 0.01٪.
بخاخHTX TechnologiesTM
Trypsin ، 0.25٪ EDTAThermoFisher Scientific   ؛C25200072
برنامجنظام التصوير الطيفي سينوفارم معهد)

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Alexandrov, T. Spatial metabolomics: From a niche field towards a driver of innovation. Nat Metab. 5 (9), 1443-1445 (2023).
  2. Gilmore, I. S., Heiles, S., Pieterse, C. L. Metabolic imaging at the single-cell scale: Recent advances in mass spectrometry imaging. Annu Rev Anal Chem. 12 (1), 201-224 (2019).
  3. Chadha, R. S., Guerrero, J. A., Wei, L., Sanchez, L. M. Seeing is believing: Developing multi-modal metabolic insights at the molecular level. ACS Central Science. 10 (4), 758-774 (2024).
  4. Shi, L., et al. Mid-infrared metabolic imaging with vibrational probes. Nat Methods. 17 (8), 844-851 (2020).
  5. Steinhauser, M. L., et al. Multi-isotope imaging mass spectrometry quantifies stem cell division and metabolism. Nature. 481 (7382), 516-519 (2012).
  6. Hu, F., Shi, L., Min, W. Biological imaging of chemical bonds by stimulated Raman scattering microscopy. Nat Methods. 16 (9), 830-842 (2019).
  7. Qian, N., et al. Illuminating life processes by vibrational probes. Nat Methods. 22 (5), 928-944 (2025).
  8. Kim, M. M., Parolia, A., Dunphy, M. P., Venneti, S. Non-invasive metabolic imaging of brain tumours in the era of precision medicine. Nat Rev Clin Oncol. 13 (12), 725-739 (2016).
  9. Baker, M. J., et al. Using Fourier transform IR spectroscopy to analyze biological materials. Nat Protoc. 9 (8), 1771-1791 (2014).
  10. Fernandez, D. C., Bhargava, R., Hewitt, S. M., Levin, I. W. Infrared spectroscopic imaging for histopathologic recognition. Nat Biotechnol. 23 (4), 469-474 (2005).
  11. Schnell, M., et al. All-digital histopathology by infrared-optical hybrid microscopy. Proc Natl Acad Sci U S A. 117 (7), 3388-3396 (2020).
  12. Yeh, K., Kenkel, S., Liu, J. N., Bhargava, R. Fast infrared chemical imaging with a quantum cascade laser. Anal Chem. 87 (1), 485-493 (2015).
  13. Ma, S., et al. High spatial resolution mass spectrometry imaging for spatial metabolomics: Advances, challenges, and future perspectives. TrAC Trends Anal Chem. 159, 116902(2023).
  14. Mckinnon, J. C., et al. Enhancing metabolite coverage in MALDI-MSI using laser post-ionisation (MALDI-2). Anal Methods. 15 (34), 4311-4320 (2023).
  15. Bednařík, A., et al. MALDI MS imaging at acquisition rates exceeding 100 pixels per second. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 30 (2), 289-298 (2019).
  16. He, M. J., et al. Comparing DESI-MSI and MALDI-MSI mediated spatial metabolomics and their applications in cancer studies. Front Oncol. 12, 2022(2022).
  17. Wang, G., et al. Analyzing cell-type-specific dynamics of metabolism in kidney repair. Nature Metab. 4 (9), 1109-1118 (2022).
  18. Haase, K., Kröger-Lui, N., Pucci, A., Schönhals, A., Petrich, W. Real-time mid-infrared imaging of living microorganisms. J Biophotonics. 9 (1-2), 61-66 (2016).
  19. Liu, X., et al. Towards mapping mouse metabolic tissue atlas by mid-infrared imaging with heavy water labeling. Adv Sci. 9 (15), e2105437(2022).
  20. Liu, X., Shi, L., Zhao, Z., Shu, J., Min, W. Vibrant: Spectral profiling for single-cell drug responses. Nat Methods. 21 (3), 501-511 (2024).
  21. Gruber, L., et al. Deep MALDI-MS spatial omics guided by quantum cascade laser mid-infrared imaging microscopy. Nat Commun. 16 (1), 4759(2025).
  22. Heijs, B., et al. Histology-guided high-resolution matrix-assisted laser desorption ionization mass spectrometry imaging. Anal Chem. 87 (24), 11978-11983 (2015).
  23. Rabe, J. H., et al. Fourier transform infrared microscopy enables guidance of automated mass spectrometry imaging to predefined tissue morphologies. Sci Rep. 8 (1), 313(2018).
  24. Wang, G., et al. Spatial quantitative metabolomics enables identification of remote and sustained ipsilateral cortical metabolic reprogramming after stroke. bioRxiv. , (2024).
  25. Jang, C., Chen, L., Rabinowitz, J. D. Metabolomics and isotope tracing. Cell. 173 (4), 822-837 (2018).
  26. Kim, J., Seo, S., Kim, T. -Y. Metabolic deuterium oxide (d2o) labeling in quantitative omics studies: A tutorial review. Analytica Chimica Acta. 1242, 340722(2023).
  27. Shi, L., et al. Optical imaging of metabolic dynamics in animals. Nature Commun. 9 (1), 2995(2018).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

Spatial MetabolomicsMass Spectrometry ImagingMid Infrared ImagingMALDI MSIImaging Co RegistrationBioinformatics AnalysisTissue Metabolite MappingMulti Modal ImagingMetabolic HeterogeneityBiomarker Discovery
الفيديو قريباً

مقالات ذات صلة