مقالة منهجية

تعزيز تقنية مستقبلات المستضد الخيمري - الحويصلات خارج الخلية (CAR-EV): مستقبل علاج السرطان

DOI:

10.3791/68726

⸱

سبتمبر 19, 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1INOVIQ Ltd., 2Centre for Clinical Research, Faculty of Medicine, The University of Queensland

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

التطبيق العلاجي للحويصلات خارج الخلية (EVs) لديه القدرة على إحداث ثورة في علاج السرطان وتوصيل الأدوية. تظهر EVs المشتقة من الخلايا (CAR-EVs) المشتقة من مستقبلات المستضد الخيمري (CAR) المعزولة باستخدام كروماتوغرافيا التبادل الأيوني زيادة في سعة الشحن ، مما يعزز بشكل كبير فعاليتها الوظيفية. تميز هذه الدراسة أيضا CAR-EVs لتوضيح نشاطها البيولوجي وإمكاناتها العلاجية.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تتميز علاجات خلايا CAR بعلاج شخصي متقدم بشكل كبير للعديد من الأورام الخبيثة الدموية. حاليا ، تمت الموافقة على سبعة منتجات لخلايا CAR من قبل إدارة الغذاء والدواء (FDA) وستة من قبل وكالة الأدوية الأوروبية (EMA) لعلاج سرطان الغدد الليمفاوية والورم النخاعي المتعدد وسرطان الدم الليمفاوي المزمن. لا تزال هناك العديد من التحديات والقيود ، مع كون متلازمة إطلاق السيتوكين (CRS) ومتلازمة السمية العصبية المرتبطة بالخلايا المستجيبة المناعية (ICANS) هي الأكثر أهمية. توفر العلاجات الخالية من الخلايا ، مثل CAR-EVs ، مزايا جوهرية على نظيراتها الخلوية. وتشمل هذه التسلل المعزز للورم وإمكانية تكرار الإعطاء مع تقليل مخاطر CRS و ICANS والآثار الجانبية الضارة الأخرى. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن ضبط فاعلية CAR-EVs من خلال هندسة إدراج العوامل السامة للخلايا والأحماض النووية الريبية المعدلة للوظيفة (RNAs). هنا ، نقدم تقريرا عن تطوير منصة CAR-EV قابلة للتطوير لإنتاج CAR-EVs قابلة للضبط. تتضمن هذه المنصة الهندسة والتكييف المسبق للخلايا المنتجة للمركبات الكهربائية (على سبيل المثال ، خلايا CAR-T و CAR-natural القاتلة (CAR-NK)) ، وعزل وإثراء المركبات الكهربائية CAR-EVs باستخدام منصة كروماتوغرافيا التبادل الأيوني (IEX) من فئة ممارسات التصنيع الجيدة (GMP) ، وتحليل السكان الفرعيين للسيارات الكهربائية عالية الإنتاجية المؤتمتة بالكامل ، وفي المختبر تقييم النشاط الوظيفي السام للخلايا CAR-EV. تم التحقق من صحة المنصة باستخدام CAR-NK-EVs و CAR-T-EVs لكل من خطوط الخلايا السرطانية الدموية والصلبة. تمثل منصة CAR-EV نهجا واعدا للتطوير السريع لعلاجات CAR-EVs الجاهزة المصممة خصيصا لمؤشرات مرضية محددة ، مع إمكانية تقليل الآثار الجانبية الضارة المرتبطة بالعلاجات القائمة على خلايا CAR.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تمت الموافقة على العلاجات القائمة على خلايا CAR لعلاج الأورام الخبيثة الدموية ، ومع ذلك ، لا تزال هناك تحديات وقيود كبيرة1. والجدير بالذكر أن مخاطر CRS و ICANS تظل عوامل حاسمة عند تقييم مدى ملاءمة المريض لعلاج CAR ، مما يؤكد الحاجة إلى التقدم المستمر في استراتيجيات العلاج2.

برزت المركبات الكهربائية المشتقة من خلايا CAR (CAR-EVs) كخيار علاجي خيفي أكثر فعالية وأكثر أمانا. توفر هذه المركبات الكهربائية العديد من المزايا ، بما في ذلك تقليل المناعة ، وانخفاض خطر الإصابة ب CRS ، وتسلل الورم المعزز ، والملاءمة لتكرار الجرعات ، وإمكانية العلاجات المركبة ، فضلا عن عمليات الإنتاج والتخزين الفعالة3. يمكن تصميم المركبات الكهربائية المشتقة بيولوجيا للتعبير عن الجزيئات التي تستهدف السرطان والتي ترتبط بتقارب كبير مع مستقبلات سطحية معينة على الخلايا السرطانية. بمجرد تعديلها ، تقدم هذه المركبات الكهربائية المصممة استراتيجية واعدة لتوصيل البضائع العلاجية بشكل انتقائي ، مع إمكانية تقليل التأثيرات غير المستهدفة. مشقة من خلايا CAR ، تظهر هذه المركبات الكهربائية المسلحة خصائص وظيفية محسنة تتيح توصيلا علاجيا أكثر دقة وفعالية. تمنح ميزاتها المتأصلة مزايا متعددة تساهم بشكل جماعي في تحسين فعالية العلاج.

هناك عقبتان رئيسيتان أمام استخدام المركبات الكهربائية بشكل فعال في العيادة هما الحجم والفعالية. تظهر المنهجيات الموضحة هنا قابلية توسع متأصلة وقابلة للتكيف بسهولة عبر مجموعة واسعة من النماذج التجريبية. تعد ترقية إنتاج المركبات الكهربائية إلى التصنيع السريري مجالا للتطوير النشط ولكنه يتطلب مزيدا من التحسين لتوليد كميات كافية من المواد السريرية4. الأهم من ذلك ، أظهرت الدراسات الحديثة مناهج واعدة لتحسين فعالية المركبات الكهربائية ، مثل تكييف الخلايا الأم مسبقا بالإنترلوكينات (على سبيل المثال ، IL-7 ، IL-15 ، IL-21) وتوليد المركبات الكهربائية في ظل ظروف نقص التأكسج (1-2٪ O2)5،6،7.

كان الهدف من هذه الدراسة هو التحقيق في الإمكانات العلاجية لمستقبلات عامل نمو البشرة (EGFR) ومستقبلات عامل نمو البشرة البشرية 2 (HER2) التي تستهدف CAR EVs في المختبر ، باستخدام خلايا سرطان الثدي MCF-7 وخلايا ابيضاض الدم النخاعي K562. تم عزل المركبات الكهربائية وإثرائها من الوسائط المكيفة للخلايا CAR (CM) عبر IEX ، وتتميز باستخدام تتبع الجسيمات النانوية وتحليل اللطخة الغربية ، وخضعها للمقايسات الوظيفية. أدت المركبات الكهربائية CAR التي تحتوي على شحنات سامة للخلايا بشكل فعال إلى موت الخلايا في المختبر. تثبت البيانات التي تم الحصول عليها جدوى إنتاج المركبات الكهربائية المستهدفة القابلة للتطوير للتطبيقات العلاجية.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ملاحظة: تعامل مع جميع الخلايا الحية داخل خزانة معتمدة من مستوى السلامة الحيوية 2 (BSL-2) باستخدام معدات الوقاية الشخصية المناسبة (مثل القفازات وعباءات المختبر). يجب تطهير المواد الخطرة بيولوجيا ، مثل كريات الخلايا التي تحتوي على خلايا حية ، باستخدام محلول نهائي من هيبوكلوريت الصوديوم بنسبة 10٪.

1. زراعة الخلايا وجمع CM

  1. زراعة خلايا CAR
    ملاحظة: على الرغم من أن خلايا CAR المحولة بالعدسة المستخدمة في هذه الدراسة قد تم الاستعانة بمصادر خارجية ، إلا أن البروتوكول لا يزال قابلا للتطبيق على خلايا CAR-T / NK التي تم إنشاؤها داخليا عبر تقنيات هندسة الخلايا القياسية.
    1. الحفاظ على خلايا CAR NK / T في مزرعة خالية من الزينو (وسط نمو مكمل ب 100 وحدة دولية / مل IL-2) بكثافة 0.5-1 × 106 / مل ، في غرفة مرطبة عند 37 درجة مئوية (5٪ ثاني أكسيد الكربون2 ، 21٪ O2). راقب كل 2-3 أيام وحدل عدد الخلايا إلى 3 مرات أسبوعيا بسبب قيود سعة المرور.
    2. قم بتأكيد تعبير CAR عبر الفحص المجهري ، والتأكد من أن الخلايا فلورية (إذا تم وضع علامة عليها بشكل مناسب). تدل الخلايا الموجودة في كتل صحية على ثقافة خلايا CAR قوية.
  2. مجموعة CM
    1. بمجرد وصول مزارع الخلايا إلى 80٪ من التقاء ، قم بتقييم قابلية الخلية للبقاء وتحديد كثافة الخلايا الحية عبر تحليل عد الخلايا الآلي Trypan blue.
    2. قم بالطرد المركزي للخلايا عند 300 × جم (درجة حرارة الغرفة) لمدة 5 دقائق لتشكيل حبيبات.
    3. اجمع المادة الطافية وجهاز الطرد المركزي بعناية عند 3,000 × جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية للتوضيح.
    4. قم بتخزين السم المصفى عند -80 درجة مئوية حتى يصبح جاهزا للتخصيب بالمركبات الكهربائية.

2. عزل EV وإثرائه

ملاحظة: تحدد الطرق التالية نهجين لتخصيب الحويصلة خارج الخلية (EV): طريقة IEX ، التي تم تطويرها لعزل EV للتحليل الوظيفي في المختبر ، وطريقة التقاط عموم الإكسوسوم عالية الإنتاجية ، المحسنة لدراسات التوصيف النهائي.

  1. إثراء المركبات الكهربائية الوظيفية CAR عبر IEX
    ملاحظة: يتم التعبير عن جميع المواصفات الحجمية من حيث حجم العمود (CV) ، مما يعكس العلاقة النسبية بين أحجام الكاشف وحجم طبقة الراتنج داخل العمود الكروماتوغرافي.
    1. أحضر عمود IEX (انظر جدول المواد للحصول على تفاصيل العمود المستخدم) إلى درجة حرارة الغرفة (RT) من خلال السماح له بالوقوف لمدة 15 دقيقة قبل الاستخدام. أضف 10 CV من المخزن المؤقت للتجديد ، متبوعا بالتوازن باستخدام 10 CV من المخزن المؤقت للتوازن متساوي التوتر (عند الرقم الهيدروجيني 7.4) (انظر جدول المواد للحصول على تفاصيل المخازن المؤقتة).
      ملاحظة: لا تدع العمود يجف لفترات طويلة. حافظ دائما على العمود في وضع مستقيم.
    2. قم بإذابة CM والمرور عبر مرشح بولي إيثر سلفون (PES) بحجم 0.22 ميكرومتر.
    3. أضف العينة إلى العمود المتوازن (حتى 31.2 CV) ، متبوعا ب 10 CV من مخزن الغسيل متساوي التوتر (عند درجة الحموضة 7.4). أضف 2.5 CV من المخزن المؤقت للشطف مفرط التوتر (انظر جدول المواد) واجمع التدفق من خلاله ، حيث أن هذه هي عينة EV eluate.
    4. قم بإجراء تبادل المخزن المؤقت على جهاز تنظيف المركبات الكهربائية باستخدام مرشحات الطرد المركزي ذات الترشيح الفائق المتوفرة تجاريا (قطع 30 كيلو دالتون) ومحلول متساوي التوتر كمخفف ، مما يضمن الحد الأدنى لعامل التخفيف يبلغ 100 ضعف. يمكن للمستخدم تحديد الحجم المستهدف بعد تبادل المخزن المؤقت ليناسب معلماته التجريبية.
    5. قم بإجراء خطوة ترشيح نهائية باستخدام مرشح 0.22 ميكرومتر لتعقيم المركبات الكهربائية المخصبة للمقايسات الوظيفية في المختبر .
    6. تحديد توزيع حجم CAR-EV وتركيزه وإنتاجيته باستخدام تحليل تتبع الجسيمات النانوية (NTA) 8،9.
  2. عزل EV لعموم الإكسوسوم عالي الإنتاجية (عبر نظام تنقية آلي ، يتم إجراؤه في درجة حرارة الغرفة (RT)) ، لتوصيف مجموعة محدودة أو كبيرة من العينات10،11.
    1. قم بإعداد ثلاثة 96 لوحة بئر عميق (DW) مع 1 مل من 1x PBS لكل بئر.
    2. قم بإنشاء لوحة "شطف" عن طريق إضافة 35 ميكرولتر من 1٪ من كبريتات دوديسيل الصوديوم (SDS) إلى كل بئر.
    3. قم بإعداد صفيحة "ملزمة" تحتوي على 1 مل من عينة CM و 30 ميكرولتر من حبات التقاط EXO-NET pan-exosome لكل بئر.
    4. قم بتعيين الإعدادات التالية على نظام العزل التلقائي:
      1. الخطوة 1: نصيحة الالتقاط: تأكد من أن بروتوكول العزل يبدأ بتشغيل الأداة بمشط طرف بعمق 96 بئرا لتمكين معالجة الخرزة المغناطيسية طوال عملية العزل.
      2. الخطوة 2: تأكد من خلط عينة CM والخرز المغناطيسي في ظل ظروف بطيئة السرعة المستمرة لمدة 30 دقيقة للسماح بالالتقاط الفعال للمركبات الكهربائية على الجسيمات المغناطيسية. بعد الخلط ، يتم تضمين 5 دورات من 30 ثانية لكل منها لضمان التقاط الخرزات المغناطيسية.
      3. الخطوة 3: تأكد من أن كل خطوة من خطوات الغسيل الثلاث تستخدم مزيجا لطيفا بطيء السرعة لمدة 30 ثانية لإزالة الملوثات غير المرتبطة على وجه التحديد مع الحفاظ على سلامة المركبات الكهربائية المربوطة. كما هو الحال سابقا ، تنتهي الخطوة ب 5 دورات من 30 ثانية لكل منها لالتقاط الخرزات المغناطيسية.
      4. الخطوة 4: شطف بروتين EV (التحلل): تأكد من تحلل المركبات الكهربائية المرتبطة لاستعادة البروتين من خلال عملية من مرحلتين. يتم إجراء خلط أولي لمدة 30 ثانية (الخلط السفلي) قبل الحضانة لمدة 7 دقائق و 30 ثانية في حالة توقف مؤقت ، مع تثبيت موضع الطرف فوق البئر. بمجرد انقضاء الوقت ، هناك خلط ثانية لمدة 30 ثانية وتوقف مؤقت لمدة 7 دقائق و 30 ثانية أخرى. أخيرا ، يتم دمج 5 دورات من 30 ثانية لكل منها.
      5. الخطوة 5: في هذه المرحلة ، تأكد من أن محتوى البروتين موجود في المخزن المؤقت ، بينما يتم توصيل الخرزات بالطرف. بعد خطوة الشطف ، يتم التخلص من مشط الطرف المستخدم ، واستكمال البروتوكول.
        ملاحظة: تحتوي حبات EXO-NET Pan-Exosome Capture على محلول حافظ بنسبة 0.05٪ (وزن / وزن). على الرغم من أنها لا تصنف على أنها خطرة بموجب لوائح إدارة السلامة والصحة المهنية (OSHA) ، يجب استخدام معدات الحماية الشخصية المناسبة (PPE) عند التعامل معها ، خاصة في سياق السوائل الحيوية.

3. توصيف المركبات الكهربائية عبر النشاف الغربي

ملاحظة: تميزت CAR-EVs بلطخة غربية (Granzyme B و Calnexin) ، مقارنة بالخلايا كعنصر تحكم.

  1. قم بإعداد محللات الخلايا عن طريق إضافة 10 ميكرولتر من المخزن المؤقت لمقايسة الترسيب المناعي المشع (RIPA) 1x (مع مثبطات البروتياز) لكل 1 × 106 خلايا. احتضان على الثلج لمدة 30 دقيقة ، ثم قم بالطرد المركزي عند 14,000 × جم (4 درجات مئوية) لمدة 15 دقيقة لإزالة بقايا الخلية. يمكن تحليل المركبات الكهربائية باستخدام نفس المخزن المؤقت أو 1٪ SDS.
  2. حدد كمية البروتين باستخدام مقايسة حمض البيسينشونيك (BCA) (أو مقياس الطيف الضوئي النانوي المناسب).
  3. قم بتجميع جل بولي أكريلاميد SDS بنسبة 4-12٪ في جهاز الرحلان الكهربائي باتباع بروتوكول الشركة المصنعة. تحضير محللات البروتين باستخدام المخزن المؤقت Laemmli.
    ملاحظة: قد تختلف أنظمة الجل حسب العلامة التجارية
  4. قم بتحميل 5 ميكروغرام من العينة في كل بئر وقم بتشغيل المواد الهلامية عند 200 فولت لمدة 20 دقيقة.
  5. قم بإجراء نقل غربي باستخدام أغشية فلوريد البولي فينيلدين (PVDF) ، مما يؤدي إلى منع البقع باستخدام ألبومين مصل البقر بنسبة 5٪ (BSA) في محلول ملحي مخزن 1x Tris مع 0.1٪ Tween 20 (1x TBST) بعد ذلك.
  6. احتضان البقع في الأجسام المضادة الأولية أحادية النسيلة (Granzyme B و Calnexin ، تخفيف 1 من 500 في محلول 5٪ BSA في 1x TBST) ، راكد (غير اهتزاز) ، وبين عشية وضحاها عند 4 درجات مئوية.
  7. في اليوم التالي ، اغسل البقع 3x لمدة 5 دقائق لكل منها ب 10-15 مل من 1x TBST قبل الحضانة في الجسم المضاد الثانوي (تعتمد على الأنواع ، 1 في 1,000 تخفيف في محلول 5٪ BSA في 1x TBST لمدة ساعة واحدة في RT). اكتشف النطاقات باستخدام التلألؤ الكيميائي المحسن (ECL) ، مع الصور الملتقطة عبر كاميرا رقمية مقترنة بجهاز مشحون (CCD).

4. الفحص الوظيفي (عبر MTS)

ملاحظة: تم تقييم السمية الخلوية بواسطة مقايسة MTS في المختبر [(3- (4،5-ثنائي ميثيل ثيازول-2-يل) -5- (3-كربوكسي ميثوكسي فينيل) -2- (4-سلفوفينيل) -2H-رباعي الزوليوم] ، حيث تقلل الخلايا من مركب التيترازوليوم إلى منتج فورمازان ملون قابل للذوبان ، يمكن قياسه عند امتصاص 490 نانومتر. تم علاج سرطان الثدي MCF-7 وخلايا سرطان الدم K-562 لمدة تصل إلى 3 أيام في ثلاث تجارب مستقلة مع زيادة التركيزات (0-500,000 جسيم / خلية) من CAR-EVs.

  1. زرع 5,000 خلية متلقية لكل بئر (50 ميكرولتر / بئر) في صفيحة 96 بئرا باستخدام ماصة متعددة القنوات. احتفظ بعمود واحد للوسيط الفارغ (لطرح خلفية كاشف MTS). تجنب آبار الحواف ، واملأها ب 200 ميكرولتر من الماء المعقم.
    ملاحظة: يجب طلاء الخلايا الملتصقة قبل يوم واحد لضمان الارتباط الخلوي بسطح اللوحة قبل المعالجة.
  2. أضف المركبات الكهربائية بكميات متزايدة (على سبيل المثال ، 2.5 × 105 و 4.5 × 105 ، أو 0.5 و 0.75 و 1 مليون EV لكل خلية). قم بتضمين عناصر التحكم: "No EV" و 1x PBS "EV buffer" والتحكم الإيجابي في قتل الخلايا (على سبيل المثال ، مثبط جزيء صغير محدد للهدف أو 0.1٪ TX-100).
  3. احتضان الخلايا في غرفة مرطبة عند 37 درجة مئوية (5٪ ثاني أكسيد الكربون2 ، 21٪ O2) لمدة 2-3 أيام.
  4. في النقطة الزمنية المحددة للعلاج ، افحص الخلايا عن طريق الفحص المجهري. أضف كاشف MTS (20 ميكرولتر لكل 100 ميكرولتر مزرعة لكل بئر). احتضان ما بين 1-4 ساعات ، وقياس الامتصاص باستخدام قارئ لوحة عند 490 نانومتر ، كل ساعة.
  5. اطرح قراءة امتصاص الوسط الفارغة لتحليل البيانات. احسب الإحصائيات باستخدام اختبار t للطالب للمقارنات المكونة من مجموعتين ، أو ANOVA أحادي الاتجاه مع مقارنات متعددة لثلاث مجموعات أو أكثر.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يوضح الشكل 1 سير عمل نموذجي لزراعة خلايا CAR T / NK ، متبوعا بعزل المركبات الكهربائية وتوصيفها واستخدامها في مقايسة وظيفية. يتم جمع CM من زراعة خلايا CAR T / NK ، قبل إثراء EV وتوصيف المصب (بما في ذلك تحليل تتبع الجسيمات النانوية) وتقييم النشاط الوظيفي عبر مقايسة MTS متعددة الآبار (الشكل 1).

يمكن تصور خلايا CAR الموسومة ب GFP عن طريق الفحص المجهري لتأكيد التعبير عن بنية CAR في الثقافة. يجب إجراء الفحص المجهري كخطوة روتينية قبل وأثناء جمع CM لضمان كفاءة نقل كافية. من المهم تراكب قنوات الحقل الساطع وقنوات GFP ، لالتقاط التألق الذاتي المحتمل عند تقييم الكفاءة. وتجدر الإشارة إلى أن الخلايا التائية تمتلك ميلا إلى التكتل بشكل طبيعي (لوحظ بالمثل في الخلايا القاتلة الطبيعية ؛ البيانات غير معروضة) ، ويمكن ملاحظة التألق بوضوح عندما تظهر الخلايا نمطا ظاهريا متكتلا (الشكل 2).

بعد تخصيب المركبات الكهربائية ، يمكن تمييز المركبات الكهربائية عبر NTA و immunoblotting الغربي. باستخدام NTA ، يمكن أن يؤكد تحليل إنتاجية الجسيمات زيادة التركيز في المركبات الكهربائية المعزولة ، مقارنة ب CM (الشكل 3 أ). تؤكد بيانات اللطخة الغربية أيضا التعبير عن علامة التحلل الخلوي granzyme B في خلايا CAR و EVs ، وغياب الكالنكسين في الأخير ، مما يؤكد عدم وجود مادة خلوية في المستحضرات. يتم تضمين HEK293T الخلايا كعنصر تحكم سلبي في CAR (الشكل 3 ب).

تم إجراء تحليل وظائف EV عبر مقايسة MTS لتحديد قدرة الخلية على البقاء / الانتشار. يتم تحديد تأثير EGFR و HER2 التي تستهدف CAR-EVs على سرطان الثدي MCF-7 وحيوية خلايا سرطان الدم K562 ونموها عن طريق قياس كاشف MTS اللوني عند امتصاص 490 نانومتر (بعد إزالة إشارة الخلفية). في هذا المثال ، قلل EGFR الذي يستهدف CAR-EVs من بقاء الخلايا MCF-7 و K562 بنسبة 70٪ و 40٪ على التوالي. خفضت HER-2 التي تستهدف CAR-EVs MCF-7 بنسبة ~ 10٪ (كما هو محدد من خلال اختبار t للطالب). بالنظر إلى التصميم التجريبي ، فإن استخدام اختبار غير معلمي (على سبيل المثال ، Mann-Whitney U) قد يقدم رؤى أكثر قوة في الدراسات اللاحقة (الشكل 4).

figure-results-1
الشكل 1: توليد CAR-EV ، والتخصيب ، وتوصيف EV ، والقراءة الوظيفية. رسم تخطيطي يصور سير عمل نموذجي لتوليد المركبات الكهربائية وإنتاجها وتوصيف عينات CAR-EV المخصبة قبل تحليل الوظائف. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-2
الشكل 2: تحليل المجهر التمثيلي عن طريق تأكيد تعبير GFP في خلايا CAR-T التي تستهدف HER2. تم التقاط الصور عن طريق الفحص المجهري الفلوري ، باستخدام هدف 20x. يمثل شريط المقياس الأبيض طولا يبلغ 50 ميكرومتر. تميل الخلايا التائية بشكل طبيعي للنمو في كتل قبل الانفصال إلى خلايا مفردة. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-3
الشكل 3: توصيف خلايا CAR و EVs. (أ) تحليل جسيمات تتبع النانو ل CAR-T CM والمركبات الكهربائية المخصبة. كان تركيز الجسيمات في المركبات الكهربائية أكبر بمقدار 1.6-2.1 مرة من تركيز CM ، بينما انخفض تركيز البروتين بنسبة >80٪. تم اختبار الفروق ذات دلالة إحصائية باستخدام ANOVA أحادي الاتجاه واختبار المقارنة المتعددة ل Tukey. ص≤ 0.001 ، **** ص ≤ 0.0001. (ب) أكد تحليل اللطخة الغربية للخلايا التائية المنقولة و CAR-EVs المخصبة وجود حبيبات ب المحللة للخلايا في كل من خلايا CAR و EVs ، بينما لوحظ وجود غياب في HEK293T الخلايا غير CAR. لم يتم اكتشاف Calnexin في CAR-EV ، مما يشير إلى انخفاض التلوث بجزيئات الشبكة الإندوبلازمية. حمل البروتين لكل حارة = 5 ميكروغرام. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-4
الشكل 4: تأثير CAR-EVs على بقاء الخلية المستهدفة (خلايا سرطان الثدي MCF-7 وخط خلايا ابيضاض الدم النقوي المزمن K562). تمت معالجة الخلايا المستهدفة بجرعة واحدة من 4.5 × 105 و 2.5 × 105 EVs / خلية (EGFR أو HER2 CARs ، على التوالي) أو التحكم (EV buffer) لمدة تصل إلى 3 أيام. (أ) خلايا CAR-EVs التي تستهدف EGFR. (ب) HER2 التي تستهدف CAR-EVs. لوحظ انخفاض في قراءة الامتصاص (مما يدل على فعالية العلاج) في كلا خطوط الخلايا. تمثل البيانات متوسط الامتصاص ± SD (ن = 3) ، والتي تم تحليلها باستخدام اختبار t للطالب غير المزوجي ثنائي الذيل ، مع قيم p التي تشير إلى دلالة إحصائية. ** ص≤ 0.01. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

قد يؤدي الجمع بين الفعالية المثبتة للعلاج ب CAR والمزايا الواعدة للعلاج القائم على الحويصلة خارج الخلية (EV) إلى تحسين فعالية علاجات السرطان ، كما هو موضح في الدراسات التي تستهدف سرطان الثدي والرئة12،13. يعالج النهج العلاجي CAR-EV القيود الحالية للعلاج ب CAR ، مثل تحديات التوصيل والسمية المرتبطة بها ، مع الاستفادة من التوافق الحيوي وقدرات الاستهداف للمركبات الكهربائية. قد يؤدي دمج هذه الطرائق إلى تسهيل تطوير استراتيجيات علاجية جديدة للسرطان ، مما يوسع فرص تطبيق المركبات الكهربائية في بيئة سريرية. بالإضافة إلى ذلك ، توفر هندسة وإثراء المركبات الكهربائية الوظيفية طريقة أكثر أمانا (عن طريق تغليف البضائع المحللة للخلايا) وطريقة أكثر دقة (أي إضافة مجالات الاستهداف) لتوصيل البضائع العلاجية ، خاصة إلى المواقع الصعبة مثل قلب الورم ونخاع العظم والمناطق المحمية بحواجز مثل حاجز الدم والدماغ أو الخصية الدموية14،15،16. على الرغم من الطريقة الراسخة لتخصيب المركبات الكهربائية باستخدام الطرد المركزي الفائق ، لا تزال هناك العديد من القيود. تشمل القيود الملحوظة: قابلية التوسع ، والعزل المشترك للشوائب ، وعائد ما بعد الإنتاج المحدود17. هناك حاجة واضحة لعمليات محسنة لتوليد المركبات الكهربائية العلاجية على نطاق واسع.

توضح دراسة إثبات المفهوم هذه أن IEX هي طريقة قابلة للتطوير وفعالة لإنتاج وعزل وإثراء CAR-EVs الوظيفية ، باستخدام CM موضح من الخلايا التي تعبر عن CAR كمدخلات. تتيح IEX معالجة عالية الإنتاجية وتدعم كلا من البحث والإنتاج على نطاق cGMP ، مما يسمح بمراقبة الجودة طوال سير العمل - من توليد المركبات الكهربائية إلى اختبار المنتج الدوائي النهائي18،19. في حين أن توصيف EV ضروري لتأكيد الوظيفة ، يمكن أن يختلف العائد بشكل كبير بسبب الاختلافات في حجم العينة وتركيز المدخلات والخصائص الخاصة ب EV مثل شحنة السطح وخصائص الربط. تظهر البيانات الداخلية التي تستخدم خلايا MCF-7 متوسط عائد ما قبل التنقية ~ 2.85 × 108 جسيمات / مل ، مع تركيزات ما بعد التنقية تتراوح عادة من 3 × 1011 إلى 1 ×10 12 جسيمات / مل. يمكن ضبط هذه المستويات عن طريق تعديل حجم إعادة التعليق أثناء التبادل المؤقت لتتناسب مع احتياجات المصب. بالنظر إلى هذا التباين ، يتم تشجيع المستخدمين بشدة على تحسين البروتوكول باستخدام CM ذي الصلة بإعدادهم التجريبي ، لضمان عوائد قوية وقابلة للتكرار.

تعد العديد من الخطوات ضمن البروتوكول حاسمة للإنتاج الناجح لمركبات CAR-EV ، مع التركيز بشكل خاص على مراحل تحميل العينة وشطفها. تؤثر هذه الخطوات بشكل مباشر على كفاءة التقاط EV بواسطة العمود ، وبالتالي على العائد الإجمالي. تعد خطوة التبادل العازل أمرا بالغ الأهمية، حيث يمكن أن تؤدي الإزالة غير الكاملة للمواد المذابة الزائدة إلى الإضرار باستقرار المركبات الكهربائية، مما يؤدي إلى التدهور بمرور الوقت. يمكن بعد ذلك تمييز المركبات الكهربائية باستخدام طرق مثل NTA أو التنميط البروتيني. إذا كانت CAR-EVs مخصصة للمقايسات الوظيفية ، مثل دراسات الامتصاص الخلوي أو التدخلات العلاجية ، فإن العقم له أهمية قصوى. تعد خطوة التعقيم "النهائية" (0.22 ميكرومتر) ضرورية لمنع التلوث الميكروبي ، والذي قد يربك النتائج التجريبية أو يشكل مخاطر على السلامة البيولوجية. بالنظر إلى هذه العوامل ، ينصح المستخدمون بشدة بتوخي الحذر بشكل خاص خلال هذه الخطوات للحفاظ على قابلية التكاثر والسلامة الوظيفية للتحضير النهائي للمركبات الكهربائية.

قد تكون هناك حاجة إلى العديد من تعديلات البروتوكول لمعالجة المشكلات الشائعة التي تتم مواجهتها أثناء إنتاج CAR-EV. يحدث العائد المنخفض بشكل شائع بسبب التحميل دون المستوى الأمثل للسم ، إما تجاوز أو أقل من قدرة ربط العمود. لتحديد حجم الإدخال الأمثل ، ينصح بإجراء دراسة معايرة CM ، وزيادة الحمل بشكل تدريجي لتحديد نقطة الحد الأقصى لاسترداد EV. غالبا ما ينتج انسداد المرشح ، الذي يتم ملاحظته عادة أثناء خطوة الترشيح المعقمة النهائية ، عن تركيز العينة المفرط واللزوجة ، مما قد يعزز تراكم المركبات الكهربائية. في مثل هذه الحالات ، يوصى بتخفيف التحضير النهائي للمركبات الكهربائية. إذا لم يكن التخفيف ممكنا ، فقد يتم إجراء ترشيح معقم قبل التبادل العازل ؛ ومع ذلك ، فإن هذا النهج يتطلب إجراء جميع الخطوات اللاحقة في ظل ظروف معقمة صارمة للحفاظ على العقم.

يتطلب تطوير المركبات الكهربائية كعلاجات للسرطان عمليات إنتاج قابلة للتكرار والتحقق القوي من فعاليتها ضد خطوط الخلايا السرطانية المستهدفة. من القيود الشائعة ل IEX في تخصيب المركبات الكهربائية العزل المشترك للجسيمات غير EV - وهو تحد يمكن تحديده من خلال التحليل النهائي للعلامات الخاصة بالمركبات الكهربائية ، ويمكن اختزاله من خلال مزيد من تحسين CM. يجب أن يشمل توصيف إطلاق التحكم للمركبات الكهربائية ما يلي: NTA لتحديد عدد الجسيمات وحجمها ، وتركيز المركبات الكهربائية بعد التخصيب ؛ التحليل الجيني والنص للتعبير عن بناء CAR ؛ تحديد التعبير الخلوي والبروتين EV للبروتينات المسؤولة عن جمهورية إفريقيا الوسطى ، والمؤشرات الحيوية الكنسية EV وعلامات التحلل الخلوي (على سبيل المثال ، الجرانزيم B والبيرفورين) ؛ وتأثيرات الهدف وخارجه. سيوفر دمج تقنيات إضافية ، مثل المجهر الإلكتروني الناقل (TEM) ، التحقق المورفولوجي لاستكمال التوصيف القائم على الحجم ، مما يدعم تحليلا أكثر شمولا. للحفاظ على مراقبة الجودة ، يجب أن تخضع منتجات المركبات الكهربائية لاختبار تلوث الميكوبلازما والسموم الداخلية للتحقق من العقم والملاءمة للإنتاج السريري. قد يوفر استخدام تركيبات مناسبة للتخزين طويل الأجل لمركبات CAR-EV الوظيفية فرصا لتعزيز استقرارها ، بما في ذلك الحفاظ على الجودة والكمية والفعالية العلاجية. يعد التقييم المتسق للأداء الوظيفي أمرا ضروريا لضمان سلامة المنتج. والجدير بالذكر أن مقايسة MTS المستخدمة في هذه الدراسة تقدم تقييما غير مباشر للسمية الخلوية من خلال قياس النشاط الأيضي. ستستفيد الدراسات المستقبلية من دمج فحوصات السمية الخلوية الموحدة ، مثل إطلاق نازعة هيدروجين اللاكتات (LDH) ، أو تلطيخ Annexin V / PI ، أو تنميط تنشيط الكاسبيز ، لتحديد التأثيرات السامة للخلايا بشكل أكثر دقة. علاوة على ذلك ، فإن دمج مقارنات خلايا CAR (التي لم يتم دمجها في الدراسة الحالية بسبب قيود المصادر) إما بمفردها أو بالاشتراك مع CAR-EVs ، بما في ذلك العلاج الموازي لخطوط الخلايا غير السرطانية الضابطة ، يمكن أن يعمق القيمة التفسيرية للنتائج.

تسلط هذه الدراسة الضوء على الاستخدام المحتمل للمركبات الكهربائية EGFR / HER2 CAR كاستراتيجية علاجية قابلة للتطبيق لأنواع معينة من السرطانات. يمكن تعزيز فعالية المركبات الكهربائية CAR من خلال الجرعات المتعددة أو التنشيط المسبق للخلايا التائية الأم لزيادة السمية الخلوية. علاوة على ذلك ، فإن التقدم في الأساليب الناشئة ، مثل شحنات siRNA ، والتحسينات في قدرة ربط EGFR / HER2 توفر فرصا لتحسين تصميم هذه المنصات العلاجية20،21. يوفر التطبيق الواعد لمستقبلات المستضد الخيمري المزدوجة (CARs المزدوجة) في العلاج الخلوي فرصة إضافية للتقدم. يمكن أن يكون توسيع استخدام CAR المزدوج من خلال استخدام نظيراتها في المركبات الكهربائية في العلاجات خطوة محورية في توسيع نطاقها العلاجي وتعزيز طرائق العلاج22،23. توفر المراقبة في الوقت الفعلي للسمية الخلوية للخلايا السرطانية التي تحركها CAR EV (على سبيل المثال ، تنشيط caspase 3/7 ، وقراءة المعاوقة) رؤى قيمة لتحديد أنظمة الجرعات المثلى ، مما يسهل الترجمة المبسطة إلى التطبيقات المستقبلية في الجسم الحي .

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Asari K و Chelvaretnam C و Mom KT و Bhuiyan S و Pham Q و Fitri A و Palma C و Shojaee M و Khanabdali R و Hinch L و Rice G هم موظفون في INOVIQ Ltd.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يود المؤلفون أن يشكروا سيينا بارتون وهبة رشيد وسارة نيكسيريشت وشاياليني ويجناراجا وآبيل سوجيف على مساهماتهم في المختبر. يقر المؤلفون بجميع المتعاونين الداخليين والخارجيين ، حيث تدعم هذه الدراسة وتمولها INOVIQ Ltd.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
<قوية>مواد
1x محلول ملحي مخزن من الفوسفات (PBS) ، درجة الحموضة 7.4جيبكو10010049إثراء المركبات الكهربائية
1٪ كبريتات دوديسيل الصوديوم (SDS)سيغماL3771-100Gقم بإذابة 1 جرام من مسحوق SDS في 10 مل من الماء فائق النقاء
1x محلول ملحي مخزن مؤقت مع Tween-20 (TBST)الكيماويات العلمية الحراريةJ77500. ك 2خفف بالماء فائق النقاء لعمل محلول 1x (بدلا من ذلك ، قم بإعداد محلول بولي سوربات -20 / توين -20 بنسبة 0.1٪ في محلول ملحي مخزن 1x تريس)
96 صفيحة دقيقة من البوليسترين ذو القاع المسطح الشفاف والمعالج ب TC ، معقمةكورنينج3595In vitro < / em> الاختبار الوظيفي
جل بروتين صغير بولت بيس تريس بلس ، 4-12٪ ، 1.0 مم ، تنسيق WedgeWellإنفيتروجينتوصيف الخلية / EV
ألبومين مصل الأبقارسيجما ألدريتشأ 9647-100 جرامتوصيف الخلية / EV
الجسم المضاد كالنيكسينإشارات الخلية2433 ثانيةتوصيف الخلية / EV
خلايا CAR-NK / TProMab Biotechnologiesيتفاوتيعتمد مجال ربط الترابط خارج الخلية CAR على الهدف المفضل على الخلايا المتلقية
CellTiter 96 Aمقايسة تكاثر الخلايا ذات المحلول الواحد (MTS)بروميجاجي 3580In vitro < / em> الاختبار الوظيفي
cOmplete ، ميني ، كوكتيل مثبط البروتياز الخالي من EDTAروش11836170001تحلل الخلية
كاشف الكشف عن النشاف الغربي ECLأميرشامRPN2232توصيف الخلية / EV
المخزن المؤقت للشطفإينوفيكإثراء/عزل المركبات الكهربائية
مخزن التوازنإينوفيكإثراء/عزل المركبات الكهربائية
عمود EXO-ACE IEXإينوفيكتخصيب / عزل EV للمقايسة الوظيفية النهائية
معرف براءة الاختراع AU2024901931
EXO-NET عموم إكزوسوم التقاط الخرزإينوفيكعزل EV للتوصيف النهائي
معرف براءة الاختراع WO/2014/011673
الأجسام المضادة Granzyme Bإشارات الخلية4275توصيف الخلية / EV
IL-2 بشري ، درجة ممتازةميلتيني بيوتيك130-097-744ثقافة خالية من الزينو للخلايا T / NK
مكدسات نقل iBlot 2 ، PVDFإنفيتروجينتوصيف الخلية / EV
ImmunoCult-XF (cGMP)تقنيات الخلايا الجذعية100-0956ثقافة خالية من الزينو للخلايا T / NK
ك -562ATCCسي سي إل -243In vitro < / em> الاختبار الوظيفي
MCF-7ATCCإتش تي بي -22In vitro < / em> الاختبار الوظيفي
وحدة تصفية حقنة Millex-GP ، 0.22 & mميرك ميليبورSLGPR33RSالترشيح الطرفي
المخزن المؤقت للتجديدإينوفيكإثراء/عزل المركبات الكهربائية
المخزن المؤقت RIPA (10X)تقنية إشارات الخلية9806تحلل الخلية
محلول تريبان الأزرق ، 0.4٪جيبكو15250061تقييم صلاحية الخلية وكثافتها
عازلة الغسيلإينوفيكإثراء/عزل المركبات الكهربائية
<قوية>معدات< / قوية>
عداد الخلايا الآليإنفيتروجينالكونتيسة الثانية فلوريداتقييم صلاحية الخلية وكثافتها
أداة الاستخراج الآلي على الطاولةإنفيتروجيننظام KingFisher Apexنظام تنقية آلي عالي الإنتاجية
انظر الرابط للحصول على تفاصيل البروتوكول: https://www.inoviq.com/site/technology/resources
مجهر مضانزييسأكسيو أوبزرفر 7ثقافة الخلية
تحليل تتبع الجسيمات النانوية (NTA)Particle Metrix GmbHزيتافيو PMX-130تحليل الجسيمات
قارئ اللوحةبي إم جي لابتيكسبيكتروستار نانوIn vitro < / em> الاختبار الوظيفي
جهاز طرد مركزي مبرد على الطاولةبيكمان كولترأفانتي J-15Rزراعة الخلايا و معالجة تخصيب المركبات الكهربائية
خزان جل صغير SDS-PAGEإنفيتروجينأ25977توصيف الخلية / EV
نظام نقل اللطخة الغربيةإنفيتروجينآي بلطعة 2توصيف الخلية / EV

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Park, J. H., Geyer, M. B., Brentjens, R. J. CD19-targeted CAR T-cell therapeutics for hematologic malignancies: Interpreting clinical outcomes to date. Blood. 127 (26), 3312-3320 (2016).
  2. Jain, M. D., Smith, M., Shah, N. N. How I treat refractory CRS and ICANS following CAR T-cell therapy. Blood. 141 (20), 2430-2442 (2023).
  3. Tang, X. J., et al. Therapeutic potential of CAR-T cell-derived exosomes: A cell-free modality for targeted cancer therapy. Oncotarget. 6 (42), 44179-44190 (2015).
  4. St-Denis-Bissonnette, F., et al. A clinically relevant large-scale biomanufacturing workflow to produce natural killer cells and natural killer cell-derived extracellular vesicles for cancer immunotherapy. JEV. 12 (12), e12387(2023).
  5. Jiang, Y., et al. Hypoxia enhances the production and antitumor effect of exosomes derived from natural killer cells. Ann Transl Med. 9 (6), 473-473 (2021).
  6. Decot, V., et al. Natural-killer cell amplification for adoptive leukemia relapse immunotherapy:comparison of three cytokines IL-2, IL-15, or IL-7 and impact on NKG2D, KIR2DL1, and KIR2DL2 expression. Exp Hematol. 38 (5), 351-362 (2010).
  7. Kim, I. Y., et al. Functional enhancement of exosomes derived from NK cells by IL-15 and IL-21 synergy against hepatocellular carcinoma cells: The cytotoxicity and apoptosis in vitro study. Heliyon. 9 (6), e16962-e16962 (2023).
  8. Mehdiani, A., et al. An innovative method for exosome quantification and size measurement. J Vis Exp. (95), e50974(2015).
  9. Bachurski, D., et al. Extracellular vesicle measurements with nanoparticle tracking analysis-an accuracy and repeatability comparison between NanoSight NS300 and ZetaView. JEV. 8 (1), 1596016(2019).
  10. Khanabdali, R., et al. High throughput surface epitope immunoaffinity isolation of extracellular vesicles and downstream analysis. Biol Methods Protoc. 9 (1), bpae032(2024).
  11. Salomon, C., et al. Early detection of ovarian cancer: An accurate high-throughput extracellular vesicle test. J Clin Oncol. 43 (16_suppl), 5582-5582 (2025).
  12. Fu, W., et al. CAR exosomes derived from effector CAR-T cells have potent antitumour effects and low toxicity. Nat Commun. 10 (1), 1-12 (2019).
  13. Zheng, W., et al. Inhalable CAR-T cell-derived exosomes as paclitaxel carriers for treating lung cancer. J Transl Med. 21 (1), 383(2023).
  14. Tian, J., et al. Engineered exosome for drug delivery: Recent development and clinical applications. Int J Nanomed. 18, 7923-7940 (2023).
  15. Chen, Z., et al. Encapsulation and assessment of therapeutic cargo in engineered exosomes:a systematic review. J Nanobiotechnology. 22 (1), 18(2024).
  16. Basyoni, A. E., Atta, A., Salem, M. M., Mohamed, T. M. Harnessing exosomes for targeted drug delivery systems to combat brain cancer. Cancer Cell Int. 25 (1), 150(2025).
  17. Coughlan, C., et al. Exosome isolation by ultracentrifugation and precipitation and techniques for downstream analyses. Curr Protoc Cell Biol. 88 (1), e110(2020).
  18. Zhang, W., et al. Large-scale separation and purification of exosomes using ion-exchange chromatography. Biomed Res Ther. 11 (4), 6348-6356 (2024).
  19. Fernandes, R. P., et al. Targeted isolation of extracellular vesicles from cell culture supernatant using immuno-affinity chromatography. Sep Purif Technol. 358 (Part A), 130312-130312 (2024).
  20. Jiang, J., et al. Anti-EGFR ScFv functionalized exosomes delivering LPCAT1 specific siRNAs for inhibition of lung cancer brain metastases. JNB. 22 (1), 159(2024).
  21. Dobersberger, M., et al. An engineering strategy to target activated EGFR with CAR T cells. Cell Rep Methods. 4 (4), 100728-100728 (2024).
  22. Shi, M., et al. Bispecific CAR T cell therapy targeting BCMA and CD19 in relapsed/refractory multiple myeloma:a phase I/II trial. Nat Commun. 15 (1), 3371(2024).
  23. Roddie, G., Amrolia, P. J. Dual targeting CAR-T cells for B-cell acute lymphoblastic leukaemia and B-cell non-Hodgkin lymphoma. Blood Adv. 9 (4), 704-721 (2024).

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

CAR CAR HER2

مقالات ذات صلة