يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

الطعوم الدهنية البيضاء والبني: نهج لتصحيح العجز التناسلي والتمثيل الغذائي والكلوي في الفئران السوداء والسمراء (BTBR) التي تعاني من البدينة

1K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/68759

⸱

سبتمبر 9, 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Albert Einstein Research and Education Institute, Hospital Israelita Albert Einstein, 2School of Medicine, Faculdade Israelita de Ciências da Saúde Albert Einstein, 3Nephrology Division, Federal University of São Paulo

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

نقدم هنا بروتوكول زرع الأنسجة الدهنية باللونين الأبيض والبني الذي يقدم استراتيجية واعدة لعكس ضعف الخصوبة والسمنة وارتفاع السكر في الدم ، مع تحسين وظائف الكلى في فئران BTBR المصابة بالسكري والسمنة.

الملخص

برزت زراعة الأنسجة الدهنية البيضاء (WAT) والأنسجة الدهنية البنية (BAT) كاستراتيجية علاجية واعدة لعكس اضطرابات التمثيل الغذائي دون الحاجة إلى الإدارة المستدامة للعوامل الخارجية. يعمل WAT كعضو رئيسي للغدد الصماء يشارك في توازن الطاقة ، في حين أن BAT هو نسيج حراري بالغ الأهمية للتنظيم الحراري. يحاكي نموذج الفأر السمنة المفرطة Black and Tan Brachyuric (BTBR) عن كثب السمات الرئيسية للسمنة وداء السكري من النوع 2 (T2DM) وأمراض الكلى السكرية (DKD) ، بما في ذلك ارتفاع السكر في الدم ومقاومة الأنسولين ونقص التمثيل الغذائي وضعف الخصوبة.

باستخدام البروتوكول الموضح أدناه ، أدى الزرع المشترك ل WAT و BAT المشتق من المتبرعين من النوع البري وغير المتجانس في BTBR إلى متلقي السمنة BTBR إلى عكس ضعف الخصوبة ، وتوهين زيادة الوزن ، وتطبيع التحكم في نسبة السكر في الدم ، وتحسين المعلمات الكلوية. والجدير بالذكر أنه تم تقليل تضخم الكلى وموت الخلايا المبرمج ، بينما تم الحفاظ على أعداد الخلايا البودوسيا. تشير هذه النتائج إلى أن زرع WAT و BAT قد يمثل استراتيجية علاجية بديلة لعلاج T2DM ، مع فوائد متزامنة في التخفيف من DKD والسمنة. علاوة على ذلك ، قد يساعد هذا النهج في زيادة عدد الفئران السمنة BTBR القابلة للحياة داخل مستعمرات الجسم الحيوي. قد يسهل إجراء مزيد من التحقيق في الآليات الأساسية الترجمة السريرية لهذا التدخل.

المقدمة

يمثل مرض الكلى السكري (DKD) وداء السكري من النوع 2 (T2DM) والسمنة ظروفا مترابطة ومتعددة العوامل تشكل تحديات صحية عالمية كبيرة ومتنامية. DKD ، الذي يعرف بأنه التعايش بين داء السكري (DM) وأمراض الكلى المزمنة في غياب أسباب أخرى يمكن تحديدها لتلف الكلى ، يؤثر على ما يقرب من 20-40٪ من الأفراد المصابين بمرض السكري1،2. T2DM هو اضطراب استقلابي جهازي يتميز بارتفاع السكر في الدم المزمن واضطرابات في توازن الجلوكوز والدهون والأنسولين. وهي تصنف من بين الأسباب العشرة الرئيسية الأولى للوفيات في جميع أنحاء العالم ، وتؤثر حاليا على أكثر من 500 مليون فرد3. تؤثر السمنة ، مدفوعة باختلال التوازن المزمن بين استهلاك الطاقة وإنفاقها ، الآن على واحد من كل ثمانية أشخاص على مستوى العالم وهي مساهم رئيسي في كل من المراضة والوفيات4. هذه الحالات الثلاثة مترابطة ارتباطا وثيقا: تزيد السمنة بشكل ملحوظ من خطر الإصابة بمرض السكري 2 ، والذي بدوره يزيد بشكل كبير من خطر الإصابة ب1،4 DKD. يؤكد الانتشار العالمي المتصاعد للسمنة ، T2DM ، و DKD على الحاجة الملحة لفهم أعمق لآلياتهم الفيزيولوجية المرضية وتطوير استراتيجيات علاجية فعالة.

برزت زراعة الخفافيش كاستراتيجية علاجية واعدة لمكافحة السمنة و T2DM. ارتبط هذا التدخل بتخفيضات في وزن الجسم ، وتحسينات مقاومة الأنسولين والتنكس الدهني الكبدي ، وزيادة في الأديبونكتين المتداول ، وتعبير مستقبلات بيتا 3 الأدرينالية ، والجينات المشاركة في أكسدة الأحماض الدهنية5. للملاحظة ، يمكن تصنيف الأنسجة الدهنية للثدييات إلى ثلاثة أنواع رئيسية بناء على اللون: الأبيض والبني والبيج6. يبدأ WAT في التوسع بعد الولادة بفترة وجيزة وينتشر على نطاق واسع في جميع أنحاء الجسم. يعمل كعضو رئيسي للغدد الصماء ، حيث يخزن الطاقة الزائدة على شكل دهون ثلاثية عن طريق عزل الجلوكوز المتداول والأحماض الدهنية الحرة6. في المقابل ، يلعب BAT دورا مهما في التنظيم الحراري عن طريق تبديد الطاقة كحرارة عن طريق توليد الحرارة غير المرتجف بدلا من تخزينها على أنها ATP6. ينخفض نشاط BAT مع تقدم العمر والسمنة والDM. في البالغين ، يشتمل BAT على جزء صغير من إجمالي الأنسجة الدهنية ويقع بشكل أساسي في المناطق فوق الترقوة وعنق الرحم في البشر ، بينما في الفئران ، يقع في الغالب في المنطقة بين الكتف6. غني بالميتوكوندريا ، يستهلك BAT كميات كبيرة من الجلوكوز والأحماض الدهنية ويرتبط بمقاومة زيادة الوزن7. تدعم الأدلة الناشئة دور BAT في تعزيز نمط ظاهري أصغر حجما وأكثر ملاءمة من الناحية الأيضية ، مما يولد اهتماما متزايدا باستخدامه العلاجي من خلال الزرع.

يلعب اللبتين ، وهو هرمون يفرز بشكل أساسي عن طريق WAT ، دورا مركزيا في تنظيم توازن الطاقة والتمثيل الغذائي والخصوبة8. يعمل على الجهاز العصبي المركزي لتحفيز إفراز هرمون الإفراج عن موجهة الغدد التناسلية (GnRH) في منطقة ما تحت المهاد ، مما يعزز لاحقا إفراز هرمون اللوتين (LH) والهرمون المنبه للجريب (FSH) من الغدة النخامية الأمامية9. يعمل اللبتين أيضا بشكل مباشر على خلايا المبيض والخلايا الحبيبية لدعم نمو البصيلات9.

نموذج الفأر BTBRob / ob (BTBR السمنة) ، المصنف وراثيا على أنه BTBR. Cg-Lep ob / WiscJ (أسود وبني ، سمين ، معنقد ؛ انظر جدول المواد) ، متماثل الزيجوت لفقدان الوظيفة التلقائي في جين اللبتين (Lep) ويعرض مجموعة من التشوهات الأيضية والإنجابية ، بما في ذلك ارتفاع السكر في الدم ، وعدم تحمل الجلوكوز ، وفرط أنسولين الدم ، وفرط شحوم الدم ، وضعف التئام الجروح ، ونقص التمثيل الغذائي ، وانخفاض حرارة الجسم ، وضعف الخصوبة بسبب قصور الغدد التناسلية القصور الغدد التناسلية. عادة ما يصاب الذكور بمرض السكري المتوسط في عمر ستة أسابيع ، بينما تفعل الإناث ذلك بحلول ثمانية أسابيع10. ارتفاع السكر في الدم شديد وتدريجي ، حيث تتجاوز مستويات الجلوكوز في الدم الصائم 400 مجم / ديسيلتر بعشرة أسابيع. بالإضافة إلى ذلك ، يظهر الذكور الذين يعانون من السمنة المفرطة BTBR بيلة زلالية تعتمد على الوقت بحلول الأسبوع الثامن ، وتتقدم إلى DKD الواضح من الناحية النسيجية ، بما في ذلك التمدد المتوسط و podocyturia. تثبت هذه الميزات الفئران البدينة BTBR كنموذج قوي قبل السريري يلخص عن كثب DKDالبشري 10.

نظرا للعواقب الأيضية العميقة لنقص اللبتين ، تم التحقيق في العديد من الاستراتيجيات لعكس النمط الظاهري OB / ob ، بما في ذلك العلاج باستبدال اللبتين وزرع الأنسجة الدهنية. في حين أن معظم الدراسات قد استخدمت فئران ob / ob على خلفية C57BL / 6 ، إلا أن القليل نسبيا قد حقق في هذه التدخلات في سلالة BTBR الأكثر عرضة للخطر من الناحية الأيضية. في الفئران C57BL / 6 ob / ob ، ثبت أن زرع WAT يعمل على تطبيع مستويات الأنسولين ، وتحسين حساسية الأنسولين ، واستعادة الخصوبة8. علاوة على ذلك ، ثبت أن زرع BAT في الفئران الخالية من الدهون C57BL / 6 يمنع زيادة وزن الجسم ، ويحسن تحمل الجلوكوز وحساسية الأنسولين ، مع تقليل مقاومة الأنسولين ، لا سيما في سياق السمنة الناجمة عن النظام الغذائي عالي الدهون11. بالإضافة إلى ذلك ، تبين أن زرع BAT يحسن ديناميكا الدم القلبية وصحة التمثيل الغذائي12. على الرغم من النتائج المشجعة ، إلا أن هذه الدراسات تقدم العديد من القيود المهمة. أجريت معظم التحقيقات على الفئران C57BL / 6 ob / ob ، والتي تظهر نمطا ظاهريا أيضيا خفيفا نسبيا مقارنة بسلالة ob / ob BTBR الأكثر تضررا. وبالتالي ، فإن قابلية تعميم هذه النتائج على النماذج ذات المقاومة الأنسولين الأكثر وضوحا ، وارتفاع السكر في الدم ، والسمنة ، وأمراض الكلى محدودة. علاوة على ذلك ، لم تتم دراسة آثار استبدال اللبتين وزرع الأنسجة الدهنية بشكل كاف في خلفية BTBR ، مما يمثل فجوة حرجة في الأدبيات. كما تم تقييم العديد من هذه التدخلات في الخالية من الدهون أو على مدى فترات قصيرة ، والتي قد لا تلتقط بشكل كاف التعقيد والطبيعة المزمنة لمرض التمثيل الغذائي البشري. على الرغم من الإبلاغ عن تحسينات في حساسية الأنسولين وتحمل الجلوكوز والخصوبة ، إلا أن الآليات الأساسية لا تزال غير مفهومة جيدا ، ولا تزال الأهمية الانتقالية لهذه النتائج في البيئات السريرية غير مؤكدة. والجدير بالذكر أن التأثيرات الأيضية المشتركة لزرع الأنسجة الدهنية البيضاء والبنية في فئران BTBR ob / ob لا تزال غير مستكشفة إلى حد كبير.

الهدف من هذه الدراسة هو توحيد بروتوكول لزرع WAT و BAT في الفئران البدينة BTBR وتقييم آثارها على استعادة الخصوبة ووظائف الكلى والتغيرات النسيجية. الهدف الثانوي هو تسهيل توسع مستعمرة BTBR البدينة ، مع تقليل فقدان الفئران غير المتجانسة (BTBR ob / +) والنوع البري (BTBR +/+) في.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

تمت الموافقة على جميع التجارب من قبل اللجان المؤسسية لرعاية واستخدامها في مستشفى إسرائيليتا ألبرت أينشتاين (HIAE) وتم تسجيلها لدى المعهد اليهودي للبحث والتعليم ، ساو باولو ، SP ، البرازيل (رقم 3309-18 ورقم 4900-21). يتم سرد تفاصيل الكواشف والمعدات المستخدمة في جدول المواد.

ملاحظة: تم استخدام الفئران البدينة BTBR (خروج المغلوب من جين اللبتين ، متماثل الزيجوت ، ob / ob) كنموذج ل T2DM و DKD والسمنة. عملت إناث الفئران البدينة BTBR التي تتراوح أعمارها بين 4-5 أسابيع كمتلقي لزرع الأنسجة الدهنية. كانت المانحة عبارة عن فئران BTBR ob /+ (متغاير الزيجوت) أو +/+ (النوع البري) (النمط الجيني غير مؤكد ، ولكن النمط الهزيل بشكل ظاهري). في وقت الزرع ، كان متوسط وزن الجسم للفئران المتلقية يتراوح من 25 إلى 32 جراما. تم إيواء جميع في أقفاص جيدة التهوية بشكل فردي في ظل ظروف قياسية ، مع إمكانية الوصول إلى الطعام والماء ، ودورة الضوء / الظلام لمدة 12 ساعة ، والتحكم في درجة الحرارة المحيطة. تم إيواء خمسة كحد أقصى لكل قفص.

1. الإجراء الجراحي

  1. القتل الرحيم للفئران المانحة باستخدام جرعة زائدة من الأيزوفلوران بنسبة 100٪ (2.5-5٪) ، متبوعا بخلع عنق الرحم (الشكل 1 أ).
  2. ضع في حالة الاستلقاء الظهري (البطن لأعلى) وتطهير أسفل البطن باستخدام 0.5٪ كلور هكسيدين ثنائي جلوكونات كحولي. قم بعمل شق في منتصف البطن بطول 2-3 سم لحصاد WAT الإربي (الشكل 1 ب). ضع المنديل المستخرج في أنبوب سعة 3 مل على الثلج.
  3. أعد وضع في حالة الاستلقاء البطني (البطن لأسفل) وقم بعمل شق خط الوسط بطول 1-2 سم بين لوح الكتف لحصاد BAT بين الكتف (الشكل 1 ج). تجمع الأنسجة الدهنية من 10-14 متبرعا. تأكد من أن إجمالي WAT + BAT يساوي 10-15٪ من وزن جسم المتلقي.
  4. قم بتجانس WAT و BAT بشكل منفصل باستخدام إبرة 16 جم وحقنة 3 مل (الشكل 1 د).
  5. قم بقياس الوزن النهائي للدهون باستخدام ميزان تحليلي (الشكل 1E) واحتفظ بالعينات على الجليد حتى الزرع.
  6. قم بتخدير الفئران السمنة BTBR المتلقية في غرفة إيزوفلوران 100٪ v / v (تحريض 2.5-5٪) والحفاظ على التخدير عن طريق قناع الوجه (1.5-2.5٪). بمجرد أن ينخفض التنفس إلى ≤1 نفس كل 3 ثوان ، ضع في حالة استلقاع بطني (الشكل 1F).
  7. تطهير المنطقة الظهرية باستخدام 2.0٪ من الكلورهيكسيدين ثنائي جلوكونات غير كحولي (الشكل 1 ز).
  8. حقن 100-200 ميكرولتر من الدهون المتجانسة لكل موقع باستخدام إبرة 16 جم عبر 6-26 موقعا على السطح الظهري. استخدم الملقط للمساعدة في التوزيع. ضع محلول الكلورهيكسيدين 0.5٪ على كل موقع حقن بعد الزرع (الشكل 1H).
  9. يتم تطبيق جرعة عضلية من الترامادول (40 ملغ/كغ؛ محلول 50 ملغ/مل) للتسكين المنزل بشكل فردي لمنع الإصابة أثناء التعافي.
  10. في اليوم التالي يتم تنظيف مواقع الحقن بمحلول الكلورهيكسيدين 0.5٪ وتطبيق جرعة ثانية من الترامادول.

figure-protocol-1
الشكل 1: تخطيطي لإجراء زراعة الدهون. (أ) القتل الرحيم للمتبرعين باستخدام الأيزوفلوران في صندوق مغلق. (ب) حصاد WAT الإربي. (ج) حصاد الخفافيش بين الكتف. (د) تجانس الدهون. (ه) وزن الدهون. (و) التخدير المتلقي. (ز) تعقيم الظهر. (ح) حقن الدهون بتقنية الملقط. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

2. التزاوج بعد الزرع

  1. بعد أسبوعين من الزرع ، تشارك في إياث الفئران البدينة BTBR مع ذكور الفئران BTBR ob /+ (متغاير الزيجوت) للتزاوج.

3. التقييمات الوظيفية

  1. قم بقياس وزن الجسم أسبوعيا باستخدام ميزان تحليلي.
  2. تقييم نسبة الجلوكوز في الدم أثناء الصيام باستخدام جهاز قياس السكر في خمس نقاط زمنية: الأسابيع 4-7 و 8-10 و 14-16 و 18-20 و 24-26.
  3. ضع في قفص استقلابي مع إمكانية الوصول إلى الماء لمدة 6 ساعات ، لجمع عينة البول.
  4. قم بقياس مستويات الألبومين البولي باستخدام طريقة ELISA وتحديد مستويات الكرياتينين البولي باستخدام طريقة حمض البيكريك اللوني في 6-8 أسابيع. احسب نسبة الألبومين إلى الكرياتينين في البول (uACR) بقسمة تركيز الألبومين (ميكروغرام) على تركيز الكرياتينين (مجم).

4. التحليل المورفولوجي

  1. القتل الرحيم للفئران المتلقية في عمر 24 أسبوعا عن طريق إعطاء جرعة زائدة من الأيزوفلوران بنسبة 100٪ (2.5-5٪) ، متبوعا بخلع عنق الرحم لضمان الوفاة.
  2. اجمع المبايض والكلى والبنكرياس في عمر 24 أسبوعا.
  3. ضع الأعضاء المحصودة في الفورمالين المحايد بنسبة 10٪ وثبته في درجة حرارة الغرفة لمدة 24-48 ساعة.
  4. بعد التثبيت ، قم بمعالجة الأنسجة باستخدام معالج الأنسجة الأوتوماتيكي لإزالة الماء وتضمينها في البارافين للتحليل النسيجي.
    1. اغمر الأنسجة بالتتابع في محاليل الإيثانول التالية لمدة ساعة واحدة لكل منهما: 70٪ و 85٪ و 95٪ (2x) و 100٪ (2x).
    2. انقل الأنسجة إلى زيلين طازج لمدة ساعة واحدة ، متبوعا بحمام زيلين ثان لمدة ساعة إضافية.
    3. اغمر الأنسجة في شمع البارافين المذاب عند 6 درجات مئوية لمدة ساعة واحدة ، ثم انقلها إلى البارافين الطازج لمدة ساعة أخرى.
    4. قم بتوجيه الأنسجة في قالب ساخن مملوء بالبارافين المنصهر واتركها تصلب في درجة حرارة الغرفة.
    5. قطع أربعة أقسام غير متتالية بسمك 3.5 ميكرومتر من كل كتلة باستخدام ميكروتوم. قم بتعويم الأشرطة على حمام مائي بدرجة حرارة 4 درجات مئوية لتسطيحها ، ثم قم بتركيب الأقسام الفردية على شرائح زجاجية موجبة الشحنة. صفي الماء الزائد وضعي الشرائح على طبق تسخين 3 درجات مئوية لمدة 60 دقيقة.
  5. تقييم عدد البصيلات في المبايض وحجم جزر البنكرياس باستخدام تلطيخ الهيماتوكسيلين والأيوسين (H & E).
    1. احتضان شرائح المناديل المدمجة بالبارافين في فرن على حرارة 6 درجات مئوية لمدة 1 ساعة. انقل الشرائح إلى وعاء به زيلين طازج واحتضنه لمدة 30 دقيقة لإذابة البارافين ، واستبدل الزيلين بمحلول جديد بعد 15 دقيقة.
    2. اغمر الشرائح بالتتابع لمدة 30 ثانية لكل منها في خليط الزيلين: الإيثانول ، 100٪ إيثانول ، 85٪ إيثانول ، 70٪ إيثانول.
    3. اشطفها بماء الصنبور (10 ثوان) ، وصمة عار في هيماتوكسيلين هاريس (30 ثانية) ، واغمسها في 95٪ إيثانول (3 ثوان).
    4. اغمر الشرائح بالتتابع في خليط 70٪ و 85٪ و 100٪ إيثانول و xylen: إيثانول لمدة 30 ثانية لكل منهما.
    5. اغمر الشرائح في الزيلين الطازج لمدة 5 دقائق ، متبوعا بحمام زيلين ثان لمدة 5 دقائق إضافية لضمان تثبيت البقع.
    6. قم بتركيب الشرائح مع الأغطية باستخدام وسيط تثبيت.
  6. تقييم حجم الكبيبات وتمدد المصفوفة المتوسطة باستخدام تلطيخ حمض شيف الدوري (PAS) لأقسام الكلى.
    1. احتضان الشرائح عند 6 درجات مئوية لمدة 1 ساعة واغمرها في الزيلين الطازج لمدة 5 دقائق لإزالة البارافين من أقسام الأنسجة.
    2. اغمر الشرائح بالتتابع في 99٪ و 95٪ و 70٪ من الإيثانول لمدة 30 ثانية لكل منها.
    3. اشطفها بماء الصنبور لمدة 10 ثوان.
    4. ضع 10 قطرات من الحمض الدوري واحتضنه لمدة 10 دقائق.
    5. اشطفها بالماء الجاري لمدة 3 دقائق ثم جففها.
    6. أضف 10 قطرات من كاشف شيف واحتضن لمدة 15 دقيقة في غرفة مظلمة.
    7. اشطفها بالماء الجاري لمدة 3 دقائق ثم جففها.
    8. أضف 10 قطرات من هيماتوكسيلين هاريس لمواجهة البقع واحتضانها لمدة 3 دقائق.
    9. اشطف الشرائح بالماء الجاري لمدة 3 دقائق ثم جففها.
    10. اغمر الشرائح بالتتابع في خليط 70٪ و 85٪ و 100٪ إيثانول و xylen: الإيثانول لمدة 30 ثانية لكل منهما.
    11. اغمر الشرائح في الزيلين الطازج لمدة 5 دقائق ، متبوعا بحمام زيلين ثان لمدة 5 دقائق إضافية لإصلاح البقعة.
    12. قم بتركيب الشرائح مع الأغطية باستخدام وسيط تثبيت.
  7. تقييم موت الخلايا المبرمج الجريبي (الكاسباز المشقوق -3) في المبايض والكلى ، وعدد الخلايا البودوبية (خلايا WT-1+) في الكلى عن طريق الكيمياء المناعية (IHC).
    1. احتضان الشرائح عند 6 درجات مئوية لمدة 1 ساعة ، متبوعا بمعالجة الزيلين لمدة 30 دقيقة (استبدل الزيلين بعد 15 دقيقة).
    2. اغمر الشرائح بالتتابع في 100٪ و 90٪ و 70٪ إيثانول وماء (30 ثانية لكل منهما).
    3. قم بإجراء استرجاع المستضد عن طريق تسخين الشرائح في عازلة السترات (درجة الحموضة 6.0) عند 95 درجة مئوية لمدة 12 دقيقة باستخدام الميكروويف لكشف مواقع المستضد.
    4. اشطفها في مخزن غسيل 1x لمدة 15 دقيقة ، مع تغيير المخزن المؤقت كل 5 دقائق.
    5. منع البيروكسيديز الذاتية ببيروكسيد الهيدروجين لتجنب تلطيخ الخلفية ومنع الارتباط غير المحدد باستخدام ألبومين مصل البقر (BSA).
      ملاحظة: بالنسبة للتلوين الكاسبيز-3 المشقوق، يجب منع نشاط البيروكسيديز الداخلي لمدة 7 دقائق و30 ثانية. لتلوين WT-1 ، قم ببلوك لمدة 5 دقائق.
    6. كرر الغسيل كما في 4.7.4.
    7. تطبيق 10 ميكرولتر من الأجسام المضادة الأولية ضد الكاسباز-3 المشقوق (موت الخلايا المبرمج) و WT-1 (الخلايا المبرمجة). احتضن طوال الليل عند درجة مئوية في غرفة مظلمة ورطبة.
    8. كرر الغسيل كما في 4.7.4.
    9. ضع 10 ميكرولتر من الأجسام المضادة الثانوية المقترنة بالفجل (HRP) لمدة 1.5 ساعة في درجة حرارة الغرفة في الظلام.
    10. كرر الغسيل كما في 4.7.4.
    11. ضع 10 ميكرولتر من DAB (3،3'-Diaminobenzidine) كروموجين لتصور نشاط HRP ، مما ينتج عنه راسب بني.
      ملاحظة: لتلطيخ الكاسباز المشقوق 3 ، احتضان مع DAB لمدة 1 دقيقة و 30 ثانية ؛ لتلطيخ WT-1 ، احتضان لمدة 45 ثانية.
    12. كرر الغسيل كما في 4.7.4.
    13. قم بمضادة الأقسام باستخدام هيماتوكسيلين هاريس لمدة 30 ثانية إلى 1 دقيقة ، حسب الكثافة المطلوبة.
    14. اشطفها بماء الصنبور لمدة 1-2 دقيقة أو حتى يصبح الماء صافيا.
    15. اغمر الشرائح بالتتابع في 70٪ و 85٪ و 95٪ و 100٪ من الإيثانول (30 ثانية لكل منهما) ، وخليط الزيلين: الإيثانول (30 ثانية).
    16. ضع الشرائح في محلول زيلين طازج لمدة 5 دقائق ، وانقلها إلى حمام زيلين ثان لمدة 5 دقائق إضافية.
    17. قم بتركيب الشرائح مع الأغطية باستخدام وسيط تثبيت.
  8. قم بتحليل المقاطع الملطخة باستخدام مجهر ضوئي مقلوب بتكبير 40x. استخدم برنامج تحليل الصور الآلي لتحديد مناطق الاهتمام (ROIs) لكل عضو.
    1. المبايض (H & E): عد وصنف أنواع البصيلات لكل قسم.
    2. البنكرياس (H&E): حدد الجزر الصغيرة باستخدام أداة عائد الاستثمار لتتبع الخطوط العريضة لكل جزيرة بنكرياس يدويا. بمجرد تحديد عائد الاستثمار ، سيقوم البرنامج تلقائيا بحساب المساحة بالميكرومتر المربع (ميكرومتر2).
    3. الكلى (H & E): حدد مساحة الكبيبات عن طريق تحديد أداة عائد الاستثمار لتتبع الحافة الخارجية لكل خصلة كبيبية يدويا. استخدم الدالة قياس المساحة للحصول على مساحتها بالميكرومتر2. بعد التتبع ، سيقوم البرنامج تلقائيا بحساب المساحة بالميكرومتر2.
    4. الكلى (PAS)
      1. لتحديد المصفوفة المتوسطة ، استخدم أداة العتبة لتحديد وتحديد مناطق PAS الإيجابية (أرجواني / وردي) داخل الكبيبة. اضبط عتبات اللون والشدة حسب الحاجة لتحديد المناطق الملطخة ب PAS بدقة، باستخدام نافذة المعاينة لتحسين التحديد. حدد منطقة PAS المحددة كعائد استثمار. بعد التتبع ، سيقوم البرنامج تلقائيا بحساب المساحة بالميكرومتر2.
      2. تطبيع تمدد المصفوفة المتوسطة عن طريق حساب النسبة المئوية للمساحة الموجبة ل PAS بالنسبة إلى المساحة الكبيبية الإجمالية.
    5. المبايض والكلى (IHC للكاسپاز المشقوق -3)
      1. حدد عائد الاستثمار المقابل للهياكل المسامية أو الكبيبية. ضع قناعا ملونا لتحديد التلوين الإيجابي DAB (البني) عن طريق ضبط عتبات تدرج اللون والتشبع والكثافة. استخدم وظيفة المعاينة لضمان الاختيار الدقيق لإشارة DAB وتحسين إعدادات العتبة لاستبعاد تلطيخ الهيماتوكسيلين (الأزرق) والخلفية غير المحددة.
      2. بمجرد تحديد العتبة المطلوبة ، قم بتعيين التحديد كعائد استثمار وقم بقياس المنطقة الموجبة ل DAB (ميكرومتر2). احسب النسبة المئوية للمنطقة الملطخة بقسمة المساحة الموجبة ل DAB على إجمالي مساحة عائد الاستثمار والضرب في 100.
    6. الكلى (IHC ل WT-1+): عد النوى الملطخة باللون البني لكل كبيبة لتقدير عدد الخلايا البودوسيا.
      ملاحظة: عدد البصيلات لكل قسم (متوسط ± SD) كان: السمنة BTBR (7.7 ± 3.11) ، المزروعة (5.8 ± 3.24) ، BTBR العجاف (4.6 ± 5.62). عدد الجزر لكل قسم (متوسط ± SD) كان: السمنة BTBR (18.3 ± 8.42) ، المزروعة (9.7 ± 5.45) ، BTBR العجاف (6.8 ± 1.72). تقييم 30 كبيبة لكل لقياس تمدد المنطقة الكبيبية والمصفوفة المتوسطة. تم التعبير عن البيانات كمتوسط ± الانحراف المعياري (SD) أو الخطأ المعياري للمتوسط (SEM) ، حسب الاقتضاء. تم تقييم الحالة الطبيعية باستخدام اختبار شابيرو ويلك. تم تطبيق ANOVA أحادي الاتجاه مع اختبار Tukey اللاحق للمقارنات بين المجموعات الموزعة بشكل طبيعي. تم تحليل المقاييس المتكررة باستخدام ANOVA ثنائي الاتجاه أو نماذج التأثيرات المختلطة ، مع تصحيح Geisser-Greenhouse عند الضرورة. بالنسبة للبيانات غير الموزعة بشكل طبيعي ، تم استخدام اختبار Kruskal-Wallis مع مقارنات Sidak المتعددة. قم بإجراء جميع التحليلات باستخدام برنامج إحصائي مناسب ، مع تحديد الدلالة الإحصائية عند p < 0.05 (انظر جدول المواد للحصول على التفاصيل).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

كمية الدهون المزروعة وفعالية البروتوكول
بعد توحيد البروتوكول ، تم تقييم حجمين لزرع الدهون (5-9.9٪ و 10-15٪ بالنسبة لوزن جسم المتبرع) للتأكد من فعاليتهما ، والتي تم تعريفها على أنها تحقيق حمل واحد على الأقل مما يؤدي إلى ذرية قابلة للحياة. أظهرت المجموعة 5-9.9٪ معدل نجاح 23.8٪ ، بينما حققت المجموعة 10-15٪ 52.2٪ ، وهو ما يعادل زيادة 2.2 ضعف في فعالية البروتوكول (الشكل 2 أ). فيما يتعلق بتكوين الأنسجة ، أظهر <...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

توضح هذه الدراسة أن الجمع بين زرع WAT و BAT هو نهج علاجي فعال للسيطرة على ارتفاع السكر في الدم ، ومنع زيادة وزن الجسم وتضخم خلايا الجزر ، واستعادة ضعف الخصوبة عند النساء ، وتحسين وظائف الكلى عن طريق تقليل موت الخلايا المبرمج والحفاظ على أعداد الخلايا البودوليست في نموذج قبل سريري ل T2DM و DKD والسمنة.

على الرغم من أن الدراسات السابقة قد بحثت في زرع WAT و BAT كاستراتيجيات لتنظيم توازن الجلوكوز وحساسية الأنسولين11 ، أو تحسين وظائف القلب

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

يعلن المؤلفون عدم وجود تضارب في المصالح.

شكر وتقدير

نشكر الفرق الفنية لمركز التدريب التجريبي والجراحي (CETEC) والمعهد اليهودي للبحث والتعليم (IIEP) على دعمهم. تم دعم هذا العمل من خلال منحة زمالة بحثية للماجستير من CAPES (Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Coordination for the Improve of Higher Staff) إلى S.B ، وهي منحة زمالة بحثية مباشرة للدكتوراه من CAPES (Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Coordination for the Improve of Higher Staff) إلى MF ، منحة زمالة بحثية للماجستير من FAPESP (Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo / São Paulo Research Foundation ؛ رقم 2024 / 08173-6) إلى M.O.M. ، ومنحة زمالة البدء العلمي من FAPESP (Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo / São Paulo Research Foundation ؛ رقم 2019 / 12636-3) إلى M.T.A.B-R. تم دعم هذا العمل أيضا من خلال منح من FAPESP (Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo / São Paulo Research Foundation ؛ رقم 2017 / 23195-2 و رقم 2021 / 02216-7) ، و EFSD (المؤسسة الأوروبية لدراسة مرض السكري) إلى É.B.R. يعلن المؤلفون أنهم لم يستخدموا العمل الذي تم إنشاؤه بواسطة الذكاء الاصطناعي (الذكاء الاصطناعي) في هذه المخطوطة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
محلول كلورهيكسيدين ثنائي الجلوكونات الكحولي 0.5٪Rioquí الميكا1068253 SKU
إبرة قياس 16بيكتون ديكنسون305198 SKU
محلول كلورهيكسيدين ثنائي جلوكونات غير كحولي بنسبة 2.0٪Rioquí الميكاSKU 1113045
حقنة 3 ملبيكتون ديكنسون309657 SKU
شرائط Accu-Check – بيرفورماروشEAN 4015630981960
مجموعة PAS الأزرق ألكيانإيزي باثSKU EP-11-20019
مصل البقر الألبومين (BSA)سيغما-ألدرتشA4612
برنامج CellSensأوليمبوسCELLENS
درجة حموضة عازل السيترات 6.0: حمض الستريك أحادي الهيدرات + هيدروكسيد الصوديومسيغما-ألدرتشحوالي 1909 + 28-3010
الأجسام المضادة المشقوقة كاسباز-3تقنية الإشارة الخلوية9661
محلل كوباس C 111روش4528778001
كرياتينين Kاختبار المختبر96-300
EnVision FLEX DAB+ كروموجينأجيلينت-داكوK3468
كاشف الكشف EnVision FLEX / HRPأجيلينت-داكوSM802
Envision كاشف حجب بيروكسيداز FLEXأجيلينت-داكوSM801
مخزن الركيزة EnVision FLEXأجيلينت-داكوSM803
كان EnVision FLEX يحتوي على مخزن مؤقت 20xأجيلينت-داكوK800721-2
إيوسينأجيلينت-داكوCS701
قارئ الميكروبليت GloMax DiscoverبروميغاGM3000
اختبار الجلوكومتر Accu-Check - بيرفورماروش4015630980512 EAN
برنامج GraphPad Prism 8 (برنامج إحصائي)GraphPad من Dotmatics-
100٪ v/v إيزوفورين (إيزوفلوران)كريست وآكيوت؛ ليا-
الهيماتوكسيلينأجيلينت-داكوCS700
مجهر IX51 الضوئيأوليمبوسIX51
قفص الأيض للفأر الواحدتكنيبلاست3600M021
وسيط التركيب - إنتيلانسيغما-ألدرتش100869
مجموعة ألبومين الفأر ELISAأبكامAb207620
إجهاد الفأر: BTBR. سي جي-ليبوب/ويسك جيمختبرات JAX4824
مجموعة الحمض الدوري (PAS)إيزي باثEP-11-20014
RM255 ميكروتوملايكا بيوسيستمز14050237960
معالج الأنسجة TP1020لايكا بيوسيستمزTP-1020
ترامادول 50 ملغ/ملGrü نينثال4022444
الأجسام المضادة WT-1سانتا كروزSC-192

المراجع

  1. Zhao, M., Cao, Y., Ma, L. New insights in the treatment of DKD: recent advances and future prospects. BMC Nephrol. 26 (1), 72(2025).
  2. van Raalte, D. H., et al. Combination therapy for kidney disease in people with diabetes mellitus. Nat Rev Nephrol. 20 (7), 433-446 (2024).
  3. Xu, M., et al. Trends and future predictions of chronic kidney disease due to diabetes mellitus type 2 attributable to dietary risks: insights based on GBD 2021 data. Front Nutr. 11, 1494383(2024).
  4. GBD 2021 Adult BMI Collaborators. Adult BMI Collaborators. Global, regional, and national prevalence of adult overweight and obesity, 1990-2021, with forecasts to 2050: a forecasting study for the Global Burden of Disease Study 2021. Lancet. 405 (10481), 813-838 (2025).
  5. Liu, X., et al. Brown adipose tissue transplantation reverses obesity in Ob/Ob mice. Endocrinology. 156 (7), 2461-2469 (2015).
  6. Ghesmati, Z., et al. An update on the secretory functions of brown, white, and beige adipose tissue: Towards therapeutic applications. Rev Endocr Metab Disord. 25 (2), 279-308 (2024).
  7. Dewal, R. S., et al. Transplantation of committed pre-adipocytes from brown adipose tissue improves whole-body glucose homeostasis. iScience. 27 (2), 108927(2024).
  8. Klebanov, S., Astle, C. M., DeSimone, O., Ablamunits, V., Harrison, D. E. Adipose tissue transplantation protects ob/ob mice from obesity, normalizes insulin sensitivity and restores fertility. J Endocrinol. 186 (1), 203-211 (2005).
  9. Childs, G. V., Odle, A. K., MacNicol, M. C., MacNicol, A. M. The importance of leptin to reproduction. Endocrinology. 162 (2), 1-18 (2021).
  10. Hudkins, K. L., et al. BTBR Ob/Ob mutant mice model progressive diabetic nephropathy. J Am Soc Nephrol. 21 (9), 1533-1542 (2010).
  11. Stanford, K. I., et al. Brown adipose tissue regulates glucose homeostasis and insulin sensitivity. J Clin Invest. 123 (1), 215-223 (2013).
  12. Pinckard, K. M., et al. A novel endocrine role for the BAT-released Lipokine 12,13-diHOME to mediate cardiac function. Circulation. 143 (2), 145-159 (2021).
  13. Valgas da Silva, P. C., et al. Brown adipose tissue prevents glucose intolerance and cardiac remodeling in high-fat-fed mice after a mild myocardial infarction. Int J Obes (Lond). 46 (2), 350-358 (2022).
  14. Zhang, Y., et al. Brown adipose tissue transplantation ameliorates diabetic nephropathy through the miR-30b pathway by targeting Runx1. Metabolism. 125, 154916(2021).
  15. Clee, S. M., Nadler, S. T., Attie, A. D. Genetic and genomic studies of the BTBR ob/ob mouse model of type 2 diabetes. Am J Ther. 12 (6), 491-498 (2005).
  16. Stoehr, J. P., et al. Identification of major quantitative trait loci controlling body weight variation in ob/ob mice. Diabetes. 53 (1), 245-249 (2004).
  17. Liu, X., Zhang, Z., Song, Y., Xie, H., Dong, M. An update on brown adipose tissue and obesity intervention: Function, regulation and therapeutic implications. Front Endocrinol (Lausanne). 13, 1065263(2022).
  18. Mollah, M. L., Yang, H. S., Jeon, S., Kim, K., Cheon, Y. P. Overaccumulation of fat caused rapid reproductive senescence but not loss of ovarian reserve in ob/ob mice. J Endocr Soc. 5 (1), bvaa168(2021).
  19. Serke, H., et al. Leptin-deficient (ob/ob) mouse ovaries show fatty degeneration, enhanced apoptosis and decreased expression of steroidogenic acute regulatory enzyme. Int J Obes (Lond). 36 (8), 1047-1053 (2012).
  20. Diamanti-Kandarakis, E., Dunaif, A. Insulin resistance and the polycystic ovary syndrome revisited: an update on mechanisms and implications. Endocr Rev. 33 (6), 981-1030 (2012).
  21. Chang, A. S., Dale, A. N., Moley, K. H. Maternal diabetes adversely affects preovulatory oocyte maturation, development, and granulosa cell apoptosis. Endocrinology. 146 (5), 2445-2453 (2005).
  22. Almog, B., et al. Leptin attenuates follicular apoptosis and accelerates the onset of puberty in immature rats. Mol Cell Endocrinol. 183 (1-2), 179-191 (2001).
  23. Beyerstedt, S., et al. Combining sodium-glucose co-transporter-2 inhibitor with mesenchymal stem cells and brown adipose tissue (BAT) and white adipose tissue (WAT) transplantation to mitigate the progression of diabetic kidney disease: a pre-clinical approach. Stem Cell Res Ther. 16 (254), 1-15 (2025).
  24. Sávio-Silva, C., et al. Therapeutic potential of mesenchymal stem cells in a pre-clinical model of diabetic kidney disease and obesity. Int J Mol Sci. 22 (4), 1546(2021).
  25. Takemura, S., Shimizu, T., Oka, M., Sekiya, S., Babazono, T. Transplantation of adipose-derived mesenchymal stem cell sheets directly into the kidney suppresses the progression of renal injury in a diabetic nephropathy rat model. J Diabetes Investig. 11 (3), 545-553 (2020).
  26. Pichaiwong, W., et al. Reversibility of structural and functional damage in a model of advanced diabetic nephropathy. J Am Soc Nephrol. 24 (7), 1088-1102 (2013).
  27. Almog, B., et al. Leptin attenuates follicular apoptosis and accelerates the onset of puberty in immature rats. Mol Cell Endocrinol. 183 (1-2), 179-191 (2001).
  28. O'Brien, P. D., et al. BTBR ob/ob mice as a novel diabetic neuropathy model: Neurological characterization and gene expression analysis. Neurobiol Dis. 73, 348-355 (2015).
  29. Sávio-Silva, C., et al. Mesenchymal stem cell therapy for diabetic kidney disease: A review of the studies using syngeneic, autologous, allogenic, and xenogenic cells. Stem Cells Int. 2020, 8833725(2020).
  30. Morsy, M. A., et al. Leptin gene therapy and daily protein administration: a comparative study in the ob/ob mouse. Gene Ther. 5 (1), 8-18 (1998).
  31. Wang, Y., Asakawa, A., Inui, A., Kosai, K. Leptin gene therapy in the fight against diabetes. Expert Opin Biol Ther. 10 (10), 1405-1414 (2010).
  32. Blüher, S., Shah, S., Mantzoros, C. S. Leptin deficiency: clinical implications and opportunities for therapeutic interventions. J Investig Med. 57 (7), 784-788 (2009).
  33. Paz-Filho, G., Mastronardi, C. A., Licinio, J. Leptin treatment: facts and expectations. Metabolism. 64 (1), 146-156 (2015).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

زراعة الأنسجة الدهنيةالنسيج الدهني البنيالنسيج الدهني الأبيضالخلل الوظيفي الأيضيالقصور التناسليالخلل الوظيفي الكلويجلوكوز الدم الصياميموت الخلايا المبرمج في المبيضتكوين الجريبات
الطعوم الدهنية البيضاء والبني: نهج لتصحيح العجز التناسلي والتمثيل الغذائي والكلوي في الفئران السوداء والسمراء (BTBR) التي تعاني من البدينة
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.