Method Article

سير عمل تم التحقق منه لمعالجة بيانات MiRNA-Seq وتحليل المعلوماتية الحيوية باستخدام R

DOI:

10.3791/68760

⸱

October 24th, 2025

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Nephrology, 905th Hospital of PLA Navy, Naval Medical University, 2Department of Nephrology, Naval Medical Center of PLA, Naval Medical University, 3Department of Nephrology, Gongli Hospital of Shanghai Pudong New Area, 4Department of Nephrology, Shanghai Changzheng Hospital, Second Affiliated Hospital of Naval Medical University (Second Military Medical University), 5Department of Cellular Biology and Anatomy, Medical College of Georgia at Augusta University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هنا ، نقدم بروتوكولا لتحليل بيانات miRNA-Seq باستخدام R. يمكن سير العمل الباحثين من استكشاف الشبكات المنظمة ل miRNA ، وأهميتها في الأسئلة البيولوجية والسريرية المتنوعة. يهدف هذا العمل إلى أن يكون بمثابة دليل عملي لكل من الباحثين المبتدئين وذوي الخبرة في مجال المعلوماتية الحيوية miRNA.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

MicroRNAs (miRNAs) هي منظمات مهمة بعد النسخ تؤثر على مجموعة واسعة من العمليات الفسيولوجية والمرضية. مع تقدم تقنيات التسلسل عالية الإنتاجية ، برز miRNA-Seq كأداة قوية لتحديد أنماط تعبير miRNA. ومع ذلك ، فإن التفسير الموثوق به لهذه البيانات يتطلب خط أنابيب تحليل موحد وقابل للتكرار. هنا ، نقدم سير عمل تم التحقق منه لمعالجة بيانات miRNA-Seq وتحليل المعلوماتية الحيوية باستخدام R. يشمل هذا البروتوكول جميع الخطوات الأساسية ، بما في ذلك المعالجة المسبقة للبيانات الأولية ، ومراقبة الجودة ، والمحاذاة ، والقياس الكمي ، والتطبيع ، وتحليل التعبير التفاضلي ، والتنبؤ بالهدف ، والإثراء الوظيفي ، وبناء الشبكة التنظيمية. تم تصميم سير العمل من أجل المرونة والشفافية ، ويدمج حزم R المعتمدة على نطاق واسع ويدعم التعليقات التوضيحية الخاصة بالأنواع والتخصيص المعياري. بالإضافة إلى ذلك ، يتم توجيه المستخدمين لإجراء التفسير البيولوجي النهائي من خلال الاستفادة من قواعد البيانات المنسقة وأدوات التصور مثل Cytoscape. لا يدعم هذا البروتوكول التحليل الإحصائي القوي فحسب ، بل يتيح أيضا رؤى ذات مغزى حول تفاعلات miRNA-mRNA وأدوارها في آليات المرض. إنه مناسب بشكل خاص لكل من الباحثين المبتدئين وذوي الخبرة الذين يجرون اكتشاف المؤشرات الحيوية miRNA أو نمذجة الأمراض أو دراسات تكاملية متعددة الأوميكس.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

MicroRNAs (miRNAs) هي جزيئات RNA قصيرة غير مشفرة تؤثر بشكل كبير على التعبير الجيني من خلال العمل في مرحلة ما بعد النسخ1. تعمل عادة عن طريق الارتباط بالتسلسلات التكميلية في 3 مناطق غير مترجمة (UTRs) من الحمض النووي الريبي المرسال المستهدف (mRNAs) ، مما يؤدي إلى تدهور mRNA أو القمع الانتقالي1. على مدى العقدين الماضيين ، تم التعرف بشكل متزايد على miRNAs كمنظمين مركزيين لمختلف العمليات البيولوجية ، بما في ذلك تكاثر الخلايا ، والتمايز ، وموت الخلايا المبرمج ، والاستجابات المناعية ، ونمو الأعضاء2. علاوة على ذلك ، فإن عدم تنظيم تعبير miRNA متورط في التسبب في العديد من الأمراض ، مثل السرطان وأمراض القلب والأوعية الدموية والاضطرابات العصبية وأمراض الكلى3. تسلط هذه النتائج الضوء على إمكانات miRNAs ليس فقط كأهداف علاجية ولكن أيضا كمؤشرات حيوية طفيفة التوغل في التشخيص السريري.

مع ظهور تقنيات تسلسل الجيل التالي (NGS) ، دخلت دراسة miRNAs حقبة جديدة. على عكس الطرق القائمة على المصفوفات الدقيقة والتي تقتصر على miRNAs المعروفة ، يتيح تسلسل miRNA (miRNA-Seq) التنميط الشامل وعالي الإنتاجية وغير المتحيز لكل من miRNAs المعروفة والجديدة عبر أنواع وظروف العيناتالمختلفة 4. يوفر miRNA-Seq حساسية ودقة ونطاقا ديناميكيا فائقا ، مما يجعله طريقة مفضلة للتحقيق في أنماط تعبير miRNA واكتشاف الآليات التنظيمية في البيئات الفسيولوجية والمرضية5. ومع ذلك ، فإن تحليل بيانات miRNA-Seq يمثل تحديات حسابية محددة ، بما في ذلك التعامل مع أطوال القراءة القصيرة ، وإزالة تسلسلات المحول ، والتمييز بين أفراد عائلة miRNA المرتبطين ارتباطا وثيقا ، وإدارة التكرار العالي في أعداد القراءة6. تتطلب هذه الخصائص سير عمل تحليلي مصمم بعناية وموحدا.

على الرغم من تطوير العديد من خطوط الأنابيب والأدوات البرمجية لتحليل بيانات miRNA-Seq ، إلا أن العديد منها يعتمد على واجهات المستخدم الرسومية أو مهام سير العمل الثابتة التي تحد من المرونة وقابلية التكرار7. في المقابل ، توفر بيئة برمجة R نظاما أساسيا قويا وقابلا للتخصيص لتحليل المعلوماتية الحيوية8. تقدم R نظاما بيئيا غنيا من الحزم للنمذجة الإحصائية وتصور البيانات والتكامل مع قواعد البيانات البيولوجية. يتيح ذلك للمستخدمين إجراء تحليلات شاملة وقابلة للتكرار بطريقة شفافة وقائمة على البرامج النصية. علاوة على ذلك ، تسمح الطبيعة المعيارية لسير عمل R للباحثين بتخصيص كل خطوة وفقا لمتطلبات تجريبية محددة ، من المعالجة المسبقة للبيانات الأولية إلى التفسير الوظيفي.

في هذا البروتوكول ، نقدم سير عمل تحليل miRNA-Seq تم التحقق منه وكاملا تم تنفيذه بالكامل في R ، بهدف توفير حل قابل للتكرار وقابل للتكيف مع المستخدم للباحثين الذين يعملون مع بيانات تعبير miRNA. يبدأ سير العمل بمراقبة الجودة وتقليم المحول لقراءات التسلسل الأولية ، متبوعا بالمحاذاة مع الجينوم المرجعي أو تسلسلات miRNA المعروفة. تشمل الخطوات اللاحقة القياس الكمي لعدد القراءة ، والتطبيع ، وتحليل التعبير التفاضلي ، والتنبؤ بالجينات المستهدفة ، والإثراء الوظيفي ، وتصور الشبكة. يشتمل سير العمل على العديد من حزم R المستخدمة على نطاق واسع والتي يتم صيانتها جيدا ، مما يضمن الموثوقية والتوافق مع التحديثات والإضافات المستقبلية.

تكمن إحدى نقاط القوة الأساسية لهذا البروتوكول في قدرته على تجاوز نتائج التعبير التفاضلي وتوفير تفسير بيولوجي ذي مغزى. من خلال دمج قواعد البيانات المنسقة لتفاعلات miRNA-mRNA التي تم التحقق من صحتها والمتوقعة ، يسمح سير العمل للمستخدمين بتحديد الجينات المستهدفة ذات الصلة بيولوجيا. يمكن بعد ذلك إخضاع هذه الأهداف لأنطولوجيا الجينات وتحليلات إثراء المسار للكشف عن العمليات البيولوجية المتأثرة والمسارات الجزيئية. في الخطوة الأخيرة ، يمكن تصور شبكات تفاعل miRNA-mRNA باستخدام أدوات خارجية مثل Cytoscape9 ، مما يوفر نظرة ثاقبة للمشهد التنظيمي وتحديد miRNAs الرئيسية ذات الأهمية الوظيفية المحتملة.

تم تطبيق هذه الطريقة بنجاح في سياقات البحث السريري ، بما في ذلك الدراسات حول أمراض الكلى ، حيث تعمل miRNAs المنتشرة كمؤشرات حيوية واعدة للتشخيصوالتشخيص 10. ومع ذلك ، فإن التصميم المعياري والمرن لسير العمل يجعله مناسبا لمجموعة واسعة من التطبيقات ، بما في ذلك نمذجة الأمراض ودراسات الاستجابة للأدوية وعلم الأحياء التنموي وعلم الجينوم المقارن. يمكن للباحثين تكييف سير العمل بسهولة لاستيعاب التعليقات التوضيحية الخاصة بالأنواع أو الظروف التجريبية أو طبقات إضافية من بيانات omics.

من خلال تقديم حل مفتوح المصدر قائم على البرنامج النصي ، يعالج خط الأنابيب الذي يركز على R العديد من القيود الرئيسية المرتبطة بأدوات miRNA-Seq الحالية ، بما في ذلك التخصيص المحدود ، والاعتماد على الواجهات الرسومية غير الشفافة ، ونقص الدعم للكائنات الحية غير النموذجية ، وضعف قابلية التكاثر بسبب غياب التحكم في الإصدار ، وصعوبة التكامل مع أطر التحليل الإحصائي والوظيفي النهائية. إنه يتيح التحكم الكامل في معلمات معالجة البيانات ، ويشجع على قابلية التكرار من خلال التعليمات البرمجية التي يتم التحكم فيها بالإصدار ، ويعزز الشفافية في أبحاث المعلوماتية الحيوية. مع استمرار تزايد أهمية miRNAs في سياق بيولوجيا النظم والطب الانتقالي ، يصبح الوصول إلى إطار تحليل موثوق به وقابل للتكيف أمرا ضروريا بشكل متزايد.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ملاحظة: المواد التي تحتوي على روابط برامج مدرجة في جدول المواد.

1. إعداد عينات الحمض النووي الريبي ومكتبات التسلسل

ملاحظة: قم بإجراء استخراج الحمض النووي الريبي وتسلسله خارج سير العمل الحسابي هذا. هناك أكثر من طريقة لتحليل بيانات تسلسل miRNA. يوفر هذا القسم سياق واحد عملي.

  1. استخراج الحمض النووي الريبي الكلي: استخراج إجمالي الحمض النووي الريبي من العينات البيولوجية باستخدام مجموعة محسنة لعزل الحمض النووي الريبي الصغير (على سبيل المثال ، مجموعة عزل الحمض النووي الريبي الصغير). اتبع بروتوكول الشركة المصنعة بعناية. تأكد من استخدام المواد الاستهلاكية الخالية من RNase والاحتفاظ بالعينات على الجليد لتقليل التدهور.
  2. تقييم سلامة الحمض النووي الريبي وكميته: قم بتشغيل 1-2 ميكرولتر من الحمض النووي الريبي المستخرج على محلل حيوي أو جهاز مكافئ. تحقق من رقم تكامل الحمض النووي الريبي (RIN) وتأكد من أنه ≥ 7.0 للحصول على تسلسل موثوق. سجل التركيز باستخدام مقياس الطيف الضوئي أو مقياس الفلور.
  3. بناء مكتبات RNA صغيرة: قم بإعداد مكتبات التسلسل من 1 ميكروغرام من إجمالي الحمض النووي الريبي باستخدام مجموعة أدوات إعداد مكتبة RNA-seq التجارية الصغيرة. اتبع بروتوكول المجموعة لربط المحولات والنسخ العكسي وتضخيم (كدنا). قم بتنقية منتجات تفاعل البوليميراز المتسلسل باختيار الحجم (على سبيل المثال ، إدراج 18-30 nt) لإثراء شظايا miRNA.
  4. مكتبات التسلسل: قم بتحميل المكتبات على نظام أساسي للتسلسل عالي الإنتاجية. قم بتعيين تكوين التشغيل للتسلسل أحادي الطرف بطول قراءة ~ 50 نقطة أساس. تأكد من أن كل عينة تولد ما يقرب من 10 ملايين قراءة أولية لتحقيق عمق كاف.
  5. تصدير مخرجات التسلسل: بعد التسلسل ، قم بتصدير البيانات الأولية كملفات FASTQ باستخدام برنامج إخراج بيانات الأداة. تحقق من أن دليل الإخراج يحتوي على كل من قراءات التسلسل وملفات نقاط الجودة المقترنة. قم بتخزين ملفات FASTQ في دليل منظم للتحليل النهائي.

2. المعالجة المسبقة للقراءات الخام وإجراء مراقبة الجودة

  1. تقليم تسلسلات المحول
    1. قم بتثبيت وتكوين Cutadapt أو fastp.
    2. قم بتشغيل اقتطاع المحول على كل ملف FASTQ باستخدام الأمر التالي:
      cutadapt -a XXXX -o trimmed_reads.fastq raw_reads.fastq
      ملاحظة: يجب تطبيق تسلسل المحول المتبعة بعد "-a" مع مجموعة إعداد مكتبة sRNA المحددة. يحدد '-o' اسم ملف الإخراج مع متابعة ملف الإدخال.
  2. تقييم جودة القراءة
    1. استخدم FastQC لإنشاء تقارير مراقبة الجودة:
      fastqc trimmed_reads.fastq
    2. مراجعة درجات الجودة لكل قاعدة وتوزيع طول القراءة وتلوث المحول: افتح تقرير FastQC HTML الذي تم إنشاؤه لكل ملف FASTQ في مستعرض ويب. افحص الوحدات التالية خطوة بخطوة:
      1. جودة التسلسل لكل قاعدة: تأكد من أن معظم القواعد تقع ضمن المنطقة الخضراء (درجة Phred ≥30). ابحث عن أي انخفاض في الجودة في نهاية 3 قد يشير إلى أخطاء التسلسل.
      2. توزيع طول القراءة: تأكد من أن التوزيع يتوافق مع حجم الإدراج المتوقع (على سبيل المثال ، 18-30 nt ل miRNAs). تأكد من عدم وجود قمم غير متوقعة.
      3. محتوى المحول: تحقق من اقتطاع تسلسلات المحول بشكل فعال. تأكد من أن نسبة تلوث المحول تقترب من الصفر بعد التشذيب.
    3. احفظ تقرير ملخص FastQC وقم بالإبلاغ عن أي عينات ذات مقاييس رديئة الجودة لإعادة التشذيب أو استبعادها من مزيد من التحليل.

3. قراءات الخريطة وإنشاء مصفوفات العد

  1. محاذاة القراءات إلى المرجع
    1. قم بتنزيل ملف FASTA للجينوم المرجعي أو تسلسلات miRNA الناضجة (على سبيل المثال ، من miRBase) 11. مثل:
      wget ftp://mirbase.org/pub/mirbase/CURRENT/mature.fa
    2. فهرسة الجينوم المرجعي باستخدام ربطة العنق.
      1. افتح محطة طرفية وقم بتشغيل الأمر التالي لإنشاء الفهرس:
        bowtie-build reference.fa reference_index
      2. استبدل reference.fa باسم ملف FASTA الفعلي.
      3. استبدل reference_index بالبادئة المطلوبة للفهرس.
      4. تأكد من أن Bowtie ينشئ ملفات فهرس متعددة (على سبيل المثال ، .ebwt). تحقق من وجود هذه الملفات في دليل العمل، لأنها مطلوبة للمحاذاة.
    3. قم بمحاذاة القراءات باستخدام ربطة العنق مع المعلمات المناسبة للقراءات القصيرة. مثل:
      bowtie -v 0 -a --best --strata reference_index trimmed_reads.fastq > aligned_reads.sam
      ملاحظة: ملف الإدخال هو trimmed_reads.fastq ، وملف الإخراج هو aligned_reads.sam. تعني "-v 0" أننا لا نسمح بأي خطأ في القراءة بأكملها. تعني عبارة "-a -best -strata" أننا نتخلص من أي محاذاة بها عدم تطابق أكثر من الأفضل.
  2. تحديد تعبير miRNA
    1. قم بتحويل ملفات SAM إلى تنسيق BAM باستخدام SAMtools.
      samtools view -S -b aligned_reads.sam > aligned_reads.bam
      ملاحظة: ملف الإدخال aligned_reads.sam هو نتيجة الأمر الأخير. يتم إعداد ملف الإخراج aligned_reads.bam للتحليل اللاحق.
      1. استخدم SAMtools لضغط ملف المحاذاة وفرزه:
        samtools sort aligned_reads.bam -o aligned_reads_sorted.bam
        samtools index aligned_reads_sorted.bam
      2. تأكد من أن الأمر الأول يحول ملف SAM إلى تنسيق BAM.
      3. تأكد من أن الأمر الثاني يفرز ملف BAM حسب الإحداثيات الجينومية.
      4. تأكد من أن الأمر الثالث ينشئ ملف فهرس (.bai)، وهو مطلوب لتحليلات الخادم.
      5. تأكد من إنشاء كل من ملف BAM الذي تم فرزه وفهرسه بنجاح قبل المتابعة إلى القياس الكمي.
    2. استخدم featureCounts أو HTSeq-count لإنشاء مصفوفة عد باستخدام التعليق التوضيحي miRNA GTF:
      featureCounts -a miRNA.gtf -o counts.txt aligned_reads.bam
      ملاحظة: featureCounts يحدد القراءات في ملف الإدخال aligned_reads.bam استنادا إلى miRNA.gtf، ويخرج counts.txt.

4. إجراء تحليل التعبير التفاضلي في R

  1. بيانات عدد الأحمال
    1. استيراد مصفوفة العد وعينة البيانات الوصفية إلى R:
      library(DESeq2)
      countData <- read.csv("counts.csv", row.names=1)
      colData <- read.csv("metadata.csv", row.names=1)
      dds <- DESeqDataSetFromMatrix(countData = countData, colData = colData, design = ~ condition)
      ملاحظة: يجب تقديم بيانات العد (counts.csv) ومجموعة العينات (metadata.csv) إلى DESeq2. توضح كلمة "الحالة" هنا مجموعة العينات المقدمة. للمتطلبات الفردية ، الدليل المرجعي ل DESeq212.
  2. تطبيع البيانات وتحويلها
    1. قم بتطبيع بيانات العد باستخدام الطريقة الافتراضية ل DESeq2:
      dds <- DESeq(dds)
    2. إجراء تحويل تثبيت التباين:
      vsd <- vst(dds, blind=FALSE)
    3. تصور تجميع العينات باستخدام PCA:
      plotPCA(vsd, intgroup="condition")
  3. تحديد miRNAs المعبر عنها تفاضليا
    1. استخراج وفرز نتائج التعبير التفاضلي:
      res <- results(dds)
      resOrdered <- res[order(res$pvalue), ]
      ملاحظة: نقوم بإعادة ترتيب ملف النتائج "res" بناء على قيمة pvalue.
      summary(res)
    2. مرشح ل miRNAs المعبر عنها بشكل تفاضلي بشكل كبير (قيمة p < 0.05 ، |log2FC | > 1).
      sig_miRNA <- subset(res, pvalue < 0.05 & abs(log2FC) > 1)
      ملاحظة: هناك عتبات متعددة لتصفية miRNAs التي تم تغييرها بشكل كبير. متطلبات القيمة العتادية < 0.05 ، |log2FC | يتم تطبيق > 1 'على نطاق واسع. يمكن تعديل الحدود للبيانات الفردية.
  4. تصور تغييرات التعبير
    1. قم بتثبيت وتحميل حزمة EnhancedVolcano.
    2. قم بإنشاء مؤامرة البركان:
      library(EnhancedVolcano)
      EnhancedVolcano(res,
      lab = rownames(res),
      x = 'log2FoldChange',
      y = 'pvalue',
      title = 'Differentially Expressed miRNAs')

5. التنبؤ بالجينات المستهدفة ل miRNAs

  1. قواعد بيانات الاستعلام
    1. استخدم الموارد عبر الإنترنت مثل TargetScan و miRDB و miRTarBase للبحث عن microRNA معين واسترداد الجينات المستهدفة.
    2. ركز على الأهداف التي تم التحقق من صحتها تجريبيا لمزيد من الثقة.
  2. أتمتة التنبؤ في R
    1. تحميل حزمة multiMiR والأهداف التي تم التحقق من صحتها عن طريق الاستعلام:
      library(multiMiR)
      target_results <- get_multimir(mirna = c("hsa-miR-21-5p"), table = "validated")
      ملاحظة: هنا نأخذ "has-miR-21-5p" على سبيل المثال ونحصل على أهداف تم التحقق من صحتها.
    2. استخراج رموز الجينات المستهدفة الفريدة لتحليل التخصيب:
      genes <- unique(target_results@data$target_symbol)

6. إجراء تحليل الإثراء الوظيفي

  1. إجراء إثراء GO
    1. أدوات تخصيب التحميل:
      library(clusterProfiler)
      library(org.Hs.eg.db)
      ملاحظة: هنا ، نقوم بتحميل قاعدة بيانات تحتوي على تعليقات توضيحية للجينوم البشري ، والتي تكون مفيدة لتحويل معرفات الجينات الشائعة.
    2. قم بتشغيل تحليل تخصيب GO للعمليات البيولوجية:
      ego <- enrichGO(gene = genes,
      OrgDb = org.Hs.eg.db,
      keyType = "SYMBOL",
      ont = "BP",
      pAdjustMethod = "BH",
      pvalueCutoff = 0.05)
      dotplot(ego)
      ملاحظة: لاستخدام enrichGO ، نقدم قائمة بالجينات ، ونوضح أنها مرشحة ك "رمز" هنا. أجرينا تخصيب العملية البيولوجية ، والتي تتوافق مع المعلمة "ont = "BP". نقوم بإجراء تصحيح اختبار متعدد ، لذلك نقوم بتعيين pAdjustMethod = "BH". للحصول على عتبة كبيرة ، نختار pvalueCutoff = 0.05.dotplot يقدم نتيجة مرئية. لمزيد من الخيارات الفردية، راجع دليل clusterProfiler13.
  2. إجراء إثراء مسار KEGG
    1. قم بتشغيل إثراء KEGG:
      ekegg <- enrichKEGG(gene = genes, organism = 'hsa')
      dotplot(ekegg)
      ملاحظة: لاستخدام enrichKEGG ، نقدم قائمة بالجينات ، ونوضح الكائن الحي على أنه إنسان ("لديه"). يقدم dotplot نتيجة مرئية. لمزيد من الخيارات الفردية، راجع دليل clusterProfiler13.

7. بناء وتصور شبكة تفاعل miRNA - mRNA

  1. تصدير البيانات لتمثيل الشبكة
  2. قم بإنشاء إطار بيانات لأزواج الجينات المستهدفة ل miRNA بناء على الأهداف التي تم إنشاؤها من TargetScan أو miRDB أو miRTarBase.
  3. اكتب جدول الشبكة إلى CSV:
    write.csv(miRNA_target_pairs, "network.csv")
  4. الاستيراد إلى Cytoscape
    1. افتح Cytoscape واستورد جدول الشبكة.
    2. تصور الشبكة باستخدام تخطيط دائري أو موجه للقوة.
    3. تحليل الخصائص الطوبولوجية (على سبيل المثال، مركزية الدرجة) لتحديد miRNAs المحورية.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

قمنا بتنزيل مصفوفة تعبير microRNA من GSE133530 وأجرينا تحليل التعبير التفاضلي مباشرة. قدمنا مثالا على نص R التحليلي لمجموعة البيانات في الملف التكميلي 1. أجرت مجموعة البيانات تنميطا عالميا ل miRNA على 16 كيسا كلويا بأحجام مختلفة (الحد الأدنى من الخراجات: أقل من 1-5 مل ، ن = 10 ؛ الخراجات المتوسطة: بين 10-25 مل ، ن = 4 ؛ الخراجات الكبيرة: أكبر من 50 مل ، ن = 4) والأنسجة الكيسية البسيطة (MCT ، ن = 7 ، بما في ذلك 1 تكرار) من أربع كلى متعددة الكيسات PKD1. بالإضافة إلى ذلك ، ت...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يمثل تحليل بيانات miRNA-Seq تحديات مميزة نظرا لصغر حجم القراءات وتكرارها ، مما يجعل مراقبة الجودة الصارمة والمعالجة المسبقة أمرا بالغ الأهمية. واحدة من أهم الخطوات في سير العمل هي تقليم المحول. نظرا لأن miRNAs يبلغ طولها حوالي 22 نيوكليوتيدا، يمكن أن تهيمن تسلسلات المحول بسهولة على القراءات إذا لم تتم إزالتها بشكل صحيح. يمكن أن يؤدي الفشل في إجراء تشذيب دقيق إلى اختلال المحاذاة وتضخم القراءات الإيجابية الخاطئة. وبالمثل ، يجب تنفيذ ترشيح الجودة قبل المحاذاة للتخلص من القواعد منخفضة الجودة...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعلن المؤلفون عدم وجود مصالح متنافسة.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ونعرب عن تقديرنا لوكالات التمويل والمتعاونين الذين يدعمون هذا المشروع. خطة عمل شنغهاي للابتكار العلمي والتكنولوجي (22Y11905500 ، 24142201800) ، المشروع المؤسسي لمستشفى جيش التحرير الشعبي الصيني رقم 905 (2024Q021) ، مشروع أبحاث الشباب التابع للجنة الصحة لمنطقة تشانغنينغ (2024QN29) ومشروع البحث للجامعة الطبية البحرية (2024QN040).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Agilent-021827 المصفوفة الدقيقة miRNA البشريةأجيلينت/مصفوفة تجارية لتوصيف microRNAs للعينات البشرية
رَبْطَة عُنُق كَفَرَاشَةجامعة جونز هوبكنزhttp://bowtie-bio.sourceforge.net/index.shtmlأداة برمجية لمحاذاة قراءات التسلسل مع التسلسلات المرجعية الطويلة
clusterProfiler (حزمة R)الموصل الحيويhttps://bioconductor.org/packages/clusterProfiler/حزمة R مصممة لتحليل الإثراء الوظيفي وتصور البيانات البيولوجية عالية الإنتاجية.
قطع التكيفالمصدر المفتوحhttps://cutadapt.readthedocs.ioأداة سطر الأوامر التي تزيل تسلسلات المحول والبادئات وذيول poly-A والأجزاء الأخرى غير المرغوب فيها من قراءات التسلسل عالي الإنتاجية.
Cytoscapeكونسورتيوم Cytoscapehttps://cytoscape.org/منصة برمجية مفتوحة المصدر مصممة لتصور وتحليل الشبكات البيولوجية المعقدة.
DESeq2 (حزمة R)الموصل الحيويhttps://bioconductor.org/packages/DESeq2/حزمة R مصممة لتحليل التعبير الجيني التفاضلي لبيانات العد
EnhancedVolcano (حزمة R)الموصل الحيويhttps://bioconductor.org/packages/EnhancedVolcano/  حزمة R مصممة لإنشاء مؤامرات بركانية بجودة النشر.
فاست كيو سيبابراهام المعلوماتية الحيويةhttps://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/أداة مراقبة الجودة مفتوحة المصدر لبيانات التسلسل عالية الإنتاجية.
featureCountsقراءة فرعية / SourceForgehttp://subread.sourceforge.net/برنامج يستخدم لحساب القراءات المعينة للسمات الجينومية
HTSeq-countحزمة بايثونhttps://htseq.readthedocs.ioأداة سطر الأوامر التي تحسب عدد التسلسل عالي الإنتاجية المحاذي الذي يقرأ الميزات الجينومية المتداخلة مثل الجينات أو الإكسونات. أنا
Illumina Human v2 MicroRNA التعبير حبةIllumina /مصفوفة تجارية لتوصيف microRNAs للعينات البشرية
multiMiR (حزمة R)الموصل الحيويhttps://bioconductor.org/packages/multiMiR/حزمة R توفر أكبر مجموعة متكاملة من microRNA المتوقعة والتحقق من صحتها تجريبيا &ndash ؛ استهداف التفاعلات جنبا إلى جنب مع ارتباطاتها بالأمراض والأدوية.
org. Hs.eg.db (حزمة R)الموصل الحيويhttps://bioconductor.org/packages/org.Hs.eg.db/حزمة تعليقات توضيحية مصممة لأبحاث الجينوم البشري (الإنسان العاقل).
برنامج Rمشروع Rhttps://www.r-project.org/مشروع مفتوح المصدر للحوسبة الإحصائية
RstudioPosit PBC/تساعد بيئة التطوير المتكاملة على أن تكون أكثر إنتاجية مع R و Python
أدوات سامالمصدر المفتوحhttp://www.htslib.org/حزمة برامج لمعالجة بيانات التسلسل من الجيل التالي (NGS).

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Hsu, P. W., et al. miRNAMap: genomic maps of microRNA genes and their target genes in mammalian genomes. Nucleic Acids Res. 34 (Database issue), D135-D139 (2006).
  2. Fragiadaki, M. Lessons from microRNA biology: top key cellular drivers of autosomal dominant polycystic kidney disease. Biochim Biophys Acta Mol Basis Dis. 1868 (5), 166358(2022).
  3. Li, D., Sun, L. MicroRNAs and polycystic kidney disease. Kidney Med. 2 (6), 762-770 (2020).
  4. Akintunde, O., Tucker, T., Carabetta, V. J. The evolution of next-generation sequencing technologies. arXiv. , (2023).
  5. Tam, S., Tsao, M. S., McPherson, J. D. Optimization of miRNA-seq data preprocessing. Brief Bioinform. 16 (6), 950-963 (2015).
  6. Zhou, X., Oshlack, A., Robinson, M. D. miRNA-seq normalization comparisons need improvement. RNA. 19 (6), 733-734 (2013).
  7. Perez-Rodriguez, D., Agis-Balboa, R. C., Lopez-Fernandez, H. MyBrain-Seq: a pipeline for miRNA-seq data analysis in neuropsychiatric disorders. Biomedicines. 11 (4), 1230(2023).
  8. R: a language and environment for statistical computing. R Foundation for Statistical Computing. , R Core Team. (2012).
  9. Shannon, P., et al. Cytoscape: a software environment for integrated models of biomolecular interaction networks. Genome Res. 13 (11), 2498-2504 (2003).
  10. Huang, L., et al. Integrated analysis of mRNA-seq and miRNA-seq reveals the potential roles of Egr1, Rxra and Max in kidney stone disease. Urolithiasis. 51 (1), 13(2022).
  11. Kozomara, A., Birgaoanu, M., Griffiths-Jones, S. miRBase: from microRNA sequences to function. Nucleic Acids Res. 47 (D1), D155-D162 (2019).
  12. Love, M. I., Huber, W., Anders, S. Moderated estimation of fold change and dispersion for RNA-seq data with DESeq2. Genome Biol. 15 (12), 550(2014).
  13. Xu, S., et al. Using clusterProfiler to characterize multiomics data. Nat Protoc. 19 (11), 3292-3320 (2024).
  14. Friedländer, M. R., et al. miRDeep2 accurately identifies known and hundreds of novel microRNA genes in seven animal clades. Nucleic Acids Res. 40 (1), 37-52 (2012).
  15. Rueda, A., et al. sRNAtoolbox: an integrated collection of small RNA research tools. Nucleic Acids Res. 43 (W1), W467-W473 (2015).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

MiRNA SeqMiRNA ExpressionData ProcessingBioinformatics AnalysisDifferential ExpressionTarget PredictionFunctional EnrichmentRegulatory NetworkR PackagesCytoscape Visualization

Related Articles