مقالة منهجية

بروتوكول بسيط لعزل واستزراع خلايا الكبد من الفئران MASLD

DOI:

10.3791/68782

⸱

يوليو 18, 2025

 ,  ,  , 
1Department of Endocrinology, The First Affiliated Hospital of USTC, Division of Life Sciences and Medicine, University of Science and Technology of China, 2Department of Pharmacy, The First Affiliated Hospital of USTC, Division of Life Sciences and Medicine, University of Science and Technology of China

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تضع هذه الدراسة بروتوكولا موحدا لعزل خلايا الكبد الأولية عن الفئران المرتبطة بمرض الكبد الدهني المرتبط بخلل التمثيل الغذائي (MASLD) ، مما يتيح إجراء التحقيقات المتعلقة بالأمراض في التنكس الدهني وضعف التمثيل الغذائي دون تحميل الدهون الاصطناعية. تنتج هذه الطريقة خلايا كبدية عالية الغلة وعالية الصلاحية مناسبة للدراسات الميكانيكية والعلاجية.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يمثل مرض الكبد الدهني المرتبط بخلل التمثيل الغذائي (MASLD) ، الذي يتميز بتراكم الدهون المرضي (التنكس الدهني) داخل خلايا الكبد ، عبئا صحيا عالميا كبيرا ومتزايدا. تعمل مزارع خلايا الكبد الأولية للفئران كنماذج لا غنى عنها خارج الجسم الحي لتوضيح التسبب في MASLD والتدخلات العلاجية. ومع ذلك ، فإن العزل الموثوق به لخلايا الكبد عالية الجودة من الكبد الدهني لا يزال يمثل تحديا تقنيا. هنا ، نقدم بروتوكولا بسيطا للعزل الفعال لخلايا الكبد الأولية من الفئران MASLD باستخدام تقنية تروية الكولاجيناز. يولد هذا البروتوكول خلايا كبدية تظهر دهنة تنكس دهني متأصل دون الحاجة إلى تحريض اصطناعي عن طريق مكملات البالميتات وحمض الأوليك ، وبالتالي الحفاظ على نمط ظاهري أكثر صلة من الناحية الفسيولوجية. ينتج عن البروتوكول خلايا كبدية عالية البقاء وعالية النقاء وهو قابل للتطبيق عالميا لعزل كميات كبيرة من خلايا الكبد من فئران MASLD. علاوة على ذلك ، فهي مناسبة للتقييم الدوائي أو دراسات التدخل الجيني. باختصار ، نحن نقدم بروتوكولا قابلا للتكرار لعزل خلايا الكبد عالية الغلة وعالية النقاء والقابلة للحياة للغاية للدراسات البيولوجية للخلايا النهائية لتسهيل اكتشاف أهداف علاجية وأدوية جديدة ل MASLD.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يتميز مرض الكبد الدهني المرتبط بخلل التمثيل الغذائي (MASLD) بتراكم الدهون المرضي في خلايا الكبد ويمثل اضطراب الكبد المزمن الأكثر انتشارا على مستوىالعالم 1. تشير التقديرات إلى أن MASLD يؤثر على 38٪ من سكان العالم البالغين وأصبح تهديدا كبيرا لصحةالإنسان 2. لم يتم توضيح آليات MASLD بشكل كامل وخيارات العلاج محدودة للغاية. أصبح اكتشاف أهداف علاجية جديدة وتطوير عوامل مستهدفة ل MASLD حاجة سريرية حاسمة. الخلايا الكبدية ، باعتبارها نوع الخلايا السائد الذي يتكون منه الكبد ، هي الموقع الأساسي لعملية التمثيل الغذائي للجلوكوز الكبدي والدهون والمخدرات. تحتفظ خلايا الكبد الأولية بوظيفة أكثر اكتمالا لخلايا الكبد من خطوط خلايا الخلايا الكبدية وهي أداة مفيدة لدراسة آليات أمراض الكبد وتطوير الأدوية3. يعد عزل واستزراع خلايا الكبد الأولية من الفئران المصابة بالكبد الدهني تقنية أساسية لدراسة الفيزيولوجيا المرضية للكبد ، بما في ذلك التمثيل الغذائي للدهون ومقاومة الأنسولين والاستجابات الالتهابية. استخدم بروتوكول سابق تم إنشاؤه لعزل خلايا الكبد من نماذج الفئران لمرض الكبد الدهني الطرد المركزي المتدرج لتمكين الفصل بين كل من خلايا الكبد الطبيعية والمتراكمة للدهون. وبالتالي ، تشكل هذه الخلايا الكبدية المعزولة المحملة بالدهون نظاما نموذجيا حاسما في المختبر للتحقيق في علم الأحياء المرضية لمرض الكبدالدهني 3. الهدف الأساسي من هذا النهج هو الحصول بسهولة واقتصادية على خلايا كبدية عالية الحيوية وعالية الغلة تحتفظ بخصائص النمط الظاهري الخاصة بالمرض وبالتالي تكون قادرة على تقليد MASLD في المختبر.

يتكون الإجراء العام لعزل خلايا الكبد في الفئران من عملية من خطوتين تبدأ بطرد الدم من الكبد بمحلول تروية متساوي التوتر ، مثل محلول هانك المتوازن للملح (HBSS) ، ثم هضم الكبد باستخدام محلول هضم يحتوي على الكولاجيناز. أدت التطورات الحديثة في تروية الكبد وتقنيات الهضم الأنزيمي إلى تحسين إنتاجية خلايا الكبد الأولية وقابليتها للحياة في إناثالفئران 4. كانت التحسينات التي أدخلت على طرق نضح الكولاجيناز التقليدية المكونة من خطوتين ، مثل تحسين تكوين المخزن المؤقت وتقصير أوقات الهضم ، حاسمة في تكييف البروتوكولات التجريبية مع عينات الكبد الدهني. تعمل خلايا الكبد الأولية كنماذج لا غنى عنها لتوضيح الآليات الفيزيولوجية المرضية الكامنة وراء MASLD ومضاعفاتها القلبية ، لا سيما من خلال دورها في التوسط في الحديث المتبادل بين القلب والكبد وتفاعلات محور الكبد والأوعية الدموية من خلال الوسطاء البطانيين والعوامل المسببة للأوعيةالدموية 5،6. توفر هذه الخلايا رؤى مهمة حول شبكات الاتصال متعددة الأعضاء التي تقود تطور المرض ، كما يتضح من الارتباطات السريرية بين MASLD ، وأمراض الكلى المزمنة ، وأمراض القلب الإقفارية7 ، مع تقديم منصة ذات صلة من الناحية الفسيولوجية لتطوير علاجات مستهدفة تعالج كل من المظاهر الكبدية والقلب والأوعية الدموية لمتلازمة التمثيل الغذائي. تعتمد الأبحاث الحالية في المختبر ل MASLD في الغالب على خلايا الكبد الطبيعية المحفزة بحمض البالمتيك / الأوليك (PA / OA) أو خطوط خلايا خلايا الكبد البشرية (على سبيل المثال ، HepG2 و Huh7) ، والتي لا تكرر بشكل كاف السمات الفيزيولوجية المرضية لخلايا الكبد الدهني في ظل الظروف المرضية ، مما يحد من أهميتها الانتقالية لدراسة تفاعلات القلب والكبد والأوعية الدموية. يفشل هذا النهج في التقاط الخلل الأيضي المزمن ، والبيئة المكروية الالتهابية ، وخاصية الحديث المتبادل بين الأعضاء الخاصة بالمرض لتطور MASLD.

يمكن استخدام هذا البروتوكول لعزل خلايا الكبد من فئران MASLD ، دون الحاجة إلى إضافة علاجات حمض البالمتيك وحمض الأوليك بشكل مصطنع. في الختام ، نقدم طريقة بسيطة وقابلة للتكرار للحصول على خلايا كبدية عالية الغلة ذات قابلية ممتازة للبقاء ومناسبة لأبحاث بيولوجيا الخلية النهائية لدعم اكتشاف أهداف علاجية جديدة وتطوير الأدوية ل MASLD.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تمت الموافقة على جميع الخطوات التجريبية من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدامه (IACUC) في جامعة العلوم والتكنولوجيا الصينية. تم تغذية ذكور الفئران C57BL / 6J بنظام غذائي غني بالدهون (HFD ، # 12492 ، نظام غذائي للبحث) لأكثر من 12 أسبوعا في هذه الدراسة.

1. تحضير طبق أو طبق ثقافة مطلي بالكولاجين

  1. أضف 15 مل 100٪ EtOH إلى 35 مل من H2O المقطر المزدوج (ddH2O). تحضير محلول من الكولاجين من النوع الأول 50 ميكروغرام / مل في 30٪ EtOH. الفلتر برأس مرشح معقم 0.22 ميكرومتر.
  2. قم بتغطية طبق أو طبق زراعة الخلايا ب 30 ميكرولتر من محلول الكولاجين لكل سم2. احتضان في درجة حرارة الغرفة (RT) لمدة 1 ساعة.
  3. قم بإزالة السوائل الزائدة باستخدام ماصة وجفف الطبق أو الطبق. قم بإشعاع الأطباق المطلية بالأشعة فوق البنفسجية لمدة 0.5 ساعة للتعقيم. يحفظ في درجة حرارة 4 درجات مئوية لمدة تقل عن شهر واحد.
    ملاحظة: يبلغ الطول الموجي لمصباح الأشعة فوق البنفسجية 254 نانومتر ، ولا تقل شدة الأشعة فوق البنفسجية عن 400 ميجاوات / م2. مسافة مصدر مصباح الأشعة فوق البنفسجية من الأطباق المطلية بالكولاجين هي 1 متر.

2. تحضير محلول التروية

  1. قبل أيام قليلة من عزل خلايا الكبد ، قم بإعداد كواشف عزل خلايا الكبد ووسائط الثقافة المحددة في الجدول 1. قم بتصفية محلول التروية A و B بطرف مرشح معقم 0.22 ميكرومتر. يحفظ في درجة حرارة 4 درجات مئوية لمدة تقل عن شهر واحد. قم بإعداد حمام مائي واضبط درجة الحرارة على 37 درجة مئوية.
  2. سخن محاليل التروية A و B في حمام مائي عند 37 درجة مئوية. أضف 40 ملجم من الكولاجيناز النوع الرابع إلى 80 مل من محلول التروية B قبل الجراحة.
  3. ضخ 75٪ EtOH بمعدل 4 مل / دقيقة لمدة 5 دقائق باستخدام مضخة تمعجية في RT. قم بتبديل أنبوب المضخة من 75٪ EtOH إلى محلول التروية المسخن مسبقا A.
    ملاحظة: قم بتجميع وحدة تعبئة الدوران الساخن وفقا للتكوين الموضح في الشكل 1 أ.

3. الإجراء الجراحي

  1. تخدير الماوس باستخدام طريقة معتمدة. حقن البنتوباربيتال الصوديوم (50 ملغ/كغ) داخل الصفاق. تحقق من فقدان منعكس الدوران قبل المتابعة.
  2. قم بتأمين الأطراف العلوية والسفلية للفأر على لوحة تشريح. تعقيم المنطقة الجراحية بالكحول بنسبة 75٪.
  3. قطع أغشية البطن الداخلية والخارجية باستخدام أدوات التشريح. قم بتدوير الأعضاء الحشوية على الجانب الأيسر للفأر باستخدام قطعة قطن لكشف الوريد الأجوف السفلي (IVC) والوريد البابي الكبدي (PV).
  4. اضغط على الوريد الأجوف السفلي بقطعة قطن لإخراجه. أدخل إبرة ساكنة 22-G موازية للوريد الأجوف السفلي.
  5. اسحب الجزء الحديدي من الإبرة السكنية. اترك القسطرة في الوريد الأجوف السفلي. قم بتوصيل الإبرة بخط التروية بطرف مرشح 0.22 ميكرومتر.
    ملاحظة: تتكون الإبرة الساكنة من جزء إبرة حديدية وجزء قسطرة بلاستيكية. تأكد من الإدخال الدقيق في الوريد الأجوف السفلي وانتظر حتى تمتلئ الإبرة الساكنة بالدم. تخلص من جميع فقاعات الهواء من الإبرة الساكنة. أكمل الإجراء بأكمله بسرعة لتجنب تجلط الدم.
  6. اضبط معدل التروية على 5 مل / دقيقة من سائل التروية أ. ابدأ التروية وراقب الكبد حتى يبدو منتفخا. قطع الوريد البوابة على الفور.
  7. قم بتدليك الكبد برفق باستخدام قطعة قطن لضمان احمرار الدم تماما. استمر في التروية حتى يتحول لون الكبد إلى اللون الأصفر الترابي.
  8. قم بالتبديل إلى سائل التروية B الذي يحتوي على 0.05٪ كولاجيناز من النوع الرابع. استمر في التروية حتى يتم هضم الكبد بالكامل.
    ملاحظة: يستغرق هضم الكبد 10 دقائق على الأقل لكل فأر. يكفي حجم 80 مل من محلول التروية B الذي يحتوي على الكولاجيناز لفأر واحد لهضم كبده. يخضع النسيج الكبدي لعملية هضم إنزيمية كاملة حتى يحقق أقصى قدر من التليين ، مع وصول الحمة المغلقة بالكبسولة إلى حالة من الهشاشة الشديدة المعرضة للاضطراب الميكانيكي.
  9. إزالة الكبد من بطن الفأر. ضع الكبد في طبق 10 سم يحتوي على DMEM.
  10. تابع في خزانة السلامة البيولوجية. قم بتقطيع الكبد إلى مسحوق باستخدام ملاقط (الكبد جيد الهضم يطلق خلايا الكبد بسهولة).
  11. قم بتصفية التعليق عبر مرشح شبكي 70 ميكرومتر في أنبوب طرد مركزي معقم سعة 50 مل. اضبط مستوى الصوت على 45 مل (لكل ماوس) باستخدام وسيط DMEM.
  12. جهاز طرد مركزي عند 50 × جم لمدة 4 دقائق. اسكب المادة الطافية تماما.
  13. أعد تعليق الحبيبات بوسط DMEM إلى حجم نهائي قدره 25 مل (لكل ماوس). جهاز الطرد المركزي مرة أخرى عند 50 × جم لمدة دقيقتين.
  14. اسكب المادة الطافية تماما. أعد تعليق الحبيبات في 25 مل من وسط الاستزراع المكملة بنسبة 10٪ FBS.
  15. امزج التعليق جيدا. قم بتلطيخ الخلايا باللون الأزرق Trypan للعد. انتقل إلى التطعيم للثقافة على الفور.
    ملاحظة: ضع 2 مل من الوسط الذي يحتوي على 2 × 105 خلايا لكل بئر في أطباق 6 آبار مغطاة بالكولاجين. استبدل وسيط DMEM بعد ساعتين من تلقيح الخلايا.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم تنفيذ البروتوكول الحالي على ذكور الفئران C57BL / 6J التي تغذت على HFD لأكثر من 12 أسبوعا. تم فحص خلايا الكبد الأولية المعزولة من حيث التشكل والوظيفة. حصلنا على متوسط عائد يبلغ 2 × 107 خلايا لكل عزلة من حوالي 40 جراما من كبد الفأر. تم تحديد صلاحية الخلية لتكون بين 85٪ -86٪ عن طريق تلطيخ الكالسين AM للخلايا الحية. كان العائد من كل عزل فأر يعاني من السمنة الناجمة عن النظام الغذائي (DIO) كافيا لبذر 15 طبقا قياسيا من 6 آبار. يوضح الشكل 1B-G النتائج ا...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يتضمن عزل خلايا الكبد الفئرانية القابلة للحياة إجراء حاسم من خطوتين يبدأ بنضح الأوعية الدموية الشامل باستخدام محلول متساوي التوتر لإزالة مكونات الدم ، يليه الهضم الأنزيمي المتحكم فيه بمحلول الكولاجيناز النشط9،10. يعتمد العزل الناجح على الحفاظ على الظروف الفسيولوجية المثلى طوال العملية ، وخاصة درجة الحرارة المستقرة (37 درجة مئوية) ودرجة الحموضة (7.2-7.4) لمحاليل التروية ، حيث تحدد هذه المعلمات بشكل مباشر بقاء الخلية

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ولم يبلغ أصحاب البلاغ عن أي تضارب محتمل في المصالح.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم دعم هذا العمل من قبل المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين [رقم 82373967].

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
50 مل أنابيب الطرد المركزي المعقمةعش602052
المضادة ل HNF4 & ألفا الأجسام المضادةImmunowayYM8517
الأجسام المضادة المضادة ل IgGProteintech30000-0-AP
BODIPYThermo Fisher ScientificD3922
CaCl2< / sub>Merck (SigmaAldrich)C5670
أجهزة الطرد المركزيThermo Sorvall ST16R
الكولاجين نوع I Corning354236
Collagenase ، النوع 4Sangon BiotechA004186-0001
إبرة احتجازBRAUN4254074B
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)GibcoC11995500BT
EGTAYeasen60339ES10
EthanolMerck (SigmaAldrich)493511
مصل الأبقار الجنينيسيجماF2442
الجلوكوزميرك (سيجما ألدريتش)G7021
هيبسجيبكو15630080
Isoginkgetin  MedChemExpressHY-N2117
K2HPO4 Merck (Supelco)PHR2900
KClMerck (SigmaAldrich)P3911
Na2HPO4 & middot; 12H2OMerck (SigmaAldrich)04273
NaClMerck (SigmaAldrich)S9888
NaHCO3< / sub>Merck (SigmaAldrich)S6014
إبرة 0.22 وميكرو ؛ MMillex-GPSLGV033RB
Nile RedInvitrogenN1142
Penicillin / streptomycin (100X)Gibco15140122
الغدي المؤتلفObio Technology Corp., ltd. إنشاء الفيروسات الغدية المؤتلفة التي تشفر الماوس IER2 الموسومة بالعلم (Ad-Ier2 ، NM_010499.4) والفيروس الغدي للتحكم (Ad-NC) بواسطة Obio Technology Corp.، ltd.
الصوديوم بنتوباربيتالميرك (SigmaAldrich)P3761
مصافي الخلايا المعقمة ، 100 مو ؛ mفيشر 22363549
تريبان بلوبيوتيمST2780-5g
مضخة تمعجية متغيرة التدفقأطولBT100-1F
مرشح الفيروس تم العلمي

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Israelsen, M., Francque, S., Tsochatzis, E. A., Krag, A. Steatotic liver disease. Lancet. 404 (10464), 1761-1778 (2024).
  2. Targher, G., Byrne, C. D., Tilg, H. Masld: A systemic metabolic disorder with cardiovascular and malignant complications. Gut. 73 (4), 691-702 (2024).
  3. Jung, Y., Zhao, M., Svensson, K. J. Isolation, culture, and functional analysis of hepatocytes from mice with fatty liver disease. STAR Protoc. 1 (3), 100222(2020).
  4. Feng, M., Divall, S., Wu, S. An improved time- and labor-efficient protocol for mouse primary hepatocyte isolation. J Vis Exp. (176), e61812(2021).
  5. Driessen, S., et al. Metabolic dysfunction-associated steatotic liver disease and the heart. Hepatology. , (2023).
  6. Chew, N. W. S., et al. Cardiovascular-liver-metabolic health: Recommendations in screening, diagnosis, and management of metabolic dysfunction-associated steatotic liver disease in cardiovascular disease via modified delphi approach. Circulation. 151 (1), 98-119 (2025).
  7. Miyamori, D., et al. Coexistence of metabolic dysfunction-associated fatty liver disease and chronic kidney disease is a more potent risk factor for ischemic heart disease. J Am Heart Assoc. 12 (14), e030269(2023).
  8. Zhang, Z., et al. A natural small molecule isoginkgetin alleviates hypercholesterolemia and atherosclerosis by targeting ACLY. Theranostics. 15 (10), 4325-4344 (2025).
  9. Edwards, M., Houseman, L., Phillips, I. R., Shephard, E. A. Isolation of mouse hepatocytes. Methods Mol Biol. 987, 283-293 (2013).
  10. Guo, Q., Furuta, K., Aly, A., Ibrahim, S. H. Isolation and characterization of mouse primary liver sinusoidal endothelial cells. J Vis Exp. (178), e63062(2021).
  11. Severgnini, M., et al. A rapid two-step method for isolation of functional primary mouse hepatocytes: Cell characterization and asialoglycoprotein receptor-based assay development. Cytotechnology. 64 (2), 187-195 (2012).
  12. Salem, E. S. B., et al. Isolation of primary mouse hepatocytes for nascent protein synthesis analysis by non-radioactive l-azidohomoalanine labeling method. J Vis Exp. (140), e58323(2018).
  13. Xu, S., et al. TRIM56 protects against nonalcoholic fatty liver disease by promoting the degradation of fatty acid synthase. J Clin Invest. 134 (5), e166149(2024).
  14. Xu, S., et al. The clinical antiprotozoal drug halofuginone promotes weight loss by elevating GDF15 and FGF21. Sci Adv. 11 (13), eadt3142(2025).
  15. Tiriticco, V., et al. Rat liver perfusion and primary hepatocytes isolation: An old procedure crucial for cutting-edge 3D organoids culture. J Vis Exp. (213), e66857(2024).
  16. Wei, S., et al. Nafld and nash: Etiology, targets and emerging therapies. Drug Discov Today. 29 (3), 103910(2024).
  17. Fang, T., et al. Mouse models of nonalcoholic fatty liver disease (nafld): Pathomechanisms and pharmacotherapies. Int J Biol Sci. 18 (15), 5681-5697 (2022).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

الفيديو قريباً

مقالات ذات صلة