بروتوكول محدث لتجميع واستخدام مصفوفة المفاعلات الحيوية المصغرة (MBRA)

Jason D. Pizzini; Firas S. Midani; Robert A. Britton

doi:10.3791/68788

Method Article

بروتوكول محدث لتجميع واستخدام مصفوفة المفاعلات الحيوية المصغرة (MBRA)

DOI:

10.3791/68788

⸱

September 5th, 2025

Jason D. Pizzini¹ , Firas S. Midani¹^,² , Robert A. Britton¹^,²

¹Department of Molecular Virology and Microbiology, Baylor College of Medicine, ²Alkek Center for Metagenomics & Microbiome Research, Baylor College of Medicine

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

مصفوفة المفاعل الحيوي المصغر (MBRA) عبارة عن نظام ثقافة عالي الإنتاجية وقابل للتخصيص وتدفق مستمر يتيح زراعة المجتمعات الميكروبية المعقدة ، ويدعم التجارب المتوازية لدراسة ديناميكيات الميكروبيوم والتفاعلات العلاجية والاستجابات الميكروبية للعوامل البيئية.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يتكون الميكروبيوم البشري من مجتمعات ميكروبية متنوعة وديناميكية تلعب أدوارا أساسية في صحة المضيف. يعد فهم هذه المجتمعات واستجاباتها للعوامل البيئية أمرا بالغ الأهمية لتطوير العلاجات القائمة على الميكروبيوم. غالبا ما تفتقر النماذج التقليدية في المختبر لزراعة الجراثيم المشتقة من الإنسان إلى قابلية التوسع وتتطلب خبرة تقنية واسعة ، مما يحد من إمكانية الوصول إليها وإنتاجيتها. لمعالجة هذه القيود ، قمنا بتطوير نظام مصفوفة المفاعل الحيوي المصغر (MBRA) - وهو عبارة عن منصة معيارية أحادية المرحلة ومستمرة للزراعة عالية الإنتاجية للمجتمعات الميكروبية. يتيح هذا النظام الزراعة المتوازية لما يصل إلى 48 مجتمعا ميكروبيا متميزا ، مما يدعم المرونة التجريبية مع الحفاظ على النمو المستقر للنظم البيئية المعقدة. يوفر هذا البروتوكول إرشادات مفصلة حول تصنيع MBRA وتجميعه وتعقيمه وتشغيله. يسمح التصميم المعياري للنظام بالاندماج السهل في الغرف اللاهوائية ويدعم التخصيص لمجموعة واسعة من التطبيقات التجريبية. وقد تم استخدامه لدراسة الاستجابات الميكروبية للمضادات الحيوية والمركبات الغذائية وغزو مسببات الأمراض وللكشف عن المجتمعات المقاومة لمسببات الأمراض. بفضل إمكانية الوصول إليها وقابليتها للتوسع وقابليتها للتكرار ، يمثل MBRA نظاما نموذجيا قويا للتحقيق في التفاعلات الميكروبية وتطوير أبحاث الميكروبيوم.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الميكروبيوم البشري هو نظام بيئي معقد من الكائنات الحية الدقيقة التي تلعب دورا مهما في العديد من العمليات الفسيولوجية وتؤثر بشكل عميق على صحة الإنسان. يمتد الميكروبيوم البشري إلى العديد من المواقع التشريحية في جميع أنحاء الجسم ، ويحتوي كل منها على مجتمعات ميكروبية ديناميكية تتفاعل بنشاط بطرق لم نفهمها تماما^{بعد 1}. يعتمد توسيع معرفتنا حول مشاركة المجتمعات الميكروبية في الصحة والمرض على فهمنا للتفاعلات الميكروبية التي تحدث في هذه البيئات¹. لدراسة هذه الأنظمة المعقدة ومعالجتها بشكل فعال لأغراض علاجية ، من الضروري اتباع نهج اختزالي. يسهل استكشاف التفاعلات الميكروبية الفردية باستخدام أنظمة نموذجية مبسطة فهما أفضل للتعقيد الكامل للميكروبيوم².

تتوفر مجموعة متنوعة من الأنظمة النموذجية لتنمية المجتمعات الميكروبية المشتقة من الإنسان. لقد طورت هذه الأنظمة فهمنا للمجتمعات الميكروبية المرتبطة بالإنسان وتتراوح من زراعة الدفعات أحادية المرحلة إلى أنظمة التدفق المستمر متعددة المراحل الأكثر تعقيدا. تعمل الأنظمة النموذجية ، مثل محاكي النظام البيئي الميكروبي المعوي^{البشري 3} ، ونظام العلاج الكيميائي أحادي المرحلة أحادي الأوعية⁴ ونظام التحكم في البيئة للميكروبات المعوية⁵ ، على تكرار الظروف الفسيولوجية لمواقع تشريحية محددة وتوفر تقريبا قريبا في المختبر للبيئات الميكروبية. ومع ذلك ، فإن اعتمادها من قبل علماء الأحياء الدقيقة محدود لأنها مكلفة ، وتتطلب خبرة فنية عالية المستوى للتشغيل والصيانة ، ولها إنتاجية محدودة.

لمواجهة هذه التحديات ، قمنا بتطوير نظام مصفوفة المفاعلات الحيوية الصغيرة (MBRA) - وهو نظام استزراع مستمر ومرحلة واحدة مصمم لتسهيل النمو المستقر للمجتمعات الميكروبية من مصادر متنوعة في بيئة خاضعة للرقابة⁶^،⁷^،⁸. يتميز نظام MBRA عن نماذج الأمعاء الأخرى ببساطته في التجميع والتشغيل ، جنبا إلى جنب مع قدرات الإنتاجية العالية التي تسمح بالزراعة المتزامنة لمجتمعات ميكروبية متعددة ، مما يعزز الكفاءة التجريبية. علاوة على ذلك ، تسمح الطبيعة البسيطة والمدمجة لهذا النظام بتشغيله داخل الغرف اللاهوائية والميكروكسية لتسهيل نمو البكتيريا من المواقع اللاهوائية ونقص الأكسجين ، مثل الجهاز الهضمي والمهبلي. تم الاستفادة من الطبيعة المتنوعة لهذا النظام لفحص المجتمعات المعدية المعوية المقاومة للعسيرة ⁹ ، بالإضافة إلى اختبار تأثيرات المضادات الحيوية¹⁰^،¹¹ والركائز الغذائية¹² على المجتمعات الميكروبية.

يتم تصنيع MBRAs عن طريق الطباعة ثلاثية الأبعاد أو التصنيع الإضافي ، مع إعطاء الأولوية للوضوح ومقاومة الماء في اختيارنا للمواد (انظر جدول المواد للحصول على معلومات البوليمر). تحتوي كل مجموعة على ست غرف فردية ، وكلها مجهزة بمنافذ لاستيراد الوسائط وتصدير النفايات وجمع العينات. يتم توفير الوسائط الطازجة باستمرار في النظام أثناء استخراج النفايات بشكل متزامن ، مع التحكم في معدلات التدفق بدقة بواسطة مضختين تمعجيتين. يتم تحريك المحتويات الموجودة في النظام باستمرار باستخدام قضبان التحريك ولوحة التحريك المكونة من 60 نقطة لتسهيل الثقافات المتجانسة. تم تحسين البروتوكول الموصوف هنا لحجم عمل 15 مل لكل غرفة ، على الرغم من أن كل مفاعل حيوي يمكن أن يستوعب نطاقا من 1-20 مل اعتمادا على المتطلبات التجريبية. يمكن للمضخة التمعجية وأنابيب المضخة أن تستوعب معدلات تدفق تتراوح من 0.016 إلى 2.9 مل / دقيقة ، وهو ما يتوافق مع معدلات دوران تتراوح من حوالي 15.63 إلى 0.09 ساعة ، على التوالي. في حين أن النظام متوافق مع مجموعة واسعة من تركيبات الوسائط والإضافات الغذائية أو الغذائية ، يجب مراعاة بعض الاعتبارات العملية: قد تتطلب الوسائط عالية اللزوجة إعادة معايرة معدلات التدفق ، ويمكن أن يؤدي وجود جزيئات غير مذابة أو مكونات غير قابلة للذوبان إلى انسداد أنابيب المضخة أو الموصلات الضيقة ، خاصة عند معدلات التدفق المنخفضة. تسمح نمطية النظام بالتفصيل السريع والسهل للتجارب عن طريق ضبط اختيار الوسائط وجمع العينات ومعدلات التدفق وحجم العمل. بالاقتران مع أربع مضخات تمعجية ذات 24 قناة ولوحين تقليب من 60 نقطة ، يمكن للنظام تشغيل 48 غرفة منفصلة لكل تجربة في غرفة لاهوائية واحدة ، مما يدعم الفحص اللاهوائي عالي الإنتاجية.

يعمل هذا البروتوكول كدليل مرئي ونسخة محدثة من طريقة تجميع وتشغيل MBRA المنشورة سابقا والتي طورها مختبرنا⁴. تم دمج العديد من التحسينات الرئيسية لتعزيز قابلية التكرار وتبسيط سير العمل وتقليل التلوث. أولا ، يتم الآن حفر قش PTFE كيميائيا لمنعها من الانفصال والسقوط في غرف المفاعل الحيوي. ثانيا ، تمت إضافة قشة وسائط إلى خطوط التغذية لتوجيه تدفق الوسائط إلى قاع الغرف ، مما يمنع الوسائط من التنقيط على جدران الغرفة. كان هذا مصدرا معروفا لتكوين الأغشية الحيوية. ثالثا ، تم توحيد أطوال الأنابيب C-flex وتقصيرها ، وتم تصميم حامل أنبوب مطبوع ثلاثي الأبعاد لإنشاء إعداد أكثر إحكاما وتنظيما. أخيرا ، لم تعد المفاعلات الحيوية مفككة بالكامل بين كل استخدام ، مما يقلل بشكل كبير من الوقت وتكاليف المواد المرتبطة بالتجارب المتكررة. تعكس هذه التحسينات التدريجية وغيرها التحسين التكراري القائم على الاستخدام المكثف للنظام عبر مشاريع متعددة في مختبرنا.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ملاحظة: هذا البروتوكول مخصص لإعداد وتجميع شريط MBRA واحد (الشكل 1). يتكون كل MBRA من مفاعل حيوي مطبوع ثلاثي الأبعاد ، وأنابيب لتسهيل تدفق وسط النمو ، وأنابيب لتسهيل تدفق النفايات من غرف المفاعل الحيوي. يمكن العثور على قائمة كاملة بالأجزاء التي تتكون من MBRA واحدة ، بما في ذلك الصور ، في الجدول 1. تشمل المعدات الإضافية المطلوبة مضختين تمعجيين ولوحة تحريك (انظر جدول المواد للحصول على تفاصيل الجهاز).

1. تحضير ما قبل التجميع

نقش البولي تترافلورو إيثيلين (PTFE)
ملاحظة: في حين أن الخصائص الكيميائية ل PTFE تجعله مثاليا للاستخدام في نظام MBRA هذا ، فإن تشحيمه يجعل من المستحيل الارتباط بأجزاء المفاعل الحيوي الأخرى باستخدام الإيبوكسي وحده. لتأمين أنابيب PTFE في سحر الذكور الملولب ، يجب أولا حفرها كيميائيا للسماح بترابط الإيبوكسي. يتم استخدام نقش الفلوروكربون (انظر جدول المواد). يعمل الشكل 2 أ كدليل مرئي لتسجيل أنبوب PTFE لتسهيل عملية النقش هذه.
1. قطع اثني عشر طولا 25 مم من أنابيب PTFE. سيتم قطع ستة منها إلى نصفين بعد النقش لتكون بمثابة قش لخطوط التغذية ("قش الوسائط").
  ملاحظة: يجب حفر القسم الذي يتم ربطه فقط. لمنع حفر السطح الداخلي والمناطق غير المرغوب فيها ، يجب لصق الأنبوب وإغلاقه من كلا الطرفين.
2. باستخدام شريط وضع العلامات المختبري للأغراض العامة (عرض 19 مم) ، لف الشريط بالكامل حول الجزء العلوي ، وتغطية ~ 5 مم من أنبوب PTFE (الشكل 2 أ). ضع قسما آخر من الشريط حول الجزء السفلي ، يغطي ~ 10 مم من أنبوب PTFE (الشكل 2 أ).
3. اضغط بإحكام على أطراف الشريط لتجنب وصول محلول النقش إلى الجزء الداخلي من PTFE (الشكل 2 أ). يجب أن يترك هذا ~ 10 مم من أنابيب PTFE مكشوفة للنقش.
4. قم بإعداد أربعة حلول: محلول حفر الفلوروكربون المسخن إلى 55 درجة مئوية (انظر جدول المواد للحصول على تفاصيل محلول حفر الفلوروكربون) ، 100٪ إيثانول (EtOH) ، H₂O المقطر المسخن إلى 70 درجة مئوية ، والمقطر H₂O + 2-5٪ حمض الأسيتيك المسخن إلى 70 درجة مئوية.
  تنبيه: محلول حفر الفلوروكربون شديد التآكل. قم بتنفيذ جميع الخطوات في غطاء الدخان باستخدام معدات الوقاية الشخصية. التخلص من المواد الكيميائية وفقا للإرشادات المؤسسية.
5. قم بتسخين جميع المحاليل إلى درجات الحرارة الموضحة في الخطوة 1.1.4. يجب تسخين محلول حفر الفلوروكربون في حمام مائي ، ويمكن تسخين المحاليل الأخرى على لوح ساخن. صب المحاليل في 4 عبوات زجاجية منفصلة عميقة بما يكفي لغمر الأنبوب المسجل تماما.
6. اغمر كل أنابيب PTFE في محلول حفر الفلوروكربون. دوامة لضمان التعرض المنتظم للسطح. نقع لمدة 1 دقيقة ، حتى يتحول لون السطح المحفور إلى اللون البني.
  ملاحظة: يمكن استخدام ملعقة مصفاة مقشدة معدنية لنقل أنابيب PTFE بين المحاليل.
7. نقل الأنابيب إلى حمام EtOH لمدة 5-20 ثانية.
8. نقل الأنابيب إلى حمام 70 درجة مئوية H₂0 لمدة 15-30 ثانية.
9. نقل الأنابيب إلى 70 درجة مئوية H₂0 + 2-5٪ حمام حمض الأسيتيك لمدة 1 دقيقة.
10. قم بإزالة الأنبوب وضعه على وسادة ماصة داخل غطاء الدخان. اترك الأنبوب المحفور يجف طوال الليل (16 ساعة على الأقل). بعد التجفيف ، قم بإزالة الشريط من الأنبوب المحفور.
11. PTFE المحفور جاهز للربط وسيظل قابلا للربط لعدة أشهر إذا تم تخزينه في درجة حرارة الغرفة. بمجرد أن يتلاشى اللون البني على أسطح النقش ، لم يعد قابلا للربط.
  ملاحظة: لا تعرض PTFE المحفور لضوء الأشعة فوق البنفسجية ، لأنه سيؤدي إلى تدهور النقش.
12. قم بقص 6 من أنابيب PTFE المحفورة إلى نصفين لتكون بمثابة قش لخطوط التغذية (الشكل 2 أ).
نفايات الايبوكسي وقش الوسائط
1. أدخل كل من 6 قش نفايات PTFE محفور و 6 قش وسائط PTFE محفور في لوير الذكور الملولب الخاص بهم. تأكد من محاذاة الأسطح المحفورة مع الجزء السفلي من اللور الذكري (الشكل 2).
2. اخلطي راتنجات الايبوكسي والمقسى بنسبة 1: 1 في قارب وزن أو طبق بتري. باستخدام طرف ماصة سعة 1 مل ، ضع الإيبوكسي حول قاعدة اللور الذكري الملولب حيث يلتقي بأنبوب PTFE.
3. ضع كل قطعة عموديا واترك الإيبوكسي يتماسك لمدة 24 ساعة.
  ملاحظة: يعمل صندوق طرف الماصة الفارغة سعة 1 مل بشكل جيد لتثبيتها في وضع مستقيم.

2. تجميع MBRA

MBRA وإعداد الأجزاء
1. تأكد من أن شرائط مصفوفة المفاعل الحيوي المصغر مطبوعة ثلاثية الأبعاد (انظر الملف التكميلي 1) وتحتوي على 6 غرف مفاعل حيوي مستقلة. تحتوي كل غرفة على ثلاثة منافذ 1/4 بوصة ، والتي يجب أن تكون ملوتة لإدخال التركيبات. قم بالخيوط باستخدام صنبور كسر 1/4 بوصة -28NF باستخدام مفتاح ربط بمقبض T.
  ملاحظة: يوصى باستخدام دليل الصنبور عند ربط المنافذ لضمان وجود خيط راسيا.
2. بمجرد الخيوط ، اغسل كل غرفة مفاعل حيوي بالماء لإزالة أي بقايا بلاستيكية. أضف شريط تقليب مغناطيسي مقاس 10 × 3 مم و 1 مل من الماء المقطر إلى كل حجرة. سيساعد الماء في عملية التعقيم أثناء التعقيم.
3. ضع غسالة مطاطية أعلى كل منفذ من منافذ المفاعل الحيوي. لكل غرفة ، قم بربط 1 من الذكور الملولبة بالقش ، و 1 لوير ذكر ملولب بالقش ، و 1 لوير ذكر ملولب فارغ في كل منفذ كما هو موضح في الشكل 2 ب.
4. أدخل 6 حواجز مطاطية على أشواك أنثوية 3/32 بوصة. اطو الكم العلوي من الحاجز لأسفل لتغطية الرقبة. قم بإرفاقها بمنافذ كل غرفة الموضحة في الشكل 2 ب.
5. قطع شرائط الأنابيب C-flex بالطول التالي: 2 3/8 بوصة ، 3 11/16 بوصة ، 5 1/4 بوصة ، 6 1/2 بوصة ، 7 13/16 بوصة ، و 9 بوصات ، و 9 بوصات (ستكون هناك حاجة إلى اثنين من كل طول لكل من خطوط النفايات وخطوط التغذية). بمجرد القطع ، قم بتوصيل شوكة لور أنثوية مقاس 1/8 بوصة بأحد طرفيها وموصل قفل لور ذكر بالطرف المقابل لكل طول للأنبوب.
  ملاحظة: تم تحسين الأطوال المستخدمة هنا لتقليل الفوضى وللمضخات الموضوعة على بعد ~ 1 بوصة من لوحة التقليب. اعتمادا على الإعداد المطلوب ، قد تكون هناك حاجة إلى أطوال أطول.
6. أدخل شوكة لور أنثوية مقاس 1/16 بوصة في كل طرف من أنابيب المختبر الإلكتروني الحمراء المكونة من 2 توقف (معرف 1.14 مم) وأنبوب المختبر الإلكتروني البرتقالي ذو الوقفتين (معرف 0.89 مم). كرر هذه العملية ست مرات لكل شريط MBRA.
  ملاحظة: لتسهيل إدخال شوكة اللور الأنثوية مقاس 1/16 بوصة ، اغمر نهايات أنبوب المختبر الإلكتروني لفترة وجيزة في ماء قريب من الغليان لتليين البلاستيك.
7. قم بتوصيل أنبوب المختبر الإلكتروني بأنبوب C-flex المعد في الخطوة 2.1.5. يجب توصيل كل من الأطوال الستة لأنابيب C-flex بخط مختبر إلكتروني أحمر وبرتقالي واحد عبر السحر الأنثوي.
8. قطع واحد وعشرين قطعة 1 بوصة ، قطعة واحدة 2 بوصة ، ثلاث قطع 3 بوصات ، وقطعة واحدة مقاس 12 بوصة من أنابيب C-flex. قم بتوصيل شوكة لور أنثوية مقاس 1/8 بوصة وموصل قفل لور ذكر بنهايات قطعة واحدة مقاس 3 بوصات وقطعة من الأنابيب مقاس 12 بوصة. إلى الأنبوب المتبقي ، قم بتوصيل موصلات قفل اللور الذكور بكلا الطرفين. ستشمل هذه القطع خط النفايات وتجميعات شجرة خط التغذية.
تجميع شجرة خط النفايات
1. اتبع الرسم البياني ثلاثي الأبعاد الموضح في الشكل 3 ب لتجميع شجرة خط النفايات.
2. قم بتوصيل الأطراف المكشوفة لأنبوب المختبر الإلكتروني الأحمر المكون من 2 توقف (معرف 1.14 مم) بأقفال الطلاء الطرفية على شجرة خط النفايات المجمعة. قم بإرفاقها بترتيب تصاعدي بناء على طول أنبوب C-flex المتصل بأنبوب المختبر الإلكتروني المكون من 2 توقف. قم بتوصيل أنبوب C-flex مقاس 3 بوصات مع شوكة اللور الأنثوية مقاس 1/8 بوصة وموصل قفل اللور الذكر بالجزء العلوي من شجرة خط النفايات.
تجميع شجرة خط التغذية
1. اتبع الرسم التخطيطي ثلاثي الأبعاد الموضح في الشكل 3 أ لتجميع شجرة خط التغذية.
  ملاحظة: لا تشتمل أشجار خط التغذية على موصلات اللور من الذكور إلى الذكور المستخدمة في شجرة خط النفايات. من خلال تجربتنا ، فإن هذه الموصلات عرضة للتسرب ويمكن فكها بسهولة ، مما يزيد من خطر التلوث في كل من غرف المفاعل الحيوي وزجاجات الوسائط. للتخفيف من ذلك ، يتم إنشاء شجرة خط التغذية بدون هذه المكونات.
2. قم بتوصيل الأطراف المكشوفة لأنبوب المختبر الإلكتروني البرتقالي المكون من 2 توقف (معرف 0.89 مم) بأقفال اللور الطرفية على شجرة خط التغذية المجمعة. قم بإرفاقها بترتيب تصاعدي بناء على طول أنبوب C-flex المتصل بأنبوب المختبر الإلكتروني المكون من 2 توقف. قم بتوصيل الأنبوب المرن C-flex مقاس 12 بوصة بالجزء العلوي من شجرة خط التغذية.
التجميع الكامل: اجمع المكونات المحضرة في نظام استزراع MBRA.
1. قم بتوصيل أنبوب C-flex متغير الطول في نهاية شجرة خط التغذية بالمفاعل الحيوي ، بترتيب تصاعدي ، مع أقصر خط على الجانب الأيسر من شريط المفاعل الحيوي والأطول على اليمين.
2. قم بتوصيل الأنبوب المرن C متغير الطول في نهاية شجرة خط النفايات بشريط المفاعل الحيوي بترتيب تنازلي ، مع طول الخط على اليسار والأقصر على اليمين. يقع أقصر خط نفايات على الجانب الأيمن من شريط المفاعل الحيوي لأنه الأقرب إلى مضخة النفايات. في المقابل ، يوجد أطول خط تغذية على الجانب الأيمن لأن مضخة التغذية تقع على اليسار (الشكل 1).
تعقيم المصفوفات المجمعة: تحضير النظام المجمع للتعقيم.
1. قم بتجميع جميع خطوط التغذية C-flex معا على الجانب الأيسر من MBRA وثبتها برباط ملتوية. افعل الشيء نفسه مع خطوط النفايات على الجانب الأيمن من الشريط.
2. قم بتشكيل حلقة باستخدام أنبوب المختبر الإلكتروني البرتقالي ذو الوقفتين بين خطوط C-flex. قم بتأمين الحلقة باستخدام شريط الأوتوكلاف. افعل الشيء نفسه مع أنابيب المختبر الإلكتروني الحمراء المكونة من 2 محطة على جانب النفايات من شريط المفاعل الحيوي. سيوفر هذا مساحة أثناء التعقيم.
3. قم بتغطية اللور الأنثوي في نهاية خط النفايات وشجرة خط التغذية بقطعة من رقائق الألومنيوم لمنع التلوث بعد إزالتها من الأوتوكلاف. قم بفك السحر الملولب الذكري باستخدام الحاجز الموجود في كل غرفة مفاعل حيوي للسماح للبخار بالهروب أثناء التعقيم.
  ملاحظة: هذه الخطوة ضرورية لضمان السماح للبخار بالخروج من المفاعل الحيوي أثناء التعقيم. إذا لم يتم تهويسه بشكل صحيح ، فقد يحدث تكسير في غرف المفاعل الحيوي.
4. ضع MBRA في صندوق الأوتوكلاف وقم بتمديد خط التغذية وأشجار خط النفايات في صناديق منفصلة مجاورة للحاوية التي تحتوي على MBRAs. إذا تم التواء أنبوب المختبر الإلكتروني بالقرب من أنثى شوكة اللور 1/16 بوصة أو أي أقسام من أنبوب C-flex أثناء التعقيم ، فقد تسد الأنبوب أو تعيق تدفق الوسائط أو النفايات.
5. الأوتوكلاف عند 121 درجة مئوية ، ≥ 15 رطل لكل بوصة مربعة لمدة 25 دقيقة. استخدم برنامج عادم بطيء نموذجي لدورات السائل. اترك المفاعل الحيوي يبرد في درجة حرارة الغرفة بعد دورة الأوتوكلاف. بعد أن يبرد MBRA بشكل كاف ، أعد شد سحر الذكور الملولب بالحاجز.
  ملاحظة: تصبح شرائط المفاعل الحيوي المعقمة مرنة وعرضة للتشقق إذا تم ضغطها. اترك وقتا كافيا ليبرد قبل شد التركيبات.
  ملاحظة: أنبوب المختبر الإلكتروني البرتقالي ذو التوقف 2 عرضة للتشقق أثناء عملية الأوتوكلاف وقد ينفصل عن شوكة اللور الأنثوية مقاس 1/16 بوصة. في حالة حدوث تكسير ، قم برش كلا الطرفين بنسبة 70٪ من الإيثانول ، ثم قم بقص الطرف المتصدع بشفرة حلاقة معقمة وأعد توصيل الأنبوب بشريط اللوت. بدلا من ذلك ، يمكن تعقيم أنابيب E-lab الإضافية مع سحر أنثوي 1/16 بوصة مرفقة بشكل منفصل في كيس الأوتوكلاف ، ويمكن تبديل الأنبوب بالكامل.

3. تجميع زجاجة الوسائط والنفايات

تجميع زجاجة الوسائط
ملاحظة: في المثال الحالي ، يتم تغذية النظام بأكمله بزجاجة واحدة سعة 2 لتر. راجع الشكل 4 أ للحصول على صورة لمجموعة غطاء زجاجة الوسائط.
1. قم بربط محولات Dibafit (محولات غطاء الزجاجة) في المنفذين الملولبين أعلى غطاء الزجاجة من السلسلة Q. أضف قسما مقاس 3 بوصات من الأنابيب C-flex إلى أحد المحولات وقسما مقاس 12 بوصة من الأنابيب C-flex إلى الآخر. إلى نهاية كل قسم من أقسام الأنابيب ، أضف موصل قفل لور ذكر.
  ملاحظة: قد يختلف طول الأنبوب المطلوب للوصول إلى شجرة خط التغذية في MBRA ويمكن تعديله وفقا لذلك.
2. قم بقص قطعة مقاس 12 بوصة من أنابيب PTFE لتكون بمثابة القش الذي يمكن من خلاله سحب الوسائط. قم بقص النهاية بزاوية 45 درجة باستخدام شفرة حلاقة لمنع انسداد الجدار الجانبي للزجاجة. أدخل PTFE في الفتحة الصغيرة الموجودة أسفل غطاء الزجاجة المتصل بقسم 12 بوصة من الأنابيب C-flex.
3. قم بقص قطعة مقاس 2 بوصة من الأنابيب C-flex وقم بإرفاق شوكة أنثوية لفة بأحد طرفيها وموصل قفل لور ذكر بالطرف الآخر. قم بتوصيل هذا الأنبوب بقسم 12 بوصة من الأنبوب الذي سيتصل في النهاية بشجرة خط التغذية. قم بتأمين القطعة مقاس 2 بوصة باستخدام Pinchcock. ضع حلقة Pinchcock حول أنبوب 3 بوصات لغطاء الزجاجة. سيكون هذا بمثابة سدادة مؤقتة لمنع تسرب الوسائط أثناء وبعد التعقيم.
4. تحضير الوسائط المطلوبة. قم بتثبيت غطاء الزجاجة المجمع بالكامل على زجاجة الوسائط. لف الأنبوب المرن C-flex مقاس 12 بوصة حول الزجاجة وقم بتأمين النهاية باستخدام Pinchcock على الأنبوب مقاس 2 بوصة ، كما هو موضح أعلاه. لا تقم بلف الغطاء بإحكام ، بل قم بفكه قليلا لمنع تراكم الضغط أثناء التعقيم.
5. استخدم رقائق معدنية لتغطية نهاية الأنبوب مقاس 3 بوصات المنبع من غطاء الزجاجة. الأوتوكلاف لفترة مناسبة لبروتوكول الوسائط. بعد التعقيم ، قم بإزالة الرقاقة من الأنبوب مقاس 3 بوصات وقم بربط مرشح حقنة 0.22 ميكرومتر في موصل قفل اللور الذكري. سيسمح ذلك بتدفق الهواء إلى زجاجة الوسائط أثناء الضخ ، ولكنه سيمنع التلوث.
  ملاحظة: قبل الاستخدام ، تأكد من إغلاق أغطية الزجاجات من السلسلة Q بإحكام على الزجاجات ، لأن الختم غير الصحيح قد يمنع التدفق السليم.
تجميع زجاجات النفايات: لتجنب تغيير زجاجات النفايات كل يوم ، أنشأ المختبر نظاما متطبقا لجمع النفايات (الشكل 4 ب) يسمح بملء زجاجات متعددة سعة 2 لتر بالنفايات أثناء التجربة. إعداد نظام النفايات المتدرج هذا هو كما يلي:
1. قم بربط محولات غطاء الزجاجة في المنفذين الملولبين أعلى غطاء زجاجة من الفئة Q. كرر ذلك لمدة 2-4 أغطية زجاجات ، اعتمادا على عدد زجاجات تخزين النفايات المطلوبة.
2. قطع قطعة 2 بوصة من PTFE لكل غطاء زجاجة. أدخل هذه القطعة داخل غطاء الزجاجة في الفتحة المخصصة لإزالة النفايات إلى الزجاجة التالية في النظام.
3. قم بقص طول الأنبوب المرن C لفترة كافية لتمتد بين شجرة خط النفايات المنبثقة من المضخة إلى موقع نظام زجاجة النفايات. قم بتركيب موصل قفل لور ذكر في الطرف المجاور لشجرة خط النفايات وقم بتوصيل الطرف الآخر بمحول غطاء الزجاجة بدون أنبوب PTFE على غطاء الزجاجة.
4. قم بقص طول ثان من الأنابيب المرنة C لتوصيل أغطية الزجاجات على زجاجات النفايات الأولى والثانية. قم بتوصيل الأنبوب الموجود على محول غطاء الزجاجة بقش PTFE على الزجاجة الأولى وعلى محول غطاء الزجاجة بدون قش PTFE على الزجاجة الثانية.
  ملاحظة: يجب وضع كل زجاجة في سلسلة زجاجة النفايات المتدرجة فوق الأولى للسماح للجاذبية بالمساعدة في التدفق من زجاجة إلى أخرى (الشكل 4 ب). يوصى بوضع جميع الزجاجات في حاوية ثانوية (على سبيل المثال ، صندوق تخزين بلاستيكي مفتوح) وترتيبها بترتيب تنازلي باستخدام الناهضين ، مثل حاويات الأدوات الحادة المقلوبة.
5. استمر في هذه السلسلة لأكبر عدد ممكن من الزجاجات حسب الرغبة. في الزجاجة النهائية ، قم بتوصيل جزء أنابيب C-flex مقاس 3 بوصات بموصل قفل لور ذكر بمحول غطاء الزجاجة المجاني. ثم قم بتوصيل حقنة سعة 20 مل لتطبيق فراغ وتسهيل سلسلة النفايات.

4. اتصال MBRA والتشغيل والتفكيك

التوصيل بالمضخات
1. قم بإزالة شريط الأوتوكلاف الذي يثبت أنبوب المختبر الإلكتروني معا لكل من خطوط النفايات والتغذية. قم بفك حزم الأنابيب المرنة.
2. ضع MBRA بين المضختين أعلى لوحة التقليب. يمكن تثبيته على اللوحة باستخدام الحوامل المطبوعة ثلاثية الأبعاد (انظر الملف التكميلي 2). تأكد من محاذاة مواضع التقليب المشار إليها على لوحة التقليب.
3. قم بتوصيل أنبوب المختبر الإلكتروني لخط التغذية بخراطيش المضخة التمعجية. ضع نقاط توقف أنبوب المختبر الإلكتروني في الفتحات الموجودة على الخراطيش. افعل الشيء نفسه مع خط النفايات أنبوب المختبر الإلكتروني على المضخة على يمين لوحة التقليب.
4. قم بقفل خراطيش المضخة التمعجية في المضخة. تأكد من تثبيت الخراطيش بالكامل على المضخة وأن الأنبوب داخل قناة الخراطيش.
  ملاحظة: قم بقفل الخراطيش في مكانها على المضخات فقط إذا كنت تنوي بدء التدفق في غضون 24 ساعة. إذا تركت مثبتة دون تدفق الوسائط لمدة تزيد عن 24 ساعة ، فقد تصبح الأنابيب مضغوطة ومسدودة. إذا حدث هذا ، فما عليك سوى إزالة المشبك وتدليك الأنبوب برفق عند نقطة الضغط.
5. رتب الأنابيب C-flex باستخدام حاملات الأنابيب المطبوعة ثلاثية الأبعاد (الملف التكميلي 3).
6. قم بتوصيل نهاية شجرة خط النفايات بالأنبوب المؤدي إلى زجاجات النفايات.
  ملاحظة: عند تشغيل العديد من MBRAs ، ستحتاج أشجار خط النفايات إلى أن تكون متشعبة معا قبل توصيلها بالأنبوب المؤدي إلى زجاجات النفايات. يمكن القيام بذلك عن طريق إنشاء شجرة متفرعة بسيطة لكل MBRA إضافية.
7. قم بتوصيل اللور الأنثوي على أنبوب دخول خط التغذية بالموصل الذكر على أنبوب 12 بوصة من غطاء زجاجة الوسائط.
  ملاحظة: يجب أن يكون كلا الطرفين معقما في هذه المرحلة. تجنب لمسها بأي مصدر محتمل للتلوث. في حالة الاشتباه في وجود تلوث ، انقع كل طرف في مبيض بنسبة 10٪ لمدة 10 دقائق قبل التوصيل.
8. قم بتشغيل كلتا المضختين لبدء تدفق الوسائط. تأكد من تدفق المضخات في الاتجاه الصحيح (كلاهما مضبوطة في اتجاه عقارب الساعة ("CW") إذا كانت النفايات على يمين المضخات).
9. مراقبة حجم وإيقاع قطرات الوسائط التي تسقط في كل غرفة مفاعل حيوي ؛ قد تشير أي اختلافات كبيرة في هذا إلى تباين معدل التدفق. إذا لوحظ تباين ، فمن المستحسن تغيير أي أنبوب تغذية برتقالي من مختبر إلكتروني مكون من 2 محطة متصل بغرفة المفاعل الحيوي المخالفة. سيساعد هذا في الحد من تباين معدل التدفق في التشغيل التجريبي.
  ملاحظة: هذا هو الوقت المناسب لتشخيص وإصلاح أي تسرب في النظام ، لذا راقب عملية التعبئة الأولية عن كثب.
10. بمجرد أن تصل غرف المفاعل الحيوي إلى سعتها ، أغلق كلتا المضختين واترك المفاعلات الحيوية بالجلوس لمدة 24-48 ساعة. هذه الخطوة ضرورية للتحقق من وجود أي تلوث محتمل في الغرف قبل بدء التجربة.
تطعيم MBRA
ملاحظة: هنا نصف البروتوكول الأساسي لتعقيم الحاجز وحقن اللقاح.
1. تحضير اللقاح حسب المواصفات المطلوبة.
2. ضع محلول مبيض طازج بنسبة 10٪ على الجزء العلوي من الحاجز على كل غرفة مفاعل حيوي باستخدام قطارة بلاستيكية. قم بإيداع كمية كافية من المبيض لتغطية الجزء العلوي من الحاجز بالكامل. اتركه لمدة 10 دقائق. جفف الحاجز باستخدام منديل مختبر معقم.
3. باستخدام إبرة بطول 3 بوصات 22 جم وحقنة تحتوي على العينة ، اخترق مركز الحاجز. تأكد من أن الإبرة تلامس الوسائط داخل الغرفة ، ثم قم بحقن اللقاح في غرفة المفاعل الحيوي. اغسل المحقنة عن طريق إزالة الوسائط وإعادة حقنها مرة أخرى في الغرفة. قم بإزالة الإبر من الحاجز وتخلص منها في وعاء أدوات حادة.
4. اسمح لللقاح بالنمو لفترة مناسبة ، بناء على التصميم التجريبي ، قبل بدء التدفق. على سبيل المثال ، تتطلب المجتمعات البكتيرية البرازية نموا أوليا للدفعة من 4-16 ساعة لزيادة الكتلة الحيوية^{الكافية 8}.
5. قم بتشغيل كلتا المضختين إلى معدل التدفق المطلوب ، اعتمادا على وقت الدوران المطلوب. راجع دليل المضخة التمعجية لمزيد من المعلومات حول معدلات التدفق.
  ملاحظة: بغض النظر عن معدل التدفق المطلوب ، يجب دائما تشغيل مضخة النفايات بسرعة أعلى من مضخة الوسائط لضمان عدم فيضان غرف المفاعل الحيوي. بالنسبة لزراعة المجتمع البكتيري المعدي المعوي ، نستخدم معدل دوران 1.92 مل / ساعة ، يتم تحقيقه عن طريق ضبط مضخة الوسائط على 1.0 دورة في الدقيقة ومضخة النفايات على 2.0 دورة في الدقيقة.
6. مرة أخرى ، لاحظ حجم وإيقاع قطرات الوسائط التي تسقط في كل غرفة مفاعل حيوي ، وأي اختلافات كبيرة في ذلك قد تشير إلى تباين معدل التدفق. إذا لوحظ تباين ، فمن المستحسن تغيير أي أنبوب تغذية برتقالي ثنائي الشباك E-lab متصل بغرفة المفاعل الحيوي المخالفة. سيساعد هذا في الحد من تباين معدل التدفق في عمليات التشغيل التجريبية.
أخذ عينات MBRA
1. ضع محلول مبيض بنسبة 10٪ على الجزء العلوي من الحاجز في كل غرفة مفاعل حيوي ، وهو ما يكفي لتغطية السطح بالكامل. اتركه لمدة 10 دقائق. بعد 10 دقائق ، جفف الحاجز باستخدام منديل مختبر معقم.
2. باستخدام إبرة وحقنة بطول 3 بوصات قياس 22 ، اخترق مركز الحاجز وأدخل الإبرة بالكامل في غرفة المفاعل الحيوي. أثناء الإمساك بالمحقنة ، اسحب المكبس للخلف لإزالة العينة من الغرفة.
  ملاحظة: تجنب إزالة أكثر من 20٪ من الحجم الكلي لغرفة المفاعل الحيوي في وقت واحد. قد تؤدي إزالة أكثر من ذلك إلى تعطيل المجتمع الميكروبي ، حيث ينقطع تدفق النفايات حتى تعيد الوسائط الجديدة ملء الغرفة إلى مستوى قش نفايات PTFE.
3. قم بإزالة الإبرة وتوزيع العينة في وعاء مناسب. تخلص من الإبرة في وعاء الأدوات الحادة.
تفكيك وتجديد MBRA
ملاحظة: بعد التجارب ، ستحتاج MBRA إلى التعقيم والتحضير للتجارب المستقبلية.
1. قم بتبديل إدخال الوسائط بسعة 1 لتر من مبيض بنسبة 10٪ في الماء منزوع الأيونات (DI). قم بزيادة معدل التدفق في كلتا المضختين إلى الحد الأقصى لإزاحة محتويات غرف المفاعل الحيوي بمحلول التبييض.
2. بمجرد أن تصبح الغرف صافية (تم استبدال جميع الوسائط بالتبيض) ، اقلب MBRA للتطهير فوق خط التعبئة لمدة 5 دقائق. بعد 5 دقائق ، قم بتصحيح الشريط وانتظر 5 دقائق إضافية للتعقيم.
  ملاحظة: لا تسمح للمبيض بالجلوس لأكثر من 10 دقائق كما هو موضح أعلاه ، لأن ذلك سيؤدي إلى تغير لون البلاستيك وإضعاف الوسائط وأنابيب النفايات.
3. استبدل محلول التبييض بنسبة 10٪ ب 1 لتر من ماء DI. اغسل النظام بماء DI حتى يمر كل الماء. افصل أنبوب المختبر الإلكتروني للمفاعل الحيوي عن المضخات وقم بإزالة MBRAs.
4. للتجديد ، قم بإزالة الحاجز المستخدم وكل الماء باستثناء 1 مل من كل حجرة.
5. استبدل الحاجز وأنبوب المختبر الإلكتروني البرتقالي المكون من 2 محطة واتبع الخطوات السابقة للتحضير للتعقيم (الخطوات 2.5.1 إلى 2.5.5) حتى 3 مرات. بعد إعادة الاستخدام الثالث ، يجب تفكيك MBRA بالكامل ، واستبدال أنبوب C-flex ، وتعقيم كل جزء على حدة بنسبة 70٪ EtOH أو استبداله في حالة كسره. سيصبح الإيبوكسي الذي يحتوي على النفايات والتغذية PTFE هشا بعد عدة دورات الأوتوكلاف وسيحتاج إلى إعادة تطبيقه.
  ملاحظة: يتم استبدال أنبوب المختبر الإلكتروني البرتقالي ذو التوقفين بين كل تشغيل للحد من تباين معدل التدفق الناجم عن التآكل ودورات الأوتوكلاف المتكررة.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

لتسهيل نمو البكتيريا اللاهوائية ، مثل تلك الموجودة في الجهاز الهضمي ، يمكن إعداد MBRA وتشغيله داخل الغرف اللاهوائية. لإثبات القدرة على زراعة المجتمعات البكتيرية المعقدة مباشرة من المواقع ذات الصلة في جسم الإنسان ، تم تحضير عينة براز بشرية وزراعتها في هذا النظام. تم تنفيذ جميع الأعمال في غرفة لاهوائية تم ضبطها على 37 درجة مئوية ، ونمت الثقافات في وسائط المفاعل الحيوي الخاصة بنا ، BRM3⁷.

تم تحضير الملاط البرازي عن طريق إذابة البراز البشري بشكل لاهوائي ثم خلطه مع محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) إلى تركيز نهائي قدره 25٪ وزن / حجم. بعد التأكد من العقم ، تم تلقيح تسع غرف للمفاعل الحيوي لكل منها 3 مل من نفس الملاط البرازي. نمت المجتمعات الميكروبية بين عشية وضحاها دون مدخلات وسائط أو إزالة النفايات ، مما أدى إلى مزارع دفعات منفصلة على مدى 16 ساعة. بعد ذلك ، تم تشغيل مضخات التغذية وضبطها على معدل تدفق يبلغ 1.92 مل في الساعة. بعد أربعة أيام من التدفق المستمر ، تم جمع العينات من المفاعلات الحيوية وتحليلها لتكوين المجتمع الميكروبي باستخدام تسلسل جيني 16S rRNA متبوعا بتقليل الضوضاء باستخدام Deblur والتصنيف التصنيفي باستخدام قاعدة بيانات SILVA 138 SSU في QIIME 2^13. تم اكتشاف ما مجموعه 65 جنسا عبر جميع النسخ التسعة ، ولكن سيطر على المفاعلات الحيوية 18 جنسا فقط ، كل منها يشتمل على وفرة لا تقل عن 2٪ في أي من التكرارات التسعة (الشكل 5). أظهرت المفاعلات الحيوية قابلية عالية للاستنساخ بحيث تم اكتشاف 22 من أصل 65 جنسا في جميع النسخ التسعة ، وتم اكتشاف 17 جنسا إضافيا في نصف التكرارات على الأقل. كانت غالبية الأجناس الغائبة عن مفاعل واحد على الأقل (37 من أصل 43 جنسا) من الأنواع النادرة ، ولكل منها وفرة نسبية أقل من 2٪ في المفاعلات الحيوية. باختصار ، دعمت مزارع MBRA ذات التدفق المستمر المجتمعات الميكروبية المعقدة والقابلة للتكاثر المشتقة من نفس عينة البراز ، حتى بعد مزارع الدفعات المنفصلة لمدة 16 ساعة داخل كل غرفة مفاعل حيوي.

figure-results-1
الشكل 1: مصفوفة المفاعل الحيوي المصغر (MBRA). MBRA مجمعة بالكامل ، بما في ذلك ملصقات لشجرة أنابيب خط التغذية والنفايات ، وغرف المفاعل الحيوي وشريط المفاعل الحيوي. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-2
الشكل 2: دليل نقش PTFE وتخطيط منفذ MBRA. (أ) مخطط انسيابي يجب اتباعه لنقش الوسائط ونفايات قش PTFE. (ب) تحتوي كل غرفة مفاعل حيوي على منفذ لقش وسائط + لوير ذكر ملولب ، وقش نفايات + لوير ذكر ملولب ، وحاجز + لوير ذكر ملولب. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-3
الشكل 3: أشجار الأعلاف والنفايات MBRA. الصور التمثيلية التي يجب اتباعها في تجميع (أ) شجرة خط التغذية و (ب) شجرة خط النفايات. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-4
الشكل 4: غطاء زجاجة الوسائط ونظام طبقة النفايات. (أ) مثال على غطاء زجاجة مجمع من السلسلة Q يستخدم لسحب الوسائط إلى MBRAs. (ب) صورة لنظام جمع النفايات المتدرجة. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-5
الشكل 5: الوفرة النسبية للأجناس البكتيرية. (أ) يبين الرسم البياني الشريطي المكدس الوفرة النسبية لجميع الأجناس التي تشتمل على وفرة لا تقل عن 2٪ في أي من العينات المعروضة. (ب) مقاييس تنوع ألفا ل OTUs المرصودة وتنوع شانون بين جميع غرف المفاعلات الحيوية التسع. تم تلقيح جميع غرف المفاعل الحيوي التسع بنفس الملاط البرازي المحضر من البراز البشري. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الجدول 1: مكونات MBRA. صور وأوصاف لجميع الأجزاء الفردية المطلوبة لتجميع MBRA بالكامل ، جنبا إلى جنب مع الكمية اللازمة لكل مكون. الرجاء النقر هنا لتنزيل هذا الجدول.

الجدول 2: دليل استكشاف الأخطاء وإصلاحها. المشكلات الشائعة التي تواجهها مع تشغيل MBRA ، جنبا إلى جنب مع أسبابها المحتملة والحلول الموصى بها. الرجاء النقر هنا لتنزيل هذا الجدول.

الملف التكميلي 1: ملف Stl للطباعة ثلاثية الأبعاد لشرائط صفيف المفاعل الحيوي المصغر. الرجاء النقر هنا لتنزيل هذا الملف.

الملف التكميلي 2: ملف Stl للطباعة ثلاثية الأبعاد لحاملي المفاعلات الحيوية المستخدمة لتثبيت المفاعلات الحيوية على ألواح التحريك. الرجاء النقر هنا لتنزيل هذا الملف.

الملف التكميلي 3.: ملف Stl للطباعة ثلاثية الأبعاد لحاملات الأنابيب المستخدمة لتنظيم نفايات C-flex وأنابيب التغذية الممتدة من MBRAs. الرجاء النقر هنا لتنزيل هذا الملف.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يصف هذا البروتوكول التجميع الكامل والتشغيل الأساسي لمصفوفة المفاعل الحيوي المصغر (MBRA) للزراعة عالية الإنتاجية للمجتمعات البكتيرية ، مع دمج العديد من التحسينات الرئيسية للطريقة المنشورة سابقا. يظل نظام MBRA أداة متعددة الاستخدامات وفعالة من حيث التكلفة تسمح للباحثين بزراعة أنظمة بيئية ميكروبية معقدة مع دعم العديد من التكرارات التجريبية بالتوازي. في هذا الإصدار المحدث، نقدم تحسينات تعزز قابلية التكرار وتبسيط سير العمل وتقلل من مخاطر التلوث. وتشمل هذه قش PTFE المحفور كيميائيا (الشكل 2) لمنع الانفصال ، وقش التغذية على خط الوسائط (الشكل 2) لتقليل تكوين الأغشية الحيوية ، وأطوال الأنابيب الموحدة مع حامل الأنابيب المطبوع ثلاثي الأبعاد المصاحب (الملف التكميلي 3) لإعداد أكثر إحكاما وتنظيما ، وبروتوكول إعادة الاستخدام المحسن الذي يلغي الحاجة إلى التفكيك الكامل بين التجارب. تمثل هذه التحسينات معا تحسينات متكررة تم تطويرها من خلال الاستخدام المكثف لنظام MBRA عبر تطبيقات تجريبية متنوعة في مختبرنا. من خلال معالجة كل من خطوات التجميع الهامة والتحسينات العملية ، تؤكد هذه المناقشة على فائدة MBRA كنظام نموذجي دائم التطور لأبحاث الميكروبيوم.

يعتمد نجاح نظام MBRA بشكل كبير على التجميع الدقيق وتعقيم المكونات لضمان التشغيل الخالي من التلوث. تشمل الخطوات الرئيسية التركيب المناسب لأغطية السلسلة Q والأنابيب والموصلات ، مما يسهل التجميع المعياري وتمكين إدخال الوسائط وجمع النفايات. يعد ضمان إحكام الإغلاق بين زجاجات الوسائط وخزانات النفايات وغرف المفاعلات الحيوية أمرا ضروريا لمنع التسرب والحفاظ على الظروف المعقمة. خطوة أخرى حاسمة هي التحقق من معدلات تدفق المضخة التمعجية قبل التجريب ، حيث يمكن أن تؤدي التناقضات إلى توصيل وسائط غير متساوية وقد تؤثر على ديناميكيات النمو الميكروبي. تشتمل معظم المضخات التمعجية متعددة القنوات التي تستخدم الكاسيت على آلية ضبط الانسداد ، والتي يجب استخدامها لضبط معدل التدفق لكل قناة. حتى مع المعايرة المناسبة ، تظل أنابيب المختبر الإلكتروني مصدرا أساسيا للتباين. للتخفيف من ذلك ، من المهم مراقبة تواتر وحجم قطرات الوسائط التي تدخل كل غرفة مفاعل حيوي أثناء الملء الأولي وأثناء بدء التجارب. تسمح هذه الفحوصات المرئية بالكشف المبكر عن تناقضات معدل التدفق التي قد تضر بقابلية التكاثر التجريبي. يقدم الجدول 2 استراتيجيات استكشاف الأخطاء وإصلاحها للمشكلات الشائعة التي تمت مواجهتها أثناء تجميع MBRAs واستخدامها. تضمن خطوات استكشاف الأخطاء وإصلاحها هذه قابلية التكرار عبر التجارب ومنع الاضطرابات أثناء الزراعة طويلة الأجل.

على الرغم من نقاط قوته، فإن نظام MBRA لديه قيود معينة يجب مراعاتها عند تصميم التجارب. على عكس الأنظمة الأكثر تقدما ، تفتقر MBRA إلى قدرات المراقبة النشطة ، مثل قياسات الكثافة الضوئية في الوقت الفعلي (OD) ، والتحكم في الأس الهيدروجيني ، وتنظيم درجة الحرارة. هذا الغياب للقياس النشط يحد من قدرة النظام على مراقبة التغيرات الديناميكية في نمو الميكروبات ونشاط التمثيل الغذائي في الوقت الفعلي. علاوة على ذلك ، في حين أن النظام يدعم الزراعة اللاهوائية داخل الغرف ، إلا أنه لا يشمل التحكم المتكامل في الغاز ، مما قد يحد من التطبيقات التي تتطلب بيئات دقيقة محبة للهوائية الدقيقة أو البيئات المخصبة بثاني أكسيد الكربون₂. بالنسبة للدراسات التي تتطلب مثل هذا التحكم ، قد تكون الأنظمة البديلة ذات تنظيم الغاز المدمج أكثر ملاءمة.

يوفر نظام MBRA مزايا رئيسية مقارنة بنماذج المفاعلات الحيوية الحالية ، بما في ذلك الإنتاجية العالية وقابلية التوسع والفعالية من حيث التكلفة ، مع الاحتفاظ بالقدرة على زراعة المجتمعات البكتيرية المعقدة تحت التدفق المستمر لتقليد البيئات الديناميكية مثل الجهاز الهضمي البشري⁶^،⁸^،¹⁰. يسمح تصميمه المدمج المعياري بالتشغيل المتزامن للعديد من المفاعلات الحيوية ، مما يجعله مثاليا للدراسات عالية الإنتاجية مثل فحص المجتمعات المشتقة من البراز لمقاومة غزو مسببات^{الأمراض 9}. يوفر هذا التصميم المعياري مرونة تجريبية واسعة النطاق: يمكن توفير كل شريط بواسطة زجاجة وسائط واحدة ، كما هو موضح في هذا البروتوكول ، أو بواسطة ما يصل إلى ستة مصادر وسائط متميزة ، واحدة لكل غرفة مفاعل حيوي. يخضع حجم العمل لطول قش نفايات PTFE النحيف الذي يتم إدخاله في منفذ النفايات لكل غرفة ، والذي يحدد ارتفاع السائل ؛ في هذا البروتوكول ، تحافظ القش مقاس 25 مم على حجم عمل 15 مل ، ولكن يمكن تحقيق أحجام تتراوح بين 1-20 مل عن طريق تقليم القش أو تمديده. بالإضافة إلى ذلك ، يتم إدخال قش تغذية أقصر في مدخل الوسائط لتوجيه التدفق نحو قاعدة الغرفة ، مما يمنع الوسائط من التساقط أسفل جدران الغرفة وتقليل تكوين الأغشية الحيوية فوق خط التعبئة. يمكن أيضا ضبط سرعات المضخة أو قطر أنابيب المضخة لتغيير معدل دوران النظام. حتى الآن ، تم استخدام نظام MBRA على نطاق واسع لدراسة التغيرات الوظيفية والتركيبية للمجتمعات الميكروبية استجابة لمجموعة متنوعة من العوامل ، بما في ذلك المضادات الحيوية¹⁰ ، وأدوية السرطان¹⁴ ، والمركبات الغذائية المختلفة¹²^،¹⁵^،¹⁶^،¹⁷ . التصميم المعياري البسيط يجعله مثاليا للتكيف مع الاحتياجات التجريبية المختلفة. على سبيل المثال ، تم تعديل MBRA لدراسة الأغشية الحيوية في ظل ظروف شبيهة بالعلاج الكيميائي¹⁸ ، مما يدل على تعدد استخداماته في دراسات البيئة الميكروبية خارج ثقافات العوالق.

يمكن أن تستفيد التكرارات المستقبلية لنظام MBRA من الترقيات الهندسية الإضافية التي توسع وظائفه ودقته وإمكانات الإنتاجية. ويتمثل أحد هذه التحسينات في دمج منافذ إضافية في كل غرفة مفاعل حيوي. يمكن استخدام هذه المنافذ لدعم المراقبة النشطة للمعلمات البيئية مثل الأس الهيدروجيني أو درجة الحرارة أو الغاز أو الكثافة البصرية. سيؤدي ذلك إلى معالجة أحد أهم قيود النموذج من خلال السماح بالتعليقات والمراقبة في الوقت الفعلي. يمكن أن تسهل التحسينات التي تم إدخالها على هندسة الغرفة أو المنفذ تنظيفا أكثر شمولا ويمكن الوصول إليها ، مما يقلل من تراكم البقايا وتغير اللون ويحسن قابلية إعادة الاستخدام على المدى الطويل. سيسمح دمج المضخات التمعجية الإضافية مع أجهزة ضبط الوقت القابلة للبرمجة بمدخلات الوسائط النبضية أو النهارية ، مما يؤدي إلى محاكاة أفضل للبيئات المرتبطة بالمضيف مثل دورات التغذية في الأمعاء البشرية. أخيرا ، قد تسمح الطباعة ثلاثية الأبعاد بمواد بديلة ، مثل البوليمرات المقاومة كيميائيا والقابلة للتعقيم ، بمزيد من المتانة والتوافق مع مجموعة واسعة من الكواشف. يمكن لهذه التحسينات معا أن توسع بشكل كبير النطاق التجريبي ودقة منصة MBRA.

في الختام ، يوفر MBRA منصة قوية وعالية الإنتاجية لزراعة ودراسة المجتمعات الميكروبية في ظل ظروف خاضعة للرقابة. في حين أن لديها قيودا في المراقبة النشطة والتحكم في الأس الهيدروجيني ، إلا أن مرونتها وقابليتها للتوسع وفعاليتها من حيث التكلفة تجعلها أداة لا تقدر بثمن لمجموعة واسعة من الدراسات الميكروبيولوجية ، لا سيما تلك التي تتطلب قابلية عالية للتكرار وإنتاجية تجريبية. الأهم من ذلك ، أن التصميم المعياري للنظام ونهج التصنيع يجعله قابلا للتكيف بطبيعته. وقد استمر الباحثون في تصميم MBRA ليناسب مجموعة واسعة من الأهداف التجريبية. تضمن هذه القدرة على التكيف أن MBRA يمكن أن تستمر في التطور جنبا إلى جنب مع الأسئلة والتقنيات العلمية الناشئة ، مما يحافظ على أهميته كمنصة متعددة الاستخدامات لأبحاث الميكروبيوم.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعلن أصحاب البلاغ عدم وجود تضارب في المصالح

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم دعم هذا العمل من قبل زمالة الأساس الجزيئي للأمراض المعدية T32 ، والمعاهد الوطنية للصحة T32DK007664 ، والمعاهد الوطنية للصحة U19AI157981 اكتشاف الميكروبيوم وآليات مكافحة مقاومة المضادات الحيوية على الأسطح المخاطية.

يشكر المؤلفون هايدن كورنين على مساهماته في تصميم وتصنيع حاملات المفاعلات الحيوية وحاملات الأنابيب المستخدمة في هذا النظام.

تم إنشاء الشكل 2 والشكل 3 جزئيا في https://BioRender.com

Materials

List of materials used in this article
Name	Company	Catalog Number	Comments
دليل V-Tap ، الأحجام القياسية من 0-80 إلى 5/8 بوصة	أدوات التمساح الكبيرة	STD500NP
0.22 μ مرشح حقنة M	صياد	SLGVR33RS
محرك التحريك 2mag MIXdrive 60 (محرك فقط)	2 ماج	مف 41060
إبر تحت الجلد من الهواء ، 22 جم × 3 بوصة	VWR	89219-274
دينار بحريني 1 مل زلة تلميح محاقن معقمة معقمة	صياد	14-823-434
مفاعل حيوي	مختبرات أولية	NA	3D مطبوعة من DMS Somos مستجمعات المياه البلاستيك. انظر الملف التكميلي 1 للحصول على القالب
حاملات المفاعلات الحيوية	مختبرات أولية	NA	طباعة ثلاثية الأبعاد من PA 12 Black. انظر الملف التكميلي 2 للحصول على القالب.
غطاء زجاجة المذيبات ديبا أومنيفيت كيو سيريز ، GL38 / 38-430 (زجاج) ، 2 منفذ UNF (F) بدون صمامات ، أزرق	كول بارمر	EW-21942-86
أنابيب Diba Omnifit ، PTFE ، 1/8 بوصة (3.2 مم) OD × 1.5 مم معرف	كول بارمر	EW-21942-76
محول ديبفيت ، 1/4 بوصة -28 UNF (M) قاع مسطح حتى 3.2 مم ، نظرة خاطفة	كول بارمر	EW-21941-49
IRWIN 12001ZR مفتاح ربط # 0-1 / 4 "مقبض T	الامازون	B00004YOB0
إيروين هانسون عالية الكربون الصلب SAE كسر الحنفية 1/4 بوصة. 1 قطعة	زورو	G7695682
مجموعة سريعة من الايبوكسي للخدمة الشاقة Loctite زجاجة 8 أونصات سائلة	الامازون	B0044F59N0
ذكر إلى ذكر موصل قفل لور	داروين الموائع الدقيقة	DM-MM-LUER-PP	بديل: التطبيقات الإستراتيجية Inc من ذكر إلى ذكر موصل لور - 10 / pk - فيشر - NC9876577
تركيبات محول Masterflex ، Luer to Luer ، نايلون ، أفانتور	VWR	MFLX45502-56
تركيب ماسترفليكس ، نايلون ، مستقيم ، أنثى لور إلى محول شائكة خرطوم ، 1/16 "معرف	VWR	MFLX45502-00
تركيب ماسترفليكس ، نايلون ، مستقيم ، أنثى لور إلى محول شائكة خرطوم ، معرف 3/32 بوصة	VWR	MFLX45502-02
تركيب ماسترفليكس ، نايلون ، مستقيم ، أنثى لور إلى محولات خارطة خرطوم ، 1/8 "	VWR	MFLX45502-04
تركيب ماسترفليكس ، نايلون ، مستقيم ، ذكر قفل لور لمحول خرطوم شائك ، 1/8	VWR	MFLX45505-04
تركيب ماسترفليكس ، نايلون ، مستقيم ، ذكر لور × 1 / 4-28 UNF	VWR	MFLX45505-82
تركيب ماسترفليكس ، بولي بروبيلين ، كوع ، أنثى لور إلى أنثى لور محول	VWR	MFLX45508-26
أنابيب مضخة Masterflex Ismatec ، 2 توقفات ، Tygon S3 E-Lab ، معرف 0.89 مم	VWR	MFLX96460-26
أنابيب مضخة Masterflex Ismatec ، 2 توقفات ، Tygon S3 E-Lab ، معرف 1.14 مم	VWR	MFLX96460-30
ماسترفليكس &ريج; أنابيب النقل ، C-Flex ، أبيض غير شفاف ، 1/8 "معرف × 1/4" OD ؛ 25 قدم	VWR	MFLX06424-67
مهر ق Pinchcock للأنابيب ؛	VWR	470201-374
غسالات درابزين المطاط من النيوبرين ½ ؛ ” OD x ¼ ؛ ” معرف × 1/16 بوصة السماكة	الامازون	B01A29F1R0
الدقة ختم المطاط الحاجز	سيجما ألدريتش	Z553905
سبينبار مايكرو ستيك بارز	VWR	58948-375
تيترا إتش	شركة آر إس هيوست	تي إي -500
حامل الأنابيب	مختبرات أولية	NA	طباعة ثلاثية الأبعاد من PA 12 Black. انظر الملف التكميلي 3 للحصول على القالب.
مضخة خرطوشة Watson-Marlow 205S متعددة القنوات	واتسون مارلو	020.3724.00 أ	بديل مخفض: مضخات تمعجية رقمية Ismatec IPC MFLX7800142 - FISHER - 113-200-014 أو مضخة تمعجية Masterflex Ismatec IPC ، 0.1 إلى 11.25 دورة في الدقيقة ، 24 قناة ، 115/230 فولت تيار متردد ، أفانتور ، VWR ، MFLX78006-48-CH

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Current understanding of the human microbiome. Nat Med. 24 (4), 392-400 (2018).">Gilbert, J. A., et al. Current understanding of the human microbiome. Nat Med. 24 (4), 392-400 (2018).
Perspective: simple state communities to study microbial interactions: examples and future directions. Front Microbiol. 13, 801864(2022).">Sarkar, S., et al. Perspective: simple state communities to study microbial interactions: examples and future directions. Front Microbiol. 13, 801864(2022).
The impact of food bioactives on health: in vitro and ex vivo models. , Springer. Cham. (2015).">Van de Wiele, T., Van den Abbeele, P., Ossieur, W., Possemiers, S., Marzorati, M. The impact of food bioactives on health: in vitro and ex vivo models. , Springer. Cham. (2015).
Evaluation of microbial community reproducibility, stability and composition in a human distal gut chemostat model. J Microbiol Methods. 95 (2), 167-174 (2013).">McDonald, J. A. K., et al. Evaluation of microbial community reproducibility, stability and composition in a human distal gut chemostat model. J Microbiol Methods. 95 (2), 167-174 (2013).
In vitro maintenance of a human proximal colon microbiota using the continuous fermentation system P-ECSIM. Appl Microbiol Biotechnol. 91 (5), 1425-1433 (2011).">Feria-Gervasio, D., Denis, S., Alric, M., Brugère, J. F. In vitro maintenance of a human proximal colon microbiota using the continuous fermentation system P-ECSIM. Appl Microbiol Biotechnol. 91 (5), 1425-1433 (2011).
MiniBioReactor arrays (MBRAs) as a tool for studying C. difficile physiology in the presence of a complex community. Methods Mol Biol. 1476, 235-258 (2016).">Auchtung, J. M., Robinson, C. D., Farrell, K., Britton, R. A. MiniBioReactor arrays (MBRAs) as a tool for studying C. difficile physiology in the presence of a complex community. Methods Mol Biol. 1476, 235-258 (2016).
Epidemic Clostridium difficile strains demonstrate increased competitive fitness compared to nonepidemic isolates. Infect Immun. 82 (7), 2815-2825 (2014).">Robinson, C. D., Auchtung, J. M., Collins, J., Britton, R. A. Epidemic Clostridium difficile strains demonstrate increased competitive fitness compared to nonepidemic isolates. Infect Immun. 82 (7), 2815-2825 (2014).
Cultivation of stable, reproducible microbial communities from different fecal donors using minibioreactor arrays (MBRAs). Microbiome. 3 (1), 42(2015).">Auchtung, J. M., Robinson, C. D., Britton, R. A. Cultivation of stable, reproducible microbial communities from different fecal donors using minibioreactor arrays (MBRAs). Microbiome. 3 (1), 42(2015).
Identification of simplified microbial communities that inhibit Clostridioides difficile infection through dilution/extinction. mSphere. 5 (4), e00387-e00320 (2020).">Auchtung, J. M., et al. Identification of simplified microbial communities that inhibit Clostridioides difficile infection through dilution/extinction. mSphere. 5 (4), e00387-e00320 (2020).
MiniBioReactor array (MBRA) in vitro gut model: A reliable system to study microbiota-dependent response to antibiotic treatment. JAC Antimicrob Resist. 4 (4), dlac077(2022).">Hobson, C. A., et al. MiniBioReactor array (MBRA) in vitro gut model: A reliable system to study microbiota-dependent response to antibiotic treatment. JAC Antimicrob Resist. 4 (4), dlac077(2022).
Evaluating effects of antibiotics across preclinical models of the human gastrointestinal microbiota. Microbiologyopen. 14 (4), e70030(2025).">Auchtung, T. A., Lerma, A. I., Schuchart, K., Auchtung, J. M. Evaluating effects of antibiotics across preclinical models of the human gastrointestinal microbiota. Microbiologyopen. 14 (4), e70030(2025).
Direct impact of commonly used dietary emulsifiers on human gut microbiota. Microbiome. 9 (1), 66(2021).">Naimi, S., Viennois, E., Gewirtz, A. T., Chassaing, B. Direct impact of commonly used dietary emulsifiers on human gut microbiota. Microbiome. 9 (1), 66(2021).
interactive, scalable and extensible microbiome data science using QIIME 2. Nat Biotechnol. 37 (8), 852-857 (2019).">Bolyen, E., et al. interactive, scalable and extensible microbiome data science using QIIME 2. Nat Biotechnol. 37 (8), 852-857 (2019).
A microbiota-dependent response to anticancer treatment in an in vitro human microbiota model: a pilot study with hydroxycarbamide and daunorubicin. Front Cell Infect Microbiol. 12, 886447(2022).">Hobson, C. A., et al. A microbiota-dependent response to anticancer treatment in an in vitro human microbiota model: a pilot study with hydroxycarbamide and daunorubicin. Front Cell Infect Microbiol. 12, 886447(2022).
Dietary fiber monosaccharide content alters gut microbiome composition and fermentation. Appl Environ Microbiol. 90 (8), e00964-e01024 (2024).">Jensen, N., et al. Dietary fiber monosaccharide content alters gut microbiome composition and fermentation. Appl Environ Microbiol. 90 (8), e00964-e01024 (2024).
Positive synergistic effects of quercetin and rice bran on human gut microbiota reduces Enterobacteriaceae family abundance and elevates propionate in a bioreactor model. Front Microbiol. 12, 751225(2021).">Ghimire, S., et al. Positive synergistic effects of quercetin and rice bran on human gut microbiota reduces Enterobacteriaceae family abundance and elevates propionate in a bioreactor model. Front Microbiol. 12, 751225(2021).
Minibioreactor arrays to model microbiome response to alcohol and tryptophan in the context of alcohol-associated liver disease. NPJ Biofilms Microbiomes. 10 (1), 132(2024).">Hu, W., et al. Minibioreactor arrays to model microbiome response to alcohol and tryptophan in the context of alcohol-associated liver disease. NPJ Biofilms Microbiomes. 10 (1), 132(2024).
MBRA-2: A modified chemostat system to culture biofilms. Microbiol Spectr. 11 (1), e02928-e03022 (2023).">Jens, J. N., et al. MBRA-2: A modified chemostat system to culture biofilms. Microbiol Spectr. 11 (1), e02928-e03022 (2023).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

بروتوكول محدث لتجميع واستخدام مصفوفة المفاعلات الحيوية المصغرة (MBRA)

In This Article

Summary

Abstract

Introduction

Protocol

Results

Discussion

Disclosures

Acknowledgements

Materials

References

Reprints and Permissions

Tags

Related Articles