يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

التحقيق في الإصابة المتكررة للسكتة الدماغية الإقفارية في نموذج انسداد الشريان الدماغي الأوسط الثانوي في الفأر

918 مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/68806

⸱

سبتمبر 16, 2025

 ,  ,  , 
1Department of Pharmacology, University of California, Davis, 2Department of Nutrition, China Medical University, 3Division of Neurosurgery, Department of Surgery, College of Medicine and Hospital, National Taiwan University, 4Institute of Toxicology, College of Medicine, National Taiwan University, 5Department of Medical Research, China Medical University Hospital, China Medical University, 6Department of Pediatrics, College of Medicine and Hospital, National Taiwan University

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

إشعار تصحيح

Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice

ملخص

هنا ، نقدم طريقة لانسداد الشريان الدماغي الأوسط الثانوي في الفئران للتحقيق في تطور السكتة الدماغية الإقفارية المتكررة. يتم وصف الإجراءات الجراحية ورعاية ما بعد الجراحة والتغيرات المرضية العصبية ومعدل البقاء على قيد الحياة.

الملخص

السكتة الدماغية هي السبب العالمي الرئيسي الثاني للوفيات والعجز ، حيث تساهم السكتات الدماغية المتكررة بشكل كبير في النتائج السيئة وزيادة العبء العصبي. على الرغم من التقدم في إدارة السكتة الدماغية السريرية الحادة ، لا تزال النماذج التجريبية للسكتة الدماغية الإقفارية المتكررة محدودة بسبب تعقيدها الإجرائي ومعدلات الوفيات العالية. في هذه الدراسة ، هدفنا إلى إنشاء سكتة دماغية إقفارية متكررة في نموذج الفأر وتقييم التغيرات المرضية في الدماغ والعجز الوظيفي باستخدام بروتوكول انسداد الشريان الدماغي الأوسط (MCAO) على مرحلتين. خضعت الفئران الذكور البالغة C57BL / 6J ل MCAO عابرة تحت مراقبة تدفق الدم بالليزر دوبلر. تم إجراء MCAO ثانوي بعد 14 يوما من الجراحة الأولية لمحاكاة تكرار السكتة الدماغية. تضمنت تقييمات ما بعد الجراحة تحليل النشاط الحركي ، وتسجيل العجز السلوكي العصبي باستخدام نظام تسجيل من ست نقاط ، وعلامات التهابية بما في ذلك عامل نقص الأكسجة -1α (HIF-1α) وعامل نخر الورم -α (TNF-α) ، والتقييم النسيجي المرضي باستخدام تلطيخ الهيماتوكسيلين والإيوزين (H & E). بعد إدارة MCAO المتكررة ، أظهرت الفئران انخفاضا كبيرا في النشاط الحركي ، وانخفاض سرعة الحركة ، وانخفاض الدرجات السلوكية العصبية ، بالإضافة إلى زيادة العلامات الالتهابية ، مقارنة بالمجموعات الضابطة. كشف الكشف النسيجي المرضي عن نخر الخلايا العصبية المعتدل إلى الشديد ، والفجوة العصبية ، والنزيف الموضعي في القشرة والحصين لفئران MCAO المتكررة. تم إحداث العلامات الالتهابية أيضا في إجراء MCAO المتكرر. يقدم نموذج الفأر MCAO المكون من مرحلتين ، لأول مرة ، طريقة تحاكي بشكل فعال السكتة الدماغية الإقفارية المتكررة مع نتائج عصبية ومرضية متسقة وتحسن البقاء على قيد الحياة بعد الجراحة. يمكن أن يوفر هذا النموذج منصة موثوقة للدراسات الميكانيكية ويمكن تطبيقه في التقييم المستقبلي للعلاجات الواقية من الأعصاب للسكتة الدماغية المتكررة.

المقدمة

لا تزال السكتة الدماغية سببا رئيسيا للوفاة والعجز طويل الأمد في جميع أنحاء العالم ، مما يشكل عبئا سريريا واجتماعيا واقتصاديا كبيرا. أكثر من 30 مليون شخص في جميع أنحاء العالم يعانون من السكتة الدماغية وعواقبها ، بما في ذلك فقدان الحركة ، وضعف الإدراك ، وزيادة خطر الإصابة بأمراض الأوعية الدموية1،2. على الرغم من التقدم في العلاج الحاد مثل انحلال الجلطات واستئصال الخثرة داخل الأوعية الدموية ، لا يزال العديد من الناجين معرضين لخطر تكرار السكتة الدماغية ، والذي يرتبط بسوء التشخيص ، وزيادة الإعاقة ، وزيادة معدلات الوفيات. تحدث السكتات الدماغية المتكررة في حوالي 10-20٪ من المرضى في غضون 90 يوما من الحدث الأولي ، مع أعلى خطر خلال فترة النوبة الإقفارية العابرة أو السكتة الدماغية الطفيفة3. والأهم من ذلك ، أن السكتة الدماغية المتكررة غالبا ما تؤثر على مناطق الأوعية الدموية وتؤدي إلى احتشاء أكثر اتساعا وإصابات شديدة ، مثل ضعف ديناميكا الدم في الدماغ4 ، وخلل التنظيم المناعي الحاد والمزمن ، ونخر الخلايا العصبية تحت القشرية5 ، مما يشير إلى أن الدماغ قد يصبح أكثر عرضة للخطر ويسبب المزيد من المضاعفات بعد إهانة إقفارية أولية.

أجرت بعض الدراسات الحديثة نماذج للسكتة الدماغية الإقفارية أو النزفية في التجارب وكشفت عن أنماط إصابة خاصة بالمنطقة ، واستجابات الأوعية الدموية العصبية المعطلة ، وآليات الإصلاح الداخلية المختلفة لتناسب الظروف السريرية البشرية6،7. ومع ذلك ، تظل النماذج البحثية للسكتة الدماغية المتكررة أقل رسوخا بسبب إجراءاتها المعقدة ومعدل الوفيات المرتفع. أنشأت بعض الدراسات السابقة نموذج الفأر الخثاري الضوئي ، والذي ظهر كأداة قيمة لدراسة السكتة الدماغية الإقفاريةالمتكررة 8،9،10. أظهروا تفاقم إصابة الخلايا العصبية ، والاستجابة الالتهابية المطولة ، والتدهور المعرفي في الفئران المصابة بالسكتة الدماغية المتكررة ، واستكشفوا الآليات الأساسية ، بما في ذلك الخرف متعدد الاحتشاء والتحضير الالتهابي8،9،10.

أظهرت دراسة أخرى نموذجا جديدا للفأر المسن لنزيف متكرر داخل المخ في المخطط الثنائي ، والذي تم حقنه بالكولاجيناز مرتين ، مما أدى إلى تأخر التعافي في الوظيفة الحركية ، وتسبب في فقدان الإدراك والإصابة العصبية في الفئران المتكررة11. تجدر الإشارة إلى أن نماذج الفئران الخثارية الضوئية والسكتة الدماغية النزفية غالبا ما تحفز آفات في مناطق تشريحية مميزة أثناء السكتة الدماغية المتكررة ، مما يعكس الاختلافات المنهجية المتأصلة. تولد هذه الاختلافات أنماطا غير متجانسة من الإصابة العصبية ، وتعطل ديناميكيات الدورة الدموية الدقيقة ، وتمارس تأثيرات متباينة على الاستجابات المناعية المحيطية11،12. على النقيض من ذلك ، فإن نموذج MCAO ، الذي ينظر إليه على نطاق واسع على أنه نموذج القوارض الأكثر تمثيلا للسكتة الدماغية الإقفارية ، يوفر ميزة الاستقرار الإجرائي ويسمح بالتحكم الدقيق في كل من موقع ومدة انسداد الدماغ. ومع ذلك ، فقد أظهر MCAO و MCAO المتكرر أيضا خطرا مرتفعا بشكل كبير للوفيات13،14 ، مما يفرض قيودا كبيرة على قابليتها للتطبيق الأوسع في البحث التجريبي. في هذه الدراسة ، هدفنا إلى إنشاء نموذج فأر MCAO مستقر وقابل للتكرار على مرحلتين يحاكي السكتة الدماغية المتكررة. قمنا بتقييم الإصابة العصبية المرتبطة بها ، والإعاقات الوظيفية ، والتغيرات النسيجية المرضية. أظهر هذا النموذج أيضا معدل بقاء مستقرا ، مما يشير إلى قابليته للتطبيق على الأبحاث المستقبلية حول الفيزيولوجيا المرضية للسكتة الدماغية المتكررة والاستراتيجيات العلاجية الواقية من الأعصاب.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

تمت مراجعة جميع التجارب على والموافقة عليها من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدامها (IACUC) التابعة لجامعة تايوان الوطنية (خطة الدراسة ID20230335) وتم إجراؤها وفقا للمبادئ التوجيهية الأخلاقية المعمول بها لرعاية واستخدام المختبر.

1. تحضير

  1. ضع ذكر الفئران C57BL / 6J البالغة من العمر 8 أسابيع تزن 20-25 جم في ظل ظروف بيئية خاضعة للرقابة عند 22 ± 1 درجة مئوية مع رطوبة نسبية 55٪ ودورة ضوء 12 ساعة / 12 ساعة مظلمة. توفير الرعاية الإنسانية مع الوصول المجاني إلى الطعام والمياه المقطرة.
  2. قم بتعيين 28 فأرا من الذكور بشكل عشوائي إلى ثلاث مجموعات: الوهمية (ن = 8) ، و MCAO (ن = 10) ، و MCAO المتكررة (ن = 10). الحجر الصحي للحيوانات لمدة أسبوعين (-d14); إجراء التأقلم والوزن والتجميع عند −d7 ؛ إدارة MCAO عند d0 ؛ إجراء الاختبارات السلوكية في D0 و D2 و D14 و D16 ؛ وإجراء جراحة MCAO المتكررة في D14.

2. أول إدارة جراحية MCAO

  1. تعقيم جميع الأدوات الجراحية عن طريق التعقيم ، وزن كل فأر ، تطبيق الكاربروفين عن طريق الفم عند 5 مجم / كغ 1 ساعة قبل الشق الأولي ، وتحفيز التخدير ب 3٪ إيزوفلوران في غاز مختلط بالأكسجين.
  2. مراقبة معدل التنفس (100-120 نفسا / دقيقة ، BPM) وتقييم عمق التخدير عن طريق فحص الجفن ومنعكس البلع. ضع الهدف على لوحة تسخين إلكترونية للحفاظ على درجة حرارة الجسم عند 37 درجة مئوية.
  3. حلق الظهر والرقبة بالقرب من الرأس وإزالة فراء وحطام الفئران باستخدام فراغ. ضع مرهما للعيون ، وافرك الجلد ، وتطهيره عن طريق الإجراءات المعقمة لجراحة بقاء القوارض.
  4. استخدم المقص والملقط الجلدي لعمل شق أولي بطول 0.5 سم بين الأذنين لتعريض الجانب الأيسر من خط الاندماج المركزي والجزء الخلفي من البريجما على الجمجمة. قم بإزالة الأنسجة الرخوة الموجودة أعلى الجمجمة باستخدام الملقط.
  5. قم بتوسيط محول دوبلر بالليزر في دماغ الماوس وقم بتثبيته بغراء الأنسجة في موضع 3 مم جانبيا إلى اليسار و 2 مم ذيلية على البريجما ، مما يضمن قطع حافة المحول مسبقا لتناسب قاعدة الجمجمة ، ثم قم بتأمين غطاء دوبلر بالليزر بمادة لاصقة لتمكين المراقبة المستمرة لتدفق الدم.
    ملاحظة: في هذه الخطوة ، قم بتثبيت غطاء دوبلر بالليزر بإحكام في البريجما باستخدام غراء الأنسجة ، ووضعه عند تقاطع الغرز الإكليلية والسهمية على خط الوسط العلوي للكالفاريا لضمان مراقبة مستقرة لتدفق الدم الدماغي.
  6. عندما تكون واثقا من المنطقة المقسمة ، اسحب غراء الأنسجة باستخدام الماصة الدقيقة وقم بتطبيق الغراء حول قاعدة المحول.
  7. قم بإعداد أسمنت الأسنان وقم بتطبيق كمية كافية لإحاطة غطاء دوبلر لضمان ثباته طوال العملية.
  8. قم بتدوير إلى وضع ضعيف وقم بعمل شق في الجلد بطول 1 سم من مدخل الصدر باتجاه الذقن على طول خط الوسط للرقبة.
  9. استمر في التشريح الحاد لفصل البطن الخلفي للعضلات ثنائية المعدة والقصية والقصية ، متبوعا باستخدام المباعدات لسحب العضلات برفق بعيدا لفضح الشرايين السباتية المشتركة (CCA) والخارجية (ECA) والداخلية (ICA) ، ووضع قسم من الحرير 6-0 حول CCA.
    ملاحظة: في هذه الخطوة ، يجب قلب الغدد اللعابية لأعلى لتسهيل عزل تشعب CCA و ECA. يقع ICA متفوقا على CCA. يستخدم التشريح الحاد باستخدام ملقط الجلد لمنع تمزق الأوعية الدموية وعزل الأنسجة الرخوة والأعصاب المحيطة.
  10. حدد موقع فرع صغير (الشريان الدرقي العلوي ، STA) بارز من ECA. استخدم الكي ثنائي القطب لحرق هذا الفرع الصغير. المضي قدما في قطع الوعاء المحترق ؛ وهذا من شأنه أن يزيد من عزل اللجنة الاقتصادية لأفريقيا.
    ملاحظة: عادة ما يكون STA هو الفرع الأول من ECA الذي يظهر تحت مستوى القرن الأكبر للعظم اللامي. لمنع الإصابة ، استخدم الكي ثنائي القطب لحرق فرع الوعاء الدموي لتحقيق الإرقاء.
  11. ضع قسمين من خياطة الحرير 6-0 حول ECA. قم بعمل عقدة دائمة على الجانب البعيد من ECA وعقدة فضفاضة في موقع التشعب.
  12. ضع مسبار إبرة دوبلر بالليزر في محول المسبار على الجمجمة. تأكد من أن برنامج الاستحواذ يظهر قيمة قراءة تدفق الدم الدماغي (CBF). سجل قراءة خط الأساس.
    ملاحظة: تم تقديم المقياس القياسي ل CBF الذي تم الحصول عليه بواسطة دوبلر الليزر كوحدات نضح (PU) ، مع معايرة قيم خط الأساس عادة في نطاق 350 إلى 450. إذا لوحظت قيم وحدة التروية (PU) المخفضة، فاضبط موضع محول مسبار دوبلر بالليزر في الماوس لضمان القياس الدقيق (انظر الخطوة 2.5).
  13. قم بتثبيت ICA باستخدام مشبك الأوعية الدموية الدقيقة واستخدم قسم الحرير 6-0 حول CCA لعمل عقدة انزلاق لربط CCA مؤقتا.
    ملاحظة: في هذه الخطوة ، تم الكشف عن انخفاض في CBF على شاشة دوبلر بالليزر.
  14. تحضير الشعيرات الأحادية المصنوعة من النايلون المطلي بالمطاط السيليكوني. ضع علامة على الفتيل باستخدام Sharpie الفضي على بعد 9-10 مم من طرف رأس السيليكون ، واستخدم مقصا جراحيا مجهريا لعمل شق صغير بين الخيط الضيق والخياطة الفضفاضة على ECA.
    ملاحظة: يجب تنظيف الدم المتبقي في موقع الشق وشطفه بالمحلول الملحي المخزن بالفوسفات (PBS) للحفاظ على سلامة الأوعية الدموية.
  15. أدخل الفتيل بعناية (رأس السيليكون أولا) في ECA عبر الشق الصغير.
    ملاحظة: يتم حذف خطوة إدخال الفتيل هذه في الوهمية.
  16. عندما يتم إدخال حوالي نصف رأس السيليكون ، شد الخيط السائب قليلا حول الشريان والخيوط ، وقم بإزالة المشبك الموجود على ICA.
  17. قم بقطع ECA أسفل العقدة الضيقة الأولى ، وقم بتدوير وعاء ECA والخيوط بعناية لأسفل (عكس اتجاه عقارب الساعة) بحيث يشير رأس السيليكون إلى الأعلى ، وادفع طرف الفتيل لأعلى باتجاه ICA.
    ملاحظة: هذه الخطوة بالغة الأهمية ويجب إجراؤها ببطء في اتجاه عكس اتجاه عقارب الساعة لتقليل اضطراب الأوعية الدموية وتقليل خطر التشابك أو التمزق.
  18. بمجرد أن يكون جزء السيليكون بالكامل في الأوعية الدموية ، قم بتشديد خياطة التثبيت قليلا ، وفك عقدة الانزلاق على CCA ، واستمر في دفع الفتيل للداخل ، باستخدام العلامة الفضية على الفتيل لتوجيه الموضع.
  19. راقب برنامج دوبلر بالليزر باستمرار ، وعندما تمنع المقاومة مزيدا من التقدم في الفتيل تحت القوة المناسبة أثناء ملاحظة انخفاض حاد في CBF ، قم بإنهاء الإدخال في الشريان الدماغي الأوسط البعيد.
    ملاحظة: يعد تقليل CBF إلى أقل من 30٪ من الحالة قبل الإقفارية إجراء قياسيا يعرف باسم طريقة لونجا15.
  20. احتفظ بالخيوط داخل MCA لمدة 40 دقيقة للحث على إصابة إقفارية في الدماغ.
  21. قم بإزالة الفتيل بعد الفترة الإقفارية المحددة لمدة 40 دقيقة لإعادة إنشاء CBF ، وتطبيق غراء الأنسجة لتحقيق الإرقاء ، وتسجيل قياس CBF المستعاد المقابل ، وفصل جميع المباعدات ، وإزالة المحول المثبت على الجمجمة.
  22. أغلق شق الجلد بالقرب من الوعاء باستخدام مشبك الجرح ، وحافظ على المراقبة المستمرة لدرجة حرارة الجسم عند 37 درجة مئوية ، وقم بتقييم معدل التنفس. بعد تأكيد استقرار ضغط الدم والتنفس في حدود 160-200 نبضة في الدقيقة ، توقف عن التخدير واسمح بالتعافي.

3. إدارة MCAO الثانية

  1. قم بإزالة مشابك الجرح بعد 14 يوما من جراحة MCAO الأولية ، ثم كرر الخطوات من 2.1 إلى 2.9 لإنجاز تحضير الجمجمة ، وتأمين وضع مسبار دوبلر بالليزر ، وفضح CCA.
  2. عزل CCA من الأنسجة المحيطة وضع ثلاثة أجزاء من خياطة الحرير 6-0 حول CCA.
  3. ضع مسبار دوبلر بالليزر في المحول وسجل خط الأساس CBF.
  4. قم بعمل عقدة انزلاقية على الجانب البعيد من CCA ، وعقدة دائمة في الطرف القريب ، وعقدة فضفاضة بينهما.
  5. قم بإعداد النايلون المطلي بمطاط السيليكون من خيوط الانسداد لإدارة MCAO وفقا للخطوة الموضحة 2.14.
  6. قم بعمل شق صغير على CCA بالقرب من الدائم وأدخل الفتيل في CCA.
    ملاحظة: يجب أيضا تنظيف الدم المتبقي في موقع الشق وشطفه باستخدام PBS للحفاظ على سلامة الأوعية الدموية. هذا مهم جدا.
  7. شد العقدة السائبة قليلا وحرر عقدة الانزلاق. تقدم الفتيل إلى ICA حتى يصبح الفتيل تحت القوة المناسبة ويتم الكشف عن انخفاض ملحوظ في CBF.
    ملاحظة: يعتبر تقليل CBF إلى أقل من 30٪ من الحالة قبل الإقفارية أيضا إجراء قياسيا.
  8. حافظ على الفتيل في موضعه لمدة 40 دقيقة لإحداث إصابة إقفارية ، كما هو محدد في الخطوة 2.20.
  9. عند الانتهاء من الفاصل الزمني الإقفاري المحدد، اسحب الفتيل وأغلق شق الجلد باتباع الإجراءات الموضحة في الخطوتين 2.21 و 2.22 من جراحة MCAO الأولية.

4. رعاية ما بعد الجراحة

  1. يتم تطبيق محلول ملحي عادي دافئ تحت الجلد عند 10 مل كغ-1 يوميا مرتين يوميا لمدة 3 أيام متتالية لمنع الجفاف بعد جراحة MCAO. يجب تطبيق محلول بوفيدون يود بنسبة 10٪ على موضع الجراحة وتطبيق أموكسيسيلين (10 ملغ/كغ) للوقاية من العدوى. قم بتوفير الكاربروفين عن طريق الفم (5 مجم / كجم) لمدة 3 أيام لتخفيف إجهاد ما بعد الجراحة وتسهيل التعافي تحت إشراف بيطري بعد كل من إجراءي MCAO الأول والثاني.
  2. قم بإجراء تقييمات يومية للحالة الصحية للفئران. سجل التغييرات في المظهر ، وكذلك استهلاك الطعام والماء أثناء الإجراءين الأول والثاني.

5. النشاط الحركي للحيوان وتقييم الإصابات العصبية البيولوجية

  1. تقييم النشاط الحركي من خلال تقييم مسار الحركة والمسافة والسرعة. ضع الفئران داخل صناديق الاختبار (10 × 20 × 15 سم) وقم بتكوينها في ظل ظروف سطوع منخفضة.
  2. تأقلم الفأر مع بيئة الاختبار من خلال فترة تثبيت مدتها 30 دقيقة ، تليها تقييم رسمي مدته 10 دقائق. سجل وحلل جميع المعلمات ، بما في ذلك المسافة المنقولة (سم) ، والسرعة (سم / ثانية) ، ومدة (ألمدة الحركية) ، والمدة (المدة) الإجمالية داخل المنطقة ، وزمن انتقال التكرار (التكرارات) لأول مرة ، ودرجات العنوان (المرات) لتحديد النشاط الحركي.
  3. تقييم الإصابة العصبية البيولوجية باستخدام نظام تسجيل الوظيفة الحركية المعدل (0-6 نقاط)16 والرجوع إلى درجات mNSS (جزء من تقييم الوظيفة الحركية ، 6 نقاط)17.
  4. حدد مستويات الإصابة على النحو التالي: الدرجة 0 لعدم وجود عجز عصبي ، والدرجة 1 لثني الأطراف الأمامية التي تؤثر على الرسغ أو الكتف ، والدرجة 2 لثني الطرف الأمامي مصحوبا بانخفاض المقاومة للدفع الجانبي ، والدرجة 3 للدوران أحادي الاتجاه نحو جانب العجز ، والدرجة 4 للدوران الطولي نحو جانب العجز ، والدرجة 5 للغزل الطولي المصحوب بنشاط النوبة ، وسجل 6 لفقدان الحركة بالكامل.

6. بروتوكول تلطيخ الهيماتوكسيلين والأيوزين

  1. قم بإصلاح MCAO وأنسجة المخ MCAO المتكررة في مخزن مؤقت للفورمالديهايد بنسبة 10٪ ، وقم بتشريح العينة إلى أربعة أجزاء متساوية باستخدام قطاعة دماغ الفأر الإكليلية 1 مم. معالجة الجزء الأمامي الثالث للتقييم المرضي.
  2. قم بإجراء إعادة الجفاف للعينات المدمجة بالبارافين: الزيلين لمدة 10 دقائق ، 95٪ إيثانول لمدة 10 دقائق ، 75٪ إيثانول لمدة 10 دقائق ، 50٪ إيثانول لمدة 10 دقائق ، ماء مقطر (ddH2O) لمدة 10 دقائق ، و PBS لمدة 10 دقائق.
  3. وصمة عار العينات: صبغة الهيماتوكسيلين لمدة 45 ثانية وشطفها في ddH2O دافئ عند 30 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة ؛ وصمة عار eosin لمدة 30 ثانية وفي DDH2O البارد لمدة 45 ثانية.
  4. قم بتجفيف وتجفيف العينات في 75٪ ، 95٪ ، 100٪ إيثانول وفي الزيلين لمدة 45 ثانية لكل منهما ، وتجفيفها في الهواء لمدة 60 ثانية.
  5. قم بتركيب الشرائح وتخزينها في غرفة مظلمة.
  6. تقييم شدة الآفة وفقا لمعيار محدد على مقياس من خمس نقاط: 1 = الحد الأدنى (<1٪) ؛ 2 = طفيف (1-25٪) ؛ 3 = معتدل (26-50٪) ؛ 4 = معتدل إلى شديد (51-75٪); 5 = شديد (76-100٪). إجراء فحص مرضي لأنسجة المخ تحت تقييم أعمى من قبل أخصائي علم الأمراض البيطري.

7. بروتوكول النشاف الغربي

  1. تجانس أنسجة المخ من MCAO والفئران المتكررة في RIPA المخزن المؤقت المكمل بالبروتياز ومثبطات الفوسفاتيز (فلوريد الصوديوم 30 ملي مولار ، أورثوفانادات الصوديوم 30 ملي مولار ، وبيروفوسفات الصوديوم 30 ملم).
  2. يتحلل جهاز الطرد المركزي عند 10,000 × جم ويجمع المادة الطافية. حدد تركيز البروتين الطاف باستخدام مقايسة حمض البيسينشونيك (BCA).
  3. قم بإجراء النشاف الغربي كما هو موضح سابقا18: قم بتحميل 20 ميكروغرام من البروتين الكلي المشوه ، المحضر عن طريق الغليان في 100 درجة مئوية من الماء المغلي ، في 8-12٪ من المواد الهلامية دوديسيل كبريتات الصوديوم وبولي أكريلاميد (SDS-PAGE).
  4. انقله بجهد 100 فولت لمدة 90 دقيقة لفصل البروتينات على أغشية PVDF في الغرفة الباردة وسد الأغشية بألبومين مصل بقري 3٪ لمدة 60 دقيقة.
  5. احتضان طوال الليل عند 4 درجات مئوية مع عامل نخر الورم ألفا (TNF-α ، 1: 1000 تخفيفات) ، نازعة هيدروجين الجلسرين ألديهايد -3 فوسفات (GAPDH ، 1: 2,000 تخفيفات) ، والعامل المحفز لنقص الأكسجة 1 ألفا (HIF-1α ، 1: 1,000 تخفيفات). احتضان الأغشية بالأجسام المضادة الثانوية المناسبة لمدة 1 ساعة.
  6. اكتشف تعبير البروتين باستخدام مجموعة ركيزة التلألؤ الكيميائي المحسنة (ECL) وتصورها باستخدام نظام تصوير الصور الرقمي.

8. التحليل الإحصائي

  1. قدم البيانات كمتوسط ± الخطأ المعياري للمتوسط (SEM) وقم بإجراء التحليل الإحصائي باستخدام تحليل التباين أحادي الاتجاه (ANOVA) ، متبوعا باختبار Tukey اللاحق لتحديد الاختلافات بين مجموعات متعددة. تفسير النتائج على أنها ذات دلالة إحصائية عندما < p 0.05.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

تقييم النشاط الحركي وإصابة الخلايا العصبية في فئران MCAO الأولى والمتكررة
في إجراءات MCAO الأولى ، تم إدخال خيوط نايلون أحادية مطلية بالمطاط من ECA و ICA إلى MCA لمدة 40 دقيقة. يمكن الكشف عن تدفق الدم الدماغي (CBF) لانخفاض واضح (قطرات <30٪ من خط الأساس) بواسطة جهاز دوبلر بالليزر ، عندما كان الفتيل يبقى في منطقة MCA. في هذا الإجراء ، حققت جميع الفئران هذه العتبة بثبات ونجت. أشارت بعض الدراسات السابقة إلى أن تغيرات وزن الجسم قد تم استردادها19 وأن...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

لا تزال السكتة الدماغية السبب الرئيسي الثاني للوفيات والعجز في جميع أنحاء العالم ، مع ارتفاع خطر الإصابة بالسكتة الدماغية المتكررة. في الوقت الحالي ، على الرغم من التقدم المحرز في تطوير التكنولوجيا والاستراتيجيات الطبية ، لا تزال الوقاية من السكتة الدماغية وتكرارها غير كافية للتحسين. في العقود الأخيرة ، تم استخدام نماذج دراسة مختلفة للسكتة الدماغية على نطاق واسع في التحقيق البحثي لإصابة السكتة الدماغية الإقفارية والآليات. من بينها ، تعتبر الطريقة الجراحية MCAO هي الأقرب إلى اضطرابات السك...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

ليس لدى أصحاب البلاغ تضارب في المصالح للإعلان.

شكر وتقدير

تم دعم هذا العمل تقنيا من قبل فرق المركز الوطني لحيوانات المختبرات وبدعم مالي من خلال منح من مؤسسة المستشفى الوطني لجامعة تايوان ، تايوان (112-S0074) ، مستشفى الجامعة الطبية الصينية ، تايوان (CMU113-S-06) ، والمجلس الوطني للعلوم والتكنولوجيا ، تايبيه ، تايوان (112-2314-B-002 -219).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
غرزة حرير 6-0  شين-تيه إنك. تحذير.ST1N-ST6
قاطع دماغ الفأر الإكليلي بقطر 1 ممشركة ثيرمو فيشر العلمية، الولايات المتحدة الأمريكيةV11335
مقص شعرأوربانر. إنك. توييرMB033
قاطع دماغ الفأر الإكليليآلة زيفيك. Inc USA BSMAS001-1
نظام الصور الرقميةشركة Azure Biosystem, Inc., دبلن، كاليفورنيا، الولايات المتحدة الأمريكيةAzure -300
المحمر الإلكتروني ثنائي القطبإنديا مارتآرون 940
لوحة تسخين إلكترونيةريبتيزوAHM23
مرهم العينلودي للرعاية البيطرية. لنا17033-21-38
كاشف دوبلر بالليزرمور إنسترومنتس المملكة المتحدة moorVMS-LDF1-HP
محول مسبار دوبلر بالليزرشركة ثيرمو فيشر العلمية05-700-76
كاشف نشاط الحركة  شركة أوركيد العلميةكلها برامج تتبع المتاهة.
(نظام المتاهة الكامل)شركة أوركيد العلميةتراكيزي. الإصدار 7.39
مشبك الأوعية الوعائية الدقيقةشين-تيه إنك. تحذير.ST-M104
مقص الأوعية الجراحية الدقيقةشين-تيه إنك. تحذير.ST-V108
جهاز مراقبة معدل التنفسشركة SDR العلمية المحدودة. الولايات المتحدةSAR-830/AP
خيط نايلون مغطى بالمطاط بالسيليكونفيشر العلميNC1773962
ملقط الجلدشين-تيه إنك. تحذير.ST-H212
مقص الجلدشين-تيه إنك. تحذير.ST-S014PK
مسحة قطنية معقمةوينر ميدكال401 003
نظام التحويلنظام شبه جاف. مختبر بيو-راد، الولايات المتحدة الأمريكية)1703940
<قوي>كيميائيات
10٪ povidone– محلول اليودشركة يوشيدا للأدوية، المحدودة JAPPVP– I  10%
محلول الإيثانول 75٪ وغير متوقع;سيغما-ألدريتش. الولايات المتحدة الأمريكية111727
أموكسيسيلينسيغما-ألدريتش، الولايات المتحدة الأمريكية A5955
مصل البقر الألبومينسيغما-ألدريتش، الولايات المتحدة الأمريكية.A2153
الكاربروفينشركة بليكس في المملكة المتحدةMD150-2
الأجسام المضادة GAPDHسانتا كروز للتكنولوجيا الحيوية، كاليفورنيا، الولايات المتحدة الأمريكيةSC-32233
H& حل EBioPioneer Tech. CO. TWG1005
الجسم المضاد ألفا المحفز لنقص الأكسجين 1تكنولوجيا الإشارات الخلية، ماساتشوستس، الولايات المتحدة الأمريكية#36169
الإيزوفلوران (مخدر)علوم الحياةR510-22-10
محلول ملحي عادي معقمنوفا تيك إنك. الولايات المتحدة الأمريكية1760RX
عامل نخر الورم ألفاتكنولوجيا الإشارات الخلية، ماساتشوستس، الولايات المتحدة الأمريكية#3707

المراجع

  1. Johnson, W., Onuma, O., Owolabi, M., Sachdev, S. Stroke: a global response is needed. Bull World Health Organ. 94 (9), 634-634A (2016).
  2. Wu, C. T., et al. Low intensity pulsed ultrasound prevents recurrent ischemic stroke in a cerebral ischemia/reperfusion injury mouse model via brain-derived neurotrophic factor induction. Int J Mol Sci. 20 (20), (2019).
  3. Coull, A. J., Lovett, J. K., Rothwell, P. M., Oxford Vascular , S. Population based study of early risk of stroke after transient ischaemic attack or minor stroke: implications for public education and organisation of services. BMJ. 328 (7435), 326(2004).
  4. Hartkamp, N. S., et al. Relationship between haemodynamic impairment and collateral blood flow in carotid artery disease. J Cereb Blood Flow Metab. 38 (11), 2021-2032 (2018).
  5. Khanevski, A. N., et al. Recurrent ischemic stroke: incidence, predictors, and impact on mortality. Acta Neurol Scand. 140 (1), 3-8 (2019).
  6. Matur, A. V., et al. Translating animal models of ischemic stroke to the human condition. Transl Stroke Res. 14 (6), 842-853 (2023).
  7. Sommer, C. J. Ischemic stroke: experimental models and reality. Acta Neuropathol. 133 (2), 245-261 (2017).
  8. Schmidt, A., et al. Progressive cognitive deficits in a mouse model of recurrent photothrombotic stroke. Stroke. 46 (4), 1127-1131 (2015).
  9. He, X. F., et al. Extracellular ASC exacerbated the recurrent ischemic stroke in an NLRP3-dependent manner. J Cereb Blood Flow Metab. 40 (5), 1048-1060 (2020).
  10. Feng, Y., et al. Cortical microinfarcts potentiate recurrent ischemic injury through NLRP3-dependent trained immunity. Cell Death Dis. 15 (1), 36(2024).
  11. Wang, L. M., et al. A novel aged mouse model of recurrent intracerebral hemorrhage in the bilateral striatum. Neural Regen Res. 18 (2), 344-349 (2023).
  12. Uzdensky, A. B. Photothrombotic stroke as a model of ischemic stroke. Transl Stroke Res. 9 (5), 437-451 (2018).
  13. Wen, Z., et al. The effect of anterior communicating artery flow on neurovascular injury and neurobehavioral outcomes in mice with recurrent stroke. Brain Res. 1724, 146440(2019).
  14. Shvedova, M., et al. Modified middle cerebral artery occlusion model provides detailed intraoperative cerebral blood flow registration and improves neurobehavioral evaluation. J Neurosci Methods. 358, 109179(2021).
  15. Ansari, S., Azari, H., McConnell, D. J., Afzal, A., Mocco, J. Intraluminal middle cerebral artery occlusion (MCAO) model for ischemic stroke with laser doppler flowmetry guidance in mice. J Vis Exp. (51), (2011).
  16. Zhang, Y., et al. Treadmill exercise promotes neuroprotection against cerebral ischemia-reperfusion injury via downregulation of pro-inflammatory mediators. Neuropsychiatr Dis Treat. 12, 3161-3173 (2016).
  17. Chen, J., et al. Therapeutic benefit of intravenous administration of bone marrow stromal cells after cerebral ischemia in rats. Stroke. 32 (4), 1005-1011 (2001).
  18. Hsu, Y. M., Yin, M. C. EPA or DHA enhanced oxidative stress and aging protein expression in brain of d-galactose treated mice. Biomedicine (Taipei). 6 (3), 17(2016).
  19. Sayed, M. A., et al. Stroke promotes the development of brain atrophy and delayed cell death in hypertensive rats. Sci Rep. 10 (1), 20233(2020).
  20. Kotoda, M., et al. Role of myeloid lineage cell autophagy in ischemic brain injury. Stroke. 49 (6), 1488-1495 (2018).
  21. Lourbopoulos, A., et al. Inadequate food and water intake determine mortality following stroke in mice. J Cereb Blood Flow Metab. 37 (6), 2084-2097 (2017).
  22. Maddahi, A., Kruse, L. S., Chen, Q. W., Edvinsson, L. The role of tumor necrosis factor-alpha and TNF-alpha receptors in cerebral arteries following cerebral ischemia in rat. J Neuroinflammation. 8, 107(2011).
  23. Mojsilovic-Petrovic, J., et al. Hypoxia-inducible factor-1 (HIF-1) is involved in the regulation of hypoxia-stimulated expression of monocyte chemoattractant protein-1 (MCP-1/CCL2) and MCP-5 (Ccl12) in astrocytes. J Neuroinflammation. 4, 12(2007).
  24. Ma, R., et al. Animal models of cerebral ischemia: a review. Biomed Pharmacother. 131, 110686(2020).
  25. Qiao, M., et al. Development of a model of recurrent stroke consisting of a mild transient stroke followed by a second moderate stroke in rats. J Neurosci Methods. 184 (2), 244-250 (2009).
  26. Fan, C., et al. Reduced severity of outcome of recurrent ipsilateral transient cerebral ischemia compared with contralateral transient cerebral ischemia in rats. J Stroke Cerebrovasc Dis. 26 (12), 2915-2925 (2017).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

تصحيح


Formal Correction: Erratum: Investigating Ischemic Stroke Recurrent Injury in a Secondary Middle Cerebral Artery Occlusion Model in Mouse
Posted by JoVE Editors on 1/01/1970. Citeable Link.

This corrects the article 10.3791/68806

الوسوم

MCAO

تم نشر هذه المقالة

الفيديو قريباً

تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.