Method Article

الكشف عن الأنواع الفلورية باستخدام PCR لأنواع الأسبيرجيلوس ، والمكورات الكريبتوكوكسية الجديدة، والتهاب الرئة الكيسي جيروفيسي

DOI:

10.3791/68819

⸱

May 8th, 2026

 ,  ,  ,  , 
1Clinical Laboratory, Foshan Sanshui District People's Hospital, 2Organization and Personnel Department and Neurology Department, Foshan Sanshui District People's Hospital

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هنا، نقدم بروتوكول اختبار سريري يعتمد على طريقة PCR الفلورية للكشف المتزامن عن أنواع الرشاش، وCryptococcus neoformans، وPneumocystis jirovecii.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يصف هذا البروتوكول إجراء موحد للكشف النوعي عن أنواع الرشاش، وكريبتوكوكوس نيوفورمانس، وPneumocystis jirovecii في عينات البلغم السريرية باستخدام مجموعة كشف الأحماض النووية الفلورية المعتمدة على PCR باستخدام مسبار فلوري. تشمل العملية جمع عينات سريرية، ومعالجة التسييل القلوية، واستخراج الأحماض النووية الآلي، والكشف عن PCR في الوقت الحقيقي عبر المتعدد البلكس. يتم اكتشاف أنواع أسبيرجيلوس، وC. neoformans، وP. jirovecii باستخدام مجسات فلورية محددة للهدف (قنوات FAM، VIC، وCY5 على التوالي)، مع دمج قناة تحكم داخلية (ROX) لضمان الجودة. تعتمد صلاحية الاختبار وتفسير نتائج العينة على قيم القطع المحددة للدورة (Ct). يجب أن يظهر التحكم الموجب منحنيات تضخيم على شكل S مع Ct ≤ 33.7 في جميع القنوات، بينما يجب ألا يظهر التحكم السالب أي تضخيم. بالنسبة للعينات السريرية، تشير قيمة Ct ≤ 33.7 في قناة FAM إلى إيجابية لأنواع الأسبيرجيلوس ، وقيمة Ct ≤ 36 في قناة VIC أو CY5 تشير إلى إيجابية ل C. neoformans أو P. jirovecii على التوالي.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تشكل العدوى الفطرية الغازية، مثل تلك التي تسببها أنواع الشبرجيلوس ، وكريبتوكوكوس نيوفورمانس، وPneumocystis jirovecii، تهديدا كبيرا للمرضى الضعيفين في المناعة، مما يؤدي إلى ارتفاع معدلات المراضة والوفيات. التشخيص الدقيق والسريع أمر بالغ الأهمية لبدء العلاج المضاد للفطريات المناسب وتحسين النتائج السريرية1. طرق التشخيص التقليدية، بما في ذلك الزراعة والمجهر والكشف عن المستضدات، لها قيود ملحوظة. الزراعة تستغرق وقتا طويلا وتظهر حساسية منخفضة، والمجهر يفتقر إلى تحديد مستوى النوع ويعتمد على المشغل، بينما قد تظهر اختبارات المستضدات (مثل جالاكتومانان، β-دي-غلوكان) تفاعلا متبادلا وأداء غير متسق. يمكن للتشخيصات الجزيئية، وخاصة PCR في الوقت الحقيقي، معالجة بعض هذه الفجوات من خلال تقديم أوقات استجابة أسرع وإمكانية لحساسية عالية وخصوصية. تسمح التطورات في PCR متعدد الإرسال بالكشف المتزامن عن عدة مسببات أمراض من عينة واحدة، مما يحسن كفاءة التشخيص.

يصف هذا البروتوكول اختبار PCR متعدد المجسات الفلورية للكشف النوعي عن الحمض النووي من أنواع أسبيرجيلوس، وC. neoformans، وP. jirovecii في عينات بلغم بشري من خلال استهداف المناطق المحفوظة من جين 18S rRNA (أنواع Aspergillus)، وجين ITS (C. neoformans)، وجين mtLSU rRNA (P. jirovecii). تشمل الميزات الرئيسية لهذه الطريقة حساسية تحليلية محددة: الحد الأقصى للكشف لأنواع أسبيرجيلوس، وC. neoformans، وP. jirovecii هو 1,500 نسخة/مل؛ خصوصية البرايمر/المسبار: تقلل البرايمرات والمجسات الخاصة بالهدف من التفاعل المتقاطع مع الحمض النووي البشري أو النباتات الشائعة الأخرى؛ التحكم القوي في التلوث: دمج أنظمة dUTP-UDG (يوراسيل-DNA جليكوزيلاز) يمنع بشكل فعال التلوث المتنقل الناتج عن أمبليكونات PCR السابقة، وهي ميزة حاسمة للحفاظ على موثوقية التحليل في بيئة مختبرية سريرية2؛ التحكم المتكامل في العملية: يتم تضخيم تحكم داخلي داخلي ذاتي يستهدف جين RP البشري (بروتين ريبوسومي)، موسوم بفلوروفور ROX، لمراقبة سلامة استخراج الحمض النووي وتحديد تثبيط PCR المحتمل، مما يقلل من النتائج السلبية الكاذبة3. يدعم هذا النهج إرشادات معتمدة لضمان الجودة في التشخيص الجزيئي 4,5. يطبق البروتوكول بشكل أساسي على عينات الجهاز التنفسي (بلغم/BALF) من الفئات عالية الخطورة، مثل مرضى أمراض الدم والأورام أو متلقي الزراعة. كما تناقش القيود المحتملة، بما في ذلك الإيجابيات الكاذبة الناتجة عن التلوث البيئي أو انخفاض الحساسية بسبب تخفيف العينة بشكل مفرط، إلى جانب استراتيجيات التخفيف.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تمت الموافقة على استخدام العينات السريرية من قبل لجنة الأخلاقيات المختصة (رقم الموافقة: ZYS-GCP-2025006). قدم جميع المشاركين موافقة واسعة ومستنيرة لاستخدام بياناتهم وعيناتهم في البحث. جميع المواد الكيميائية والمواد المستخدمة في هذا البروتوكول مدرجة في قائمة المواد (Table of Material).

1. جمع عينات

  1. اجمع 3–5 مل من البلغم أو سائل غسل الشعب الهوائية في حاويات معقمة وتقديمها للاختبار بسرعة.

2. تحضير الكواشف

ملاحظة: تم تنفيذ هذه الخطوات في غرفة تحضير المواد الكيميائية.

  1. أزل مجموعة الكشف من الفريزر بدرجة حرارة -28 درجة مئوية واذيب تماما عند درجة حرارة الغرفة (25–30 درجة مئوية) لمدة 30 دقيقة.
  2. احسب إجمالي عدد التفاعلات (N): N = عدد عينات الاختبار (n) + الضوابط الإيجابية/السلبية (2) + 1
  3. جهز خليط التفاعل في أنبوب طرد مركزي دقيق معقم. لتفاعل واحد: 35 ميكرولتر من خليط تضخيم الأحماض النووية + 5 ميكرولتر من خليط البرايمر-بروب، دوامة شاملة، وطرد مركزي لفترة وجيزة.
  4. أليكوت 40 ميكرولتر من خليط التفاعل في كل أنبوب PCR (وفقا لبروتوكول مصنع المجموعة) ونقلها إلى نافذة المرور في غرفة معالجة العينات.

3. معالجة العينات

ملاحظة: تم تنفيذ هذه الخطوات في غرفة معالجة العينات. التخلص من النفايات: تخلص من المادة الفائقة من الخطوة 3.2.2 والنفايات السائلة الأخرى التي تحتوي على NaOH في حاوية نفايات كيميائية مخصصة.

  1. التسييل
    1. أضف سائل غسل البلغم/الحصلات الهوائية (BALF) إلى أنبوب بغطاء لولبي بحجم 50 مل.
    2. أضف 1–2 حجم من محلول الهضم بنسبة 4٪ NaOH (بالنسبة لزوجة البلغم).
      تحذير: NaOH يسبب التآكل. تجنب ملامسة الجلد والعينين.
    3. شد الغطاء، واستخدمه دوامة لمدة دقيقة واحدة، ثم احتضن في خزانة السلامة البيولوجية بدرجة حرارة الغرفة لمدة 15–20 دقيقة.
  2. الإثراء
    1. قام الطرد المركزي بتحويل عينات إلى سائلة بسرعة 3000 دورة في الدقيقة لمدة 5 دقائق.
    2. تخلص من المادة الفائقة باستخدام ماصة، مع الاحتفاظ ب 1,000 ميكرولتر من الرواسب.
    3. انقل الدوامة إلى الرواسب جيدا.
  3. التحلل
    1. انقل 500 ميكرولتر من الرواسب إلى أنبوب تحلل. الدوامة لمدة 10 دقائق وجهاز طرد مركزي لفترة وجيزة.
  4. الاستخراج
    ملاحظة: التخلص من النفايات: يجب التخلص من ألواح الاستخراج والأطراف والأنابيب المستخدمة التي لامست عينات بيولوجية في حاوية نفايات بيولوجية خطرة معتمدة.
    1. انقل جميع فائض التحليل و100 ميكرولتر من عناصر التحكم السالبة/الموجبة إلى العمود 2 من صفيحة الاستخلاص.
    2. إجراء استخراج الأحماض النووية باستخدام نظام استخراج أحماض نووية آلي مع البرنامجالمخصص 6.
  5. تحميل العينات
    1. نقل 10 ميكرولتر من حمض النووي المستخرج (العمود 6) وأجهزة التحكم إلى أنابيب PCR. يتم استخدام الطرد المركزي لفترة وجيزة ثم الانتقال إلى نافذة المرور في غرفة التضخيم.

4. تضخيم الأحماض النووية

ملاحظة: تم تنفيذ هذه الخطوات في غرفة التضخيم.

  1. تحميل أنابيب PCR في جهاز التضخيم النووي الآلي واختيار قالب التضخيم المناسب.
  2. تعيين قنوات الكشف: أنواع الأسبيرجيلوس: قناة FAM؛ C. neoformans: قناة VIC؛ P. jirovecii: قناة CY5؛ التحكم الداخلي: قناة ROX7، 8، 9.
  3. حدد أسماء العينات وشغل البرنامج.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تظهر منحنيات التضخيم التمثيلية التي تم الحصول عليها باستخدام اختبار PCR بمسبار فلورسنت متعدد الأبعاد في الشكل 1 والشكل 2. تم تحديد صلاحية الاختبار بناء على معايير ضابط محددة مسبقا. في التشغيل الصالح، أنتج التحكم الموجب منحنيات تضخيم على شكل S مميزة في قنوات FAM وVIC وCY5 وROX، مع قيم عتبة دورة (Ct) ≤ 33.7 في جميع قنوات الكشف (الشكل 1A). أظهر التحكم السلبي عدم وجود منحنيات تضخيم على شكل S في أي قناة،...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يوفر بروتوكول PCR اللحظي متعدد القنوات الذي تم وضعه في هذه الدراسة إجراء موحيدا للكشف المتزامن والسريع عن ثلاثة مسببات فطريات غازية رئيسية (Aspergillus spp.، Cryptococcus neoformans، وPneumocystis jirovecii) في عينات بلغم سريرية. تتيح هذه الطريقة الكشف المباشر عن الحمض النووي الممرض من العينات السريرية. على عكس الطرق التشخيصية التقليدية مثل الزراعة أو المجهر أو اختبار المستضدات المصلي، فإن هذه الطريقة الجزيئية لا تخضع للقيود الجوهرية لتلك التقنيات، بما في ذلك طول مدة المعالجة المرتبطة با...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

المؤلفون لا يفرضون أي تضارب مصالح.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نود أن نشكر قسم المختبرات السريرية في مستشفى شعب منطقة شانشوي في فوشان على توفير المعدات والدعم الفني.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
10 μ رؤوس مطرقة ممتدة معقمة برأس فلتر L (معلقة)تقنية شياوروي الحيويةS20221126
1000 μ أطراف ماصنة معقمةشركة جيانغسو شينكانغ للأدوات الطبية المحدودة241101
200 μ رؤوس معصمة معقمة من فلتر Lتقنية شياوروي الحيوية241001
أنابيب التحللشركة بكين ZC للعلوم الحيوية والإنتاج شركة التكنولوجياF1040
مجموعة كشف الأحماض النووية ل Aspergillus spp، Cryptococcus neoformans، و Pneumocystis jiroveciiشركة بكين ZC للعلوم الحيوية والإنتاج شركة تكنولوجي.CT8143-48T
كاشف استخراج الأحماض النوويةشركة بكين ZC للعلوم الحيوية والإنتاج شركة التكنولوجياCN8053-B40T
مخزن تخفيف العينةشركة بكين ZC للعلوم الحيوية والإنتاج شركة التكنولوجياSP7065

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Morrissey, C. O., et al. Aspergillus fumigatus—a systematic review to inform the World Health Organization priority list of fungal pathogens. Med Mycol. 62 (6), 6(2024).
  2. Higuchi, R., Fockler, C., Dollinger, G., Watson, R. Kinetic PCR analysis: real-time monitoring of DNA amplification reactions. Biotechnology (N Y). 11 (9), 1026-1030 (1993).
  3. Longo, M. C., Berninger, M. S., Hartley, J. L. Use of uracil DNA glycosylase to control carry-over contamination in PCR. Gene. 93 (1), 125-128 (1990).
  4. Vandesompele, J., et al. Accurate normalization of real-time quantitative RT-PCR data by geometric averaging of multiple internal control genes. Genome Biol. 3 (7), research0034.1-research0034.12 (2002).
  5. Bustin, S. A., et al. The MIQE guidelines: minimum information for publication of quantitative real-time PCR experiments. Clin Chem. 55 (4), 611-622 (2009).
  6. Boom, R., et al. Rapid and simple method for purification of nucleic acids. J Clin Microbiol. 28 (3), 495-503 (1990).
  7. Loeffler, J., et al. Quantification of fungal DNA by using fluorescence resonance energy transfer and the LightCycler system. J Clin Microbiol. 38 (10), 3463-3466 (2000).
  8. Bovers, M., et al. Six monophyletic lineages identified within Cryptococcus neoformans and Cryptococcus gattii by multi-locus sequence typing. Fungal Genet Biol. 43 (5), 353-359 (2008).
  9. Wakefield, A. E., et al. Detection of Pneumocystis carinii with DNA amplification. Lancet. 336 (8726), 751-753 (1990).
  10. Schrader, C., et al. PCR inhibitors—occurrence, properties and removal. J Appl Microbiol. 113 (5), 1014-1026 (2012).
  11. White, T. J., et al. Amplification and direct sequencing of fungal ribosomal RNA genes for phylogenetics. PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications. Innis, M. A., Gelfand, D. H., Sninsky, J. J., White, J. J. , Academic Press. 315-322 (1990).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

PCR DetectionFluorescent ProbeAspergillus SppCryptococcus NeoformansPneumocystis JiroveciiMultiplex Real Time PCRNucleic Acid ExtractionClinical Sputum SamplesCycle ThresholdInternal Control

Related Articles