مقالة منهجية

تحفيز الخلايا البطانية الوعائية باستخدام مصائد العدلات خارج الخلية في وجود البروتين الدهني منخفض الكثافة

979 مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/68830

⸱

أغسطس 12, 2025

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biological Chemistry, Showa Medical University Graduate School of Pharmacy

في هذه المقالة

ملخص

يتم وصف سلسلة من الطرق ، بما في ذلك عزل البروتين الدهني منخفض الكثافة (LDL) عن البلازما البشرية ، وتمايز خلايا HL-60 إلى خلايا شبيهة بالعدلات ، وتحضير مصائد العدلات خارج الخلية (NETs) في وجود LDL ، وتحفيز الخلايا البطانية الأبهرية البشرية بمزيج من NETs و LDL.

الملخص

ظهرت مصائد العدلات خارج الخلية (NETs) كعوامل مسببة في العديد من الأمراض غير المعدية ومتورطة في اضطرابات القلب والأوعية الدموية مثل تصلب الشرايين والتخثر. لوحظ تكوين NET في جدار الأوعية الدموية ، وهناك أدلة دامغة على أن علامات البلازما لتكوين NET تزداد مع شدة المرض. تؤثر مكونات NET المشتقة من العدلات ، بما في ذلك المايلوبيروكسيداز والبروتياز ، على البروتينات الدهنية في البلازما وتوازن الأوعية الدموية. هنا ، يتم وصف سلسلة من الطرق لتحفيز الخلايا الوعائية باستخدام NETs التي تشكلت في وجود البروتين الدهني منخفض الكثافة (LDL). تم تجزئة LDL من البلازما البشرية عن طريق الطرد المركزي الفائق. تمت معالجة خلايا HL-60 بحمض الريتينويك المتحول بالكامل لتمايزها إلى خلايا شبيهة بالعدلات ثم تحفيزها باستخدام فوربول 12-ميريستات 13-أسيتات (PMA) للحث على تكوين NET. بعد إزالة وغسل PMA ، تم احتضان الخلايا بشكل أكبر باستخدام LDL. تم استخدام المواد الطافية التي تم جمعها التي تحتوي على NETs و LDL على الفور لتحفيز الخلايا البطانية الأبهرية البشرية (HAECs). كاستجابة تمثيلية ، تم تعزيز التغيير المورفولوجي ل HAECs الناجم عن علاج NET من خلال وجود LDL ، مما يشير إلى أن تكوين NET ، بالاشتراك مع LDL ، يعزز استجابة HAECs. هذه الطرق مفيدة لاستكشاف تأثيرات LDL على الخلايا البطانية تحت تنشيط العدلات والالتهاب المرتبط ب NET ، وبالتالي توفير رؤى جديدة حول الآليات الكامنة وراء أمراض القلب والأوعية الدموية المرتبطة بزيادة LDL في البلازما.

المقدمة

تطلق مصائد العدلات خارج الخلية (NETs) ، التي تنتجها العدلات المنشطة عند العدوى البكتيرية ، وكذلك في ظل ظروف غير معدية معقولة من الناحية الفسيولوجية ، الحمض النووي والبروتينات غير المكثفة ، مثل الهستونات ، ومايلوبيروكسيداز (MPO) ، والإيلاستاز العدلات1. نظرا لأن هذه المكونات يمكن أن تفكك الخلايا والأنسجة الهامشية ، مما يتسبب في التهاب مستمر ، فقد ظهر تكوين NET كعامل مسبب في بدء وتطور العديد من الأمراض الحادة والمزمنة ، بما في ذلك التهاب المفاصل الروماتويدي والصدفية والسكري ومرض الزهايمر ورم خبيث السرطان وأمراض القلب والأوعيةالدموية 2. أظهرت التحليلات النسيجية للآفات الوعائية البشرية لتصلب الشرايين3 وتمدد الأوعية الدموية الأبهري البطني4 أن تسلل العدلات وتكوين NET كانا متوضعين. في الدم المتداول ، تزداد مستويات علامات NETs ، مثل الهستونات الكريهة ، و NET-DNA ، و MPO ، مع شدة مرض الشريان التاجي5. في المراحل المبكرة من تصلب الشرايين ، غالبا ما يسبق تكوين NET تراكم الدهون ، والذي يحدث عن طريق تكوين خلايا الرغوة التي تحركها البلاعم6،7. تشير هذه الظواهر بقوة إلى أن إنزيمات MPO والحالة للبروتين التي يتم إطلاقها خارج الخلية أثناء تكوين NET يمكن أن تعمل ليس فقط على أنسجة الأوعية الدموية ولكن أيضا على مكونات الدم ، مثل البروتينات الدهنية. البروتينات الدهنية هي مجمعات بروتينات دهنية هشة يمكن أن تتلف بسبب البروتينات المشتقة من NET مثل MPO8. وبالتالي ، يمكن أن يتسبب تكوين NET في حدوث تغييرات هيكلية وكيميائية حيوية في البروتينات الدهنية ، وبالتالي التأثير على توازن الأوعية الدموية. ومع ذلك ، فإن التأثيرات التآزرية لتكوين NET والبروتينات الدهنية على خلل التنظيم الناجم عن الخلايا الوعائية والاستجابات الالتهابية لا تزال غير واضحة.

هنا ، توفر هذه المخطوطة طريقة لفحص الاستجابات الخلوية للخلايا البطانية الوعائية البشرية الناتجة عن العلاج باستخدام NETs المحضرة من خلايا شبيهة بالعدلات المشتقة من HL-60 والبروتينات الدهنية منخفضة الكثافة (LDL) المجزأة من البلازما البشرية. توضح النتائج التمثيلية تجزئة LDL من البلازما البشرية عن طريق الطرد المركزي الفائق والاستجابات الخلوية للخلايا البطانية الأبهرية البشرية (HAECs) المحفزة باستخدام NETs بعد الحضانة المشتركة مع LDL. هذه الطريقة قابلة للتطبيق على نطاق واسع لدراسة خلايا الأوعية الدموية التي تتضمن البروتينات الدهنية الأخرى.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

تمت الموافقة على بروتوكول تحضير LDL من قبل لجنة الأخلاقيات في كلية الصيدلة بجامعة شوا الطبية (رقم 231). تم الحصول على موافقة خطية مستنيرة وفقا لإعلان هلسنكي، وقدم جميع المشاركين طوعا توقيعاتهم للمشاركة في هذه الدراسة. تم التلاعب بالخلايا بشكل عقيم باستخدام غطاء التدفق الصفحي. كان معيار الإدراج هو الفئة العمرية من 22 إلى 65 سنة. وشملت معايير الاستبعاد عادات التدخين، وأمراض القلب والأوعية الدموية الموجودة مسبقا (مثل أمراض القلب التاجية، والسكتة الدماغية، وأمراض الشريان المحيطي)، والخلل الوظيفي الحاد في الكبد، والحالات المزمنة غير المنضبطة، بما في ذلك السكري وارتفاع ضغط الدم وعسر شحميات الدم والأمراض الالتهابية الشديدة والسرطان. الكواشف والمعدات المستخدمة مدرجة في جدول المواد.

1. عزل LDL عن البلازما البشرية

  1. جمع الدم الكامل من متطوع بشري سليم في وجود الهيبارين المضاد للتخثر (10 وحدات / مل).
  2. جهاز طرد مركزي 45-50 مل من الدم الكامل البشري الذي يتم الحصول عليه في أنبوب الهيبارين (700 × جم لمدة 15 دقيقة عند 4 درجات مئوية). تأكد من تقليل سرعة جهاز الطرد المركزي ببطء. اجمع الطبقة العليا التي تتكون من جزء البلازما.
  3. قم بإجراء الطرد المركزي مرتين (700 × جم ، 15 دقيقة عند 4 درجات مئوية) في نفس إعداد التباطؤ كما في الخطوة 1.2 للتخلص من خلايا الدم. أضف 1: 1,000 حجم 250 ملي مولار EDTA (الرقم الهيدروجيني 7.4) لمنع أكسدة البروتينات الدهنية بوساطة الأيونات ثنائية التكافؤ.
  4. ضع 2.7 مل من البلازما في أنبوب 4 مل من البولي كربونات (4 قطع) ، وتراكب 900 ميكرولتر من المحلول الملحي المخزن بالفوسفات (PBS) الذي يحتوي على 250 ميكرومتر EDTA (PBS / EDTA) ، وجهاز طرد مركزي فائق (600،000 × جم ، 7 دقائق عند 4 درجات مئوية).
  5. تخلص من 900 ميكرولتر من الطبقة العليا للتخلص من الكيلوميكرون. قم بتكديس 900 ميكرولتر من PBS / EDTA على البلازما وأجهزة الطرد المركزي الفائقة (600,000 × جم ، 2.5 ساعة عند 4 درجات مئوية).
  6. تخلص من 900 ميكرولتر من الطبقة العليا للتخلص من البروتين الدهني منخفض الكثافة (VLDL). هذه الخطوة مهمة لمنع تلوث LDL بكسور البروتين الدهني الأخرى.
  7. أضف 540 ميكرولتر من محلول 0.5 مجم / مل كيلوبايت لضبط الكثافة إلى d = 1.063 ، متبوعا بخلط لطيف بماصة ثم جهاز طرد مركزي فائق (600,000 × جم ، 2.5 ساعة عند 4 درجات مئوية).
  8. اجمع 540 ميكرولتر من الطبقة العليا التي تحتوي على LDL. تشير الطبقة الصفراء البرتقالية إلى الفصل الناجح LDL9. نقل إلى غشاء غسيل الكلى.
  9. قم بتحويل جزء LDL ثلاث مرات مقابل 2 لتر من PBS / EDTA عند 4 درجات مئوية في الظلام للتخلص من KBr.
  10. قم بتخزين LDL في درجة حرارة 4 درجات مئوية في الظلام قبل الاستخدام.

2. تحضير الآبار المطلية ب poly-L-lysine أو الجيلاتين

  1. قم بإعداد محلول بولي إل ليسين 0.01٪10 عن طريق تخفيف محلول بولي إل ليسين بنسبة 0.1٪ بالماء المعقم ، متبوعا بالترشيح بفلتر معقم 0.2 ميكرومتر. يحفظ في درجة حرارة 4 درجات مئوية قبل الاستخدام.
  2. أضف 152 ميكرولتر / بئر من محلول بولي إل ليسين 0.01٪ إلى كل بئر من صفيحة 12 بئرا واحتضانها لمدة 5 دقائق على الأقل.
  3. قم بإزالة المحلول ثم اغسله مرة واحدة ب 200 ميكرولتر / بئر من الماء المعقم وجففه لمدة ساعتين على الأقل.
  4. يحفظ في درجة حرارة الغرفة قبل استخدامه في تحضير الشبكات الصافية.

3. تحضير الآبار المطلية بالجيلاتين

  1. قم بإعداد محلول جيلاتين 0.1٪ قبل الاستخدام عن طريق تخفيف محلول الجيلاتين 2٪ بالماء المعقم.
  2. أضف 152 ميكرولتر / بئر من محلول الجيلاتين 0.1٪ إلى كل بئر من صفيحة 12 بئرا واحتضانها لمدة 5 دقائقعلى الأقل 11.
  3. قم بإزالة المحلول ثم اغسله مرة واحدة ب 200 ميكرولتر / بئر من الماء المعقم وجففه لمدة ساعتين على الأقل.
  4. يحفظ في درجة حرارة الغرفة قبل الاستخدام.

4. صيانة وإعداد الخلايا البطانية الأبهرية البشرية (HAECs)

  1. زراعة HAECs الأولية في قارورة مزرعة غير مغلفة باستخدام وسط كامل يحتوي على 2٪ مصل ربلة الساق الجنينية (FCS) ، 5 نانوغرام / مل عامل نمو البشرة ، 10 نانوغرام / مل عامل نمو الخلايا الليفية الأساسية ، 20 نانوغرام / مل عامل نمو شبيه بالأنسولين ، 0.5 نانوغرام / مل عامل نمو بطانة الأوعية الدموية ، 1 ميكروغرام / مل حمض الأسكوربيك ، 22.5 ميكروغرام / مل من الهيبارين ، و 0.2 ميكروغرام / مل هيدروكورتيزون ، كما هو موضح في تعليمات المصنعين. قم بتغيير الوسيط كل يوم بديل حتى تتلاقى الخلايا بنسبة 70٪ -80٪.
  2. للتحفيز, بذور HAECs في ألواح 12 بئر مغلفة بالجيلاتين. قم بتغيير الوسيط كل يوم بديل حتى يتم الوصول إلى التقاء. قم بإجراء التجربة بين المقطعين 4 و 7.

5. تحضير الخلايا الشبيهة بالعدلات المشتقة من HL-60 متبوعة ب NETs

  1. الحفاظ على خلايا HL-60 مع متوسط RPMI-1640 مكمل بنسبة 5٪ مصل بقري للجنين و 1٪ بنسلين / ستربتومايسين ، باستخدام أطباق غير معالجة.
  2. لتحضير الخلايا الشبيهة بالعدلات المشتقة من HL-60 ، استزراع 2 × 106 خلايا لكل 10 مل من خلايا HL-60 لمدة 4 أيام في وسط RPMI-1640 يحتوي على 2 ميكرومتر من حمض الريتينويك المتحول بالكامل (AtRA).

6. تحضير NETs مع LDL

  1. اجمع خلايا HL-60 بعد 4 أيام من العلاج باستخدام 2 ميكرومتر AtRA. بعد تمايز خلايا HL-60 إلى خلايا شبيهة بالعدلات ، تصبح الخلايا أصغر.
  2. خلايا الطرد المركزي (220 × جم ، 4 دقائق عند 18-22 درجة مئوية). استنشق المادة الطافية واغسل الخلايا بحجم متساو من RPMI-1640 الخالي من المصل.
  3. الطرد المركزي للخلايا (220 × جم ، 4 دقائق عند 18-22 درجة مئوية) ثم أعد تعليق الخلايا باستخدام RPMI-1640 الخالي من المصل.
  4. عد الخلايا ، ثم أعد تعليق الخلايا إلى 2 × 106 خلايا / مل في RPMI-1640 الخالي من المصل وبذرة 0.5 مل من تعليق الخلية في آبار صفيحة 12 بئرا مطلية مسبقا ببولي إل ليسين. الثقافة لمدة 30 دقيقة على الأقل.
  5. أضف 100 ميكرولتر من RPMI-1640 الخالي من المصل مع أو بدون 300 نانومتر فوربول 12-ميريستات 13-أسيتات (PMA) إلى التركيز النهائي ل 0 أو 50 نانومتر PMA. ثقافة لمدة 30 دقيقة.
  6. قم بإزالة الوسط وغسل الخلايا مرة واحدة باستخدام RPMI-1640 الخالي من المصل. استبدل الوسط ب RPMI-1640 الخالي من المصل مع أو بدون 20 ميكروغرام / مل من LDL ثم استزراعه لمدة ساعتين.
  7. اجمع وسط الاستزراع وأجهزة الطرد المركزي (700 × جم ، 3 دقائق عند 18-22 درجة مئوية) لإزالة بقايا الخلية.

7. تحفيز HAECs باستخدام NETs و LDL

  1. استبدل الوسط ب 0.5 مل من وسط الاستزراع الطازج. الثقافة لمدة 30 دقيقة على الأقل قبل التحفيز.
  2. أضف 167 ميكرولتر من وسط الاستزراع الذي يحتوي على NETs و LDL (الخطوة 6.7) و LDL إلى أطباق HAEC. تحقق من التغيرات المورفولوجية في HAECs المستحثة بعد التحفيز لمدة 12 ساعة أو أكثر.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

بعد إزالة الكيلوميكرون ، متبوعا بكسور VLDL من البلازما البشرية من خلال الطرد المركزي المتسلسل ، تم خلط البلازما البشرية بمحلول KBr لضبط الكثافة إلى d = 1.063. في هذه الخطوة ، لم يتم إذابة المرسب المتبقي تماما في المحلول ، وتم تجنب الخلط الشديد ، الذي أدى إلى تكوين فقاعات غاز ، للحفاظ على LDL سليما. بعد الطرد المركزي الفائق ، تم تقييم LDL بصريا على الطبقة العليا من خلال لونه الأصفر البرتقالي9 (الشكل 1) ، والذي ميزها عن المحلول عديم اللون تحتها مباشرة. عادة ، ب...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

يصف هذا البروتوكول تحضير NETs من خلايا dHL-60 الناجمة عن تعايش LDL ، والتي تستخدم لاحقا لتحليل استجابات HAEC. تكمن أهمية هذا البروتوكول في استخدام وسط جديد يحتوي على NETs و LDL لتحفيز الخلايا ، على الرغم من أن العديد من الدراسات الأخرى تستخدم محلول مخزون من NETs المجمدة عند -20 درجة مئوية. نظرا لأن البروتينات الدهنية عبارة عن مجمعات بروتينية دهنية ، فإن هياكلها وخصائصها السليمة تفقد أثناء التجميد والذوبان ، مما يتسبب في تمسخ وتراكم LDL. تتمثل إحدى مزايا الطريقة الحالية في أن منتجات تكوي...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

المؤلفون ليس لديهم ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

تم دعم هذه الدراسة جزئيا من قبل الجمعية اليابانية لتعزيز العلوم ، KAKENHI (أرقام المنحة 23K10897 و 19K07069). نود أن نشكر Editage (www.editage.jp) على تحرير اللغة الإنجليزية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
0.1٪ بولي L-يسينسيجما ألدريتشP8920-100 مل
طبق 10 سمكورنينج430591
12-بئر لوحات زراعة الأنسجةصقر353043
2٪ جيلاتينسيجما ألدريتشجي 1393-20 مل
أنبوب 4 قطعةهيماكS404332A
حمض الريتينويك العابر بالكاملواكو188-01113يمكن استبداله بأي بائع
أنابيب غسيل الكلى السليلروزMISUMI Group Inc.0327-23-37-07 (UC18-32-100)يمكن استبداله بأي بائع
إيدتادوجيندو345-01865يمكن استبداله بأي بائع
متوسط نمو الخلايا البطانية 2 كيتخلية ترويجيةسي -22111
مصل الأبقار الجنينيةجيبكو10270-106يمكن استبداله بأي بائع
الهيبارين الصوديوم (5,000 وحدة / 5 مل)Mochida الصيدلانية المحدودةيمكن استبداله بأي بائع
أجهزة طرد مركزي مبردة عالية السرعةتوميSRX-201التسارع: 9 ، التباطؤ: 7
خلايا بطانة الأبهر البشريلونزاسي سي -2535
كيلو بايتواكو168-03475يمكن استبداله بأي بائع
برنامج الفحص المجهري KEYENCEكينسمحلل BZ-II
جهاز الطرد المركزي الفائق الصغيرهيماكCS150GX
مجهريهأوليمبوسCK40
مجهريهكينسبيز-9000للتصوير بفاصل زمني (اختياري)
كاميرا مجهريةنيكونDS-Fi3
برنامج كاميرا الفحص المجهرينيكونDS-L4
البنسلين / الستربتومايسينجيبكو15140-122 100 مليمكن استبداله بأي بائع
محلول ملحي عازلة للفوسفات (& مرات; 10)قم بإذابة 2.6 جم من هيدروكيت الصوديوم 2< / sub>PO4< / sub> · ؛ 2H2O، 29 جم من Na2HPO4· 12H2O، 80 جم من كلوريد الصوديوم و 2.0 جم من KCl في الماء المقطر وضبط حجم 1 لتر  (يمكن استبداله بأي بائع)
PMA (Phorbol 12-Myristate 13-Acetate)واكو162-23591يمكن استبداله بأي بائع
ReagentPackلونزاسي سي -5034(CC-5022: محلول ملحي مخزن HEPES ، CC-5012: التربسين / EDTA ، CC-5002: محلول تحييد التربسين)   ؛
الدوارهيماكS100AT6-0242
RPMI-1640 (مع فينول أحمر)واكو189-02025يمكن استبداله بأي بائع
RPMI-1640 (بدون فينول أحمر)واكو186-02155يمكن استبداله بأي بائع
قارورة T-25كورنينج3275

المراجع

  1. Papayannopoulos, V. Neutrophil extracellular traps in immunity and disease. Nat Rev Immunol. 18 (2), 134-147 (2018).
  2. Wang, H., et al. Neutrophil extracellular traps in homeostasis and disease. Signal Transduct Target Ther. 9 (1), 235(2024).
  3. Megens, R. T., et al. Presence of luminal neutrophil extracellular traps in atherosclerosis. Thromb Haemost. 107 (3), 597-598 (2012).
  4. Meher, A. K., et al. Novel role of IL (Interleukin)-1β in neutrophil extracellular trap formation and abdominal aortic aneurysms. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 38 (4), 843-853 (2018).
  5. Borissoff, J. I., et al. Elevated levels of circulating DNA and chromatin are independently associated with severe coronary atherosclerosis and a prothrombotic state. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 33 (8), 2032-2040 (2013).
  6. Liu, Y., et al. Myeloid-specific deletion of Peptidylarginine Deiminase 4 mitigates atherosclerosis. Front Immunol. 9, 1680(2018).
  7. Zhai, M., et al. Extracellular traps from activated vascular smooth muscle cells drive the progression of atherosclerosis. Nat Commun. 13 (1), 7500(2022).
  8. Abdo, A. I., Rayner, B. S., van Reyk, D. M., Hawkins, C. L. Low-density lipoprotein modified by myeloperoxidase oxidants induces endothelial dysfunction. Redox Biol. 13, 623-632 (2017).
  9. Mueller, P. A., et al. A method for lipoprotein (a) Isolation from a small volume of plasma with applications for clinical research. Sci Rep. 12 (1), 9138(2022).
  10. Hosseinzadeh, A., Messer, P. K., Urban, C. F. Stable redox-cycling nitroxide tempol inhibits NET formation. Front Immunol. 3, 391(2012).
  11. Gupta, A. K., et al. Activated endothelial cells induce neutrophil extracellular traps and are susceptible to NETosis-mediated cell death. FEBS Lett. 584 (14), 3193-3197 (2010).
  12. Obama, T., et al. Cooperative action of oxidized low-density lipoproteins and neutrophils on endothelial inflammatory responses through neutrophil extracellular trap formation. Front Immunol. 10, 1899(2019).
  13. Schröter, J., Schiller, J. Chlorinated phospholipids and fatty acids: Patho)physiological relevance, potential toxicity, and analysis of lipid chlorohydrins. Oxid Med Cell Longev. 2016, 8386362(2016).
  14. Nose, F., et al. Crucial role of perilipin-3 (TIP47) in formation of lipid droplets and PGE2 production in HL-60-derived neutrophils. PLoS One. 8 (8), e71542(2013).
  15. Manda-Handzlik, A., et al. The influence of agents differentiating HL-60 cells toward granulocyte-like cells on their ability to release neutrophil extracellular traps. Immunol Cell Biol. 96 (4), 413-425 (2018).
  16. Ermert, D., et al. Mouse neutrophil extracellular traps in microbial infections. J Innate Immun. 1 (3), 181-193 (2009).
  17. Ohinata, H., Obama, T., Makiyama, T., Watanabe, Y., Itabe, H. High-density lipoprotein suppresses neutrophil extracellular traps enhanced by oxidized low-density lipoprotein or oxidized phospholipids. Int J Mol Sci. 23 (22), 13992(2022).
  18. Pertiwi, K. R., et al. Extracellular traps derived from macrophages, mast cells, eosinophils, and neutrophils are generated in a time-dependent manner during atherothrombosis. J Pathol. 247 (4), 505-512 (2019).
  19. Xu, J., et al. Differential roles of eosinophils in cardiovascular disease. Nat Rev Cardiol. 22 (3), 165-182 (2025).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

HL 60

مقالات ذات صلة