يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

مقايسة تضخيم بوليميراز إعادة التركيب المركبة CRISPR / Cas12a للكشف عن Fusarium oxysporum f. sp. cubense العرق الاستوائي 4

678 مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/68841

⸱

نوفمبر 14, 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Plant Pathology, Faculty of Agrisciences, Stellenbosch University, 2CIRAD, UMR PVBMT, 3Department of Genetics, Faculty of Agrisciences, Stellenbosch University

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

في هذا البروتوكول ، تم توضيح مقايسة تضخيم بوليميراز إعادة التركيب CRISPR / Cas12a للكشف عن مسببات الأمراض النباتية الغازية ، Fusarium oxysporum f. sp. cubense tropical race 4.

الملخص

تعتبر المراقبة المنتظمة والدقيقة أمرا أساسيا للإدارة الفعالة لأمراض النبات. ويمكن أن يشير إلى مسار العمل الأنسب، وما إذا كانت الوقاية أو القضاء عليها أو عدم اتخاذ أي إجراءات. غالبا ما تكون المراقبة القائمة على علم الأعراض في النباتات المضيفة وحدها غير موثوقة بسبب أوجه التشابه في الأعراض الناجمة عن الإجهاد الحيوي واللاأحيائي. الطرق الجزيئية القائمة على المختبر مثل تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) وتفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي (q) هي الأكثر استخداما وموثوقية للكشف عن مسببات الأمراض النباتية ، ولكنها تعتمد على معدات باهظة الثمن ومشغلين مهرة. هنا ، نصف بروتوكولا يجمع بين استخراج الحمض النووي المبسط ، وتضخيم بوليميراز إعادة التركيب (RPA) ، والتكرارات المتجانسة القصيرة المتباعدة بانتظام (CRISPR) / Cas12a (RPA-Cas12a) للكشف عن العامل الممرض الغازي ، Fusarium oxysporum f. sp. cubense العرق الاستوائي 4 (Foc TR4). توفر هذه التقنية بديلا بسيطا للكشف عن أنبوب واحد قوي من الناحية التحليلية مع خصوصية محسنة مقارنة بفحوصات الكشف الجزيئي المتاحة وينفي الحاجة إلى معدات مختبرية باهظة الثمن ومتطورة.

المقدمة

ذبول الفيوزاريوم ، الناجم عن مسببات الأمراض الفطرية المنقولة بالتربة Fusarium oxysporum f. sp. cubense (Foc) ، يعتبر عالميا أحد أكثر مسببات الأمراض النباتية العابرة للحدود تدميرا في التاريخ1. بمجرد إدخالها إلى منطقة جديدة ، يظل Foc غير مرئي حتى تظهر الأعراض على النباتات المصابة. قد يستغرق هذا شهورا ، مما يسمح للفطر بالثبات والانتشار دون علمه. بمجرد إنشائها ، يكاد يكون من المستحيل القضاء عليها اقتصاديا بسبب إنتاج الكلاميدوساتبور المرنة والطبيعة المعمرة لإنتاج الموز. وبالتالي ، فإن أهمية الوقاية والكشف المبكر أمر بالغ الأهمية في حماية المزارعين الضعفاء1. ويتطلب الوباء الحالي للمرض، الناجم عن العرق الاستوائي 4 (TR4)، الكشف عن طريق المراقبة المنتظمة لتحديد نباتات الموز التي تظهر عليها أعراض في المناطق عالية الخطورة. تؤدي القيود اللاأحيائية مثل الإجهاد المائي وبعض نقص المغذيات إلى اصفرار خارجي ، وهو مشابه للأعراض التي تنتجها عدوى Foc TR4. بالإضافة إلى ذلك ، لا يمكن تمييز الأعراض الناتجة عن العدوى من قبل سباقات Foc المختلفة. لذلك ، فإن التنقية المختبرية والكشف اللاحق عن النمط الظاهري والجزيئي ضروريان للكشف الموثوق به من Foc TR42. تتوفر العديد من المقايسات الجزيئية للكشف عن Foc TR4 ، بما في ذلك تفاعل البوليميراز المتسلسل ، وتفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي (q) ، ومقايسات التضخيم متساوي الحرارة بوساطة الحلقة (LAMP)3،4،5،6،7. ومع ذلك ، لا تزال معظم هذه البروتوكولات تتطلب مهارات ومعدات باهظة الثمن ومتخصصة ، والتي يجب إجراؤها في البيئات المختبرية. يمكن إجراء تضخيم بوليميراز إعادة التركيب (RPA) بشكل متساوي الحرارة ، وبالتالي ، يلغي الحاجة إلى مثل هذه المعدات ويمكن النظر فيه لبروتوكولات الكشف الميداني8.

تم استخدام أنظمة التكرارات المتجانسة القصيرة المتباعدة بانتظام (CRISPR) -Cas بشكل متزايد لتحسين التشخيص الجزيئي9. يتم استخدام هذه الأنظمة لأنها غير مكلفة وبسيطة ولا تتطلب استخدام أجهزة خاصة ، وبالتالي يمكن النظر فيها للكشف في الميدان. عادة ما تتضمن التشخيصات المستندة إلى CRISPR تضخيما متساوي الحرارة لتسلسل مستهدف ، متبوعا بالتعرف على الهدف عبر بروتينات CRISPR-Cas والانقسام الجانبي لصبغة مراسل الفلورسنت DNA أو RNA للإشارة إلى وجود الهدف10،11. في أنظمة CRISPR-Cas12a ، على وجه التحديد ، يوجه CRISPR RNA (crRNA) Cas12a للتعرف على أهداف الحمض النووي وشقها. يمكن تصميم crRNA هذا لاستهداف منطقة معينة من الحمض النووي أو الحمض النووي الريبي ذات أهمية من خلال التهجين إلى تسلسل تكميلي. بمجرد ربطه ، ينتج عنه Cas12a شق الهدف بخصوصية أحادية النوكليوتيدات ، متبوعا بالانقسام الجانبي لجزيئات المراسل12. في الآونة الأخيرة ، تم استخدام أنظمة CRISPR-Cas12a للكشف عن مختلف مسببات الأمراض النباتية الفطرية المهمةاقتصاديا 13،14،15،16،17،18،19،20.

في هذا البروتوكول ، تم وصف تطوير تقنية الكشف عن أنبوب واحد ، تجمع بين استخراج الحمض النووي المبسط ، وتضخيم بوليميراز إعادة التركيب (RPA) ، وتقنية CRISPR / Cas12a (RPA-Cas12a) للكشف عن Foc TR4 ، والتي تم تصورها على مقياس فلوري محمول وبعين مجردة تحت الصمام الثنائي الباعث للضوء الأزرق غير المكلف (LED)21. يمكن تحسين الطريقة بشكل أكبر للكشف الميداني لتحسين استراتيجيات الوقاية والاحتواء. يمكن أيضا استخدام نهج مماثل لتصميم فحوصات الكشف المستندة إلى Cas12a لمسببات الأمراض النباتية الأخرى.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

1. استخراج الحمض النووي المبسط من المواد النباتية

ملاحظة: انظر الشكل 1 للحصول على نظرة عامة.

  1. إجراء استخراج الحمض النووي.
    1. انقل 250 مجم من كل قطعة من الجذع الكاذب المصحوب بأعراض إلى كيس استخراج منفصل (انظر جدول المواد).
    2. أضف 2 مل من 0.5 M NaOH-PVP (جدول المواد) إلى الأكياس التي تحتوي على مادة نباتية. طحن الأوعية المصابة في كيس استخراج باستخدام مطحنة يدوية مثل المدقة.
      ملاحظة: أضف 1-2 مل تكميلية 0.5 M هيدروكسيد الصوديوم-PVP إذا لزم الأمر للحصول على ما يكفي من مستخلص سائل من الكيس.
    3. أضف 195 ميكرولتر من 100 ملي مولار Tris-HCL (درجة الحموضة 8.0) (جدول المواد) في أنابيب 1.5 مل.
    4. ماصة 5 ميكرولتر من المستخلص من الكيس في أنبوب 1.5 مل مع 195 ميكرولتر من 100 ملي Tris-HCL (درجة الحموضة 8.0) ، مما يخفف المستخلص 40 ضعفا.
    5. قم بتدوير الأنابيب لمدة 15-30 ثانية وتخزينها في درجة حرارة -20 درجة مئوية حتى الاستخدام.

2. تخليق crRNA ومراقبة الجودة

  1. إجراء النسخ.
    1. باستخدام مجموعة نسخ الحمض النووي الريبي (جدول المواد) ، أضف ما يلي إلى أنبوب تفاعل البوليميراز المتسلسل 0.2 مل: 1.5 ميكرولتر من 10x T7 Reaction Buffer ، و 1.5 ميكرولتر من كل dNTP ، و 1.5 ميكرولتر من مزيج بوليميراز الحمض النووي T7 ، و 1 ميكرولتر من الماء الخالي من النوكلياز ، و 10 ميكرولتر من 100 ميكرومتر T7 الحمض النووي لحجم إجمالي يبلغ 20 ميكرولتر.
    2. احتضان الأنبوب عند 37 درجة مئوية في حمام مائي أو جهاز PCR لمدة 4 ساعات على الأقل.
    3. استخدم مقياس الطيف الضوئي (جدول المواد) لتحديد كمية الحمض النووي الريبي المنسوخ. قم بتخفيف الحمض النووي الريبي إلى 250 نانوغرام / ميكرولتر (10 ميكروغرام) بحجم 40 ميكرولتر باستخدام ماء خال من النوكلاز أو مخزن مؤقت TE (الملف التكميلي 1).
      ملاحظة: يمكن تخزين الحمض النووي الريبي المنسوخ عند -80 درجة مئوية حتى الاستمرار في علاجات DNase وخطوات التنظيف.
  2. إجراء علاج DNase وتنظيف crRNA.
    ملاحظة: قم بتنفيذ جميع الخطوات في درجة حرارة الغرفة. احتفظ بإنزيم الحمض النووي الريبي والحمض النووي الريبي الأول على الجليد.
    1. عالج عينة الحمض النووي الريبي باستخدام DNase I المدرج في مجموعة تنظيف الحمض النووي الريبي (جدول المواد) وفقا لتعليمات الشركة المصنعة22.
    2. قم بتنظيف عينة الحمض النووي الريبي باستخدام مجموعة تنظيف الحمض النووي الريبي وفقا لتعليمات الشركة المصنعة ، باتباع البروتوكولالثاني 22.
    3. قم بإسقاط crRNA النظيف لتحديد الكمية والجودة الموجودة. قم بتخفيف الحمض النووي الريبي إلى 100 نانوغرام / ميكرولتر باستخدام ماء خال من النوكلياز وتخزينه عند -80 درجة مئوية حتى الاستخدام.
    4. قم بتسخين crRNA باستخدام صبغة تحميل الحمض النووي الريبي (جدول المواد) إلى 70 درجة مئوية لمدة 10 دقائق في حمام مائي ، وقم بتعريض crRNA للرحلان الكهربائي على هلام agarose بنسبة 1.5٪ لتصور crRNA المركب (الشكل 2).

3. تضخيم بوليميراز إعادة التركيب (RPA) -Cas12a تفاعل أنبوب واحد للكشف عن Foc TR4 في المختبر

ملاحظة: انظر الشكل 3 للحصول على نظرة عامة.

  1. قم بإعداد خلطات تفاعل RPA و Cas12a.
    ملاحظة: تأكد من تنفيذ هذه الخطوات في مساحة خالية من الحمض النووي على الجليد ، مع تبريد الكواشف والمواد مسبقا. امسح سطح العمل والماصات بالمبيض و 70٪ إيثانول قبل التجربة. انظر الجدول 1 للحصول على معلومات حول جميع قليل النوكليوتيدات المستخدمة في هذه الدراسة.
    1. قم بإعداد خليط تفاعل Cas12a سعة 20 ميكرولتر في أنبوب منفصل 0.5 مل (جدول المواد) بأحجام الكاشف التالية: 2 ميكرولتر من 10x NEBuffer r2.1 (50 ملي كلوريد الصوديوم ، 10 ملي Tris-HCl ، 10 ملي MgCl2 ، 100 ميكروغرام / مل الألبومين المؤتلف ، الرقم الهيدروجيني 7.9) ، 0.4 ميكرولتر من 10 ميكرومتر بروتين LbCas12a ، 0.6 ميكرولتر من 100 نانوغرام / ميكرولتر crRNA ، 0.4 ميكرولتر من مراسل 10 ميكرومتر ، و 16.6 ميكرولتر من الماء منزوع الأيونات.
      ملاحظة: التركيزات النهائية لبروتين LbCas12a و crRNA و reporter هي 200 نانومتر على التوالي.
    2. قم بإعداد خليط تفاعل RPA سعة 9.5 ميكرولتر في أنبوب منفصل سعة 0.5 مل بأحجام الكاشف التالية: 5 ميكرولتر من 2x Reaction Buffer (التركيز النهائي 1x وفقا لإرشادات الشركة المصنعة) ، 1.6 ميكرولتر من dNTP Mix (التركيز النهائي 1.6 ملليمتر) ، 1 ميكرولتر من 10x Basic E-Mix (التركيز النهائي 1x وفقا لإرشادات الشركة المصنعة) ، 0.5 ميكرولتر من كل برايمر RPA عند 10 ميكرومتر (التركيز النهائي 0.5 ميكرومتر لكل منهما) ، 0.5 ميكرولتر من مزيج التفاعل الأساسي 20x (التركيز النهائي 1x وفقا لإرشادات الشركة المصنعة) ، و 0.4 ميكرولتر من الماء منزوع الأيونات.
    3. ضع شريطا من 8 أنابيب في رف أنبوبي (جدول المواد) على الثلج.
    4. انقل مزيج تفاعل Cas12a سعة 20 ميكرولتر إلى قاعدة الأنبوب.
    5. انقل مزيج تفاعل RPA 9.5 ميكرولتر إلى غطاء شريط الأنبوب. أضف 0.5 ميكرولتر من 280 نانومتر MgOAc (التركيز النهائي 14 نانومتر) إلى مزيج تفاعل RPA في غطاء شريط الأنبوب واخلطه عن طريق سحب العينة لأعلى ولأسفل.
    6. أضف 0.5 ميكرولتر من الماء منزوع الأيونات إلى غطاء أنبوب التحكم غير القالب (NTC) وأغلقه بعناية لضمان عدم دمج مخاليط تفاعل RPA و Cas12a.
      ملاحظة: يتم تضمين عنصر تحكم غير قالب (NTC) لضمان موثوقية النتائج.
  2. أضف الحمض النووي للقالب وابدأ التفاعل.
    1. أضف 0.5 ميكرولتر من الحمض النووي للقالب إلى خليط تفاعل RPA 10 ميكرولتر الذي يحتوي على MgOAc في غطاء شريط الأنبوب ، باستثناء NTC ، مع الماء منزوع الأيونات بدلا من الحمض النووي. أضف دائما التحكم الإيجابي المعروف Foc TR4 DNA في بئر واحد لضمان عمل الفحص على النحو المنشود. امزج عن طريق سحب العينة لأعلى ولأسفل.
    2. أغلق أغطية شريط الأنبوب بعناية لضمان عدم اختلاط تفاعل RPA و Cas12a.
    3. قم بتشغيل مقياس الفلورومتر المحمول (جدول المواد) وقم بإنشاء ملف تعريف تشغيل لمقايسة RPA-Cas12a (الملف التكميلي 2). افتح ملف تعريف التشغيل المحفوظ وضع شريط الأنبوب في مقياس الفلورومتر المحمول لاحتضانه لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
      ملاحظة: احرص على عدم لمس الجزء السفلي من الأنابيب عند التعامل مع شريط الأنبوب ؛ بدلا من ذلك ، أمسك الحواف الخارجية في الطرف الأيسر العلوي والأيمن.
    4. قم بإزالة شريط الأنبوب من مقياس الفلورومتر المحمول بعد 30 دقيقة. اقلب الأنابيب ست مرات لخلط تفاعلات RPA و Cas12a وتدور لأسفل في جهاز طرد مركزي صغير (انظر جدول المواد) لمدة 5 ثوان.
    5. ضع شريط الأنبوب مرة أخرى في مقياس الفلورومتر المحمول واحتضنه لمدة 30 دقيقة أخرى عند 37 درجة مئوية باستخدام ملف تعريف التشغيل المحفوظ.
  3. تصور النتائج.
    1. تفسير متوسط وحدات التألق النسبية (RFUs) المقاسة على مقياس الفلور المحمول (الملف التكميلي 2 ودليل المستخدم23).
    2. تصور الأنابيب تحت ضوء LED الأزرق بطول موجي للإثارة 465 نانومتر باستخدام محول الضوء الأزرق (الملف التكميلي 3). التقط الصور باستخدام كاميرا الهاتف.

   

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

الكشف الناجح عن Foc TR4 من المواد النباتية المصابة باستخدام استخراج الحمض النووي المبسط متبوعا بمقايسة RPA-Cas12a المدمجة عند إجراؤها في مقياس الفلور المحمول Genie III موضح في الشكل 4 أ. تظهر العينات الإيجابية مضانا مرئيا (الممر 6-8) ، بينما تظهر العينات السلبية مضان منخفضا لنقطة النهاية (الممر 1-5). عندما تم عرض أنابيب العينة تحت ضوء LED الأزرق ، أظهرت العينات المصابة ب Foc TR4 أيضا مضانا مرئيا (الشكل 4 ب). في المقابل ، لم ينتج...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

المراقبة المنتظمة هي استراتيجية مهمة لجهود الوقاية والاحتواء الفعالة ل Foc TR4 وغيرها من الآفات الغازية المهمة. يمكن لبروتوكولات الكشف التي يمكن تطبيقها في الميدان ، وتحديد مسببات الأمراض بسرعة ودقة ، تسريع عملية صنع القرار والحد من التكاليف المرتبطة بجهود المراقبة. تحقيقا لهذه الغاية ، جمع البروتوكول المقدم هنا بين استخراج مبسط للحمض النووي ، تم إجراؤه مباشرة على المواد النباتية التي تم أخذ عينات منها ، والتي تم تضمينها لاحقا في مقايسة من أنبوب واحد تجمع بين تفاعلات RPA و Cas12a ، من أج...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

لا يعلن المؤلفون عن عدم وجود مصالح مالية أو فكرية متنافسة.

شكر وتقدير

نحن نقر بالتمويل المقدم من المؤسسة الوطنية للبحوث في جنوب إفريقيا ، رقم المنحة: 138109 ، في إطار الدعم التنافسي لبرنامج الباحثين غير المصنفين. كما نعرب عن تقديرنا لتمويل زمالة Marie Sklodowska-Curie للبحث والابتكار في برنامج الاتحاد الأوروبي Horizon 2020 بموجب منحة مشروع INDICANTS: 890856.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
بروتين EnGen LBA Cas12a (Cfp1)مختبرات نيو إنجلاند البيولوجيةM0653T
EnGen LBA Cas12a مخففمختبرات نيو إنجلاند البيولوجيةB0653A
أنابيب PCR من إبندورفميركEP0030124332
أنابيب اختبار إيبندورف ذات القفل الآمنميركEP0030121708
أكياس الاستخراج العالميةبيوريبا430100
سلم الحمض النووي GeneRuler بطول 100 نقطة أساسثيرمو فيشر ساينتيفكSM0241 / SM0242
جني طرد مركزي ميني-6KOأوبتيجينأوب-فيوج
الجني الثالثأوبتيجينhttps://www.optigene.co.uk/instruments/genie-iii/ ؛
حامل شريط الجنيأوبتيجينGBLOCK-01 / GBLOCK-02 / GBLOCK-03
جيني ستريبسأوبتيجينOP-0008-50 / OP-0008-500
مجموعة تصنيع الحمض النووي الريبي عالي العائد HiScribe T7مختبرات نيو إنجلاند البيولوجيةE2040S
مطياف الفوتومتري الأشعة فوق بنفسج/الرؤية من نانوسدروب ND-1000ثيرمو فيشر ساينتيفكhttps://caeonline.com/buy/spectrometers/nanodrop-nd-1000/293669253
NEBuffer 3مختبرات نيو إنجلاند البيولوجيةB7003S
NEBuffer r2.1مختبرات نيو إنجلاند البيولوجيةB6002S
مسحوق بولي فينيل بيروليدون (PVP)سيغما-ألدرتش9003-39-8
مجموعة تنظيف RNA وConcentrator-5زيمو للأبحاثR1013
صبغة تحميل RNAثيرمو فيشر ساينتيفكR0641
جهاز الإضاءة المؤقت SmartBlue Blue Lightأكويريس إنسترومنتسE4000-E
حبيبات هيدروكسيد الصوديوم (NaOH)ميرك، إمبارتاK277
أمينوميثان تريس (هيدروكسيل ميثيل)ميرك77-86-1
مجموعة TwistAmp Liquid Basicتويست دي إكسTALQBAS01

المراجع

  1. Viljoen, A., Ma, L. J., Molina, A. B. Fusarium Wilt (Panama Disease) and Monoculture in Banana Production: Resurgence of a Century-Old Disease. Emerging Plant Diseases and Global Food Security. , The American Phytopathological Society. St. Paul, MN. (2020).
  2. Viljoen, A., et al. Banana Diseases and Pests: Field Guide for Diagnostics and Data Collection. , IITA, Ibadan. (2017).
  3. Dita, M. A., Waalwijk, C., Buddenhagen, I. W., Souza, M. T., Kema, G. H. A molecular diagnostic for tropical race 4 of the banana. Plant Pathol. 59 (2), 348-357 (2010).
  4. Li, M., et al. Identification and application of a unique genetic locus in diagnosis of Fusarium oxysporum f. sp. cubense tropical race 4. Can J Plant Pathol. 35 (4), 482-493 (2013).
  5. Aguayo, J., et al. Development of a hydrolysis probe-based real-time assay for the detection of tropical strains of Fusarium oxysporum f. sp. cubense race 4. PLoS One. 12 (2), e0171767(2017).
  6. Matthews, M. C., Mostert, D., Ndayihanzamaso, P., Rose, L. J., Viljoen, A. Quantitative detection of economically important Fusarium oxysporum f. sp. cubense strains in Africa in plants, soil and water. PLoS One. 15 (7), e0236110(2020).
  7. Ordóñez, N., et al. A loop-mediated isothermal amplification (LAMP) assay based on unique markers derived from genotyping by sequencing data for rapid in planta diagnosis of Panama disease caused by tropical race 4 in banana. Plant Pathol. 68 (9), 1682-1693 (2019).
  8. Martzy, R., et al. Challenges and perspectives in the application of isothermal DNA amplification methods for food and water analysis. Anal Bioanal Chem. 411, 1695-1702 (2019).
  9. Ghouneimy, A., Mahas, A., Marsic, T., Aman, R., Mahfouz, M. CRISPR-based diagnostics: Challenges and potential solutions toward point-of-care applications. ACS Synth Biol. 12 (1), 1-16 (2023).
  10. Chen, J. S., et al. CRISPR-Cas12a target binding unleashes indiscriminate single-stranded DNase activity. Science. 360 (6387), 436-439 (2018).
  11. Gootenberg, J. S., et al. Nucleic acid detection with CRISPR-Cas13a/C2c2. Science. 356 (6336), 438-442 (2017).
  12. Chen, Y., Mei, Y., Jiang, X. Universal and high-fidelity DNA single nucleotide polymorphism detection based on a CRISPR/Cas12a biochip. Chem Sci. 12 (12), 4455-4462 (2021).
  13. Shin, K., Kwon, S. H., Lee, S. C., Moon, Y. E. Sensitive and rapid detection of citrus scab using an RPA-CRISPR/Cas12a system combined with a lateral flow assay. Plants (Basel). 10 (10), 2132(2021).
  14. Zhang, Y. M., Zhang, Y., Xie, K. Evaluation of CRISPR/Cas12a-based DNA detection for fast pathogen diagnosis and GMO test in rice. Mol Breed. 40 (1), 11(2020).
  15. Wang, Q., Qin, M., Coleman, J. J., Shang, W., Hu, X. Rapid and sensitive detection of Verticillium dahliae from complex samples using CRISPR/Cas12a technology combined with RPA. Plant Dis. 107 (6), 1664-1669 (2023).
  16. Sun, X., et al. Rapid and sensitive detection of two fungal pathogens in soybeans using the recombinase polymerase amplification/CRISPR-Cas12a method for potential on-site disease diagnosis. Pest Manag Sci. 80 (3), 1168-1181 (2024).
  17. Chen, Z., et al. A frontline, rapid, nucleic acid-based Fusarium circinatum detection system using CRISPR/Cas12a combined with recombinase polymerase amplification. Plant Dis. 107 (6), 1902-1910 (2023).
  18. Mu, K., et al. CRISPR-Cas12a-based diagnostics of wheat fungal diseases. J Agric Food Chem. 70 (23), 7240-7247 (2022).
  19. Li, Y., et al. Visual detection of Fusarium temperatum by using CRISPR-Cas12a empowered LAMP assay coupled with AuNPs-based colorimetric reaction. LWT. 185, 115190(2023).
  20. Liang, X., et al. Development of an RPA-based CRISPR/Cas12a assay in combination with a lateral flow strip for rapid detection of toxigenic Fusarium verticillioides in maize. Food Control. 157, 110172(2024).
  21. Matthews, M. C., et al. A combined recombinase polymerase amplification CRISPR/Cas12a assay for detection of Fusarium oxysporum f. sp. cubense tropical race 4. Sci Rep. 15 (1), 2436(2025).
  22. RNA Clean & Concentrator-5: Instruction Manual Version 3.1.3. , Zymo Research Corporation. Irvine, CA. (2023).
  23. Genie III user manual, instrument software version v3.18.2. , Optigene. Horsham, U.K. (2021).
  24. Li, S. Y., et al. CRISPR-Cas12a-assisted nucleic acid detection. Cell Discov. 4, 1-4 (2018).
  25. Magdama, F., et al. Comparative analysis uncovers the limitations of current molecular detection methods for Fusarium oxysporum f. sp. cubense race 4 strains. PLoS One. 14 (9), e0222727(2019).
  26. Mckillop, C. Independent review blames unreliable test, not Biosecurity Queensland, for false Panama diagnosis. , ABC News, Australia. (2016).
  27. Mckillop, C., Craig, Z. Quarantine lifted on Mareeba banana farm suspected of having Panama disease. , ABC News, Australia. (2015).
  28. Wang, B., et al. Cas12aVDet: A CRISPR/Cas12a-based platform for rapid and visual nucleic acid detection. Anal Chem. 91 (19), 12156-12161 (2019).
  29. Fozouni, P., et al. Amplification-free detection of SARS-CoV-2 with CRISPR-Cas13a and mobile phone microscopy. Cell. 184 (2), 323-333 (2021).
  30. Ding, X., et al. Ultrasensitive and visual detection of SARS-CoV-2 using all-in-one dual CRISPR-Cas12a assay. Nat Commun. 11 (1), 4711(2020).
  31. Parida, M., Sannarangaiah, S., Dash, P. K., Rao, P. V., Morita, K. Loop-mediated isothermal amplification (LAMP): A new generation of innovative gene amplification technique; perspectives in clinical diagnosis of infectious diseases. Rev Med Virol. 18 (6), 407-421 (2008).
  32. Zeng, R., et al. CRISPR-Cas12a-driven MXene-PEDOT:PSS piezoresistive wireless biosensor. Nano Energy. 82, 105711(2021).
  33. Zhang, J., et al. Rapid and sensitive detection of toxigenic Fusarium asiaticum integrating recombinase polymerase amplification, CRISPR/Cas12a, and lateral flow techniques. Int J Mol Sci. 24 (18), 14134(2023).
  34. Manzo-Sánchez, G., Orozco-Santos, M., Martínez-Bolaños, L., Garrido-Ramírez, E., Canto-Canche, B. Diseases of quarantine and economic importance in banana tree (Musa sp.) in México. Rev Mex Fitopatol. 32 (2), 89-107 (2014).
  35. Blomme, G., et al. Bacterial diseases of bananas and enset: Current state of knowledge and integrated approaches toward sustainable management. Front Plant Sci. 8, 1290(2017).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

Fusarium Oxysporum RPA Cas12a DNA
مقايسة تضخيم بوليميراز إعادة التركيب المركبة CRISPR / Cas12a للكشف عن Fusarium oxysporum f. sp. cubense العرق الاستوائي 4
اتصل بنا
أوصِ بها للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

2026 © حقوق الطبع والنشر MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.