Method Article

التطبيع القائم على MTT لإطلاق الجلسرين من أجل القياس الكمي الدقيق لتحلل الدهون في الخلايا الشحمية البربخية الأولية للفئران

DOI:

10.3791/68853

⸱

September 9th, 2025

 ,  ,  ,  , 
1College of Bee Science and Biomedicine, Fujian Agriculture and Forestry University, 2School of Pharmacy and Medical Technology, Putian University, 3School of Medicine, Huaqiao University, 4Department of Pharmacy, Taining County General Hospital, 5School of Pharmacy, Fujian Medical University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تعيق القطع الأثرية التجريبية ، بما في ذلك التقلبات في صلاحية الخلية وتداخل الفحص ، التقدير الكمي الدقيق لإفراز الجلسرين في الخلايا الشحمية الأولية الغنية بالدهون. للتخفيف من هذه التحديات ، يتم استخدام استراتيجية تطبيع قائمة على MTT لضبط قياسات الجلسرين لنشاط التمثيل الغذائي للخلية ، وبالتالي تعزيز موثوقية القياس الكمي لتحلل الدهون.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تحلل الدهون ، وهو مسار استقلابي مهم ، ينطوي على التحلل المائي للدهون الثلاثية المخزنة إلى أحماض دهنية حرة وجلسرين. ومع ذلك ، غالبا ما يتم الخلط بين القياس الكمي الدقيق لإخراج الجلسرين في الخلايا الشحمية الأولية الغنية بالدهون بسبب القطع الأثرية التجريبية ، مثل التباين في قابلية الخلية للبقاء وتداخل الفحص. لمعالجة هذه القيود ، تم إنشاء طريقة مباشرة لتطبيع قياسات إطلاق الجلسرين باستخدام مقايسة جدوى الخلية القائمة على 3- (4،5-ثنائي ميثيل ثيازول-2-يل) -2،5-ثنائي فينيل تترازوليوم بروميد (MTT). يستفيد هذا البروتوكول من الفرق في الثقل النوعي بين الخلايا الشحمية والمحاليل المائية ، مما يتيح القياس الكمي المتزامن للناتج الدهني وصلاحية الخلية. في تجارب فحص الأدوية ، عزز برافاستاتين وسيمفاستاتين بشكل كبير إفراز الجلسرين من الخلايا الشحمية في البطن ، في حين أن أتورفاستاتين ولوفاستاتين لم يغير بشكل كبير ناتج الجلسرين. تشير هذه النتائج إلى أن التطبيع القائم على MTT يوفر نهجا قويا ومريحا لقياس تحلل الدهون بدقة ، مع تطبيقات محتملة في اكتشاف الأدوية التي تستهدف السمنة ومتلازمة التمثيل الغذائي. تؤكد هذه الدراسة على الحاجة إلى إعادة تقييم فحوصات تحلل الدهون التقليدية للتمييز بين الاستجابات الأيضية الحقيقية وتسرب الغشاء غير المحدد.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يمكن تقسيم الأنسجة الدهنية إلى أنسجة دهنية بيضاء (WAT) وأنسجة دهنية بنية (BAT) 1. يؤدي WAT وظيفة تخزين الطاقة الزائدة كدهون ثلاثية ، بينما BAT لها وظيفة توليد الحرارة للحفاظ على درجة حرارة الجسم ، والتي تحول الطاقة الكيميائية إلى طاقة حرارية تحت تحفيز البرد1. الأنسجة الدهنية لديها أيضا وظيفة الغدد الصماء2. يمكن أن يفرز مجموعة متنوعة من الهرمونات والسيتوكينات والمستقلبات (يشار إليها مجتمعة باسم الأديبوكينات) ، والتحكم في توازن الطاقة في الجسم عن طريق تنظيم سلوك البحث عن الطعام من الجهاز العصبي المركزي والنشاط الأيضي للأنسجة المحيطة2.

تحلل الدهون هو عملية تحلل مائي خطوة بخطوة للدهون داخل الخلايا تحت تأثير سلسلة من الإنزيمات الدهنية3،4. في الخلايا الشحمية ، يتم تخزين الدهون بشكل أساسي في قطرات الدهون على شكل الدهونالثلاثية 5. يتم تغطية قطرات الدهون بعائلة البروتين المرتبط بالقطرات الدهنية ، والذي يمنع التحلل المائي للدهون الثلاثية بواسطة الإنزيمات السليلية6،7. ومع ذلك ، عندما يتم تعزيز إشارة تحلل الدهون ، تنخفض مستويات التعبير عن عائلة perilipin في الخلايا الشحمية ، وتدخل الإنزيمات الدهنية قطرات الدهون3،4. وبالتالي ، تتحلل الدهون الثلاثية إلى جلسرين وأحماض دهنية حرة3،4،5.

تحلل الدهون ، تكسير الدهون الثلاثية المخزنة إلى جلسرين وأحماض دهنية حرة ، هي عملية أساسية في استقلاب الخلايا الشحمية8. في حين أن القياس المباشر لمنتجات تحلل الدهون مثل الجلسرين يوفر رؤى قيمة ، إلا أن القياس الكمي الدقيق كان يمثل تحديا ، لا سيما في الخلايا الشحمية الأولية المعلقة بسبب الأخطاء التشغيلية الناشئة عن الاختلافات في أعداد الخلايا بين المجموعات التجريبية. هدفت هذه الدراسة إلى مواجهة هذا التحدي من خلال استخدام مقايسة جدوى الخلية لتطبيع القياس الكمي لإفراز الجلسرين من الخلايا الشحمية الأولية في بطن الفئران. من خلال توحيد طريقة القياس ، تم تطبيق مقايسة إطلاق الجلسرين الطبيعي كأداة محتملة لاكتشاف الأدوية التي تستهدف السمنة ومتلازمة التمثيل الغذائي في الخلايا الشحمية.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يستفيد هذا البروتوكول من الفرق في الثقل النوعي بين الخلايا الشحمية والمحاليل المائية لتمكين القياس المتزامن لإفراز الجلسرين (كمؤشر على تحلل الدهون) و 3- (4،5-ثنائي ميثيل ثيازول-2-يل) -2،5-ثنائي فينيل رباعي زوليوم بروميد (MTT) في نفس الآبار لصفيحة مكونة من 96 بئرا ، وبالتالي تبسيط سير العمل التجريبي وتعزيز الكفاءة.

امتثلت جميع الإجراءات الحيوانية لإرشادات ARRIVE وتم إجراؤها وفقا لدليل المعاهد الوطنية للصحة لرعاية واستخدام المختبر (منشور المعاهد الوطنية للصحة رقم 8023 ، المنقح عام 1978). تمت الموافقة على بروتوكول الدراسة من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدامها (رقم الموافقة 202112 ، تمت الموافقة عليه في 5 مايو 2021). كان عمر ذكور فئران Wistar المستخدمة في هذه الدراسة 8 أسابيع على الأقل مع أوزان جسم ≥200 غرام في ظل ظروف السكن القياسية. تم جمع الأنسجة الدهنية البيضاء البربخية بإنتاجية نموذجية تتراوح من 0.6-0.8 جم لكل فأر. والجدير بالذكر أن الفئران الأكبر سنا أو أولئك الذين يتغذون على أنظمة غذائية غنية بالدهون أظهروا زيادة ملحوظة في كتلة الأنسجة الدهنية البيضاء (غالبا 1.5-3 جم) ، مما يتطلب تعديلا نسبيا لتركيزات إنزيم الهضم (على سبيل المثال ، الكولاجيناز) للحفاظ على كفاءة تفكك الأنسجة المتسقة. تجنب الاستخدام الحصري للفئران الذكور الآثار المربكة المحتملة من التقلبات الهرمونية لدورة الشبق الأنثوية. تم الحفاظ على اختيار السلالة (على سبيل المثال ، Sprague-Dawley أو Wistar أو Long-Evans) باستمرار في التجارب لضمان التوحيد الجيني في استجابات الأنسجة الدهنية. يتم سرد الكواشف والمعدات المستخدمة في جدول المواد.

1. عزل الخلايا الشحمية الأولية للفئران البطن

  1. قم بتخدير ذكر فأر Wistar البالغ بحقنة داخل الصفاق بنسبة 7٪ هيدرات الكلورال (مذاب في H2O المقطر) (باتباع البروتوكولات المعتمدة مؤسسيا).
  2. تأكد من التخدير الكامل عن طريق التحقق من عدم وجود استجابات انعكاسية ، ثم قم بعمل شق في خط الوسط في البطن باستخدام مقص جراحي معقم.
  3. قم بإزالة الأنسجة الدهنية الحشوية بعناية من الجانبين الأيسر والأيمن من وسادة الدهون البربخية.
    ملاحظة: الخلايا الشحمية البربخية كبيرة نسبيا وطافية ، مما يسهل الفصل والتحليل.
  4. نقل الأنسجة التي تم جمعها إلى محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS; الشكل 1 أ).
  5. اغسل الأنسجة مرتين باستخدام PBS لإزالة الشوائب ، بما في ذلك الأوعية الدموية الملتصقة والجلطات الدموية.
  6. قطع المناديل المغسولة إلى قطع صغيرة.

2. تنقية الخلايا الشحمية البطن الأولية للفئران

  1. احتضان الأنسجة الدهنية المشرحة بالتربسين والكولاجيناز من النوع الثاني (10 ملغ في محلول تربسين 10 مل) عند 37 درجة مئوية لمدة ساعتين تحت الرج.
  2. قم بتصفية الأنسجة الدهنية المهضومة من خلال مصفاة خلية (الشكل 1 أ).
  3. قم بالطرد المركزي للمرشح عند 120 × جم لمدة 3 دقائق في درجة حرارة الغرفة لإزالة النشاط الأنزيمي المتبقي.
  4. انقل الخلايا الشحمية المعلقة (الطبقة البيضاء العليا) إلى أنبوب نظيف واغسلها باستخدام PBS.
  5. قم بالطرد المركزي للمرشح عند 120 × جم لمدة 3 دقائق في درجة حرارة الغرفة لإزالة PBS.
  6. احتضان الخلايا الشحمية المفلترة (الطبقة البيضاء العليا) في وسط النسر المعدل (DMEM) من Dulbecco المكمل ب 10٪ مصل أبقار الجنين (FBS) و 1٪ محلول البنسلين والستربتومايسين لمدة لا تزيد عن 30 دقيقة.

3. تحليل إطلاق الجلسرين

  1. زرع الخلايا الشحمية المفلترة (104-10 5 خلايا لكل بئر ؛ 200 ميكرولتر) في صفيحة زراعة الخلايا المكونة من 96 بئرا.
    ملاحظة: تم قياس الخلايا الشحمية باستخدام مقياس الخلايا الدموية القياسي. نظرا للتباين الكبير في حجم الخلايا الشحمية ، لا يمكن حساب بعض الخلايا الكبيرة بدقة. لذلك ، قد لا يعكس عدد الخلايا بدقة العدد الفعلي للخلايا الشحمية. كان الهدف الرئيسي هو تحقيق توزيع متساو للخلايا عبر الآبار بدلا من القياس الكمي الدقيق.
  2. عالج الخلايا الشحمية بثنائي ميثيل سلفوكسيد 0.05٪ (DMSO؛ كمجموعة تحكم) و 50 ميكروموتر أتورفاستاتين، برافاستاتين، لوفاستاتين، وسيمفاستاتين لمدة 4 ساعات عند 37 درجة مئوية تحت الاهتزاز اللطيف.
    ملاحظة: يتم توفير شروط العلاج هذه كمرجع ويمكن تعديلها حسب الحاجة بناء على الأهداف المحددة وتصميم التجربة.
  3. اجمع وسط زراعة الخلايا (الطبقة الحمراء السفلية) لتحليل إطلاق الجلسرين ، مما يشير إلى ظهور تحلل الدهون (الشكل 1 ب).
  4. استخدم مجموعة أدوات فحص إطلاق الجلسرين التجارية لتقييم تحلل الدهون في الخلايا الشحمية استجابة للعلاجات المختلفة.
  5. قم بقياس الامتصاص عند 570 نانومتر باستخدام قارئ صفيحة دقيقة.

4. تحليل بقاء الخلية

  1. قم بإذابة مسحوق MTT بتركيز 5 مجم / مل في H₂O المقطر وتعقيمه من خلال مرشح 0.22 ميكرومتر قبل الاستخدام.
  2. بعد تحليل إفراز الجلسرين ، أضف محلول MTT (إلى 0.5 مجم / مل نهائي) إلى الخلايا واحتضان عند 37 درجة مئوية لمدة ساعتين.
  3. انقل الخلايا الشحمية العالقة (الطبقة الأرجوانية العليا) إلى أنبوب نظيف يحتوي على DMSO لتحليل صلاحية الخلية (الشكل 1 ب).
  4. دوامة لفترة وجيزة لذوبان بلورات الفورمازان الأرجواني المتكونة.
  5. قم بقياس الامتصاص عند 570 نانومتر باستخدام قارئ صفيحة دقيقة.

5. حساب التطبيع

  1. قم بإجراء جميع التجارب ثلاث مرات وكرر أربع مرات (ن = 4).
    ملاحظة: لكل تجربة مستقلة (ن = 4) ، تم عزل الخلايا الشحمية من ثلاثة فئران ، وتم إجراء كل حالة علاج في ثلاث نسخ.
  2. لكل مجموعة علاجية ، قسم قيمة امتصاص إطلاق الجلسرين على قيمة امتصاص صلاحية الخلية المقابلة.
  3. قدم البيانات كمتوسط ± الانحراف المعياري (SD).
    ملاحظة: تم حساب المتوسط و SD باستخدام Microsoft Excel مع الدالتين = AVERAGE (نطاق) و = STDEV. S (نطاق). بالنسبة للمقارنات الجماعية ، تم إجراء اختبارات t ثنائية الذيل غير المزاوجة باستخدام GraphPad Prism 6 مع اختبار الوظيفة t لوسائل المقارنة.
  4. تحديد الدلالة الإحصائية للاختلافات بين المجموعات باستخدام اختبار t للطالب ، حيث تعتبر قيمة P أقل من 0.05 ذات دلالة إحصائية.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

بعد الفحص الأولي للأدوية ، تم استخدام العقاقير المخفضة للكوليسترول المضادة لفرط شحميات الدم للتحقيق في آثار تحلل الدهون في الخلايا الشحمية بطريقة إطلاق الجلسرين الطبيعي9.

تأثير العقاقير المخفضة للكوليسترول على إطلاق الجلسرين من الخلايا الشحمية البطن الأولية للفئران
تم تقييم تأثير العصور المخفضة للكولكول على تحلل الدهون في الخلايا الشحمية البطنية الأولية للفئران عن طريق معالجة الخلايا ب 50 ميكرومتر من البرافاستاتين ، سيمفاستاتين ، أتورفاستاتين ، لوفاس...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

توفر هذه الدراسة طريقة أكثر دقة لقياس تحلل الدهون في الخلايا الشحمية الأولية المحملة بالدهون. تم العثور على برافاستاتين وسيمفاستاتين للحث على إفراز الجلسرين وتقليل الجدوى في الخلايا الشحمية البربخية للفئران ، في حين لم يظهر أتورفاستاتين ولوفاستاتين أي آثار ذات دلالة. أدى إعطاء سيمفاستاتين إلى ارتفاع طفيف في إفراز الجلسرين من الخلايا الشحمية. لمعالجة هذه المشكلة ، تم استخدام مقايسة MTT لتوحيد قياس تحلل الدهون. كشف هذا النهج عن تحسن كبير في تقييم التأثير الدهني الناجم عن كل من البرافاستاتي...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعلن المؤلفون عن عدم وجود مصالح مالية أو شخصية متنافسة يمكن أن تؤثر على العمل المبلغ عنه في هذه الدراسة.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم دعم هذا العمل من قبل جامعة فوجيان للزراعة والغابات وجامعة بوتيان (وكلاهما من ليو تسوي).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
0.22 - وميكرو ؛ مرشح مسانغون للتكنولوجيا الحيوية المحدودةF513165-0001مرشح حقنة ، نظام aquo ، معقم
3- (4،5-ثنائي ميثيل ثيازول -2-يل) -2،5-ثنائي فينيل رباعي الزوليوم بروميد   ؛سانغون للتكنولوجيا الحيوية المحدودةA600799-00011 جرام
96 بئر صفائح زراعة الخلايا   ؛سانغون للتكنولوجيا الحيوية المحدودةF603204-0001عقيم
ملح الكالسيوم أتورفاستاتينكايمان كيميكال10493-55 مجم
مصفاة الخلية   ؛سانغون للتكنولوجيا الحيوية المحدودةF513450-000180 شبكة شاشة
هيدرات الكلورالسانغون للتكنولوجيا الحيوية المحدودةA500288-0250250 جرام
ثنائي ميثيل سلفوكسيدسانغون للتكنولوجيا الحيوية المحدودةA460700-0100100 مل
Dulbecco's Modified Eagle Medium سانغون للتكنولوجيا الحيوية المحدودةE600003500 مل ، عالي الجلوكوز ، معقم
مصل أبقار الجنينسانغون للتكنولوجيا الحيوية المحدودةE600001100 مل ، معقم
طقم فحص القياس اللوني الجلسرينكايمان كيميكال10010755-9696 بئرا
لوفاستاتينكايمان كيميكال10010338-55 مجم
ذكور الفئران البالغة   ؛جامعة بوتيانويستارحوالي 10-12 أسبوعا
محلول البنسلين والستربتومايسين سانغون للتكنولوجيا الحيوية المحدودةB540732-001010 مل ، معقم
محلول ملحي من الفوسفاتسانغون للتكنولوجيا الحيوية المحدودةE607009-0500500 مل ، معقم ، بدون كالسيوم أو مغنيسيوم
ملح الصوديوم برافاستاتينكايمان كيميكال10010343-55 مجم
Simvastatin كايمان كيميكال10010344-55 مجم
محلول التربسين   ؛سانغون للتكنولوجيا الحيوية المحدودةE607003-0100100 مل ، بدون EDTA والفينول الأحمر ، معقم
النوع الثاني من الكولاجيناز   ؛سانغون للتكنولوجيا الحيوية المحدودةA004174-0100100 مجم

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Saely, C. H., Geiger, K., Drexel, H. Brown versus white adipose tissue: A mini-review. Gerontology. 58 (1), 15-23 (2012).
  2. Ahima, R. S., Flier, J. S. Adipose tissue as an endocrine organ. Trends Endocrinol Metab. 11 (8), 327-332 (2000).
  3. Lass, A., Zimmermann, R., Oberer, M., Zechner, R. Lipolysis - A highly regulated multi-enzyme complex mediates the catabolism of cellular fat stores. Prog Lipid Res. 50 (1), 14-27 (2011).
  4. Zechner, R., et al. FAT SIGNALS - lipases and lipolysis in lipid metabolism and signaling. Cell Metab. 15 (3), 279-291 (2012).
  5. Duncan, R. E., Ahmadian, M., Jaworski, K., Sarkadi-Nagy, E., Sul, H. S. Regulation of lipolysis in adipocytes. Annu Rev Nutr. 27, 79-101 (2007).
  6. Blanchette-Mackie, E. J., et al. Perilipin is located on the surface layer of intracellular lipid droplets in adipocytes. J Lipid Res. 36 (6), 1211-1226 (1995).
  7. Sztalryd, C., Brasaemle, D. L. The perilipin family of lipid droplet proteins: Gatekeepers of intracellular lipolysis. Biochim Biophys Acta Mol Cell Biol Lipids. 1862 (10 Pt B), 1221-1232 (2017).
  8. Schweiger, M., et al. Measurement of lipolysis. Methods Enzymol. 538, 171-193 (2014).
  9. Mangione, C. M., et al. Statin use for the primary prevention of cardiovascular disease in adults: us preventive services task force recommendation statement. Jama. 328 (8), 746-753 (2022).
  10. Grabner, G. F., Xie, H., Schweiger, M., Zechner, R. Lipolysis: cellular mechanisms for lipid mobilization from fat stores. Nat Metab. 3 (11), 1445-1465 (2021).
  11. Roh, E., Yoo, H. J. The role of adipose tissue lipolysis in diet-induced obesity: Focus on vimentin. Diabetes Metab J. 45 (1), 43-45 (2021).
  12. Vaughan, M. The production and release of glycerol by adipose tissue incubated in vitro. J Biol Chem. 237, 3354-3358 (1962).
  13. Ghasemi, M., Turnbull, T., Sebastian, S., Kempson, I. The MTT assay: Utility, limitations, pitfalls, and interpretation in bulk and single-cell analysis. Int J Mol Sci. 22 (23), 12827(2021).
  14. Miller, C. N., et al. Isoproterenol increases uncoupling, glycolysis, and markers of beiging in mature 3T3-L1 adipocytes. PLoS One. 10 (9), e0138344(2015).
  15. Ghaben, A. L., Scherer, P. E. Adipogenesis and metabolic health. Nat Rev Mol Cell Biol. 20 (4), 242-258 (2019).
  16. Dias, S., Paredes, S., Ribeiro, L. Drugs involved in dyslipidemia and obesity treatment:Focus on adipose tissue. Int J Endocrinol. 2018, 2637418(2018).
  17. Redberg, R. F. Statins and weight gain. JAMA Intern Med. 174 (7), 1046(2014).
  18. Ferrieres, J., et al. Body mass index impacts the choice of lipid-lowering treatment with no correlation to blood cholesterol - Findings from 52,916 patients in the Dyslipidemia International Study (DYSIS). Diabetes Obes Metab. 20 (11), 2670-2674 (2018).
  19. Chait, A., Jden Hartigh, L. J. Adipose tissue distribution, inflammation and its metabolic consequences, including diabetes and cardiovascular disease. Front Cardiovasc Med. 7, 22(2020).
  20. Kahn, C. R., Wang, G., Lee, K. Y. Altered adipose tissue and adipocyte function in the pathogenesis of metabolic syndrome. J Clin Invest. 129 (10), 3990-4000 (2019).
  21. Reiter-Brennan, C., et al. ACC/AHA lipid guidelines: Personalized care to prevent cardiovascular disease. Cleve Clin J Med. 87 (4), 231-239 (2020).
  22. Sahebkar, A., et al. Statin therapy and plasma free fatty acids: a systematic review and meta-analysis of controlled clinical trials. Br J Clin Pharmacol. 81 (5), 807-818 (2016).
  23. Zhai, W., et al. Increased lipolysis in adipose tissues is associated with elevation of systemic free fatty acids and insulin resistance in perilipin null mice. Horm Metab Res. 42 (4), 247-253 (2010).
  24. Teusink, B., et al. Contribution of fatty acids released from lipolysis of plasma triglycerides to total plasma fatty acid flux and tissue-specific fatty acid uptake. Diabetes. 52 (3), 614-620 (2003).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Lipolysis QuantificationGlycerol ReleaseMTT AssayCell ViabilityPrimary AdipocytesRat Epididymal AdipocytesTriglyceride HydrolysisDrug ScreeningStatin EffectsMetabolic Syndrome

Related Articles