يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

قياس نفاذية الحاجز المعوي عن طريق الكشف عن تدفق متتبعات الفلورسنت عبر الطبقات الأحادية للقولون البشري

1K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/68857

⸱

أكتوبر 17, 2025

 ,  , 
1Department of Pediatrics, Division of Gastroenterology, Hepatology and Nutrition, Children's Hospital Colorado, 2Department of Medicine, Mucosal Inflammation Program, Division of Gastroenterology and Hepatology, University of Colorado, 3Rocky Mountain Veterans Hospital

في هذه المقالة

ملخص

نصف تقنية لقياس سلامة الحاجز المعوي ، حيث يعكس معدل نقل السكر الموسوم بالفلورسنت بحجم معروف نفاذية القولون المعوي البشري المشتق من الأنسجة.

الملخص

يعد الحاجز المعوي موقعا مهما للتنظيم بين المستضدات اللمعة والجهاز المناعي المضيف ، ويتورط خلل تنظيمه في أمراض الجهاز الهضمي المتعددة. يمكن أن تكون العضيات المعوية أداة مفيدة لفهم ونمذجة الاختلافات في سلامة الحاجز المعوي. هنا ، نصف بروتوكولا يستخدم القولون البشري لتحديد الاختلافات في الحاجز المعوي الوظيفي عن طريق قياس تدفق متتبعات الفلورسنت عبر الطبقات الأحادية العضوية. بعد نمو الطبقات الأحادية للالتقاء ، نضيف متتبع الفلورسنت ، مثل FITC-dextran ، إلى الغرفة القمية ونكتشف انتقالها إلى الغرفة القاعدية بمرور الوقت. يعكس النقل المتزايد لمتتبع الفلورسنت حاجزا ظهاريا أكثر نفاذية أو أضعف. هذا البروتوكول عبارة عن منصة قابلة للتكيف تسمح بتقييم اختلافات الحاجز المعوي الوظيفي عبر ظروف متعددة بالتوازي. باستخدام الاختلافات في هذا البروتوكول ، يمكن للمرء تقييم النفاذية عبر الظهارة للجزيئات ذات الأحجام والأشكال والتركيب الكيميائي المختلفة ، بالإضافة إلى اختلافات النفاذية في سياق العلاجات المعزولة أو التغيرات البيئية الدقيقة على الجانبين القمي أو القاعدي الجانبي للخلايا الظهارية. هذا يسمح بفهم أعمق لآلية وعلاج اضطراب الحاجز في حالات المرض.

المقدمة

الغشاء المخاطي للأمعاء هو بنية معقدة تلعب دورا مهما في تنظيم التلامس بين المستقلبات والمستضدات والميكروبات في تجويف الأمعاء والجهاز المناعي والدورة الدموية المعوية. تعد الخلايا الظهارية المعوية مكونا رئيسيا لهذا النظام ، وفي الظروف الصحية ، تشكل حاجزا انتقائيا للغاية. يمكن أن يحدث النقل عبر الظهارة من خلال آليات متعددة: النقل النشط أو السلبي عبر الخلايا ، أو مسارات المسام أو التسرب شبه الخلوية التي تنظمها تقاطعات ضيقة وتقاطعات ملتصقة. يتم تحديد ما إذا كان يمكن استخدام أي من هذه المسارات بواسطة جزيء للانتقال عبر الظهارة من خلال الكراهية للماء والحجم والتركيب الكيميائي. بمجرد عبور الظهارة ، يمكن لهذه الجزيئات أن تتفاعل بسهولة أكبر مع الخلايا المناعية المخاطية وتدخل الدورة الدموية أو الدورة اللمفاوية للأمعاء1،2 يعد اضطراب الحاجز المعوي سمة مميزة للعديد من أمراض الجهاز الهضمي الالتهابية ، مثل مرض التهاب الأمعاء ومرض الاضطرابات الهضمية1،3،4،5،6،7. يعتقد أن هذا الحاجز المعوي الضعيف يلعب دورا في الفيزيولوجيا المرضية لهذه العمليات المرضية من خلال النقل غير المنظم للمستضدات المسببة للأمراض ، والتي يمكن أن تخلق بعد ذلك استجابة التهابية موضعية أو جهازية.

هناك العديد من البروتوكولات المعمول بها لقياس الحاجز المعوي. تستخدم الدراسات في المختبر تقليديا خطوط الخلايا السرطانية ، مثل خلايا T84 أو Caco-2 ، لقياس المقاومة الكهربائية عبر الظهارة (TEER) وتحديد كمية الوصلة الضيقة ومكونات الوصلة الملتصقة8. خارج الجسم الحي ، يمكن إجراء قياسات للتيار عبر الظهارة باستخدام غرف Ussing على الخزعة أو عينات الأمعاء المقطوعة9. تتضمن الدراسات في الجسم الحي عادة إعطاء أدوات تتبع خاملة عن طريق الفم ، ثم قياس امتصاص الدم أو البول لهذه المتتبعات10،11. على الرغم من أن هذه التقنيات أثبتت فائدتها في دراسة الحاجز المعوي ، إلا أنها تقدم العديد من القيود: خطوط الخلايا الخالدة المحولة بطبيعتها لها تغيرات في التمثيل الغذائي والهيكل الخلوي تؤثر على الحاجز المعوي بطرق سيئة التحديد. يمكن أن يكون الوصول إلى المرضى أو عينات المرضى أو الكائنات الحية النموذجية محدودا. يصعب التحكم في الدراسات في الجسم الحي للعوامل المربكة أو التوصل إلى استنتاجات على المستوى الجزيئي. وبالتالي ، على الرغم من الإبلاغ عن أدلة على اضطراب الحاجز هذا في نماذج أمراض متعددة ، إلا أن فهم آلية عيوب الحاجز المعوي لا يزال محدودا ، وظلت قدرتنا على استهداف وعلاج هذا الجانب من أمراض الجهاز الهضمي بعيدة المنال.

توفر العضيات المعوية البشرية قدرة فريدة ومثيرة لتوضيح سبب وعلاج عيوب الحاجز المعوي. العضيات المعوية البشرية المشتقة من الأنسجة هي مزارع خلايا أولية مشتقة من الخلايا الجذعية البالغة الموجودة في قاعدة الخبايا المعوية12. يمكن عزل هذه الخلايا من الخزعة أو العينات الجراحية وزراعتها للحفاظ على التغيرات الجينية والجينية التي شوهدت في المرضى الذين اشتقت منهم13،14،15. إنها بمثابة نموذج أكثر صلة من الناحية الفسيولوجية من خطوط الخلايا الخالدة التقليدية لأنها لا تحتوي على التغيرات الأيضية لخطوط الخلايا السرطانية ويمكن تمييزها إلى أنواع الخلايا المختلفة الموجودة في ظهارة الأمعاء الناضجة16،17،18. بالإضافة إلى ذلك ، نظرا لأنه يمكن توسيعها في المختبر ، فهي أكثر سهولة ومفيدة للدراسات الخاضعة للرقابة للتأثير الخلوي لمختلف العلاجات وظروف النمو بالتوازي. على الرغم من وجود قيود متأصلة في النماذج العضوية المعوية أيضا ، وأبرزها عدم وجود أنواع الخلايا الأخرى غير الظهارية وسياق نظام الجسم كله ، فقد ثبت أن العضيات المعوية البشرية توفر نموذجا موثوقا به لجوانب متعددة من أمراض الجهاز الهضمي13.

من بين هؤلاء ، ثبت أن العضيات المعوية تقوم بنمذجة عيوب الحاجز المعوي عن كثب ، مما يدل على التغييرات المتوقعة في تنظيم الوصلة الضيقة و TEER في وضع إهانات الحاجز19،20،21. هنا ، نقوم بتكييف تقنية واحدة لتقييم سلامة الحاجز في القولون البشري ، حيث يتم الكشف عن تدفق الجزيئات الموسومة بالفلورسنت عبر الطبقات الأحادية العضوية22. في هذا البروتوكول ، تزرع العضيات وتنضج إلى طبقات أحادية ثنائية الأبعاد مستقطبة على أغشية شبه منفذة. يستلزم الفحص إضافة متتبع فلوري إلى السطح القمي للطبقة الظهارية الأحادية ، ويتم قياس وجوده على الجانب الآخر بمرور الوقت. يعكس تدفق التتبع المتزايد ظهارة أكثر تسربا أو نفاذية. يوفر هذا الفحص قراءة حاجز وظيفي ، والتي يمكن أن تكون مضافة لتقييمات هيكل التقاطعات الضيقة والملتزمة. بالإضافة إلى ذلك ، على الرغم من أن قياسات TEER غالبا ما تستخدم لتوفير تقييم أساسي لسلامة الحاجز ، إلا أن مقايسة التدفق الموصوفة هنا يمكن تكييفها للكشف عن نفاذية الجزيئات من مختلف الفئات والشحنة والحجم ، وبالتالي توصيف الحاجز بمزيد من التفصيل. يمكن استخدام العديد من أجهزة تتبع الفلورسنت المتوفرة تجاريا لهذا الغرض. علاوة على ذلك ، من خلال استخدام أطياف الفلورسنت غير المتداخلة ، يمكن تقييم النفاذية لأجهزة تتبع متعددة في وقت واحد. علاوة على ذلك ، يسمح التكوين أحادي الطبقة لهذا الاختبار بتقييم استجابة الحاجز لظروف النمو المطبقة على وجه التحديد على السطح القمي أو القاعدي الجانبي للخلايا فقط. مع هذا ، يمكن إجراء تقييم متحكم فيه لتأثير العلاجات والتغيرات البيئية الدقيقة وظروف الزراعة المشتركة.

من المعروف أن عيوب الحاجز المعوي تلعب دورا مهما في الإصابة بالعديد من أمراض الجهاز الهضمي ، ولكن يستخدم مصطلح "الأمعاء المتسربة" بشكل متزايد في وسائل الإعلام الشعبية دون الدقة23 ، وكانت الجهود المبذولة لاستهداف الحاجز المعوي المعيب محدودة في النجاح. هذا يسلط الضوء على الحاجة إلى نماذج محسنة لتقييم وتوصيف الحاجز المعوي. يستخدم النظام الموصوف طبقات أحادية عضوية معوية مشتقة من الأنسجة البشرية الفسيولوجية لتقييم سلامة الحاجز الوظيفي في ظل ظروف خاضعة للرقابة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

تم الحصول على جميع العينات واستخدامها وفقا لبروتوكول معتمد من قبل مجلس المراجعة المؤسسية بجامعة كولورادو (IRB) ، البروتوكول رقم 14-2012.

ملاحظة: يجب أن تتم جميع الإجراءات الواردة في الخطوات 1-3 في خزانة معقمة للسلامة الحيوية بتقنية معقمة. يتم عرض مخطط للبروتوكول في الشكل 1.

1. إنشاء القولون البشري من الثقافات المجمدة

ملاحظة: تأكد من أن جميع المواد جاهزة في خزانة السلامة الحيوية قبل إذابة الخلايا لتقليل تعرض العضيات المذابة لوسط التجميد. يبدأ البروتوكول بالقولون البشري المشتق من الأنسجة المبردة. تم وصف بروتوكولات اشتقاق القولون البشري وحفظه بالتبريد سابقا24.

  1. تحضير وسط الجذع العضوي المعوي البشري
    1. قم بإعداد الوسائط المكيفة Wnt-3A / Noggin / R-Spondin 3 (L-WRN) وفقا للبروتوكولات الموصوفة سابقا25،26.
    2. استكمل وسائط L-WRN بعوامل النمو التالية: عامل نمو البشرة [50 نانوغرام / مل] ، نيكوتيناميد [10 مل] ، A83-01 [500 نانومتر] ، SB202190 [10 ميكرومتر] ، CHIR99021 [3 ميكرومتر] ، ثيازوفيفين [4 ميكرومتر] ، SB431542 [4 ميكرومتر] ، جاسترين الأول [10 نانومتر].
    3. امزج وسائط L-WRN المكملة 1: 1 مع الوسائط العضوية المعوية التجارية.
    4. قبل الاستخدام مباشرة ، مكمل مع Y-27632 [10 ميكرومتر].
      ملاحظة: قد يختلف التكوين الأمثل للجذع العضوي المعوي بناء على المختبر وخط القولون. قد يكون من الممكن أيضا استخدام وسائط L-WRN المكملة وحدها أو استخدام الوسائط العضية المعوية التجارية وحدها. يعد استخدام هذا البروتوكول لأجزاء متساوية من الوسائط المكيفة L-WRN والوسائط التجارية أكثر مرونة في مواجهة التباين من دفعة إلى دفعة مقارنة باستخدام الوسائط المكيفة وحدها وهو أكثر فعالية من حيث التكلفة مقارنة باستخدام الوسائط التجارية وحدها.
  2. تحضير وسيط التمايز
    1. تكملة DMEM / F12 مع 10٪ مصل الأبقار الجنينية (FBS), 1٪ البنسلين-ستربتومايسين, و 2 ملي L-ألانيل-L-الجلوتامين ثنائي الببتيد.
    2. امزج DMEM / F12 1: 1 المكمل مع وسط جذع عضوي معوي من الخطوة 1.1
  3. تحضير المصفوفة خارج الخلية (ECM)
    1. قم بإذابة ECM طوال الليل على الجليد ، ثم قم بإعداد 100 ميكرولتر من الحصات.
      ملاحظة: يمكن إعادة تجميد Aliquots عند -20 درجة مئوية. راجع تعليمات الشركة المصنعة للحصول على التفاصيل.
    2. احتضان aliquots على الجليد حتى وقت طلاء الخلايا.
  4. ذوبان وطلاء العضيات
    1. قم بإذابة محتويات التبريد في حمام مائي بدرجة حرارة 37 درجة مئوية ، مما يضمن بقاء القارورة مغمورة ، لكن الغطاء فوق الماء ، حتى يذوب للتو.
    2. انقل محتويات القارورة إلى أنبوب مخروطي سعة 15 مل يحتوي على 13 مل من وسط DMEM / F12 المكمل بالثلج (من الخطوة 1.2.1).
    3. جهاز طرد مركزي عند 200 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية.
    4. استنشق المادة الطافية ، تاركا ما يقرب من 1 مل من الحجم المتبقي فوق حبيبات الخلية.
    5. ضع الأنبوب على الثلج. أضف 1 مل من DMEM / F12 المكمل المثلج البارد (من الخطوة 1.2.1) وقم بماصة المعلق 10-15 مرة لإعادة تعليق الحبيبات.
    6. جهاز طرد مركزي عند 200 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية.
    7. قم بإزالة المادة الطافية باستخدام ماصة ، مع ترك أقل قدر ممكن من وسائط الغسيل المتبقية فوق حبيبات الخلية.
    8. أضف 100 ميكرولتر من ECM المذابة إلى الحبيبات. أعد التعليق جيدا ، مع التأكد من تشتيت العضيات بالتساوي دون كتل. ماصة ببطء لتجنب إدخال فقاعات الهواء.
    9. لوحة ECM عن طريق سحب ما يقرب من 10 قباب أو قطرات ثلاثية الأبعاد من ECM ، حوالي 10 ميكرولتر لكل منها ، في بئر واحد من لوحة 6 آبار.
    10. اقلب اللوحة بسرعة واحتضن عند 37 درجة مئوية لمدة 5-10 دقائق أو حتى تتصلب القباب.
    11. بمجرد ضبط القباب ، أضف 2 مل من الوسائط الجذعية العضوية المعوية (من الخطوة 1.1) إلى البئر.
    12. احتضان عند 37 درجة مئوية ، في حاضنة مرطبة تحتوي على 5٪ ثاني أكسيد الكربون2. استبدل الوسائط كل يومين.
    13. تابع الخطوة 2 بمجرد أن تشغل العضيات إما أكثر من 75٪ من مساحة قبة ECM أو تتراكم الحطام المركزي.

2. مرور وتوسع القولون البشري

  1. لكل بئر ، استنشق وسائط النمو من الآبار دون تعطيل قباب ECM.
  2. اغسل القباب برفق ب 1 مل من المحلول الملحي البارد بالفوسفات المثلج (PBS) ، ثم قم بإزالة PBS.
  3. أضف 1 مل من التربسين المثلج إلى كل بئر. استخدم ماصة لتفتيت قباب ECM عن طريق سحب العينة لأعلى ولأسفل. قم بقطع الخليط 10-15 مرة لفصل ECM تماما.
  4. احتضن الطبق عند 37 درجة مئوية لمدة 3-5 دقائق.
  5. أضف 1 مل من DMEM / F12 المكمل المثلج (من الخطوة 1.2.1) إلى البئر لتحييد التربسين. قم بقطع الخليط بقوة 20-30 مرة حتى يتم تفكيك الخلايا إلى مجموعات من 2-3 خلايا لكل منها.
  6. انقل معلق الخلية إلى مخروطي 15 مل.
  7. استخدم 1 مل إضافي من DMEM / F12 المكمل (من الخطوة 1.2.1) لغسل البئر وإضافة محلول الغسيل إلى مخروطي 15 مل.
  8. أضف DMEM / F12 المكمل (من الخطوة 1.2.1) للوصول إلى الحجم الإجمالي 13 مل في الشكل المخروطي 15 مل.
  9. تابع الخطوات 1.4.3-1.4.12 من الخطوة 1 باستخدام كمية مناسبة من ECM للتوسع في آبار إضافية.
    ملاحظة: يمكن عادة تمرير بئر ملتقي من العضيات في 100 ميكرولتر ECM إلى 2-3 آبار (200-300 ميكرولتر من ECM). يكفي بئر واحد من العضيات لحوالي 3-6 طبقات أحادية في الخطوة 3.

3. جيل أحادية الطبقات القولونية البشرية

  1. إدراج ثقافة خلايا طلاء الكولاجين
    1. ضع حشوات زراعة خلايا البوليسترين (حجم المسام 0.4 ميكرومتر) في صفيحة مكونة من 24 بئرا وأضف 100 ميكرولتر من محلول طلاء الكولاجين إلى الغرفة القمية لكل إدخال.
    2. أغلق اللوحة بغشاء مانع للتسرب لمنع التبخر.
    3. احتضان عند 4 درجات مئوية لمدة 4-24 ساعة.
      ملاحظة: لا يوجد فرق في النتائج خلال وقت الحضانة هذا ، ولكن يمكن اختيار وقت حضانة أقصر أو أطول ليناسب نقطة توقف مناسبة.
  2. طلاء أحادية الطبقات العضوية
    1. اتبع الخطوات 2.1-2.5 لفصل العضيات.
    2. مرر تعليق الخلية عبر مصفاة خلية 70 ميكرومتر في أنبوب مخروطي سعة 50 مل.
    3. اشطف الآبار ب 1 مل من كل من DMEM / F12 المكمل (من الخطوة 1.2.1). اجمع وسائط الغسيل هذه وقم بتمريرها عبر مصفاة الخلية.
    4. اغسل مصفاة الخلية ب DMEM / F12 المكمل (من الخطوة 1.2.1) حتى يصل الحجم الإجمالي في الأنبوب المخروطي 50 مل إلى 15 مل.
    5. انقل المرشح إلى مخروطي 15 مل.
    6. جهاز طرد مركزي عند 200 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية.
    7. استنشق المادة الطافية ، واترك 1 مل فوق الحبيبات.
    8. أضف 1 مل إضافي من وسط DMEM / F12 المكمل (من الخطوة 1.2.1) وأعد تعليقه.
    9. افحص المعلق تحت المجهر لتأكيد التفكك الكامل. إذا لزم الأمر ، قم بماصة الخلايا بقوة حتى تصبح في الغالب خلايا مفردة.
    10. جهاز طرد مركزي عند 200 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. قم بإزالة المادة الطافية باستخدام ماصة ، مع ترك أقل قدر ممكن من وسائط الغسيل المتبقية فوق حبيبات الخلية.
    11. أعد التعليق في حجم صغير (200-1000 ميكرولتر) من وسط الجذع العضوي المعوي (من الخطوة 1.1). استمر على الجليد.
    12. خذ حصة من تعليق الخلية لاستخدامها في حساب الخلايا القابلة للحياة باستخدام الطريقة المفضلة. استخدم عدد الخلايا القابلة للحياة لتحديد حجم تعليق الخلية اللازم لطلاء 100,000 خلية قابلة للحياة لكل إدخال.
    13. استنشق محلول طلاء الكولاجين من كل ملحق دون لمس غشاء الإدخال.
    14. أضف الحجم المناسب من الوسائط الجذعية العضوية المعوية (من الخطوة 1.1) إلى الغرفة القمية لكل إدخال لرفع الحجم النهائي إلى 200 ميكرولتر بمجرد إضافة تعليق الخلية.
      ملاحظة: إذا كنت تفضل ذلك، يمكن تعديل تعليق الخلية في الخطوة 3.2.12 إلى تركيز نهائي قدره 100,000 خلية/200 ميكرولتر، ثم يمكن طلاء 200 ميكرولتر في الغرفة القمية. ومع ذلك ، إذا لم يتم استخدام تعليق الخلية بالكامل للطلاء أحادي الطبقة ، فقد يؤدي ذلك إلى إهدار مفرط للوسائط.
    15. أضف الحجم المناسب لتعليق الخلية إلى الغرفة القمية.
    16. أضف 500-1000 ميكرولتر من الوسائط الجذعية العضوية المعوية إلى الغرفة القاعدية الجانبية.
      ملاحظة: 500 ميكرولتر كافية للقولون النموذجي. إذا كانت الخلايا أكثر نشاطا من الناحية الأيضية أو حساسة لتراكم النفايات ، فقد يكون استخدام حجم أكبر في الغرفة القاعدية الجانبية مفيدا في الحفاظ على النمو.
    17. كرر مع جميع الإدخالات / الآبار.
    18. احتضان عند 37 درجة مئوية ، في حاضنة مرطبة تحتوي على 5٪ ثاني أكسيد الكربون2.
    19. استبدل الوسائط مرة واحدة في الأسبوع.
      ملاحظة: يمكن تطبيق المعالجات ذات الأهمية على الغرف القمية و / أو القاعدية الجانبية للإدخالات في أي وقت قبل أو بعد الطلاء.

4. قياس المقاومة الكهربائية عبر الظهارة (TEER) ونضج أحادي الطبقة

  1. قياس المقاومة
    1. استخدم مقياس فولت / أوم ظهاري في إعداد أوم. نظف المسبار عن طريق مسحه بمنديل مهام مبلل بنسبة 70٪ إيثانول. ضع الذراع الأطول للقطب في الحجرة القاعدية الجانبية والذراع الأقصر في الحجرة القمية للملحق. قياس القياس.
      ملاحظة: إذا كانت قياسات TEER هي أيضا نقطة نهاية ذات اهتمام ، فقم أيضا بأخذ قياسات المقاومة لملحق مطلي بالكولاجين بدون خلايا كخلفية. بعد ذلك ، يتم حساب TEER على أنه (المقاومة - مقاومة إدراج الخلفية) × مساحة سطح الإدراج. تبلغ مساحة سطح الملحق في هذا البروتوكول 0.33 سم2. سيعطي هذا الحساب TEER في أوم · سم2. إذا كنت تستخدم مقياس فولت / أوم ظهاري مختلفا عن المدرج في جدول المواد ، فاستخدم تعليمات الشركة المصنعة لاستخدام جهاز القياس لقياس المقاومة.
    2. كرر يوميا حتى تستقر القياسات.
      ملاحظة: تحدث الهضبة عادة بعد 2 إلى 3 أسابيع مع TEER أكبر من 200 أوم · سم2 ، ولكنها تختلف حسب خط القولون وظروف النمو.
  2. بمجرد أن تستقر المقاومة ، ابدأ النضج العضوي عن طريق استبدال الوسائط الجذعية بوسائط التمايز (من الخطوة 1.2).
  3. استمر في قياسات TEER اليومية. توقع زيادة في TEER وهضبة ثانية.
    ملاحظة: تحدث الهضبة الثانية عادة حوالي 7 أيام مع TEER من 1500-2500 أوم سم2 ، ولكن هذا يختلف حسب خط القولون وظروف النمو.
  4. بمجرد استقرار قياسات TEER مرة ثانية ، تابع الخطوة 5.

5. مقايسة تدفق FITC-dextran

ملاحظة: يستخدم هذا البروتوكول FITC-dextran 4 كيلو دالتون (نصف قطر ستوكس 14 Å). ومع ذلك ، اعتمادا على الاحتياجات التجريبية ، يمكن استخدام أجهزة تتبع الفلورسنت ذات الأحجام والشحنات والفلوروفورات المختلفة22. يمكن أيضا استخدام أجهزة تتبع متعددة في نفس الوقت ، وفي هذه الحالة ، يجب تأكيد أطياف الإثارة والانبعاث غير المتداخلة. يقترح تنفيذ الخطوات 5.1-5.3 في خزانة تسخين (حاضنة غير مرطبة وغير ثاني أكسيد الكربون) مضبوطة على 37 درجة مئوية. إذا لم يكن ذلك متاحا ، فيجب تسخين الكواشف إلى 37 درجة مئوية قبل الاستخدام ، ويجب الاحتفاظ بالخلايا والمخازن المؤقتة والعينات التي تم جمعها عند 37 درجة مئوية خلال أوقات الحضانة.

  1. تحضير الكاشف
    1. قم بإعداد محلول هانك الملحي المخزن (HBSS) ب 10 ملي مولار HEPES واضبط الرقم الهيدروجيني إلى 7.4. دافئ إلى 37 درجة مئوية.
      ملاحظة: إذا لزم الأمر، قم بإعداد HBSS + HEPES مع العلاجات ذات الأهمية. تحضير ما يكفي ل 80 ميكرولتر / بئر في الغرفة القمية و 1 مل / بئر في الغرفة القاعدية الجانبية.
    2. صب حوالي 50 مل من HBSS + HEPES الدافئ في دورق صغير لشطف الحشوات. احصل على دورق أكبر بالقرب من النفايات السائلة.
    3. إذابة FITC-dextran تماما 4 كيلو دالتون. تحضير محلول 1.25 مجم / مل في HBSS مع HEPES. قم بإعداد كمية كافية من محلول FITC-dextan لتخصيص 80 ميكرولتر لكل بئر و 1 ميكرولتر للمنحنى القياسي.
      ملاحظة: يمكن تعديل تركيز البداية بناء على الحجم والنفاذية المتوقعة للمتتبع على سبيل المثال ، يمكن إضافة أدوات تتبع أصغر أو أكثر بتركيز أقل للحفاظ على الكواشف. إذا كانت هناك حاجة إلى تطبيق العلاجات على الغرفة القمية ، فقم بإعداد محلول FITC-dextran في HBSS + HEPES المعالج بشكل مناسب.
  2. تطبيق FITC-dextran على الطبقات الأحادية
    1. قم بإعداد طبق جديد بسعة 24 بئرا عن طريق إضافة 1 مل من HBSS + HEPES (مع العلاج إذا رغبت في ذلك) إلى الآبار المناسبة.
    2. اغسل الطبقات الأحادية العضوية عن طريق الإمساك بالملقط ، ورفعه من البئر ، وغمسه في الدورق الذي يحتوي على HBSS + HEPES دافئ (من الخطوة 5.1.2) لملء الحجرة القمية ، ثم قلبها فوق دورق النفايات لتفريغ محلول الغسيل.
    3. كرر هذا الغسيل 2 مرات إضافية.
    4. ضع الملحق في البئر المناسب للوحة الطازجة المعدة في الخطوة 5.2.1.
    5. ضع الماصة برفق 80 ميكرولتر من محلول FITC-dextran في الحجرة القمية. ماصة على جانب الملحق لتجنب إزعاج الطبقة الأحادية.
    6. كرر الخطوة 5.2.5 لجميع الطبقات الأحادية.
    7. أضف HBSS أو PBS إلى أي آبار فارغة للحفاظ على الرطوبة.
  3. جمع عينات التدفق
    1. مباشرة بعد الخطوة 5.2.7 ، اجمع 70 ميكرولتر من الغرفة القاعدية الجانبية لكل بئر في بئر من صفيحة سوداء مسطحة ذات قاع شفاف من 96 بئرا وحافظ على حمايتها من الضوء عند 37 درجة مئوية. ستكون هذه هي النقطة الزمنية 0.
    2. احتضان اللوحة المحمية من الضوء عند 37 درجة مئوية.
    3. كل 30 دقيقة لمدة ساعتين ، امزج المخزن المؤقت في البئر القاعدي ، ثم اجمع 70 ميكرولتر إضافيا في الآبار الفارغة للوحة ذات القاع الصافي المكون من 96 بئرا من الخطوة 5.3.1.
  4. تحضير المنحنى القياسي
    1. أضف 1 ميكرولتر من محلول FITC-dextran المحجوز (1.25 مجم / مل ؛ الخطوة 5.1.3) إلى 999 ميكرولتر من HBSS + HEPES. سيكون هذا هو التخفيف 1: 1000 أو 1.25 ميكروغرام / مل للمنحنى القياسي.
    2. قم بتخفيف هذا المحلول بشكل متسلسل 1: 1 عن طريق أخذ 150 ميكرولتر من المحلول وإضافته إلى 150 ميكرولتر من HBSS + HEPES ، ثم الخلط جيدا. كرر هذا بشكل متسلسل عشر مرات إضافية ليصبح المجموع تخفيفا من 12 خطوة.
      ملاحظة: سيؤدي ذلك إلى إنشاء منحنى قياسي من: 1250 و625 و312.5 و156.25 و78.13 و39.06 و19.53 و9.77 و4.88 و2.44 و1.22 و0.61 نانوغرام/مل. اعتمادا على نفاذية خطوط الخلايا ، قد يحتاج المنحنى القياسي إلى تركيز أكثر أو أقل. في المرة الأولى التي يتم فيها تشغيل التجربة ، احتفظ بمحلول FITC-dextran إضافي 1.25 مجم / مل في حالة الحاجة إلى إعادة تشكيل المنحنى القياسي بتركيز مختلف.
    3. ماصة 70 ميكرولتر من كل تخفيف للمنحنى القياسي في آبار فارغة من اللوحة السفلية الصافية المكونة من 96 بئرا من الخطوتين 5.3.1 و 5.3.3. كرر للتكرار الثاني.
  5. قم بقياس التألق على قارئ لوحة الفلورسنت بالإعدادات التالية: الإثارة 490 نانومتر ، والانبعاث إلى 520 نانومتر ، والقراءة من أسفل اللوحة ، مع كسب 100 وارتفاع قراءة 7 مم.
    ملاحظة: اضبط الأطوال الموجية للإثارة / الانبعاث حسب الاقتضاء للفلوروفور المختار.
  6. تحليل البيانات
    1. ارسم المنحنى القياسي مع التركيز على المحور x والمضان على المحور y. استخدم هذا لتحديد معادلة الانحدار الخطي.
    2. استخدم معادلة الانحدار الخطي هذه وقراءات الفلورسنت للعينات لحساب تركيز FITC-dextran في كل نقطة زمنية لكل عينة.
    3. ارسم التركيز بمرور الوقت لكل عينة واحسب ميل معادلة الانحدار الخطي ، والتي تمثل ميكروغرام / دقيقة (ميكروغرام / دقيقة). اقسم هذا على مساحة سطح ملحق مزرعة الخلية (0.33 سم) لتحديد معدل التدفق بمقدار ميكروغرام في الدقيقة لكل سنتيمتر مربع (ميكروغرام / دقيقة / سم2).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

باستخدام هذا البروتوكول ، تم تحليل نفاذية القولون البشري السليم في وجود وعدم وجود إشارات التهابية. إضافة خليط من السيتوكينات الالتهابية ، يسمى السيتومكس ، والذي يشمل IFNγ و TNFα و IL-1β (كل منها عند 10 نانوغرام / مل) ، ثبت سابقا أنه يؤدي إلى خلل في الحاجز المعوي كما تم قياسه بواسطة TEER في نماذج الخلايا الظهارية المعوية20،27. كنا نهدف إلى تحديد ما إذا كان يمكن تلخيص هذا الخلل الوظيفي في الحاجز باستخدام مقايسة تدفق FITC-dextran الموصوفة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

هذا بروتوكول لتقييم الحاجز المعوي في النموذج التمثيلي الفسيولوجي للطبقات الأحادية القولونية البشرية. يوفر اختبار تدفق التتبع الفلوري الموصوف هنا معلومات حول السلامة الوظيفية للحاجز بما يتجاوز ما يتم استخلاصه بأنواع أخرى من فحوصات الحاجز ، مثل TEER أو قياسات غرفة Ussing أو تقييم تعبير بروتين الوصلة الضيقة. بالإضافة إلى ذلك ، فإن استخدام النماذج العضية المعوية المشتقة من المريض يمنح فائدة تلخيص فسيولوجيا الإنسان المعقدة13،19 أفضل م...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

لا توجد إفصاحات أو تضارب في المصالح.

شكر وتقدير

يتم تمويل الدكتور شون كولجان من خلال منح المعاهد الوطنية للصحة DK1047893 و DK50189 و DK095491 و DK103639 و VA Merit BX002182.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
أنابيب الطرد المركزي المخروطية 15 ملسيلتريت229411
2 مل قارورة مبردة داخلية ملولبة   ؛كورنينج430488
أنابيب الطرد المركزي المخروطية 50 ملسيلتريت229421
صفيحة 6 آبار ، معالجة زراعة الأنسجةسيلتريت229106
70 μ مصفاة خلية Mصقر352350
96 بئر أسود / لوحة سفلية شفافةثيرمو ساينتفيك165305
A83-01 آر آند D2939
قارئ لوحة BioTek Synergyأجيلينتالتآزر H1
عداد خلية Cellometer Auto T4 BrightfieldنكسلكومCMT-AT4P
غرف عد خلايا مقياس الخلواتنكسلكومNC1531583
CHIR99021سيجما ألدريتشSML1046-5 ملغ
محلول طلاء الكولاجين   ؛تطبيقات الخلية125-50
دي إم إيم / إف -12جيبكو11330057
DMSOسيجما ألدريتشD2650-100 مل
الإيثانول 100٪فيشر العلميةأ4094
EVOM2 Voltohm متر مع Stx2 الكهربائيالأدوات الدقيقة العالميةNC9792051
مصل الأبقار الجنينية (FBS)سيتيفاSH30396.03مرحبا
أطراف ماصة المرشحفيشر العلمية02-707-000, 02-707-002, 02-707-006, 02-707-008
فلورسين إيزوثيوسيانات (FITC) - ديكستران ، 4 كيلو دالتونسيجما ألدريتش46944
جاسترين الأول (إنسان)آر آند D3006
جلوتا ماكس فيشر العلمية35050061200 ملي ل-ألانيل-ل-جلوتامين ثنائي الببتيد
محلول ملحي مخزن Hanks 10xثيرمو ساينتفيك14065056
HEPES 1 مثيرمو ساينتفيك15630080
إنترفيرون جاما المؤتلف الإنسانبيو ليجند575308
إنترلوكين 1 بيتا المؤتلف الإنسانالعلوم الحرارية200-01B-500UG
وسط نمو الأمعاء العضوية المعوية (بشري)تقنيات الخلايا الجذعية06010 الوسائط العضوية المعوية التجارية
مجهر مقلوب حيأوليمبوسIX85
ماتريجلكورنينج354234المصفوفة خارج الخلية (ECM)
حاضنة ميكروبيولوجيةفيشر العلمية151030515
لوحة Multiwell لثقافة التعليق ، 24 بئرغرينر بيو ون662102
نيكوتيناميدآر آند D4106
بارافيلمميليبور سيجماHS234526Bفيلم الختم
ماصات باستور (زجاج البورسليكات)فيشر العلمية13-678-20 ب
برنامج تلفزيوني  جيبكو10010-023
البنسلين ستربتومايسين (10,000 وحدة / مل)جيبكو15140122
مؤتلف موس عامل نمو البشرةآر آند D2028-EG
جهاز طرد مركزي مبردبيكمان كولتربي إي اكس 15 آر
SB202190 آر آند D1264
ثيازوفيفينآر آند D3845
إدراج مزرعة الخلايا ThinCert ل 24 لوحة بئر ، 0.4 &mu ؛ mغرينر بيو ون662641
التربسين-EDTA (0.25٪)فيشر العلمية25200114
عامل نخر الورم ألفا المؤتلف الإنسانآر آند D10291-تا-100
Y-27632 ثنائي هيدروكلوريد   ؛توكريسTB1254-GMP

المراجع

  1. Vanuytsel, T., Tack, J., Farre, R. The role of intestinal permeability in gastrointestinal disorders and current methods of evaluation. Front Nutr. 8, 717925(2021).
  2. Tsai, P. Y., et al. Il-22 upregulates epithelial claudin-2 to drive diarrhea and enteric pathogen clearance. Cell Host Microbe. 21 (6), 671-681.e4 (2017).
  3. Bjarnason, I., O'morain, C., Levi, A. J., Peters, T. J. Absorption of 51chromium-labeled ethylenediaminetetraacetate in inflammatory bowel disease. Gastroenterology. 85 (2), 318-322 (1983).
  4. Bjarnason, I., Peters, T. J., Veall, N. A persistent defect in intestinal permeability in coeliac disease demonstrated by a 51cr-labelled EDTA absorption test. Lancet. 1 (8320), 323-325 (1983).
  5. Schulzke, J. D., Bentzel, C. J., Schulzke, I., Riecken, E. O., Fromm, M. Epithelial tight junction structure in the jejunum of children with acute and treated celiac sprue. Pediatr Res. 43 (4 Pt 1), 435-441 (1998).
  6. Schumann, M., et al. Cell polarity-determining proteins par-3 and pp-1 are involved in epithelial tight junction defects in coeliac disease. Gut. 61 (2), 220-228 (2012).
  7. Zeissig, S., et al. Changes in expression and distribution of claudin 2, 5 and 8 lead to discontinuous tight junctions and barrier dysfunction in active Crohn's disease. Gut. 56 (1), 61-72 (2007).
  8. Schoultz, I., KeitaÅ, V. The intestinal barrier and current techniques for the assessment of gut permeability. Cells. 9 (8), 1909(2020).
  9. Thomson, A., et al. The ussing chamber system for measuring intestinal permeability in health and disease. BMC Gastroenterol. 19 (1), 98(2019).
  10. Gan, J., et al. A case for improved assessment of gut permeability: A meta-analysis quantifying the lactulose:Mannitol ratio in coeliac and Crohn's disease. BMC Gastroenterol. 22 (1), 16(2022).
  11. Sequeira, I. R., Lentle, R. G., Kruger, M. C., Hurst, R. D. Standardising the lactulose mannitol test of gut permeability to minimise error and promote comparability. PLoS One. 9 (6), e99256(2014).
  12. Barker, N., et al. Identification of stem cells in small intestine and colon by marker gene Lgr5. Nature. 449 (7165), 1003-1007 (2007).
  13. Zachos, N. C., et al. Human enteroids/colonoids and intestinal organoids functionally recapitulate normal intestinal physiology and pathophysiology. J Biol Chem. 291 (8), 3759-3766 (2016).
  14. Jung, P., et al. Isolation and in vitro expansion of human colonic stem cells. Nat Med. 17 (10), 1225-1227 (2011).
  15. Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium. Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).
  16. Yin, X., et al. Niche-independent high-purity cultures of Lgr5+ intestinal stem cells and their progeny. Nat Methods. 11 (1), 106-112 (2014).
  17. Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
  18. Basak, O., et al. Induced quiescence of Lgr5+ stem cells in intestinal organoids enables differentiation of hormone-producing enteroendocrine cells. Cell Stem Cell. 20 (2), 177-190.e4 (2017).
  19. Jelinsky, S. A., et al. Molecular and functional characterization of human intestinal organoids and monolayers for modeling epithelial barrier. Inflamm Bowel Dis. 29 (2), 195-206 (2023).
  20. Kollmann, C., et al. Human organoids are superior to cell culture models for intestinal barrier research. Front Cell Dev Biol. 11, 1223032(2023).
  21. Parente, I. A., Chiara, L., Bertoni, S. Exploring the potential of human intestinal organoids: Applications, challenges, and future directions. Life Sci. 352, 122875(2024).
  22. Sanders, S. E., Madara, J. L., McGuirk, D. K., Gelman, D. S., Colgan, S. P. Assessment of inflammatory events in epithelial permeability: A rapid screening method using fluorescein dextrans. Epithelial Cell Biol. 4 (1), 25-34 (1995).
  23. Lacy, B. E., Wise, J. L., Cangemi, D. J. Leaky gut syndrome: Myths and management. Gastroenterol Hepatol. 20 (5), 264-272 (2024).
  24. Pleguezuelos-Manzano, C., et al. Establishment and Culture of Human Intestinal Organoids Derived from Adult Stem Cells. Curr Protoc Immunol. 130 (1), e106(2020).
  25. Vandussen, K. L., Sonnek, N. M., Stappenbeck, T. S. L-wrn conditioned medium for gastrointestinal epithelial stem cell culture shows replicable batch-to-batch activity levels across multiple research teams. Stem Cell Res. 37, 101430(2019).
  26. Miyoshi, H., Stappenbeck, T. S. In vitro expansion and genetic modification of gastrointestinal stem cells in spheroid culture. Nat Protoc. 8 (12), 2471-2482 (2013).
  27. Wang, R. X., Lee, J. S., Campbell, E. L., Colgan, S. P. Microbiota-derived butyrate dynamically regulates intestinal homeostasis through regulation of actin-associated protein synaptopodin. Proc Natl Acad Sci U S A. 117 (21), 11648-11657 (2020).
  28. Al-Qadami, G., et al. Intestinal organoid coculture systems: Current approaches, challenges, and future directions. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 328 (3), G252-G276 (2025).
  29. Wang, Y., Kim, R., Sims, C. E., Allbritton, N. L. Building a thick mucus hydrogel layer to improve the physiological relevance of in vitro primary colonic epithelial models. Cell Mol Gastroenterol Hepatol. 8 (4), 653-655.e5 (2019).
  30. Yang, L., et al. A tunable human intestinal organoid system achieves controlled balance between self-renewal and differentiation. Nat Commun. 16 (1), 315(2025).
  31. Bein, A., et al. Microfluidic organ-on-a-chip models of human intestine. Cell Mol Gastroenterol Hepatol. 5 (4), 659-668 (2018).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

FITC
اتصل بنا
أوصِ بها للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

2026 © حقوق الطبع والنشر MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.