يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

إنتاج واستخدام قوالب الاغاروز القابلة للتخصيص لزراعة بصيلات مبيض الفأر الخالية من السقالات

1.2K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/68871

⸱

أكتوبر 24, 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Obstetrics and Gynecology, Feinberg School of Medicine, Northwestern University, 2Department of Biomedical Engineering, Northwestern University, 3Roy J. Carver Department of Biomedical Engineering, Pappajohn Biomedical Institute, University of Iowa

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

نصف طرق زراعة بصيلات المبيض في قالب الاغاروز الجديد الخالي من السقالات الذي يكمل تكوين الأمشاج في المختبر .

الملخص

بصيلات المبيض هي الوحدة الوظيفية للمبيض التي تنتج الهرمونات والأمشاج اللازمة للحفاظ على الوظيفة الإنجابية للأنثى وصحتها. القدرة على تلخيص تكوين الجريبات والإباضة واللوتين في المختبر لها فائدة أساسية وانتقالية وسريرية واسعة. تحافظ أنظمة نمو البصيلات الأكثر تقدما في المختبر على بنية البصيلات ثلاثية الأبعاد (3D) ، وهو أمر بالغ الأهمية لتطوير بويضات الطور الثاني المؤهلة انقتصايا في البشر. في الآونة الأخيرة ، تم تطوير طريقة خالية من السقالات لنمو البصيلات في المختبر لبصيلات الفأر الثانوية متعددة الطبقات والتحقق من صحتها. لهذا الغرض ، تم استخدام القوالب المطبوعة ثلاثية الأبعاد المخصصة لتشكيل الاغاروز مع الآبار الدقيقة التي تستوعب التوسع الحجمي للبصيلات. أظهرت البصيلات المزروعة في هذه البيئة الخالية من السقالات إنتاجا قابلا للهرمونات وقابلية للبقاء مقارنة بأنظمة نمو البصيلات المختبرية المغلفة (eIVFG). الأهم من ذلك ، أن آبار الاگاروز الدقيقة هي طريقة قابلة للتطوير ، وأقل تطلبا من الناحية الفنية ، وتظهر تحسنا في نمو البصيلات ومعدلات الإباضة مقارنة ب eIVFG. تنتج هذه المنهجية قوالب قابلة للتخصيص ومتوافقة حيويا مع البويضة ، وهي خلية شديدة الحساسية للعصارة الخاصة بالمواد والملوثات البيئية الأخرى. علاوة على ذلك ، يتم زراعة البصيلات في هذا النظام في نفس المستوى البؤري ، مما يتيح التصوير والتحليل بفاصل زمني في الوقت الفعلي. لزيادة إمكانية الوصول إلى هذا النهج الجديد ، توضح هذه المقالة بالتفصيل الطرق اللازمة لتصميم القوالب الرئيسية والطباعة ثلاثية الأبعاد ، وإنشاء قوالب سيليكون لألواح 24 أو 96 بئرا ، وزراعة بصيلات المبيض الثانوية متعددة الطبقات المعزولة في قوالب الاغاروز. يمكن أيضا دمج هذا الإعداد مع نظام تصوير بفاصل زمني فعال من حيث التكلفة، مما يتيح التحليل الشكلي. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن أن تكون القوالب مدمجة في البارافين للتحليلات النسيجية النهائية. بشكل عام ، تعد هذه الطريقة سهلة الاستخدام أداة متعددة الاستخدامات لزراعة البصيلات ويمكن تخصيصها بشكل أكبر لتعزيز تمايز ونضج الخلايا الجرثومية في سياق المسام للحفاظ على تكوين الأمشاج الكامل في المختبر .

المقدمة

تساهم البويضة ، أو الأمشاج الأنثوية ، بالجزء الأكبر من السيتوبلازم ونصف المادة الوراثية للجنين عند الإخصاب ، وهو أمر ضروري لنمو الجيل القادم. يبدأ تكوين البويضات أثناء التطور الجنيني عندما تدخل الخلايا الجرثومية البدائية الانقسام الاختزالي وتتوقف في الطور الأول. توجد هذه البويضات داخل البصيلات البدائية وتشكل احتياطي المبيض ، وهو تجمع محدود وغير متجدد يتم تجنيدها منه تدريجيا. تتطور البصيلات في عملية تعرف باسم تكوين الجريبات ، بهدف إنتاج مشيج ناضج قادر على الإخصاب1،2،3،4،5. يبدأ نمو البصيلات بمرحلة مبكرة مستقلة عن موجهة الغدد التناسلية حيث تكون إشارات paracrine ضرورية لبقاء المسام ونموه. عندما تنضج البصيلات إلى المرحلة الثانوية ، فإنها تعتمد على موجهة الغدد التناسلية ، مما يمثل تحولا إلى إشارات الغدد الصماء. السمة الرئيسية للبصيلات الثانوية هي البويضة المحاطة بطبقتين كاملتين على الأقل من الخلايا الحبيبية المكعبة ، جنبا إلى جنب مع طبقة theca المطورة حديثا. تشكل خلايا Theca الطبقة الخارجية للجريب ، مما يوفر الأندروجينات والدعم الهيكلي6،7. أخيرا ، يتشكل تجويف غاري مملوء بالسوائل ويتمزق استجابة لزيادة هرمون اللوتين (LH) أثناء الإباضة ، مما يؤدي إلى إطلاق مشيج مختص بالإخصاب تم القبض عليه في الانقسام الاختزالي الثاني2،8،9.

تحقق البويضة الكفاءة التنموية للتخصيب والقدرة على دعم التطور المبكر للأجنة قبل الزرع ، والتي يشار إليها باسم النضج النووي والسيتوبلازم ، أثناء تكوين البويضات وتكوين الجريبات10،11،12. يتضح النضج السيتوبلازمي من الناحية الشكلية ، حيث تتوسع البويضات طوال فترة تكوين الجريبات. نتيجة لتكاثر الخلايا الجسدية ، بما في ذلك خلايا ثيكا والحبيبات والركام ، تشهد البصيلات نفسها توسعا حجميا كبيرا. في الفئران ، يزداد قطر المسام خمسة أضعاف من بصيلات ما قبل الإباضة الثانوية المبكرة إلى بصيلات ما قبل الإباضة. يعد الاتصال ثنائي الاتجاه بين البويضة والخلايا الجسدية المحيطة ضروريا لتكوين البويضات. في البصيلات الأولية ، تتشكل المنطقة الشفافة من البروتينات التي تفرزها البويضة ، ويتم التوسط جزئيا في الاتصال بين مقصورات البصيلات هذه جزئيا عن طريق الإسقاطات عبر المنطقة ، والتي توفر اتصالا جسديا بين هاتين الجزأين من البصيلات13،14. ومن ثم ، فإن البيئة المكروية المسامية حيوية لتنظيم النمو والنضج النووي والسيتوبلازمي للبويضة2،5 بشكل صحيح. لفهم الآليات المنفصلة التي تدعم هذه العمليات بشكل أفضل ، هناك حاجة إلى تقنيات زراعة متقدمة وذات صلة من الناحية الفسيولوجية في المختبر . القدرة على استزراع البصيلات في المختبر لها تطبيقات واسعة ، بما في ذلك تقنيات الإنجاب المساعدة والحفاظ على الخصوبة15،16،17،18 ، والحفاظ على الأنواع19،20 ، وتطوير الأدوية21 ، وفحص السموم22،23.

تعد أنظمة زراعة البصيلات في المختبر أيضا خطوة وسيطة أساسية للقدرة على توليد الأمشاج من الخلايا الجذعية متعددة القدرات ، والمعروفة أيضا باسم تكوين الأمشاج في المختبر (IVG) 24. استخدم الباحثون الخلايا الجذعية الجنينية ، والخلايا الجذعية الوسيطة ، والخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات لتطوير الأمشاج في مجموعة متنوعة من الأنواع ، وغالبا ما يعتمدون على الخلايا الجسدية لإعادة إنشاء البيئة المكروية للجريب الأصلي25،26،27،28،29،30. في حين تم تحقيق معالم إثبات المفهوم الرئيسية من خلال هذه الأساليب ، لا يزال هناك تحد يتمثل في البويضات منخفضة الجودة ، والذي ينعكس في انخفاض نمو الأجنة ومعدلات النسل الحي بعد الإخصاب في المختبر في الفئران31،32. لم تتحقق حتى الآن أي ولادات حية في الأنواع الأخرى ، مما يؤكد الحاجة إلى استمرار صقل البروتوكولات لدعم تكوين البويضات وتكوين الجريبات بشكل كامل.

حاليا ، يتم استخدام العديد من الاستراتيجيات لزراعة البصيلات. الأساليب الأقل تطلبا من الناحية الفنية والأعلى إنتاجية هي الطرق الخالية من السقالات ، حيث يتم وضع البصيلات في طبق بلاستيكي أو غشاء33،34. هنا ، تلتصق الخلايا الحبيبية بسطح المزرعة ، وتفقد الاتصال بالبويضة33،34. يحد انهيار البنية المسامية من قابلية الاستخدام والملاءمة البيولوجية لهذه التقنيات. ومع ذلك ، فإن الاستزراع الخالي من السقالات في ألواح التعلق المنخفضة أو القطرات المقلوبة تسمح للجريب بالحفاظ على السلامة الهيكلية في العديد من أنواع الثدييات35،36،37. لسوء الحظ ، باستخدام هذه التقنيات ، يصعب التحكم في التفاعل بين البصيلات ومقدار الدعم الميكانيكي الذي تتلقاه. ومن ثم ، لتلخيص فسيولوجيا الجسم الحي بشكل أفضل ، تم تطوير طرق الاستزراع حيث يتم تغليف البصيلات في هيدروجيلز ذات تركيبات كيميائية محددة وقابلة للضبط و / أو خصائص ميكانيكية33،34،38،39،40،41،42،43،44،45،4647،48،49،50،51،52،53. على سبيل المثال ، يمكن لنظام نمو البصيلات المغلف بالألجينات في المختبر تلخيص التوقيعات النسخية الرئيسية التي لوحظت في الجسم الحي21.

على الرغم من نجاح وقيمة بروتوكولات الثقافة المغلفة ، إلا أن هناك العديد من العيوب. يمكن أن تكون صعبة من الناحية الفنية ، وشاقة ، ومنخفضة الإنتاجية ، وغير متوافقة مع طرق التصوير التلقائي. علاوة على ذلك ، تحتاج طرق الاستزراع المغلفة إلى مناهج متعددة الخطوات لأنواع الثدييات الأكبر حجما بسبب التمدد الحجمي العالي للجريب37. علاوة على ذلك ، تمارس التقنيات المغلفة دعما موحدا في جميع الاتجاهات ، ويجب إطلاق البصيلات من الهيدروجيل قبل الإباضة. لا يحدث هذا في الجسم الحي ، حيث تتفاعل المسام مع البيئة المكروية للمبيض المحيطة ، والتي توفر دعما حيويا ديناميكيا54. على سبيل المثال ، تحافظ قشرة المبيض المتيبسة على هدوء البصيلات البدائية ، بينما توجد البصيلات الكبيرة المتنامية عادة في حجرة النخاع الأكثر نعومة55،56. بمجرد وصول المسام ذات البويضة المختصة إلى حجمها النهائي ، تسمح تعديلات جدار المسام وظهارة سطح المبيض بالإباضة. لذلك ، فإن تقنيات الاستزراع حيث يسمح للبصيلات بالنمو في اتجاه واحد مع مقاومة قليلة يمكن أن تحاكي بشكل أفضل فسيولوجيا الجسم الحي .

في نهج جديد ، تم تطوير طريقة استزراع قابلة للتكرار وقابلة للتطوير وأقل تطلبا تقنيا وفعالة من حيث التكلفة لبصيلات الفأر الثانوية متعددة الطبقات57. هنا ، يتم تصنيع آبار الاغاروز الصغيرة ذات الالتصاق المنخفض للغاية مع هندسة يمكن التحكم فيها بدقة (الشكل والأبعاد) والترتيب المكاني (العدد والقرب) باستخدام طرق ميسورة التكلفة. تتعرض البصيلات في قوالب الاغاروز لدعم ميكانيكي في جميع الاتجاهات باستثناء اتجاه واحد ويتم زراعتها في نفس المستوى البؤري ، مما يتيح التصوير بفاصل زمني للتحليل المورفوكيني المتقدم. تم استخدام الطباعة ثلاثية الأبعاد للطباعة الحجرية المجسمة (SLA) كطريقة ودودة لتصنيع قالب رئيسي ، تليها خطوات التشكيل التي تخلق قوالب سيليكون خالية من العصارة لصب الاغاروز. تم تحقيق نمو البصيلات ونتائج الإباضة المحسنة باستخدام النظام الجديد مقارنة ب eIVFG التقليدي ، دون المساس ببقاء البصيلات بشكل عام أو نضجها أو اللوتين57. تصف ورقة البروتوكول هذه الخطوات اللازمة لتخصيص وتصنيع قوالب الاغاروز ، وكيفية زراعة البصيلات الثانوية متعددة الطبقات وزراعتها ، ومعالجتها ، وأخيرا إجراء تحليل الفاصل الزمني (الشكل 1).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

تمت الموافقة على جميع إجراءات المتعلقة بهذا البروتوكول من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدامها (IACUC) بجامعة نورث وسترن وتم تنفيذها وفقا لدليل المعاهد الوطنية للصحة لرعاية واستخدام المختبر.

1. تكييف تصميم القالب الرئيسي

يصف هذا القسم الخطوات الأولى التي تم إجراؤها خلال مرحلة التصميم (الشكل 1) ، حيث يتم إدخال الآبار الصغيرة المخصصة في تصميم بمساعدة الكمبيوتر (CAD) لقالب رئيسي لألواح الزراعة المكونة من 24 بئرا ، يسمى تصميم قاعدة القالب الرئيسي المكون من 24 بئرا (الملف التكميلي 1). تحدد أبعاد الآبار الدقيقة مقدار الدعم وحجم النمو الأقصى للبصيلات ، بينما يحدد عدد الآبار الحد الأقصى لعدد البصيلات لكل قالب أغاروز. سيتم بعد ذلك استخدام تصميم القالب الرئيسي المكيف في القسم التالي لإنشاء قوالب سيليكون متوافقة حيويا لصب الاغاروز.

  1. افتح ملف .step لتصميم قاعدة القالب الرئيسي المكون من 24 بئرا باستخدام برنامج CAD (الشكل 2 أ).
  2. حدد مساحة السطح الداخلية للكائن، ثم انتقل إلى علامة التبويب Solid في مساحة عمل Design ، وحدد Create Sketch لإدراج تصميم micromold المطلوب (الشكل 2Bi).
  3. أدخل أبعاد xy المطلوبة وعدد الآبار الصغيرة وحدد الرسم النهائي على شريط الأدوات (الشكل 2Bii).
    ملاحظة: بالنسبة للبصيلات الثانوية متعددة الطبقات ، تم استخدام شكل هندسي للملعب 500 × 700 ميكرومتر سابقا57. يمكن أن تختلف دقة الطباعة اعتمادا على الراتنجات وطابعات SLA المستخدمة ؛ السماح بتباعد ضئيل يبلغ 400 ميكرومتر بين الآبار الدقيقة.
  4. قم بإنشاء الآبار الصغيرة بعمق 800 ميكرومتر باستخدام وظيفة البثق (انقر فوق Solid | إنشاء | بثق). تأكد من تحديد عملية القطع ، وإنشاء تجويف البئر الصغير (الشكل 2Biii).
  5. حدد فيليه نصف قطر 0.100 مم (انقر فوق تصميم | صلب | تعديل | فيليه) لأعلى الآبار الصغيرة
    ملاحظة: لإنشاء بئر صغير دائري القاع ، استخدم عملية الفيليه مرة أخرى في الجزء السفلي من بئر المزرعة ويكون لديك قيمة نصف قطرها مساوية لنصف قطر تصميم البئر الصغير. على سبيل المثال ، عند تصميم آبار 500 ميكرومتر × 700 ميكرومتر ، حدد قيمة نصف قطرها 0.250 مم (الشكل 2Biv).
  6. تصدير نسخة من تصميم القالب الرئيسي الجديد بتنسيق .step (انقر فوق ملف | تصدير).

2. إنشاء حاويات قوالب السيليكون

ملاحظة: لمنع ترشيح المركبات السامة للخلايا من الأجزاء المطبوعة ثلاثية الأبعاد ، سيتم صنع قالبين من السيليكون المتوافقين حيويا. يصف هذا القسم الخطوات الأخيرة في مرحلة التصميم (الشكل 1) وسيؤدي إلى الحاويتين المستخدمتين لقولبة السيليكون. هنا ، سيتم استخدام ثلاثة ملفات CAD مختلفة ، وهي تصميم القالب الرئيسي الجديد الذي تم إنشاؤه من القسم 1 ، وحاويات السيليكون المصبوبة ذات 24 بئرا 1 و 2 (الشكل 2Ci-ii والملف التكميلي 2 ، الملف التكميلي 3 ، على التوالي).

  1. افتح ملف 1.step من السيليكون المصبوب ذو 24 بئرا وأدخل تصميم القالب الرئيسي الجديد كمكون خارجي (انتقل إلى Solid | إدراج | إدراج المكون).
    1. انقر بزر الماوس الأيمن فوق المكون وحدد Break Link لإزالة المرجع المرتبط بتصميم القالب الرئيسي الجديد.
  2. قم بتوسيط تصميم القالب الرئيسي الجديد مع حاوية سيليكون مصبوبة 24 بئر 1 سطح ، مع التأكد من أنه يواجه الداخل.
    1. انقر بزر الماوس الأيمن فوق كائن تصميم القالب الرئيسي الجديد في المتصفح وحدد خيار النقل/النسخ .
    2. حدد عملية Free Move في قسم Move Type وقم بتدوير الكائن 180 درجة على المحور x إذا لزم الأمر.
    3. حدد العملية من نقطة إلى نقطة في قسم نوع النقل مع منتصف كائن تصميم القالب الرئيسي الجديد كنقطة أصل ومركز سطح حاوية السيليكون المصبوب المكونة من 24 بئرا كنقطة مستهدفة.
    4. حدد OK لمحاذاة الكائنات.
  3. حدد عملية القطع مع الحاوية كجسم مستهدف والقالب الرئيسي كتصميم جسم الأداة (الشكل 2Ciii). هذا يخلق الحاوية للخطوة الأولى من قولبة السيليكون (الشكل 2Civ).
    ملاحظة: الآبار الصغيرة التي تم تصميمها في القسم الأول هي الآن أعمدة دقيقة سيتم طباعتها ثلاثية الأبعاد كما هو موضح في القسم 3. طباعة SLA هي طريقة تصنيع مضافة. وبالتالي ، فإن طباعة الركائز الدقيقة تعمل على تحسين دقة الطباعة مقارنة بطباعة الآبار الدقيقة.
  4. احفظ وقم بتصدير قالب السيليكون الجديد الناتج 24 بئرا 1 كملف .stl و .step.

طباعة 3. 3D لحاويات السيليكون

ملاحظة: يصف هذا القسم الخطوات الأولى التي تم إجراؤها خلال مرحلة التصنيع (الشكل 1) حيث تتم طباعة تصميمات CAD الجديدة مع ميزات تصميم microwell المطلوبة ثلاثية الأبعاد.

  1. افتح ملفات .stl الخاصة بقالب السيليكون الجديد 24 بئرا 1 وحاوية سيليكون مصبوبة 24 بئر 2 مع برنامج إعداد الطباعة ثلاثية الأبعاد.
  2. قم بتوجيه الطباعة بحيث تكون الركائز الدقيقة متجهة لأعلى واستخدم وظيفة ثقب الحفر لإنشاء فتحة بعرض 1 مم (الشكل 2D). تأكد من أن هذه القناة مفتوحة على جانب الطباعة.
    ملاحظة: ثقب التجويف الذي يتجنب تأثيرات الحجامة أثناء الطباعة ويمكن ملؤه بعد الطباعة ، أو يمكن إزالة مادة السيليكون الزائدة بعد صب السيليكون الأول.
  3. اطبع تصميمي الحاوية بسمك طبقة 25 ميكرومتر (الشكل 3 أ).
    ملاحظة: اطبع كل طراز بثلاث نسخ لمراعاة عيوب الطباعة أو التلف أثناء المعالجة.
  4. قم بإزالة القوالب من منصة الطباعة واغسلها بنسبة 95٪ من الأيزوبروبانول وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. رش قسم العمود الدقيق على نطاق واسع بنسبة 95٪ من الأيزوبروبانول (الشكل 3 ب). قم بإزالة أي إيثانول متبقي بالهواء المضغوط.
  5. دع الإيثانول المتبقي يتبخر لمدة 30 دقيقة على الأقل.
    ملاحظة: في هذه المرحلة ، يمكن إغلاق قناة الحفر بعرض 1 مم. يمكن القيام بذلك عن طريق وضع قطرة صغيرة من الراتنج غير المبلمر بطرف ماصة p200 على السطح الخارجي للطباعة. سوف تملأ القوى الشعرية القناة.
  6. عالج المطبوعات ثلاثية الأبعاد عند 60 درجة مئوية بالأشعة فوق البنفسجية لمدة 15 دقيقة.
  7. افحص كل طباعة باستخدام مجهر مجسم وتخلص من أي مطبوعات ثلاثية الأبعاد بها عيوب (الشكل 3C-F). افحص بدقة كل طباعة بصريا ، وتأكد من فصل جميع الأعمدة الدقيقة وموحدة في الحجم والمظهر (الشكل 3D). تجاهل القوالب الرئيسية المعيبة ذات الركائز الدقيقة المدمجة (الشكل 3E).
    ملاحظة: المشكلات الشائعة هي الأعمدة الدقيقة أو الجسور التالفة من الراتنج المتبقي غير المغسول (الشكل 3Fi ، ii).
  8. قم بتغطية الجزء الخارجي من الطباعة بالبارافيلم إذا لم يتم ملء قناة الحفر وتخزينها حتى الاستخدام مرة أخرى.

4. تصنيع قوالب السيليكون

ملاحظة: يصف هذا القسم الخطوات النهائية لمرحلة التصنيع (الشكل 1) ، حيث ستتم خطوتان لتشكيل السيليكون. يعد ذلك ضروريا لمنع إطلاق العصارة السامة بواسطة الأجزاء المطبوعة ثلاثية الأبعاد.

  1. تحضير السيليكون وفقا لتعليمات الشركة المصنعة ، باختصار:
    1. امزج محتويات حاويات الجزء A و B جيدا ، ضع كوبا على ميزان واسكبه في الحاوية بنسبة 1A: 1B بالوزن. تأكد من وجود مواد زائدة.
    2. تخلط جيدا لمدة 3 دقائق ، مع التأكد من كشط الجوانب والقاع.
    3. ضع المادة في مجفف فراغ واتركه لمدة 5 دقائق للتخلص من فقاعات الهواء المحبوسة. كرر التفريغ حتى 2x إذا بقيت فقاعات الهواء.
  2. صب الخليط بتدفق موحد في حاوية قالب السيليكون 1. تأكد من أن مستوى الخليط على نفس مستوى الطباعة ثلاثية الأبعاد أو أقل بقليل لضمان تسطيح قالب السيليكون (الشكل 4Ai ، ii).
    1. قم بإزالة أي هواء محبوس باستخدام طرف ماصة P200 واستخدم التفريغ بالتفريغ إذا لزم الأمر.
  3. عالج السيليكون في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 ساعات على الأقل ويفضل طوال الليل قبل إزالة القوالب.
  4. قم بإزالة السيليكون من القالب المطبوع ثلاثي الأبعاد وتأكد بصريا من سلامة القوالب الدقيقة باستخدام مجهر مجسم (الشكل 4AIII ، B). قم بإزالة المواد الزائدة من قناة الحفر إذا لزم الأمر (الشكل 4Aiv). تخلص من القوالب ذات الآبار الصغيرة الجسرية أو المخترقة (الشكل 4 ج).
  5. ضع قالب السيليكون في حاوية قالب السيليكون 2 لخطوة صب السيليكون الثانية (الشكل 4Av). تحتوي حاوية السيليكون 2 على فتحة 1 مم في الجدار الجانبي سيتم تغطيتها بمجرد وضع قالب السيليكون.
  6. رش قالب السيليكون برفق بزيت معدني آمن للأجنة وقم بإزالة أي زيت زائد من الآبار الدقيقة. سيكون هذا بمثابة عامل تحرير لفصل جزأين من السيليكون بعد المعالجة.
  7. كرر خطوات الخلط الموضحة في الخطوة 4.1 واسكب الخليط في وعاء قالب السيليكون 2. تأكد من أن مستوى الخليط أقل أو بنفس ارتفاع الطباعة ثلاثية الأبعاد لضمان تسطيح قالب السيليكون (الشكل 4Avi).
  8. اترك السيليكون ينجح في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 ساعات على الأقل ، ويفضل بين عشية وضحاها ، قبل إزالة القوالب.
  9. قم بإزالة السيليكون من القالب المطبوع ثلاثي الأبعاد وافصل قوالب السيليكون 1 و 2 عن بعضها البعض (الشكل 4Avii). تأكد بصريا من سلامة الركائز الدقيقة باستخدام المجهر الفراغي (الشكل 4 د). تخلص من القالب في حالة وجود فقاعات أو زيت زائد في الآبار الصغيرة (الشكل 4E).
  10. اغسل قالب السيليكون بنسبة 70٪ من الإيثانول واتركه يجف في الهواء لمدة 30 دقيقة في غطاء التدفق الرقائقي.
  11. ضعه في كيس التعقيم والأوتوكلاف باستخدام دورة جافة للتعقيم (ضغط السترة: 20 رطل لكل بوصة مربعة ، درجة حرارة الغرفة: 250 درجة فهرنهايت ، وقت التعقيم: 15 دقيقة).

5. إعداد وسائل الإعلام الثقافية

ملاحظة: يتطلب هضم أنسجة المبيض لعزل وزراعة البصيلات ، ونضوج البويضات في المختبر ، واللوتيني ستة أنواع من الوسائط: وسائط التشريح (DM) ، والوسائط الأنزيمية (EM) ، ووسائط الصيانة (MM) ، ووسائط النمو (GM) ، ووسائط النضج (IVM) ، ووسائط اللوتين (LM). يمكن العثور على إعداد هذه الوسائط كما هو موضح سابقا بواسطة Converse et al.38 مع شرح لأهمية مكونات الوسائط المختلفة التي حللها Simon et al.33 ، والغرض منها مذكور بإيجاز في الجدول 1.

  1. قم بإعداد الوسائط حتى 1 أسبوع مقدما وتخزينها عند 4 درجات مئوية.

6. صب وتخزين قالب الاغاروز المخصص وثقافة البصيلات

ملاحظة: يصف هذا القسم كيفية صب قوالب الاغاروز المخصصة لزراعة البصيلات من قوالب السيليكون المتولدة في القسم 4. يمكن صنع قوالب الاغاروز وتخزينها في درجة حرارة 4 درجة مئوية حتى أسبوعين قبل زراعة البصيلات.

  1. ضع القوالب في كيس التعقيم والأوتوكلاف باستخدام دورة جافة كما هو موضح في القسم 4.11. اترك القوالب لتبرد قبل الاستخدام.
  2. اصنع محلول الاغاروز عن طريق إذابة محلول الاغاروز المعقم بنسبة 1.5٪ (وزن / حجم) في محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) في ميكروويف أو لوح ساخن. استخدم أنبوبا مخروطيا معقما يتم وضعه في دورق به ماء للسماح بتسخين أكثر توازنا للاغاروز وإبطاء تصلب محلول الاغاروز السائل.
  3. ماصة محلول الاغاروز المعقم في قوالب السيليكون في غطاء تدفق رقائقي. ماصة ببطء وسلاسة لتقليل تكون الفقاعات والتأكد من أن الجزء العلوي من القالب مسطح وليس محدبا أو مقعرا. سيكون الجزء العلوي عند الصب هو الجزء السفلي من القالب عند الزراعة ويجب أن يكون مسطحا. استخدم ما يقرب من 600 ميكرولتر من الاغاروز لقالب صغير للوحة 24 بئرا و 85 ميكرولتر للقالب الصغير الذي يناسب صفيحة 96 بئرا.
  4. دع القوالب الصغيرة تبرد لمدة ~ 3 دقائق حتى تتماسك. اقلب قالب السيليكون لطرد القوالب الدقيقة على طبق بتري مقاس 100 مم.
  5. قم بتقييم القوالب الدقيقة تحت المجهر بحثا عن أي تشوهات ، بما في ذلك الشقوق أو دمج الآبار الدقيقة أو الحدود غير المكتملة. ضع القوالب الدقيقة في PBS معقم + 1٪ بنسلين ستربتومايسين وقم بتخزينه في درجة حرارة 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى أسبوعين قبل الاستخدام.
    ملاحظة: اصنع قوالب أكثر من اللازم لحساب التدهور بمرور الوقت أو تلف القوالب الدقيقة عند النقل بين الألواح.
  6. قم بموازنة القوالب الدقيقة في 750 ميكرولتر من وسائط الصيانة 2x لمدة ساعة واحدة على الأقل (إجمالي حضنتين) في يوم عزل البصيلات.
  7. قم بإزالة جميع وسائط الصيانة ، وأضف 750 ميكرولتر من وسائط النمو وضعها في الحاضنة لمدة ساعة واحدة.
  8. استبدلها بوسائط نمو جديدة ومتوازنة قبل البذر.

7. عزل وثقافة البصيلات الثانوية المتأخرة

ملاحظة: يشرح هذا القسم كيفية عزل بصيلات البذور في قوالب الاغاروز الدقيقة لزراعة البصيلات. يتم استزراع الثانوية متعددة الطبقات لمدة 8 أيام ، ويجب أن يكون لها أكثر من 80٪ من الجدوى ، وتنتج بويضات ناضجة. تم وصف عزل وثقافة البصيلات الثانوية بتفصيل كبير في مكان آخر38. يتم عزل واختيار البصيلات لتغليف الألجينات الراسخة والبذر في قوالب الاغاروز متسقة.

  1. تشريح المبايض من الفئران وإزالته من الأنسجة الدهنية السمحاقية والجرب. ضع المبايض في 2.5 مل من الوسائط الأنزيمية واحتضان في شاكر مداري عند 37 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة كما هو موضح سابقا57.
  2. ماصة 2 مل من وسائط الصيانة في طبق التلقيح الاصطناعي وضعها في حاضنة (37 درجة مئوية ، 5٪ ثاني أكسيد الكربون2) قبل عزل البصيلات.
  3. إخماد التفاعل مع 250 ميكرولتر من FBS. اختر البصيلات الثانوية المتأخرة بعد العزل الأنزيمي وانقلها إلى طبق التلقيح الاصطناعي مع DM.
  4. انقل البصيلات إلى طبق أطفال الأنابيب مع وسائط صيانة متوازنة مسبقا وضعها في حاضنة (37 درجة مئوية ، 5٪ ثاني أكسيد الكربون2) لمدة ساعة واحدة.
    ملاحظة: الحجم الأولي للبصيلات الثانوية المتأخرة هو 150-180 ميكرومتر مع وجود أكثر من طبقتين من الخلايا الحبيبية.
  5. أضف 750 ميكرولتر من الكائنات المعدلة وراثيا الطازجة إلى قوالب الاغاروز الدقيقة واحفظها في الحاضنة للتحضير للبذر. أضف PBS المعقمة إلى الآبار المجاورة المحيطة بقوالب الاغاروز الدقيقة للحفاظ على الرطوبة وتقليل تبخر الوسائط طوال فترة الاستزراع.
  6. بصيلات البذور في قوالب الاغاروز التي تم توازنها مسبقا ومغمورة في جنرال موتورز. نقل بصيلات ثانوية متعددة الطبقات عالية الجودة إلى قوالب الاغاروز الدقيقة تحت المجهر باستخدام طرف متجرد 200 ميكرومتر. تأكد من نقل 10 بصيلات إلى كل قالب صغير في صفيحة مكونة من 24 بئرا وأن كل بصيلات في بئر صغير منفصل ولكن مجاور.
    1. ثني طرف المتجرد للسماح بمعالجة أكثر دقة ونقل البصيلات إلى الآبار الدقيقة.
    2. نقل البصيلات بسرعة لتقليل درجات الحرارة وتغيرات الأس الهيدروجيني حيث يتم تخزين MM و GMCO2 مؤقتا.
    3. تأكد من أن البصيلات داخل القالب الدقيق ذات حجم يبدأ مماثل بمجرد نقل جميع البصيلات العشرة.
  7. ضع القوالب الدقيقة المصنفة مرة أخرى في الحاضنة لمدة ساعة واحدة على الأقل للسماح للبصيلات بالتعافي قبل التصوير.
  8. صورة بصيلات بتكبير 4x و 10x كل يومين لتحديد بقاء البصيلات ونتائج النمو.
    ملاحظة: يمكن أيضا إعداد التصوير بفاصل زمني لإجراء قياسات مورفوكينتيك ويتم وصفه بمزيد من التفصيل في القسم 9.
  9. قم بتغيير 50٪ من وسائل الإعلام الثقافية كل يومين.
  10. قم بتجميد الوسائط المستهلكة بالثلج الجاف ثم تخزينها في درجة حرارة -80 درجة مئوية. استخدم هذه الوسائط المكيفة لتقييم إنتاج الهرمونات من خلال استراديول ELISAs.
    ملاحظة: إذا تم تصنيع الكائنات المعدلة وراثيا في يوم البذر (بداية فترة الاستزراع) ، فيمكن تخزين الوسائط عند 4 درجات مئوية واستخدامها طوال فترة الاستزراع.
  11. قم بإزالة جميع وسائط النمو (750 ميكرولتر) وتجميدها بشكل فوري في اليوم 8 من الاستزراع.
  12. استبدل وسائط النمو بوسائط IVM للسماح بالإباضة في المختبر .
    ملاحظة: يمكن أن تحدث الإباضة أيضا تحت التصوير بفاصل زمني لتقييم التوقيت وميزات التمزق.
  13. قم بإزالة مجمعات البويضات الركامية (COCs) بعد 14-16 ساعة من إضافة وسائط IVM وتسجيل حالة النضج.
    1. حدد حالة النضج على النحو التالي: تحديد MII عن طريق بثق الجسم القطبي الأول (النتيجة المتوقعة للبويضات السليمة) ، GVBD / MI من خلال عدم وجود جسم قطبي أو حويصلة جرثومية (تأخر النضج) ، GV بواسطة النواة الكروية المرئية في مركز البويضة (نقص التقدم الانتصافي) أو البويضة المتدهورة و / أو المظلمة.
  14. اختياري: نظرا لأن معلمات المغزل لبويضات MII ، بما في ذلك محاذاة الكروموسومات وشكلها وحجمها ، ترتبط ارتباطا وثيقا بجودة البويضات ونتائج الأجنة58،59 ، استخدمها لتقييم نجاح تكوين البويضات في المختبر . لتقييم مورفولوجيا المغزل ، قم بإصلاح وتلطيخ بيض MII من خلال الكيمياء المناعية الكاملة.
    1. التثبيت: ثبت البيض في 3.8٪ PFA مع 0.1٪ Triton X-100 عند 37 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة. اغسل البيض 3x في محلول مانع (PBS مع الكالسيوم والمغنيسيوم (PBS +/+) مع 10٪ توين -20 و 0.3٪ BSA).
    2. تلطيخ المغزل:
      1. احتضان البيض في مخزن نفاذية (PBS +/+ مع 0.1٪ Triton X-100 و 0.3٪ BSA) لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة
      2. اشطفه 2x في المخزن المؤقت للحظر.
      3. احتضان البيض في أليكسا فلور 488 المترافق مضاد ألفا توبولين بتركيز 1 ميكروغرام / مل على هزاز ملفوف بورق الألمنيوم لمدة ساعتين في درجة حرارة الغرفة.
      4. اغسل البيض لمدة 3 × 20 دقيقة في المخزن المؤقت قبل التركيب على شرائح المجهر باستخدام وسيط تثبيت يحتوي على DAPI.
      5. لمراقبة الهيكل الخلوي للبويضة ، قم بتضمين 1:50 رودامين فالويدين أثناء تلطيخ.
    3. عينات الصور على مجهر متحد البؤر باستخدام هدف 63x مع مكدس z بعرض 1.0 ميكرومتر في جميع أنحاء المغزل بأكمله.

8. التطبيقات النهائية لقوالب الاغاروز المخصصة

ملاحظة: يمكن استخدام قوالب الاغاروز الدقيقة للتحليل النسيجي ، مما يسمح بالقياس الكمي والتوطين للجينات أو البروتينات المختلفة ذات الأهمية. تخلق القوالب الدقيقة مصفوفة دقيقة للبصيلات تسمح بتلطيخ بصيلات متعددة بالتوازي. يمكن أيضا إجراء التصوير المقطعي البصري (OCT) دون الحاجة إلى نقل البصيلات (الشكل 1 ، التطبيق). التصوير المقطعي للتماسك البصري هو تقنية تصوير تسمح بإعادة بناء العينات ثلاثية الأبعاد ولها عمق اختراق ودقة أعلى مقارنة بالفحص المجهري متحد البؤر ، مما يسمح بتصوير محسن للعينات ثلاثية الأبعاد مثل البصيلات المزروعة في المختبر60.

  1. بالنسبة لتطبيقات الأنسجة ، قم بعمل محلول أغاروز (1.5٪ وزن / حجم) كما هو موضح في الخطوة 6.2.
    1. قم بإزالة جميع الوسائط المحيطة بقوالب الاغاروز الدقيقة في البئر وقم بإزالة الوسائط بعناية في تجويف القالب الدقيق باستخدام ماصة p200 في زوايا التجويف.
    2. قم بتعبئة 100 ميكرولتر من محلول الاغاروز السائل بعناية لملء وإغلاق الآبار الصغيرة والتجويف دون تحريك البصيلات ؛ تأكد من أن الجزء العلوي مسطح. قم بإزالة أي فقاعات بطرف ماصة P10 معقم.
    3. دع الاغاروز يتجمد في درجة حرارة الغرفة لمدة 2 دقيقة. تأكد تحت المجهر من أن القالب الدقيق مغلق بالكامل.
    4. قم بتثبيت القوالب الدقيقة طوال الليل عند 4 درجات مئوية مع هزاز لطيف في 750 ميكرولتر من المثبت (محلول ديفيدسون المعدل أو 3.8٪ بارافورمالديهايد).
    5. استنشق المثبت واغسل القوالب الدقيقة المختومة بتركيزات تصاعدية من الإيثانول ، بدءا من 50٪ وأخيرا 70٪ EtOH.
    6. العملية باستخدام معالج الأنسجة الآلي باستخدام بروتوكولات المعالجة القياسية (الجدول 2) وتضمينها في شمع البارافين. عند التضمين ، قم بتدوين اتجاه القوالب الدقيقة. تأكد من وجود شمع قبل وبعد العينة أثناء عملية التضمين لتقليل فقدان الأنسجة أثناء التقسيم.
    7. عينات مدمجة بشكل متسلسل بسمك 5 ميكرومتر وضعها على شرائح مجهر مشحونة.
    8. قم بإجراء تلطيخ H&E بواسطة صبغة أوتوماتيكية وختم مع وسيط تثبيت قبل التصوير.
  2. عند إجراء OCT ، ضع القالب الدقيق مع البصيلات في طبق 50 مم يحتوي على وسائط IVM.
    1. لاتباع الإجراء المستخدم لإنشاء صور OCT التمثيلية ، صورة باستخدام نظام OCT مصمم خصيصا يعمل ضمن النطاق الطيفي للضوء المرئي بدقة محورية تبلغ 1.3 ميكرومتر ودقة جانبية تبلغ 9.4 ميكرومتر61،62.
    2. مسح البصيلات في مجال رؤية 1.58 × 1,58 مم2 ، يتكون من 512 خطا A و 512 مسحا ضوئيا B ، متكررا 2x لكل مسح B و 3x لكل حجم.
    3. قم بمعالجة صور OCT باستخدام ImageJ لتصور البنية ثلاثية الأبعاد للبصيلات وتحديد أحجام التخزين.
      1. قم بتحميل الصور إلى ImageJ كمكدس Z عن طريق سحب الملفات إلى التطبيق المفتوح.
      2. تصور z-stack كصورة ثلاثية الأبعاد بالانتقال إلى الإضافات|3D|عارض وحدة الصوت. قم بتدوير الصورة ثلاثية الأبعاد لعرض زوايا مختلفة في نقاط زمنية مختلفة.
      3. انتقل إلى ملف| حفظ باسم |Tiff لحفظ الصورة في الموقع المطلوب.

9. تحليل الفاصل الزمني لثقافة البصيلات

ملاحظة: توجد البصيلات المزروعة في نظام الاستزراع الخالي من السقالات في نفس المستوى البؤري وهي متوافقة مع التصوير بفاصل زمني في الحاضنة. يمكن بدء التصوير بفاصل زمني بعد بذر البصيلات في الخطوة 7.7 (الشكل 1 ، التطبيق).

تأكد من أن جميع التغييرات دقيقة طوال الفاصل الزمني. ومن ثم ، قم بالمرور عبر المكدس بأكمله بعد كل خطوة لضمان عدم وجود تناقضات في القياسات.

  1. إعداد اللقطات الزمنية
    1. ضع غطاء بؤر / مكثف خفيف على المجهر المحمول باليد.
    2. ضع المجهر المحمول باليد مع حامل التثبيت في الحاضنة وقم بتوصيله بجهاز كمبيوتر محمول مثبت عليه.
    3. ضع المزرعة وقم بمحاذاة المجهر جيدا واضبط ارتفاع المجهر وتركيزه بحيث تكون جميع البصيلات في بؤرة التركيز. باستخدام توازن اللون الأبيض التلقائي (AWB)، اختر ظروف الإضاءة المثلى باستخدام التحكم في مؤشر LED، وقم بإيقاف تشغيل التعريض الضوئي التلقائي (AE)، وحدد وقت التعريض الضوئي الأمثل.
      ملاحظة: تأكد من أن محاذاة القالب هي نفسها قبل وبعد كل تغيير للوسائط ؛ خلاف ذلك ، يجب إجراء التحليل بشكل منفصل لكل يومين من الثقافة.
    4. ابدأ التصوير بفاصل زمني ، وحدد مدة 8 أيام وفاصل زمني 30 دقيقة. حدد الصورة وقم بإيقاف تشغيل مؤشر LED عند عدم التقاط الصور.
  2. حدد القياسات التي سيتم تسجيلها في مربع حوار تعيين القياسات (انقر فوق تحليل | تعيين القياسات) قبل تحليل ImageJ.
    ملاحظة: لمزيد من المعلومات حول القياسات المحتملة المدمجة في برنامج ImageJ، راجع القسم الفرعي 30.763 لدليل المستخدم.
  3. ضع جميع الصور في مجلد تحليل منفصل لبدء التحليل.
  4. اسحب مجلد التحليل وأفلته في برنامج ImageJ لفتح الفاصل الزمني كمكدس. تأكد من تحديد أسماء الفرز رقميا وإذا لم تتناسب تسلسلات الصور مع ذاكرة الوصول العشوائي للكمبيوتر، فحدد المكدس الظاهري.
  5. استخدم أداة التحديد المستطيلة لتحديد منطقة توجد بها جميع البصيلات طوال الفاصل الزمني. لهذا ، استخدم الصورة الأخيرة أولا وقم بالتمرير عبر المكدس للتأكد من عدم قطع أي من البصيلات. بعد ذلك ، قم بقص التحديد (انتقل إلى صورة | اقتصاص أو Ctrl + Shift + X ، الشكل 5Ai ، ii).
  6. تعيين شريط المقياس لمكدس الفاصل الزمني (تحليل | تعيين المقياس). استخدم صورة اليوم 0 المصنوعة باستخدام جهاز التصوير وقم بقياس ثلاث ميزات يمكن تحديدها مثل البصيلات أو الآبار الدقيقة. استخدم نفس اليوم 0 صورة من مكدس الفاصل الزمني وحدد مقياس أحد القياسات ؛ استخدم القياسين الآخرين لتأكيد ضبط المقياس الدقيق.
  7. قم بمحاذاة جميع الصور باستخدام المكون الإضافي SIFT (انتقل إلى المكونات الإضافية | التسجيل | محاذاة المكدس الخطي مع SIFT ، (الشكل 5Bi ، ii). استخدم الإعدادات القياسية التالية، والتي يمكن ضبطها على أساس كل حالة: محاذاة المكدس الخطي مع SIFT، initial_gaussian_blur = 1.60 steps_per_scale_octave = 3 minimum_image_size = 64 maximum_image_size = 1024 feature_descriptor_size = 4 feature_descriptor_orientation_bins = 8 أقرب/next_closest_ratio = 0.92 maximal_alignment_error = 25 inlier_ratio = 0.05 expected_transformation=استيفاء صلب.
  8. تحويل المكدس إلى تدرج رمادي 8 بت (صورة | النوع | 8 بت).
  9. قم بإزالة الخلفية باستخدام طرح خلفية الكرة المتدحرجة (انقر فوق عملية | طرح الخلفية ، الشكل 5Ci ، ii) باستخدام الإعدادات التالية ، والتي يمكن تعديلها على أساس كل حالة: نصف قطر الكرة المتدحرجة = 70.0 بكسل ؛ حدد تعطيل التنعيم.
  10. عتبة الصورة (انتقل إلى الصورة | ضبط | Threshold) لتقسيم صور الفاصل الزمني إلى فئتين من وحدات البكسل ، باستخدام الإعدادات التالية: setThreshold (35 ، 255 ، "raw") ؛ run("تطبيق LUT" ، "مكدس") ؛ setOption ("BlackBackground" ، true) ؛ run ("Convert to Mask" ، "method = Intermodes background = Dark calculate black").
  11. قم بقياس كل بصيلات على حدة باستخدام تحديد المستطيل، ثم حدد وظيفة تحليل الجسيمات (انقر فوق تحليل | تحليل الجسيمات). استخدم الإعدادات التالية: تحليل الجسيمات ...", "الحجم = 8000-Infinity display exclude بما في ذلك تلخيص تراكب إضافة مكدس مركب (الشكل 5Di,ii).
    1. قبل حفظ النتائج ، تأكد من دقة عائد الاستثمار لكل صورة (الشكل 5Ei، ii). حفظ الملخص والنتائج في ملف . تنسيق CSV.
    2. كرر هذا لجميع البصيلات الأخرى.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

لتحديد ما إذا كان بقاء البصيلات ونموها مدعومين باستخدام هذه التكنولوجيا الجديدة كما هو موضح في قسم البروتوكول 7 ، تم عزل بصيلات من نفس الفئران وزراعتها بالتوازي في قوالب الاغاروز الدقيقة أو مغلفة في ألجينات 0.5٪. أظهرت الصور التمثيلية للبصيلات من كل يومين من الثقافة نموا طبيعيا ونموا وتشكيل تجويف غاري طوال فترة الاستزراع (الشكل 6 أ). أظهرت النتائج المنشورة سابقا أن بقاء البصيلات لا يظهر فروقا ذات دلالة إحصائية بين طرق الاستزراع وقطر أكبر بكثير للبصيلات المزر...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

يعد تكوين الأمشاج في المختبر والنضج من التقنيات الرئيسية للفهم الأساسي لبيولوجيا البويضات ، مع تطبيقات محتملة في تكنولوجيا الإنجاب المساعدة ، والحفاظ على الخصوبة ، والحفاظ على الأنواع. غالبا ما تعتمد طرق دعم IVG على الزراعة المشتركة مع الخلايا الجسدية لإنشاء المبايض المعاد بناؤها30. إن أهمية هذه الخلايا الداعمة معروفة جيدا في الجسم الحي ، حيث تعتبر البيئة المكروية الجسدية المسامية ضرورية لنمو البويضات وتطورها بشكل صحي2

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

ليس لدى المؤلفين تضارب في المصالح للإفصاح عنها.

شكر وتقدير

تم تمويل هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية لصحة الطفل والتنمية البشرية (R01HD105752 إلى F.E.D و T32HD094699 إلى EZ) وبرنامج SenNet التابع للصندوق المشترك للمعاهد الوطنية للصحة (U54AG075932 و UH3CA268105 إلى FED) ومنحة مؤسسة بيل وميليندا جيتس (INV-003385 إلى F.E.D). بموجب شروط المنح الخاصة بمؤسسة بيل وميليندا غيتس ، تم بالفعل تعيين ترخيص عام للمشاع الإبداعي 4.0 لنسخة المخطوطة المقبولة من المؤلف والتي قد تنشأ عن هذا التقديم.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
<قوي>المواد والمواد الكيميائية
  أنابيب طرد مركزي بوليسترين بسعة 50 ملغلوب ساينتفيك941-11017-CS
أنابيب الطرد المركزي الدقيق بسعة 1.5 ملفيشر ساينتيفكMCT-150لتجميد الوسائط وتخزينها
طبق 100 مم، غير معالجفيشر ساينتيفك08-757-100D لصنع وتخزين قوالب الأغاروز الدقيقة
100٪ إيثانولمرسيدس ساينتيفك1200معالجة الأنسجة
1000 وميكرو؛ L  أطراف الماصحة، احتفاظ منخفضMIDSCIPR-1000BKنصائح ثقافية  
200 وميكرو؛ L  أطراف الماصحة، احتفاظ منخفضMIDSCIPR-200BKنصائح ثقافية  
صفيحة ذات 24 بئركورنينغ353047الثقافة
أطباق 35 ممفالكون351008عزل المبايض والاحتضان في وسط إنيزماتي
95٪ إيثانولمرسيدس ساينتيفك1210معالجة الأنسجة
أغاروزهوفرGR140القوالب الدقيقة
زيت بايوكسترا المعدني، زيت خفيف، مناسب لزراعة خلايا جنين الفأرسيغما-ألدرتشM5310-500MLيستخدم كعامل متوافق حيويا لإزالة القالب
مصل البقر ألبومين MP Biomedicals103700نمو الإعلام
تنظيف التنظيف (Cleaning Dusters)، 10 أونصات، عبوة من 6مكتب ديبوت 110284الهواء المضغوط
راتنج كلير V4 سعة 1 لترفورملابز، إنكRS-F2-GPCL-04راتنج الطباعة ثلاثية الأبعاد
البلاستيك القابل لإعادة الاستخدام من كورنينغ، كأس منخفض الشكل 100 مل، بولي بروبيلين، مدرجكورنينغ1000P-100كأس لخلط مكونات السيليكون  
DNAse Iتشياغن79254الوسائط الإنزيمية
إيكوفليكس 00-45 قرب كليرشركة سموذ-أون، إنكB09M8Y9PTVمادة السيليكون
F-12 + جلوتاماكسجيبكو31765-035نمو الإعلام
جنينة البقر الجنينيسيغماF-3385نمو الإعلام
مصل الأبقار الجنيني (FBS)مصل الذروةPS-FB2وسائط التشريح، الوسائط الإنزيمية،   وسائط الصيانة والوسائط وسائط النضج
فيشربراند   أكياس التعقيمفيشر ساينتيفك01-812-50 أكياس التعقيم
هرمون تحفيز الجريبات (FSH)شركة EMD سيرونو، إنك.وصفة جونال-F فقط الإعلام والنمو وسائط النضج
Gibco  متلازمة DPBS، الكالسيوم، المغنيسيومفيشر ساينتيفك14-040-182 محلول دولبيكو الملحي المخزن بالفوسفات
الغونادوتروبين المشيمي البشري (hCG)سيغما ألدريتشC1063-1VLوسائط النضج
الإنسولين-ترانسفيرين-السيلينيوم (ITS)ثيرموفيشر41400045نمو الإعلام
المجسات الجزيئية للطاقة الرودامين فالويدينفيشر ساينتيفكR415بقعة هيكل خلوي البيضة
أطباق التلقيح الصناعيثيرمو ساينتفيك150260لعزل واختيار وتسوية الجريبات مسبقا
ليبوفيتز 15 (L15)جيبكو11415-064التشريح والوسائط الوسائط الإنزيمية
ليبرازيسيغما ألدريتش5401119001الوسائط الإنزيمية
ميم؟ + جلوتاماكسجيبكو32561-037مينتنانس ميديا،  الإعلام والنمو وسائط النضج
عامل نمو البشرة للفأر (EGF)بكالوريوس العلوم الحيوية354010وسائط النضج
مزيل مجفف نالجين الشفاف من البولي كربونات كلاسيكي التصميمثيرمو ساينتفيك5311-0250مزيل الفراغ 
البارافينفيشر ساينتيفك83-30معالجة الأنسجة ومعالجة الأنسجة التضمين
البنسلين-ستربتوميسينجيبكو15140-122وسائط التشريح، الوسائط الإنزيمية والإعلام وسائط الصيانة
نصائح للراقصينأوريجيوMXL3-200الثقافة
وسيط تركيب مضاد التدرج VECTASHIELD PLUS مع DAPIمختبرات فيكتورH-2000صبغة نواة البيض
زيلينمرسيدس ساينتيفك9840معالجة الأنسجة
α-tubulin (11H10) أرنب mAb (Alexa Fluor 488 conjungate)تقنية الإشارة الخلوية5063Sصبغة بيض توبولين
<قوي>معدات
بناء منصة 2فورملابز، إنكBP-F3-02-01 مكون الطابعة ثلاثية الأبعاد
Dino-Lite Edge AF4915ZTL، USB 2.0دينو-لايتAF4915ZTLمصور لإعداد التايم لابس
خزان راتنج الشكل 3 V2.1 فورملابز، إنكRT-F3-02-01مكون الطابعة ثلاثية الأبعاد
نموذج 3B+ طابعة ثلاثية الأبعادفورملابز، إنكF3B-P-Printerطابعة الطباعة ثلاثية الأبعاد من Formlabs باستخدام الطباعة المجسمة (SLA)
علاج الشكل  فورملابز، إنكFH-CU-01منصة المعالجة 
غسل الشكلفورملابز، إنكFH-WA-01منصة الغسيل
زجاجة رش مع جهاز تبخير المضخةVWR0309-3005لتطبيق عامل إزالة القالب
غطاء تركيز/تركيز الضوء لسلسلة Edge (باستثناء طرازات T5 وT8)دينو-لايتN3C-Rمكون التصوير لإعداد التايم لابس
حزمة حامل التركيب التي تجمع بين رف RK-10 وذراع RK-10-EX Arm Extensionدينو-لايتRK-10Aمكون التصوير لإعداد التايم لابس
مبرمج الأنسجةلايكاهيستوكور أركاديالتضمين القوالب الصغيرة
معالج الأنسجةلايكاTP1020لمعالجة القوالب الصغيرة
حاضنة الهز 211DS (الهزاز المداري)لابنت إنترناشونالI-5211-DSحضانة المبايض في الأوساط الإنزمية لإطلاق الجريبات
Software 
أوتوديسك فيوجنشركة أوتوديسك، إنكبرنامج التصميم بمساعدة الحاسوب (CAD). تقدم أوتوديسك وصولا تعليميا مجانيا من خلال برنامج أوتوديسك التعليمي.
إصدار DinoCapture 3.0 1.1.1.3 دينو-لايت
ImageJالمعاهد الوطنية للصحةتحليل صور OCT وقياس الجريبات
ما قبل التقديمفورملابز، إنكبرنامج تحضير الطباعة الحر المصمم للعمل مع طابعات الطباعة الستيريوليثوغرافية (SLA) من Formlabs. 

المراجع

  1. Duncan, F. E., et al. Unscrambling the oocyte and the egg: clarifying terminology of the female gamete in mammals. Mol Hum Reprod. 26 (11), 797-800 (2020).
  2. Jaffe, L., Egbert, J. R. Regulation of mammalian oocyte meiosis by intercellular communication within the ovarian follicle. Annu Rev Physiol. 79 (1), 237-260 (2016).
  3. Baerwald, A. R., Adams, G. P., Pierson, R. A. Ovarian antral folliculogenesis during the human menstrual cycle: a review. Hum Reprod Updat. 18 (1), 73-91 (2012).
  4. American Society for Reproductive Medicine. Testing and interpreting measures of ovarian reserve: a committee opinion. Fertil Steril. 114 (6), 1151-1157 (2020).
  5. Telfer, E. E., Grosbois, J., Odey, Y. L., Rosario, R., Anderson, R. A. Making a good egg: human oocyte health, aging, and in vitro development. Physiol Rev. 103 (4), 2623-2677 (2023).
  6. Young, J. M., McNeilly, A. S. Theca: the forgotten cell of the ovarian follicle. Reproduction. 140 (4), 489-504 (2010).
  7. Liu, T., Qin, Q. Y., Qu, J. X., Wang, H. Y., Yan, J. Where are the theca cells from: the mechanism of theca cells derivation and differentiation. Chin Med J. 133 (14), 1711-1718 (2020).
  8. Abbara, A., Clarke, S. A., Dhillo, W. S. Novel concepts for inducing final oocyte maturation in in vitro fertilization treatment. Endocr Rev. 39 (5), 593-628 (2018).
  9. Conti, M., Franciosi, F. Acquisition of oocyte competence to develop as an embryo: integrated nuclear and cytoplasmic events. Hum Reprod Updat. 24 (3), 245-266 (2018).
  10. Williams, C. J., Erickson, G. F. Morphology and physiology of the ovary. , (2000).
  11. Lees-Murdock, D. J., Lau, H. T., Castrillon, D. H., Felici, M. D., Walsh, C. P. DNA methyltransferase loading, but not de novo methylation, is an oocyte-autonomous process stimulated by SCF signalling. Dev Biol. 321 (1), 238-250 (2008).
  12. Jiang, Y., He, Y., Pan, X., Wang, P., Yuan, X., Ma, B. Advances in oocyte maturation in vivo and in vitro in mammals. Int J Mol Sci. 24 (10), 9059(2023).
  13. Clarke, H. J. Regulation of germ cell development by intercellular signaling in the mammalian ovarian follicle. Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 7 (1), (2018).
  14. Hsueh, A. J. W., Kawamura, K., Cheng, Y., Fauser, B. C. J. M. Intraovarian control of early folliculogenesis. Endocr Rev. 36 (1), 1-24 (2015).
  15. Smitz, J., et al. Current achievements and future research directions in ovarian tissue culture, in vitro follicle development and transplantation: implications for fertility preservation. Hum Reprod Updat. 16 (4), 395-414 (2010).
  16. Resetkova, N., Hayashi, M., Kolp, L. A., Christianson, M. S. Fertility preservation for prepubertal girls: update and current challenges. Curr Obstet Gynecol Rep. 2 (4), 218-225 (2013).
  17. Wallace, W. H. B., Kelsey, T. W., Anderson, R. A. Fertility preservation in pre-pubertal girls with cancer: the role of ovarian tissue cryopreservation. Fertil Steril. 105 (1), 6-12 (2016).
  18. Donnez, J., Dolmans, M. M. Fertility preservation in women. Nat Rev Endocrinol. 9 (12), 735-749 (2013).
  19. Cabeza, J. P., Gambini, A. Advancements and challenges in in vitro reproductive technologies for the conservation of equine species. Theriogenology Wild. 2, 100036(2023).
  20. Nagashima, J. B., Hill, A. M., Songsasen, N. In vitro development of mechanically and enzymatically isolated cat ovarian follicles. Reprod Fertil. 2 (1), 35-46 (2021).
  21. Zhang, J., et al. An ex vivo ovulation system enables the discovery of novel ovulatory pathways and nonhormonal contraceptive candidates. Biol Reprod. 108 (4), 629-644 (2023).
  22. Gal, A., Gedye, K., Craig, Z. R., Ziv-Gal, A. Propylparaben inhibits mouse cultured antral follicle growth, alters steroidogenesis, and upregulates levels of cell-cycle and apoptosis regulators. Reprod Toxicol. 89, 100-106 (2019).
  23. Zhou, H., Shikanov, A. Three-dimensional hydrogel-based culture to study the effects of toxicants on ovarian follicles. Methods Mol Biol. 1758, 55-72 (2018).
  24. Silber, S. J., Goldsmith, S., Castleman, L., Hayashi, K. In vitro maturation, in vitro oogenesis, and ovarian longevity. Reprod Sci. 31 (5), 1234-1245 (2024).
  25. Tian, C., et al. Functional oocytes derived from granulosa cells. Cell Rep. 29 (13), 4256-4267 (2019).
  26. Zolfaghar, M., et al. Wharton's jelly derived mesenchymal stem cells differentiate into oocyte like cells in vitro by follicular fluid and cumulus cells conditioned medium. Heliyon. 6 (10), e04992(2020).
  27. Psathaki, O. E., et al. Ultrastructural characterization of mouse embryonic stem cell-derived oocytes and granulosa cells. Stem Cells Dev. 20 (12), 2205-2215 (2011).
  28. Malik, H. N., Singhal, D. K., Saini, S., Malakar, D. Derivation of oocyte-like cells from putative embryonic stem cells and parthenogenetically activated into blastocysts in goat. Sci Rep. 10 (1), 10086(2020).
  29. Saitou, M., Miyauchi, H. Gametogenesis from pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 18 (6), 721-735 (2016).
  30. Saitou, M., Hayashi, K. Mammalian in vitro gametogenesis. Science. 374 (6563), eaaz6830(2021).
  31. Yoshino, T., et al. Generation of ovarian follicles from mouse pluripotent stem cells. Science. 373 (6552), (2021).
  32. Hikabe, O., et al. Reconstitution in vitro of the entire cycle of the mouse female germ line. Nature. 539 (7628), 299-303 (2016).
  33. Simon, L. E., Kumar, T. R., Duncan, F. E. In vitro ovarian follicle growth: a comprehensive analysis of key protocol variables. Biol Reprod. 103 (3), 455-470 (2020).
  34. Green, L. J., Shikanov, A. In vitro culture methods of preantral follicles. Theriogenology. 86 (1), 229-238 (2016).
  35. Wycherley, G., Downey, D., Kane, M. T., Hynes, A. C. A novel follicle culture system markedly increases follicle volume, cell number and oestradiol secretion. Reproduction. 127 (6), 669-677 (2004).
  36. Nation, A., Selwood, L. The production of mature oocytes from adult ovaries following primary follicle culture in a marsupial. Reproduction. 138 (2), 247-255 (2009).
  37. Xiao, S., Zhang, J., Romero, M. M., Smith, K. N., Shea, L. D., Woodruff, T. K. In vitro follicle growth supports human oocyte meiotic maturation. Sci Rep. 5 (1), 17323(2015).
  38. Converse, A., Zaniker, E. J., Amargant, F., Duncan, F. E. Recapitulating folliculogenesis and oogenesis outside the body: encapsulated in vitro follicle growth. Biol Reprod. 108 (1), 5-22 (2022).
  39. Tomaszewski, C. E., DiLillo, K. M., Baker, B. M., Arnold, K. B., Shikanov, A. Sequestered cell-secreted extracellular matrix proteins improve murine folliculogenesis and oocyte maturation for fertility preservation. Acta Biomater. 132, 313-324 (2021).
  40. Kreeger, P. K., Deck, J. W., Woodruff, T. K., Shea, L. D. The in vitro regulation of ovarian follicle development using alginate-extracellular matrix gels. Biomaterials. 27 (5), 714-723 (2006).
  41. Xu, Y., Duncan, F. E., Xu, M., Woodruff, T. K. Use of an organotypic mammalian in vitro follicle growth assay to facilitate female reproductive toxicity screening. Reprod Fertil Dev. 28 (9), 1295-1306 (2015).
  42. West, E., Shea, L., Woodruff, T. Engineering the follicle microenvironment. Semin Reprod Med. 25 (4), 287-299 (2007).
  43. Xu, M., et al. In vitro oocyte maturation and preantral follicle culture from the luteal-phase baboon ovary produce mature oocytes. Biol Reprod. 84 (4), 689-697 (2011).
  44. Kreeger, P. K., Fernandes, N. N., Woodruff, T. K., Shea, L. D. Regulation of mouse follicle development by follicle-stimulating hormone in a three-dimensional in vitro culture system is dependent on follicle stage and dose. Biol Reprod. 73 (5), 942-950 (2005).
  45. Pangas, S. A., Saudye, H., Shea, L. D., Woodruff, T. K. Novel approach for the three-dimensional culture of granulosa cell-oocyte complexes. Tissue Eng. 9 (5), 1013-1021 (2003).
  46. Parrish, E. M., Siletz, A., Xu, M., Woodruff, T. K., Shea, L. D. Gene expression in mouse ovarian follicle development in vivo versus an ex vivo alginate culture system. Reproduction. 142 (2), 309-318 (2011).
  47. Xu, M., West, E., Shea, L. D., Woodruff, T. K. Identification of a stage-specific permissive in vitro culture environment for follicle growth and oocyte development. Biol Reprod. 75 (6), 916-923 (2006).
  48. Xu, M., Banc, A., Woodruff, T. K., Shea, L. D. Secondary follicle growth and oocyte maturation by culture in alginate hydrogel following cryopreservation of the ovary or individual follicles. Biotechnol Bioeng. 103 (2), 378-386 (2009).
  49. Babayev, E., Xu, M., Shea, L. D., Woodruff, T. K., Duncan, F. E. Follicle isolation methods reveal plasticity of granulosa cell steroidogenic capacity during mouse in vitro follicle growth. Mol Hum Reprod. 28 (10), gaac033(2022).
  50. Brito, I. R., et al. Alginate hydrogel matrix stiffness influences the in vitro development of caprine preantral follicles. Mol Reprod Dev. 81 (7), 636-645 (2014).
  51. West, E. R., Xu, M., Woodruff, T. K., Shea, L. D. Physical properties of alginate hydrogels and their effects on in vitro follicle development. Biomaterials. 28 (30), 4439-4448 (2007).
  52. Amorim, C. A., Langendonckt, A. V., David, A., Dolmans, M. M., Donnez, J. Survival of human pre-antral follicles after cryopreservation of ovarian tissue, follicular isolation and in vitro culture in a calcium alginate matrix. Hum Reprod. 24 (1), 92-99 (2009).
  53. Xu, M., Kreeger, P. K., Shea, L. D., Woodruff, T. K. Tissue-engineered follicles produce live, fertile offspring. Tissue Eng. 12 (10), 2739-2746 (2006).
  54. Thorne, J. T., Segal, T. R., Chang, S., Jorge, S., Segars, J. H., Leppert, P. C. Dynamic reciprocity between cells and their microenvironment in reproduction. Biol Reprod. 92 (1), 25(2015).
  55. Shea, L. D., Woodruff, T. K., Shikanov, A. Bioengineering the ovarian follicle microenvironment. Biomed Eng. 16 (1), 29-52 (2014).
  56. Berkholtz, C., Shea, L., Woodruff, T. Extracellular matrix functions in follicle maturation. Semin Reprod Med. 24 (4), 262-269 (2006).
  57. Zaniker, E. J., Hashim, P. H., Gauthier, S., Ankrum, J. A., Campo, H., Duncan, F. E. Three-dimensionally printed agarose micromold supports scaffold-free mouse ex vivo follicle growth, ovulation, and luteinization. Bioengineering. 11 (7), 719(2024).
  58. Fluks, M., Milewski, R., Tamborski, S., Szkulmowski, M., Ajduk, A. Spindle shape and volume differ in high- and low-quality metaphase II oocytes. Reproduction. 167 (4), (2024).
  59. Tomari, H., et al. Meiotic spindle size is a strong indicator of human oocyte quality. Reprod Med Biol. 17 (3), 268-274 (2018).
  60. Popescu, D. P., et al. Optical coherence tomography: fundamental principles, instrumental designs and biomedical applications. Biophys Rev. 3 (3), 155(2011).
  61. Fang, R., et al. Robotic visible-light optical coherence tomography visualizes segmental Schlemm's canal anatomy and segmental pilocarpine response. Invest Ophthalmol Vis Sci. 66 (2), 47(2025).
  62. Kim, D., et al. In vivo quantification of anterior and posterior chamber volumes in mice: implications for aqueous humor dynamics. Invest Ophthalmol Vis Sci. 66 (1), 18(2025).
  63. ImageJ user guide - IJ 1.46r | Analyze menu. , https://imagej.net/ij/docs/guide/146-30.html#toc-Subsection-30.7 (2012).
  64. Takashima, T., Fujimaru, T., Obata, Y. Effect of in vitro growth on mouse oocyte competency, mitochondria and transcriptome. Reproduction. 162 (4), 307-318 (2021).
  65. Xu, J., Zelinski, M. B. Oocyte quality following in vitro follicle development. Biol Reprod. 106 (2), 291-315 (2021).
  66. Li, A., et al. Nuclear and cytoplasmic quality of oocytes derived from serum-free culture of secondary follicles in vitro. J Cell Physiol. 236 (7), 5352-5361 (2021).
  67. Jin, S. Y., Lei, L., Shikanov, A., Shea, L. D., Woodruff, T. K. A novel two-step strategy for in vitro culture of early-stage ovarian follicles in the mouse. Fertil Steril. 93 (8), 2633-2639 (2010).
  68. Xiao, S., Duncan, F. E., Bai, L., Nguyen, C. T., Shea, L. D., Woodruff, T. K. Size-specific follicle selection improves mouse oocyte reproductive outcomes. Reproduction. 150 (3), 183-192 (2015).
  69. Pepling, M. E., Sundman, E. A., Patterson, N. L., Gephardt, G. W., Medico, L., Wilson, K. I. Differences in oocyte development and estradiol sensitivity among mouse strains. Reproduction. 139 (2), 349-357 (2010).
  70. Canning, J., Takai, Y., Tilly, J. L. Evidence for genetic modifiers of ovarian follicular endowment and development from studies of five inbred mouse strains. Endocrinology. 144 (1), 9-12 (2003).
  71. Hirshfeld-Cytron, J. E., Duncan, F. E., Xu, M., Jozefik, J. K., Shea, L. D., Woodruff, T. K. Animal age, weight and estrus cycle stage impact the quality of in vitro grown follicles. Hum Reprod. 26 (9), 2473-2485 (2011).
  72. Tingen, C. M., Bristol-Gould, S. K., Kiesewetter, S. E., Wellington, J. T., Shea, L., Woodruff, T. K. Prepubertal primordial follicle loss in mice is not due to classical apoptotic pathways. Biol Reprod. 81 (1), 16-25 (2009).
  73. Wang, H., et al. Rejuvenation of aged oocyte through exposure to young follicular microenvironment. Nat Aging. 4 (9), 1194-1210 (2024).
  74. Briley, S. M., et al. Reproductive age-associated fibrosis in the stroma of the mammalian ovary. Reproduction. 152 (3), 245-260 (2016).
  75. Amargant, F., et al. Ovarian stiffness increases with age in the mammalian ovary and depends on collagen and hyaluronan matrices. Aging Cell. 19 (11), e13259(2020).
  76. Umehara, T., Richards, J. S., Shimada, M. The stromal fibrosis in aging ovary. Aging (Albany NY). 10 (1), 9-10 (2018).
  77. Pietroforte, S., Plough, M., Amargant, F. Age-associated increased stiffness of the ovarian microenvironment impairs follicle development and oocyte quality and rapidly alters follicle gene expression. bioRxiv. , (2024).
  78. McElhinney, K. L., Rowell, E. E., Laronda, M. M. Encapsulation of bovine primordial follicles in rigid alginate does not affect growth dynamics. Bioengineering. 11 (7), 734(2024).
  79. Dean, D. M., Napolitano, A. P., Youssef, J., Morgan, J. R. Rods, tori, and honeycombs: the directed self-assembly of microtissues with prescribed microscale geometries. FASEB J. 21 (14), 4005-4012 (2007).
  80. Sosa, E., et al. Reconstituted ovaries self-assemble without an ovarian surface epithelium. Stem Cell Rep. 18 (11), 2190-2202 (2023).
  81. Rogers, H. B., et al. Dental resins used in 3D printing technologies release ovo-toxic leachates. Chemosphere. 270, 129003(2021).
  82. de Almeida Monteiro Melo Ferraz, M., et al. Potential health and environmental risks of three-dimensional engineered polymers. Environ Sci Technol Lett. 5 (2), 80-85 (2018).
  83. Bomba-Warczak, E. K., et al. Exceptional longevity of mammalian ovarian and oocyte macromolecules throughout the reproductive lifespan. eLife. 13, RP93172(2024).
  84. Rajendran, S., et al. Automatic ploidy prediction and quality assessment of human blastocysts using time-lapse imaging. Nat Commun. 15 (1), 7756(2024).
  85. Bori, L., Meseguer, F., Valera, M. A., Galan, A., Remohi, J., Meseguer, M. The higher the score, the better the clinical outcome: retrospective evaluation of automatic embryo grading as a support tool for embryo selection in IVF laboratories. Hum Reprod. 37 (6), 1148-1160 (2022).
  86. Merces, G. O. T., Kennedy, C., Lenoci, B., Reynaud, E. G., Burke, N., Pickering, M. The incubot: a 3D printer-based microscope for long-term live cell imaging within a tissue culture incubator. HardwareX. 9, e00189(2021).
  87. Xia, Y., Whitesides, G. M. Soft lithography. Angew Chem Int Ed. 37 (5), 550-575 (1998).
  88. Pernodet, N., Maaloum, M., Tinland, B. Pore size of agarose gels by atomic force microscopy. Electrophoresis. 18 (1), 55-58 (1997).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

إنتاج واستخدام قوالب الاغاروز القابلة للتخصيص لزراعة بصيلات مبيض الفأر الخالية من السقالات
اتصل بنا
أوصِ بها للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

2026 © حقوق الطبع والنشر MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.