إنتاج واستخدام قوالب الاغاروز القابلة للتخصيص لزراعة بصيلات مبيض الفأر الخالية من السقالات

ملخص

نصف طرق زراعة بصيلات المبيض في قالب الاغاروز الجديد الخالي من السقالات الذي يكمل تكوين الأمشاج في المختبر .

الملخص

بصيلات المبيض هي الوحدة الوظيفية للمبيض التي تنتج الهرمونات والأمشاج اللازمة للحفاظ على الوظيفة الإنجابية للأنثى وصحتها. القدرة على تلخيص تكوين الجريبات والإباضة واللوتين في المختبر لها فائدة أساسية وانتقالية وسريرية واسعة. تحافظ أنظمة نمو البصيلات الأكثر تقدما في المختبر على بنية البصيلات ثلاثية الأبعاد (3D) ، وهو أمر بالغ الأهمية لتطوير بويضات الطور الثاني المؤهلة انقتصايا في البشر. في الآونة الأخيرة ، تم تطوير طريقة خالية من السقالات لنمو البصيلات في المختبر لبصيلات الفأر الثانوية متعددة الطبقات والتحقق من صحتها. لهذا الغرض ، تم استخدام القوالب المطبوعة ثلاثية الأبعاد المخصصة لتشكيل الاغاروز مع الآبار الدقيقة التي تستوعب التوسع الحجمي للبصيلات. أظهرت البصيلات المزروعة في هذه البيئة الخالية من السقالات إنتاجا قابلا للهرمونات وقابلية للبقاء مقارنة بأنظمة نمو البصيلات المختبرية المغلفة (eIVFG). الأهم من ذلك ، أن آبار الاگاروز الدقيقة هي طريقة قابلة للتطوير ، وأقل تطلبا من الناحية الفنية ، وتظهر تحسنا في نمو البصيلات ومعدلات الإباضة مقارنة ب eIVFG. تنتج هذه المنهجية قوالب قابلة للتخصيص ومتوافقة حيويا مع البويضة ، وهي خلية شديدة الحساسية للعصارة الخاصة بالمواد والملوثات البيئية الأخرى. علاوة على ذلك ، يتم زراعة البصيلات في هذا النظام في نفس المستوى البؤري ، مما يتيح التصوير والتحليل بفاصل زمني في الوقت الفعلي. لزيادة إمكانية الوصول إلى هذا النهج الجديد ، توضح هذه المقالة بالتفصيل الطرق اللازمة لتصميم القوالب الرئيسية والطباعة ثلاثية الأبعاد ، وإنشاء قوالب سيليكون لألواح 24 أو 96 بئرا ، وزراعة بصيلات المبيض الثانوية متعددة الطبقات المعزولة في قوالب الاغاروز. يمكن أيضا دمج هذا الإعداد مع نظام تصوير بفاصل زمني فعال من حيث التكلفة، مما يتيح التحليل الشكلي. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن أن تكون القوالب مدمجة في البارافين للتحليلات النسيجية النهائية. بشكل عام ، تعد هذه الطريقة سهلة الاستخدام أداة متعددة الاستخدامات لزراعة البصيلات ويمكن تخصيصها بشكل أكبر لتعزيز تمايز ونضج الخلايا الجرثومية في سياق المسام للحفاظ على تكوين الأمشاج الكامل في المختبر .

المقدمة

تساهم البويضة ، أو الأمشاج الأنثوية ، بالجزء الأكبر من السيتوبلازم ونصف المادة الوراثية للجنين عند الإخصاب ، وهو أمر ضروري لنمو الجيل القادم. يبدأ تكوين البويضات أثناء التطور الجنيني عندما تدخل الخلايا الجرثومية البدائية الانقسام الاختزالي وتتوقف في الطور الأول. توجد هذه البويضات داخل البصيلات البدائية وتشكل احتياطي المبيض ، وهو تجمع محدود وغير متجدد يتم تجنيدها منه تدريجيا. تتطور البصيلات في عملية تعرف باسم تكوين الجريبات ، بهدف إنتاج مشيج ناضج قادر على الإخصاب^{1،2،3،4،5}. ي....

البروتوكول

تمت الموافقة على جميع إجراءات المتعلقة بهذا البروتوكول من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدامها (IACUC) بجامعة نورث وسترن وتم تنفيذها وفقا لدليل المعاهد الوطنية للصحة لرعاية واستخدام المختبر.

1. تكييف تصميم القالب الرئيسي

يصف هذا القسم الخطوات الأولى التي تم إجراؤها خلال مرحلة التصميم (الشكل 1) ، حيث يتم إدخال الآبار الصغيرة المخصصة في تصميم بمساعدة الكمبيوتر (CAD) لقالب رئيسي لألواح الزراعة المكونة من 24 بئرا ، يسمى تصميم قاعدة القالب الرئيسي المكون من 24 بئرا (الملف التكميلي 1). تحدد....

النتائج

لتحديد ما إذا كان بقاء البصيلات ونموها مدعومين باستخدام هذه التكنولوجيا الجديدة كما هو موضح في قسم البروتوكول 7 ، تم عزل بصيلات من نفس الفئران وزراعتها بالتوازي في قوالب الاغاروز الدقيقة أو مغلفة في ألجينات 0.5٪. أظهرت الصور التمثيلية للبصيلات من كل يومين من الثقافة نموا طبيعيا ونموا وتشكيل تجويف غاري طوال فترة الاستزراع (الشكل 6 أ). أظهرت النتائج المنشورة سابقا أن بقاء البصيلات لا يظهر فروقا ذات دلالة إحصائية بين طرق الاستزراع وقطر أكبر بكثير للبصيلات المزر.......

المناقشة

يعد تكوين الأمشاج في المختبر والنضج من التقنيات الرئيسية للفهم الأساسي لبيولوجيا البويضات ، مع تطبيقات محتملة في تكنولوجيا الإنجاب المساعدة ، والحفاظ على الخصوبة ، والحفاظ على الأنواع. غالبا ما تعتمد طرق دعم IVG على الزراعة المشتركة مع الخلايا الجسدية لإنشاء المبايض المعاد بناؤها³⁰. إن أهمية هذه الخلايا الداعمة معروفة جيدا في الجسم الحي ، حيث تعتبر البيئة المكروية الجسدية المسامية ضرورية لنمو البويضات وتطورها بشكل صحي²

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
<قوي>المواد والمواد الكيميائية
أنابيب طرد مركزي بوليسترين بسعة 50 مل	غلوب ساينتفيك	941-11017-CS
أنابيب الطرد المركزي الدقيق بسعة 1.5 مل	فيشر ساينتيفك	MCT-150	لتجميد الوسائط وتخزينها
طبق 100 مم، غير معالج	فيشر ساينتيفك	08-757-100D	لصنع وتخزين قوالب الأغاروز الدقيقة
100٪ إيثانول	مرسيدس ساينتيفك	1200	معالجة الأنسجة
1000 وميكرو؛ L  أطراف الماصحة، احتفاظ منخفض	MIDSCI	PR-1000BK	نصائح ثقافية
200 وميكرو؛ L  أطراف الماصحة، احتفاظ منخفض	MIDSCI	PR-200BK	نصائح ثقافية
صفيحة ذات 24 بئر	كورنينغ	353047	الثقافة
أطباق 35 مم	فالكون	351008	عزل المبايض والاحتضان في وسط إنيزماتي
95٪ إيثانول	مرسيدس ساينتيفك	1210	معالجة الأنسجة
أغاروز	هوفر	GR140	القوالب الدقيقة
زيت بايوكسترا المعدني، زيت خفيف، مناسب لزراعة خلايا جنين الفأر	سيغما-ألدرتش	M5310-500ML	يستخدم كعامل متوافق حيويا لإزالة القالب
مصل البقر ألبومين	MP Biomedicals	103700	نمو الإعلام
تنظيف التنظيف (Cleaning Dusters)، 10 أونصات، عبوة من 6	مكتب ديبوت	110284	الهواء المضغوط
راتنج كلير V4 سعة 1 لتر	فورملابز، إنك	RS-F2-GPCL-04	راتنج الطباعة ثلاثية الأبعاد
البلاستيك القابل لإعادة الاستخدام من كورنينغ، كأس منخفض الشكل 100 مل، بولي بروبيلين، مدرج	كورنينغ	1000P-100	كأس لخلط مكونات السيليكون
DNAse I	تشياغن	79254	الوسائط الإنزيمية
إيكوفليكس 00-45 قرب كلير	شركة سموذ-أون، إنك	B09M8Y9PTV	مادة السيليكون
F-12 + جلوتاماكس	جيبكو	31765-035	نمو الإعلام
جنينة البقر الجنيني	سيغما	F-3385	نمو الإعلام
مصل الأبقار الجنيني (FBS)	مصل الذروة	PS-FB2	وسائط التشريح، الوسائط الإنزيمية،   وسائط الصيانة والوسائط وسائط النضج
فيشربراند   أكياس التعقيم	فيشر ساينتيفك	01-812-50	أكياس التعقيم
هرمون تحفيز الجريبات (FSH)	شركة EMD سيرونو، إنك.	وصفة جونال-F فقط	الإعلام والنمو وسائط النضج
Gibco  متلازمة DPBS، الكالسيوم، المغنيسيوم	فيشر ساينتيفك	14-040-182	محلول دولبيكو الملحي المخزن بالفوسفات
الغونادوتروبين المشيمي البشري (hCG)	سيغما ألدريتش	C1063-1VL	وسائط النضج
الإنسولين-ترانسفيرين-السيلينيوم (ITS)	ثيرموفيشر	41400045	نمو الإعلام
المجسات الجزيئية للطاقة الرودامين فالويدين	فيشر ساينتيفك	R415	بقعة هيكل خلوي البيضة
أطباق التلقيح الصناعي	ثيرمو ساينتفيك	150260	لعزل واختيار وتسوية الجريبات مسبقا
ليبوفيتز 15 (L15)	جيبكو	11415-064	التشريح والوسائط الوسائط الإنزيمية
ليبرازي	سيغما ألدريتش	5401119001	الوسائط الإنزيمية
ميم؟ + جلوتاماكس	جيبكو	32561-037	مينتنانس ميديا،  الإعلام والنمو وسائط النضج
عامل نمو البشرة للفأر (EGF)	بكالوريوس العلوم الحيوية	354010	وسائط النضج
مزيل مجفف نالجين الشفاف من البولي كربونات كلاسيكي التصميم	ثيرمو ساينتفيك	5311-0250	مزيل الفراغ
البارافين	فيشر ساينتيفك	83-30	معالجة الأنسجة ومعالجة الأنسجة التضمين
البنسلين-ستربتوميسين	جيبكو	15140-122	وسائط التشريح، الوسائط الإنزيمية والإعلام وسائط الصيانة
نصائح للراقصين	أوريجيو	MXL3-200	الثقافة
وسيط تركيب مضاد التدرج VECTASHIELD PLUS مع DAPI	مختبرات فيكتور	H-2000	صبغة نواة البيض
زيلين	مرسيدس ساينتيفك	9840	معالجة الأنسجة
α-tubulin (11H10) أرنب mAb (Alexa Fluor 488 conjungate)	تقنية الإشارة الخلوية	5063S	صبغة بيض توبولين
<قوي>معدات
بناء منصة 2	فورملابز، إنك	BP-F3-02-01	مكون الطابعة ثلاثية الأبعاد
Dino-Lite Edge AF4915ZTL، USB 2.0	دينو-لايت	AF4915ZTL	مصور لإعداد التايم لابس
خزان راتنج الشكل 3 V2.1	فورملابز، إنك	RT-F3-02-01	مكون الطابعة ثلاثية الأبعاد
نموذج 3B+ طابعة ثلاثية الأبعاد	فورملابز، إنك	F3B-P-Printer	طابعة الطباعة ثلاثية الأبعاد من Formlabs باستخدام الطباعة المجسمة (SLA)
علاج الشكل	فورملابز، إنك	FH-CU-01	منصة المعالجة
غسل الشكل	فورملابز، إنك	FH-WA-01	منصة الغسيل
زجاجة رش مع جهاز تبخير المضخة	VWR	0309-3005	لتطبيق عامل إزالة القالب
غطاء تركيز/تركيز الضوء لسلسلة Edge (باستثناء طرازات T5 وT8)	دينو-لايت	N3C-R	مكون التصوير لإعداد التايم لابس
حزمة حامل التركيب التي تجمع بين رف RK-10 وذراع RK-10-EX Arm Extension	دينو-لايت	RK-10A	مكون التصوير لإعداد التايم لابس
مبرمج الأنسجة	لايكا	هيستوكور أركاديا	لتضمين القوالب الصغيرة
معالج الأنسجة	لايكا	TP1020	لمعالجة القوالب الصغيرة
حاضنة الهز 211DS (الهزاز المداري)	لابنت إنترناشونال	I-5211-DS	حضانة المبايض في الأوساط الإنزمية لإطلاق الجريبات
Software
أوتوديسك فيوجن	شركة أوتوديسك، إنك		برنامج التصميم بمساعدة الحاسوب (CAD). تقدم أوتوديسك وصولا تعليميا مجانيا من خلال برنامج أوتوديسك التعليمي.
إصدار DinoCapture 3.0 1.1.1.3	دينو-لايت
ImageJ	المعاهد الوطنية للصحة		تحليل صور OCT وقياس الجريبات
ما قبل التقديم	فورملابز، إنك		برنامج تحضير الطباعة الحر المصمم للعمل مع طابعات الطباعة الستيريوليثوغرافية (SLA) من Formlabs.