يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

نموذج الورم الدبقي الدائري لفحوصات العلاج بالخلايا التائية لمستقبلات المستضد الخيمري

410 مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/68881

⸱

أكتوبر 17, 2025

 ,  ,  ,  , 
1School of Chemistry and Chemical Engineering, Southeast University, 2Department of Immunology, Key Laboratory of Human Functional Genomics of Jiangsu Province, Gusu School, Nanjing Medical University, 3Department of Neurosurgery, The First Affiliated Hospital of Nanjing Medical University, 4Department of Neurosurgery, The Affiliated Brain Hospital of Nanjing Medical University, 5Department of Clinical Laboratory Medicine, Children's Hospital of Nanjing Medical University

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

يؤسس البروتوكول الحالي نموذجا للورم الدبقي المنتشر عن طريق الحقن الجانبي للبطين للتحقيق في التأثير العلاجي للعلاج بالخلايا التائية لمستقبلات المستضد الخيمري في الجسم الحي.

الملخص

تعد الخلايا السرطانية المنتشرة في السائل النخاعي (CSF) عاملا مهما في تكرار الورم والورم الخبيث داخل الجمجمة في الورم الدبقي. تحاول العديد من الدراسات تحديد استراتيجيات فعالة لاستهداف الورم المنتشر في السائل الدماغي النخاعي والقضاء عليه. كثيرا ما يستخدم العلاج بالخلايا التائية لمستقبلات المستضد الخيمري (CAR) لمختلف الأورام المنتشرة. ومع ذلك ، فإن البحث محدود بسبب عدم وجود نموذج مناسب للورم الدبقي المتداول. هنا ، تم تطوير نموذج الورم الدبقي المنتشر وتطبيقه في تحقيقات العلاج بالخلايا التائية CAR. تم إنشاء هذا النموذج باستخدام حقن البطين الجانبي ، والذي يستخدم على نطاق واسع في العلاج الموضعي للأمراض داخل الجمجمة. تم حقن خلايا الورم الدبقي في البطين الجانبي لتشكيل الورم الأولي داخل الجمجمة. تم استخدام الأورام التي تم إلقاؤها من البطين الجانبي للإشارة إلى الورم المنتشر في السائل الدماغي النخاعي. النموذج سهل البناء ويمكن تطبيقه في دراسات مختلفة حول علاج الخلايا التائية CAR للورم الدبقي الدائري. نتيجة لذلك ، يوفر نموذج الورم الدبقي المنتشر نموذجا فريدا من نوعه لورم خبيث للورم الدبقي لدراسات العلاج الفعالة للخلايا التائية CAR للورم الدائري.

المقدمة

الورم الدبقي هو أكثر أورام المخ الخبيثة الأولية شيوعا لدى البالغين1،2. تظهر العلاجات الحالية ، بما في ذلك الجراحة والعلاج الإشعاعي والعلاج الكيميائي ، فعالية محدودة ، حيث يبلغ متوسط البقاء على قيد الحياة من 14 إلى 15 شهرافقط 3،4،5. تلعب خلايا الورم الدبقي المنتشرة في السائل الدماغي النخاعي دورا مهما في تكرار الورم والورم الخبيث داخل الجمجمة6،7. وبالتالي ، هناك حاجة ملحة لتطوير استراتيجيات علاج أكثر فعالية للقضاء على خلايا الورم الدبقي المنتشرة.

ركزت الأبحاث الحديثة حول الورم الدبقي بشكل أساسي على الأورام الأولية داخل الجمجمة8،9. ومع ذلك ، فإن أهم مشكلة يجب معالجتها في العيادة هي كيفية استهداف خلايا الورم الدبقي المنتشرة والقضاء عليها. لذلك ، تحتاج الدراسات حول الورم الدبقي المنتشر قبل الجراحة أو بعدها إلى مزيد من الاهتمام. العلاج بالخلايا التائية لمستقبلات المستضد الخيمري (CAR) هو الإستراتيجية الأكثر شيوعا المستخدمة في الدراسات التي أجريت على الخلايا السرطانية المنتشرة10،11. ومع ذلك ، نظرا للبنية التشريحية الخاصة للأورام داخل الجمجمة ، من الصعب تطوير نموذج مناسب للورم الدبقي المنتشر ، وهو أمر بالغ الأهمية لدراسة الورم الدبقي المنتشر12،13،14،15،16.

أنتجت هذه الدراسة نموذجا فريدا للورم الدبقي المنتشر يعتمد على حقن البطين الجانبي. في هذا النموذج ، يتم حقن خلايا الورم الدبقي في البطين الجانبي ، ويتم الكشف عن الورم الأولي داخل الجمجمة والورم المنتشر في السائل النخاعي عن طريق التصوير الحيوي في الجسم الحي وتحليل قياس التدفق الخلوي في اليوم 10. بدأ العلاج ب CAR-T عندما وصل عبء الورم في الفئران النموذجية للورم الدبقي المنتشرة إلى حوالي 6.5 × 105ص / ثانية. تمت مراقبة عبء الورم كل 5 أيام لتقييم التأثير العلاجي للخلايا التائية ذات مستقبلات المستضدات الوهمية. يحاكي هذا النموذج حالة تقشر الخلايا السرطانية لمرضى الورم الدبقي ويمكن استخدامه في دراسات مختلفة حول الورم الدبقي الدائري.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

تمت الموافقة على جميع التجارب على في هذه الدراسة والإشراف عليها من قبل مجلس المراجعة المؤسسية ولجنة أخلاقيات بجامعة نانجينغ الطبية (IACUC-1905048). تم استخدام إناث الفئران C57BL / 6J ، الذين تتراوح أعمارهم بين 6-8 أسابيع ، في هذه الدراسة. يتم سرد الكواشف والمعدات المستخدمة في جدول المواد.

1. تحضير

  1. ضع الفئران في حاجز ، دورة ضوئية / داكنة 12 ساعة / 12 ساعة ، ودرجة حرارة محيطة تبلغ 24 درجة مئوية ، ورطوبة نسبية تبلغ 50٪ قفص.
  2. يتم وزن الفئران وتخديرها (باتباع البروتوكولات المعتمدة مؤسسيا) بحقن داخل الصفاق من 50 ملغ/كغ من الصوديوم بنتوباربيتال و10 ملغ/كغ زيلازين17.
    ملاحظة: يستخدم مزيج من بنتوباربيتال الصوديوم والإزيلازين على نطاق واسع في إجراءات الحقن التجسيمي للفأر. تم تأكيد التخدير المناسب من خلال عدم الاستجابة لقرصة إصبع القدم ، مما يضمن أن كان فاقدا للوعي تماما قبل الجراحة. لمنع جفاف القرنية وتلفها ، تم وضع مرهم العين البيطري على العينين أثناء التخدير.
  3. قم بإزالة الشعر الموجود على رأس الفأر باستخدام ماكينة حلاقة المختبر وقم بتثبيت رأس وأطراف الفأر على الجهاز التجسيمي.
  4. تعقيم رأس الفأر باستخدام اليودوفور بقطعة قطن ، وقم بتغطية باقي جسم الفأر بمنشفة جراحية معقمة.
  5. قطع فروة الرأس حوالي 1 سم على طول خط الوسط في الجزء العلوي من الجبهة اليمنى بمشرط.
    ملاحظة: يجب تعقيم جميع الأدوات الجراحية بشكل صحيح قبل الاستخدام لمنع العدوى. يجب توخي الحذر للتعامل مع الأدوات بحذر لتجنب الإصابة ، ويجب تنفيذ جميع الإجراءات في بيئة معقمة.
  6. اضبط مشبك الأنف وقضيب الأذن ، مع التأكد من أن فرق ارتفاع المحور Z بين خياطة لامدا والبريجما أقل من أو يساوي 0.05 مم.

2. بناء نموذج الورم الدبقي الدائري

  1. ضع علامة على النقطة 1.5 مم على الجانب الأيمن من خط الوسط و 1.1 مم إلى الجانب الخلفي من البريجما باستخدام قطعة قطن مغموسة بنفسجي الجنطيانا (الإحداثيات: AP -1.1 مم ، ML -1.5 مم من bregma).
  2. باستخدام مثقاب قحفي مصغر بقطر 0.5 مم ، قم بحفر ثقوب عند الإحداثيات المستهدفة لفضح الأم الجافية.
  3. اشطفها بالمحلول الملحي لإزالة بقايا العظام.
  4. ارسم 5 ميكرولتر من تعليق الخلايا السرطانية باستخدام حقنة دقيقة مع سدادة تحد من العمق (GL261-Luc-GFP ، 1×105 خلايا / ميكرولتر في PBS تحتوي على 0.1٪ BSA).
  5. أدخل الإبرة بمعدل 0.2 مم / ثانية على عمق 3.0 مم وأعد الإبرة بمقدار 0.5 مم ، وتوقف مؤقتا لمدة 10 ثوان لتثبيت ضغط الأنسجة.
  6. حقن الخلايا بمعدل 1 ميكرولتر / دقيقة باستخدام مضخة حقن مجهرية معايرة ، مع وقت بقاء مدته 10 دقائق بعد الحقن لتقليل التدفق العكسي.
  7. اسحب المحقنة الدقيقة ببطء ، واضغط على موقع الحقن بقطعة قطن معقمة لمدة 30-60 ثانية.
  8. خياطة فروة الرأس بخيطة جراحية قابلة للامتصاص (6-0) ، وأعد تطهير الشق باليودوفور.
  9. ضع الماوس على وسادة تسخين تبلغ 37 درجة مئوية يتم التحكم فيها بدقة لإعادة التدفئة ومراقبة حالتها الصحية.
  10. أعد الماوس إلى قفص نظيف بعد إظهار رد فعل التقويم المستمر والحركة التلقائية.
  11. قم بتصوير الفأر باستخدام نظام التصوير المضيء الحيوي في الجسم الحي (IVIS Spectrum) للكشف عن الورم المزروع في اليوم العاشر بعد حمل الورم.
  12. حقن الفأر داخل الصفاق بملح البوتاسيوم D-luciferin (150 مجم / كجم).
    ملاحظة: تمييع ملح البوتاسيوم D-Luciferin باستخدام D-PBS المعقم.
  13. يتم تحفيز التخدير باستخدام 2٪ من الأيزوفلوران في 1 لتر / دقيقة O2 خلال فترة الانتظار التي تبلغ 10 دقائق.
    ملاحظة: يجب استخدام الأيزوفلوران في غطاء كيميائي جيد التهوية لتقليل التعرض لأبخرة التخدير. هذا لضمان سلامة كل من والباحثين أثناء العملية.
  14. الحفاظ على التخدير بنسبة 1.5٪ إيزوفلوران عبر مخروط الأنف.
  15. قم بإجراء التصوير المضيء الحيوي باستخدام IVIS Spectrum.
  16. قم بإجراء جمع السائل الدماغي النخاعي عن طريق ثقب الصهريج المخي الوحي البودي في الماوس.
    ملاحظة: تم جمع السائل الدماغي النخاعي عن طريق ثقب الصهريج المخي الوحمي في الفئران تحت التخدير المتساوي فلوران. تم تنفيذ جميع الإجراءات ، بما في ذلك التخدير والتعرض الجراحي وجمع العينات ، في ظل ظروف عامل حماية من الشمس لتقليل مخاطر التلوث والعدوى. تم وضع الفئران في وضع الانبطاح على إطار تجسيمي ، وتم تعريض الصهريج المخضرم بعناية تحت مجهر تشريح. تم استخدام إبرة حقنة هاميلتون 27 جم لثقب الخزان وجمع السائل النخاعي باستخدام تقنية اليد الحرة. تم الحصول على ما يقرب من 5-10 ميكرولتر من السائل الدماغي النخاعي الشفاف من كل فأر. لتقليل خطر العدوى بشكل أكبر ، تم تعقيم موقع الجراحة باستخدام Iodophor قبل الثقب ، وتم تعقيم جميع الأدوات الجراحية. بعد جمع السائل الدماغي النخاعي ، تم ضغط موقع الثقب برفق بقطن معقم لوقف أي تسرب للسوائل. ثم تم وضع الفئران على وسادة تدفئة ومراقبتها باستمرار حتى الشفاء التام من التخدير. تم إعطاء المسكنات بعد الجراحة لتخفيف الانزعاج. تمت مراقبة يوميا لمدة ثلاثة أيام متتالية على الأقل لضمان عدم وجود أعراض عصبية أو علامات العدوى.
  17. إجراء قياس التدفق الخلوي للكشف عن الخلايا السرطانية في السائل الدماغي النخاعي. تمثل مجموعة GFP + الخلايا السرطانية.
    ملاحظة: تم تصميم خط خلايا الورم الدبقي في الفئران GL261 لحمل لوسيفيراز (لوك). عندما تصل قيمة التألق إلى ~ 5 × 105 p /sand الخلايا السرطانية في السائل النخاعي ، يكون الإجراء ناجحا. كان برنامج التصوير المستخدم هو Living Image 4.5.2 ، وتم ضبط معلمات التصوير على Luminescent.
  18. حدد الفئران ذات الحمل الناجح للورم لتقييم الفعالية العلاجية للخلايا التائية ذات مستقبلات الوهمدات الوهمية.

3. علاج الورم الدبقي المنتشر عن طريق حقن الخلايا التائية CAR-T في البطين الجانبي

  1. عندما يصبح حجم الورم في الفئران النموذجية للورم الدبقي المنتشرة ~ 6.5 × 105 ص / ث ، حدد هذه الفئران لعلاج CAR-T.
  2. قم بوزن الفئران النموذجية للورم الدبقي المنتشرة ، وتخدير الفئران بحقن داخل الصفاق من 50 مجم / كجم من بنتوباربيتال الصوديوم و 50 مجم / كجم زيلازين.
  3. كرر عملية الخطوات 1.3-1.5.
  4. افصل فروة الرأس والجمجمة ، وحدد بدقة ثقب الحفر الذي تم إجراؤه أثناء بناء نموذج الورم الدبقي المتداول ، واتبع الإجراء المذكور في الخطوات 2.2-2.3.
  5. استنشق 10 ميكرولتر من تعليق الخلايا التائية CAR-T باستخدام حقنة صغيرة ، وأدخل الإبرة بعناية في البطين الجانبي للماوس ، واضبط عمق الحقن باستخدام جهاز التجسيم ، وقم بإدارة محلول الخلايا التائية CAR-T ببطء.
    ملاحظة: تمشيا مع حقن خلايا GL261 ، تم حقن خلايا CAR-T في البطين الجانبي الأيمن (الإحداثيات: AP -1.1 مم ، ML -1.5 مم من بريجما) ، بعمق حقن 2.5 مم. تم علاج المجموعة الضابطة ب PBS بدلا من خلايا CAR-T.
  6. احتفظي بالإبرة لمدة 10 دقائق ، ثم أزيلي الإبرة ببطء واضغطي برفق على نقطة الحقن بشاش معقم لمنع أي نزيف بعد الانتهاء من الحقن. خياطة فروة الرأس بخيطة جراحية قابلة للامتصاص (6-0) ، وتطهير الشق.
  7. ضع الماوس على وسادة تسخين تبلغ 37 درجة مئوية يتم التحكم فيها بدقة لإعادة التدفئة ومراقبة حالتها الصحية.
  8. أعد الماوس إلى قفص نظيف بعد إظهار رد فعل التقويم المستمر والحركة التلقائية.
  9. إجراء التصوير الحيوي في الجسم الحي لمراقبة نمو الأورام في الفئران. يسمح التصوير البصري بتقييم الفعالية العلاجية للخلايا التائية CAR-T
  10. قم بوزن الفئران كل يومين ، وقم بإجراء تصوير BLI كل 5 أيام لتتبع نمو الورم بدقة أكبر حتى يتم الوصول إلى نقطة النهاية النهائية.
  11. القتل الرحيم للفأر وإصلاح أنسجة المخ في 4٪ بارافورمالديهايد لمدة 24-48 ساعة.
  12. قم بتضمين الأنسجة في البارافين وقسمها إلى شرائح بسمك 5 ميكرومتر.
  13. قم بإزالة البارارافين من الأقسام ، وإعادة ترطيبها من خلال الكحول المتدرج ، وصمة عار بالهيماتوكسيلين ، ومضاد البقع باليوزين ، وقم بتركيب الأقسام باستخدام غطاء.
    ملاحظة: بالنسبة للدراسة الحالية ، كانت نقطة النهاية النهائية هي اليوم 30 ، وتم القتل الرحيم للفئران بجرعة زائدة من بنتوباربيتال الصوديوم مع الحقن داخل الصفاق. تم تسليم جثث الفئران إلى مركز التجارب الطبية بجامعة نانجينغ الطبية للتخلص منها. تم وضع الإبر المهملة في حاوية الأدوات الحادة وتسليمها إلى قسم إدارة المختبرات والمعدات في جامعة نانجينغ الطبية للتخلص منها مركزيا.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

يظهر الرسم التخطيطي لنموذج الورم الدبقي الدائري للعلاج ب CAR-T في الشكل 1. تم حقن خلايا CAR-T في البطين الجانبي باستخدام حقنة دقيقة لإثبات تأثيرها العلاجي. تسمح هذه الطريقة بالتوصيل المباشر لخلايا CAR-T إلى الدماغ ، مستهدفة خلايا الورم الدبقي المنتشرة. تم إجراء عملية الحقن في اليوم 11 ، بعد زرع خلايا GL261 في البطين الجانبي للفأر. في نقاط زمنية مختلفة (الأيام 15 و 20 و 25 و 30) ، تمت مراقبة استجابة الورم باستخدام التصوير في الجسم الحي والتلمع البيولو...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

يوفر نموذج الورم الدبقي الدائري الذي تم إنشاؤه في هذه الدراسة باستخدام حقن البطين الجانبي تقدما كبيرا ، حيث يوفر العديد من المزايا مقارنة بالنماذج الحالية. تقنية حقن البطين الجانبي قابلة للتكرار بدرجة كبيرة ، مما يتيح نمذجة الورم المتسقة في إطار زمني قصير نسبيا. هذا يجعلها أداة قيمة للباحثين الذين يسعون إلى التحقيق في انتشار الخلايا السرطانية في السائل الدماغي النخاعي وتقييم فعالية العلاجات ، مثل خلايا CAR-T. على عكس التسريب التقليدي في الوريد CAR-T ، والذي يواجه صعوبات في عبور الحاجز ال...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

يعلن المؤلفون عدم وجود تضارب في المصالح.

شكر وتقدير

تم تمويل هذه الدراسة من قبل المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (82230059) ، وبرنامج تطوير البحوث الرئيسية في مقاطعة جيانغسو في الصين (BE2022770).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
خياطة جراحية قابلة للامتصاصشنغهاي بودونغ Jinhuan المنتجات الطبية المحدودةالتوصية 611
CAR-Tمختبرات حيوية إبداعية
ملح البوتاسيوم D-LuciferinMCEHY-12591B
GL261-لوك-GFPشنغهاي تشونغ تشياو شين تشو التكنولوجيا الحيوية المحدودةZQ0932
نظام التصوير المضيء الحيوي في الجسم الحيتانونتانون ABL X6
ماكينة حلاقة المختبرBeyotime Biotechnologyالوحدة الخامسة 600
فئرانمرفق الأساسي بجامعة نانجينغ الطبية
مضخة الحقن المجهريRWDالتوصية 462
حقنة دقيقةهاملتون87943
مثقاب الجمجمة الصغيرRWD78001
بنتوباربيتال الصوديوم   ؛كيم إس آر سي57-33-0
جهاز تجسيميRWD68043
زيلازينكيم إس آر سي7361-61-7

المراجع

  1. Lim, M., Xia, Y., Bettegowda, C., Weller, M. Current state of immunotherapy for glioblastoma. Nat Rev Clin Oncol. 15 (7), 422-442 (2018).
  2. Weller, M., et al. Glioma. Nat Rev Dis Primers. 10 (1), 33(2024).
  3. Van Den Bent, M. J., et al. Primary brain tumours in adults. Lancet. 402 (10412), 1564-1579 (2023).
  4. Capper, D., et al. Eano guideline on rational molecular testing of gliomas, glioneuronal, and neuronal tumors in adults for targeted therapy selection. Neuro Oncol. 25 (5), 813-826 (2023).
  5. Nicholson, J. G., Fine, H. A. Diffuse glioma heterogeneity and its therapeutic implications. Cancer Discov. 11 (3), 575-590 (2021).
  6. Schaff, L. R., Mellinghoff, I. K. Glioblastoma and other primary brain malignancies in adults: A review. JAMA. 329 (7), 574-587 (2023).
  7. Wang, A. P. A review of glioblastoma and other primary brain malignancies. JAMA. 330 (2), 188-189 (2023).
  8. Steeg, P. S. The blood-tumour barrier in cancer biology and therapy. Nat Rev Clin Oncol. 18 (11), 696-714 (2021).
  9. Sun, S., et al. Targeting golph3l improves glioblastoma radiotherapy by regulating Sting-NLRP3-mediated tumor immune microenvironment reprogramming. Sci Transl Med. 17 (788), eado0020(2025).
  10. Bagley, S. J., et al. Intrathecal bivalent CAR-T cells targeting EGFR and IL-13Rα2 in recurrent glioblastoma: Phase 1 trial interim results. Nat Med. 30 (5), 1320-1329 (2024).
  11. Nikanjam, M., Kato, S., Kurzrock, R. Liquid biopsy: Current technology and clinical applications. J Hematol Oncol. 15 (1), 131(2022).
  12. Akhoundi, M., Mohammadi, M., Sahraei, S. S., Sheykhhasan, M., Fayazi, N. CAR T cell therapy as a promising approach in cancer immunotherapy: Challenges and opportunities. Cellular Oncol. 44 (3), 495-523 (2021).
  13. Das, A. K., et al. T-cell therapy: A potential treatment strategy for pediatric midline gliomas. Acta Neurol Belgica. 124 (4), 1251-1261 (2024).
  14. Lin, H. L., Cheng, J. L., Mu, W., Zhou, J. F., Zhu, L. Advances in universal CAR-T cell therapy. Front Immunol. 12, 744823(2021).
  15. Lin, Y. J., Mashouf, L. A., Lim, M. CAR-T cell therapy in primary brain tumors: Current investigations and the future. Front Immunol. 13, 817296(2022).
  16. Zhu, Y. X., Feng, J. G., Wan, R. X., Huang, W. H. CAR T cell therapy: Remedies of current challenges in design, injection, infiltration and working. Drug Design Develop Ther. 17, 1783-1792 (2023).
  17. Aswendt, M., Adamczak, J., Couillard-Despres, S., Hoehn, M. Boosting bioluminescence neuroimaging: An optimized protocol for brain studies. Plos One. 8 (2), e55662(2013).
  18. Vaughn-Beaucaire, P., Choi, M. J., Liang, O. L., Lawler, S. E. Intracranial CAR-T cell delivery in glioblastoma patients. Trends Cancer. 10 (6), 478-480 (2024).
  19. Choi, B. D., et al. Intraventricular carv3-team-e T cells in recurrent glioblastoma. New England J Med. 390 (14), 1290-1298 (2024).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

CAR T
اتصل بنا
أوصِ بها للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

2026 © حقوق الطبع والنشر MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.