مقالة منهجية

إجراء بسيط وفعال لعلاج التعثر الدموي في شرايين الفئران

390 مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/68907

⸱

نوفمبر 28, 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1College of Animal Science and Veterinary Medicine, Shenyang Agricultural University, 2Key Laboratory of Livestock Infectious Diseases, Ministry of Education, and Key Laboratory of Ruminant Infectious Disease Prevention and Control (East), Ministry of Agriculture and Rural Affairs, College of Animal Science and Veterinary Medicine, Shenyang Agricultural University, 3Manzhouli International Travel Health Care Center, 4Shenyang Baihao Biotechnology Co., Ltd., 5The Affiliated Animal Hospital of Jinzhou Medical University, Collaborative Innovation Center Zoonosis Prevention and Treatment of Jinzhou Medical University

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

تهدف هذه الدراسة إلى تطوير طريقة فعالة لتحقيق الارتسام الدموي في شرايين الفئران.

الملخص

أثناء الطعوب الشريانية أو القناة في الفئران، غالبا ما يكون هناك حاجة إلى ربط دائم للشريان بسبب صعوبة تحقيق التعقيم بعد سحب الإبرة. يؤدي ذلك إلى إصابة إقفاري دائمة في منطقة الأنسجة المجهزة. غالبا ما تسبب هذه الإقرامية الموضعية مضاعفات ثانوية، مما يضر بنتائج التجارب في النماذج الحيوانية. تهدف الطريقة الحالية إلى إغلاق موقع الثقب بعد العملية مع الحفاظ على تدفق الدم الطبيعي، وبالتالي منع نقص التروية بعد العملية. تتضمن هذه الطريقة جمع جزء من نسيج دهني من التجريبي نفسه، وإجراء ثقب الشريان باستخدام التقنيات القياسية، ثم لف موقع الثقب بوسادة الدهون لتحقيق الرطوبة الدموية مع الحفاظ على تدفق الدم. في هذه الدراسة، تم إجراء ثقب في الشريان السباتي المشترك على الفئران، تلاه عملية النزيف الدموي باستخدام تقنية لف الدهون. أظهر تصوير التباين بالليزر (LSCI) عدم وجود اختلافات في تغيرات تدفق الدم الدماغي بين الفئران الوهمية والتي تم جراحتها، ولم تلاحظ تغييرات ذات دلالة إحصائية في قياسات تدفق الدم الدماغي قبل العملية وما بعدها في المجموعة التي تم إجرائها. كشف التقييم النسيجي الذي أجري في اليوم 7 و14 و28 بعد الجراحة أن: (1) الحفاظ على بنية الدماغ (تلوين H&E)، (2) الحفاظ على شكل الخلايا العصبية دون تغييرات تنكسية (صبغة Nissl)، و(3) غياب التغيرات المرضية في مقاطع الدماغ. تستفيد هذه التقنية من الطبيعة المرنة للأنسجة الدهنية وآليات التخثر الفسيولوجي. يتضمن الإجراء: (1) لف الدهون الذاتية حول موقع الثقب، (2) تثبيتها بالغرز لضمان التلامس الأمثل مع الشريان الأدفينتيسيا، و(3) السماح للدم المتسرب بالاختراق إلى واجهة الشريان الدهني حيث يخضع للتخثر. تحقق هذه الآلية ثلاثية التأثير دموية موثوقة مع الحفاظ على الكفاءة الشريانية ومنع المضاعفات الإقفاري بعد العملية. تظهر هذه الطريقة بساطة إجرائية ملحوظة، وفعالية سريرية، وإمكانات ترجمة ممتازة.

المقدمة

في النماذج الحيوانية، يعد التسبب في إصابة الشريان نهجا تجريبيا واسع الاستخدام لنمذجة حالات مرضية مختلفة، بما في ذلك نماذج نقص التروية الدماغية-إعادة التروية، ونماذج تصلب الشرايين السباتي (CCA) أو الأبهر (AO)، ونماذج نقص التروية في الحبل الشوكي.

بأخذ نموذج نقص التروية الدماغية الدماغية للفئران كمثال، يتضمن نهج النمذجة الحالي 1,2,3: عزل الشريان السباتي الخارجي (ECA)، ربط نهايته البعيدة، تثبيت الشريان الشريان الشريان الأقرب بمشبك شريان مع وضع خياطة ثابتة، إنشاء ثقب ثقب بين هاتين النقاط، إدخال خيط رجعي عبر CCA, تثبيت الوعاء والخيط بالخياطة الثابتة، وقطع ECA بين موقع الثقب والربط البعيد، وتحرير المشبك الشريائي، وإعادة توجيه الخيط إلى الشريان السباتي الداخلي (ICA) لإغلاق الشريان الدماغي الأوسط، وعند سحب الخيط، ربط الشريان الكهربائي القريب.

بينما يحقق هذا الإجراء إعادة التروية، فإنه يعيد فقط تدفق الدم بين الواصل المشترك وICA، مما يترك ECA منفصلا بشكل دائم. يسبب هذا الاستئصال من ECA ضررا إقفاريا في المناطق الجسدية من نفس الجانب في الوجه، وهي إصابة غير مقصودة لا تعقد العملية فحسب، بل تسبب أيضا صدمات مربكة للحيوانات التجريبية، مما قد يؤثر على نتائج الدراسة. والأكثر إثارة للقلق، أنه في بعض البروتوكولات التجريبية 4,5، يجري الباحثون ثقبا مباشرا لاختبار CCA، ثم يتم إدخال غرزة لتثبيت MCAO، ثم إزالتها فورا، تليها ربط دائم في طرفي موقع الثقب لحدوث النزع. ومع ذلك، فإن هذه الطريقة تزيد الضغط الوعائي بشكل مباشر، مما يرفع من الحمل القلبي اللاحق وقد يؤدي إلى فشل القلب6.

باستخدام نموذج إصابة بطانة الفأر CCA أو AO مع نظام غذائي غني الدهون لتحديد تصلب الشرايين كمثال، تتضمن المنهجيةالتقليدية 7,8,9,10 إجراء ثقب شريان في الشريان الأورطي البطني (AA)، أو الشريان الفخذي (CFA)، وإدخال قسطرة بالون لتحفيز إزالة البطانة، وتحقيق النزيف عن طريق ربط طرفي موقع الثقب بشكل دائم. يقدم هذا النهج القياسي عدة قيود حرجة: الارتباط الإلزامي يخلق نقص تروي موضعي بعيدا عن موقع الإغلاق. والأهم من ذلك، يحدث تراكم الدهون في مواقع الربط. تتغير صلاحية نموذج التسوية بسبب تأثيره على الهيموديناميكا الموضعية، مما يتداخل مع توصيل الدواء لاستهداف الآفات ويشوه نتائج التقييم الدوائي.

في نموذج نقص التروية في الحبل الشوكي في الفأر، يتضمن الإجراء ثقبا شريانيا (عبر الوصول إلى CCA أو AA أو CFA) يليه إدخال قسطرة بالون لتحفيز نقص التروية في المواقعالمستهدفة 11. بعد سحب البالون، يتم تحقيق الورم الدموي التقليدي عن طريق ربط موقع الثقب بشكل دائم على جانبين.

في جميع النماذج الثلاثة المذكورة أعلاه، يتم تحقيق الورم الدموي بعد الثقب بشكل موحد من خلال ربط موقع الثقب الثنائي الطرفين. على الرغم من فعاليته في السيطرة على النزيف، إلا أن هذا النهج يحفز حتما نقص التروية الموضعي، مما يؤدي إلى مضاعفات ثانوية تضر في النهاية بصحة النموذج. لذلك، فإن الحفاظ على الفراغ الوعائي أثناء إجراءات التعقيم الدموي أمر بالغ الأهمية من الناحية الفسيولوجية والتجريبية. لذلك، تقدم هذه المقالة طريقة مبتكرة وبسيطة وفعالة لعلاج التواء الشرياني لتجارب الفئران. يتضمن الإجراء أولا تثبيت طرفي موقع الثقب بمشابك وعائية شريانية، ثم لف الشريان بوسادة دهنية بحجم 3 مم × 3 مم × 1 مم لتغطية الثقب. يتم تثبيت وسادة الدهون في مكانها بخيط رباط حول الشريان. يتم تحرير مشابك الشرايين تدريجيا، ويتم ضبط شد الرباط بناء على النزيف حتى يتم تحقيق الارتعاش الكامل. هذا النهج يعيد تدفق الدم، ويحافظ على ديناميكا الدم الطبيعية، ويمنع الضرر الإقفاري للأنسجة المحيطة الناتج عن ربط الأوعية الدائمة. ويعد ذلك مفيدا بشكل خاص لمراقبة حالات الفئران بعد النمذجة طويلة الأمد ولتقييم التدخلات الدوائية، مما يعزز بشكل كبير صرامة الدراسات التجريبية قبل السريرية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

تم إجراء جميع الإجراءات التجريبية وفقا لمعايير العناية واستخدام المخبرية (رقم الموافقة على البروتوكول). SNLL25040501؛ رخصة استخدام رقم SYXK(Liao)2021 - 0010) التي أسستها لجنة رعاية واستخدام المؤسسية (IACUC) في جامعة شنيانغ الزراعية. المواد المستخدمة والمواد المستخدمة مدرجة في جدول المواد.

1. التحضير التجريبي

  1. تفاصيل والتوثيق: وثق جميع بيانات أبحاث وفقا لإرشادات ARRIVE (أبحاث: الإبلاغ عن تجارب In Vivo). استخدم فئران Balb/C الذكور بعمر 6-8 أسابيع، تزن 22 جرام ± 4 جرام. حافظ على ظروف السكن عند 24 ± 2 درجة مئوية مع رطوبة نسبية 55٪ ± 5٪ خلال دورة ضوء/ظلام مدتها 12 ساعة.
  2. تحضير
    1. تخدير الفئران باستخدام جهاز تبخير إيزوفلوران (وفقا لبروتوكولات معتمدة مؤسسيا). تحفز التخدير بنسبة 4٪ من إيزوفلوران، ثم حافظ على التخدير مع 2٪ إيزوفلوران.
    2. بعد التخدير، قم بإزالة العضلات العنقية والجمجمة وتعقيم الجلد المكشوف بالبوفيدون-يودين، ثم 75٪ إيثانول لإزالة البقايا.
    3. ضع الفئران على وسادة تسخين بدرجة حرارة 37 درجة مئوية لجميع الإجراءات التجريبية اللاحقة.
  3. قياس تدفق الدم الدماغي الأساسي في الفئران
    1. ضع الفئران في وضعية الاستلقاء. قم بعمل شق منتصف فروة الرأس لكشف عظام الجدارية. قم بتشريح وإزالة الطبقة اللفافية العلوية من سطح الجمجمة بعناية.
    2. ضبط نظام LSCI لمسح عظم الجدارية المكشوفة للفأر بزيادة تكبير 10 أضعاف، وسجل بيانات تدفق الدم الدماغي الأساسية.
  4. احصد وسادة الدهون وقم بثقب الشريان
    1. أعد وضع الفئران في وضعية الاستلقاء على الظهر. قم بعمل شق في منتصف الرقبة. احصد رقعة نسيج دهنية تحت الجلد بطول 3 مم × 3 مم × 1 مم لاستخدامها لاحقا.
    2. قم بإجراء تشريح غير حاد للغدة تحت الفك السفلي، وعضلة القص العرقية، وعضلة القصية الترشائية. كشف كلا النوعين من CCA.
    3. حرر CCA لكشف ICA وECA.
    4. ضع المشبك الوعائي 1 على الطرف البعيد من CCA، وضع المشبك الوعائي 2 في الطرف القريب.
    5. قم بثقب CCA بين المشبكين باستخدام إبرة 23 جيلون.
  5. تطبيق وسادة الدهون
    1. بعد إزالة الإبرة، لف CCA عند موقع الثقب مع سطح القطع (الجانب غير المصل) من وسادة الدهون.
    2. ضع خياطة 4-0 تحت المنطقة الملفوفة بالدهن؛ ثم يربط رمية واحدة بلطف فوق سطح الدهون لتطبيق ضغط للحفاظ على اتصال آمن بين الوسادة الدهنية وجدار الوعاء؛ وأخيرا، قم بضبط الربط تدريجيا لتحقيق توازن الضغط لعلاج التخدير.
    3. ارفع ال CCA البعيد بمسحة قطنية رطبة. حرر المشبك الوعائي 1 واسحب المسحة ببطء للسماح بتدفق الدم تدريجيا نحو موقع الثقب.
    4. تحقق من تدفق الدم؛ إذا لوحظ نزيف نشط، أعد تثبيت ال CCA البعيد باستخدام مشبك الأوعية الدموية 1.
    5. انتظر دقيقة واحدة، ثم حرر المشبك الوعائي ببطء 1؛ إذا حدث نزيف، أعد وضع وسادة الدهون أو شد قليلا الرمية الوحيدة للرباط لزيادة الضغط؛ استمر في هذه التعديلات حتى يتم تحقيق الاندماج الكامل.
    6. ارفع ال CCA القريب باستخدام قطعة قطن مبللة. أطلق المشبك الوعائي 2 واسحب المسحة تدريجيا للسماح بتدفق الدم المسيطر عليه نحو موقع الثقب.
    7. إذا حدث نزيف، أعد تثبيت ال CCA البعيد باستخدام مشبك وعائي 2.
    8. شد قليلا الجزء الواحد من الغرز لزيادة الضغط؛ انتظر لمدة دقيقة واحدة، ثم ارفع ال CCA القريب وأطلق المشبك الوعائي 2؛ يدحرج قطعة القطن المبللة ببطء نحو موقع الثقب.
    9. إذا استمر النزيف، كرر الخطوتين السابقتين حتى تصل إلى النزيف الكامل.
    10. ضع رمية إضافية مع الغرز لتشكيل عقدة مزدوجة فوق العقدة الأولى، مما يثبت وسادة الدهون بشكل أفضل على جدار الوعاء ويحقق الارتعاش من خلال الضغط المتوازن داخل الأوعية الدموية والخارجية.
    11. التأكد من أن الشرايين السباتي المشتركة على جانبي وسادة الدهون كانت ممتلئة وتظهر قطر وعاء ثابت في الجسم؛ اعتبر هذا استعادة ناجحة لتدفق الدم وفقدان الدم.
    12. كرر نفس الإجراء لإجراء الوخز الدموي على الشريان السباتي الشائع الجهة المقابلة للجسم.
    13. كشف الشرايين السباتية المشتركة الثنائية في الفئران الوهمية دون إجراء ثقب شريان أو لف وسادة دهنية، مع الحفاظ على جميع الإجراءات الأخرى مطابقة للمجموعة التي أجريت العملية.
    14. خياطة الشق الجراحي في عنق الرحم ووضع مطهر.
  6. إجراء تقييم تدفق الدم الدماغي بعد العملية
    1. بعد الانتهاء من الدواء الثنائيين في الفئران، قم بضبط نظام LSCI لمسح العظم الجداري المكشوف والحصول على صور مكبرة بمقدار 10 مرات؛ ثم يسجل تغيرات تدفق الدم الدماغي.
    2. قم بخياطة شق فروة الرأس ووضع المطهر، ودع الفئران تتعافى على وسادة تدفئة بدرجة حرارة 37 درجة مئوية قبل إعادتها إلى قفص السكن لمواصلة الرعاية.
  7. إجراء المراقبة بعد العملية وجمع الأنسجة
    1. راقب وسجل يوميا حالة البقاء على قيد الحياة، والنشاط الحركي، وأي علامات نزيف في منطقة عنق الرحم في الفئران خلال فترة ما بعد العملية.
    2. في الأيام بعد العملية 7 و14 و28، قم بقتل الفئران بثاني أكسيد الكربون (وفقا للبروتوكولات المعتمدة من المؤسسات) وتثبيت أنسجة الدماغ في 4٪ بارافورمالديهايد.

2. الفحص المرضي

  1. بعد تثبيت لمدة 24 ساعة، جفف أنسجة الدماغ عبر تدرج الإيثانول، ونظفه بالزيلين، ودمج البارافين للتقسيم.
  2. إجراء تلوين H&E على مقاطع الحصين وفحص شكل نسيج الدماغ تحت المجهر.
  3. إجراء تلوين Nissl على مقاطع الحصين وفحص بنية الخلايا العصبية تحت المجهر.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

كشف تحليل بيانات تصوير التباين بالليزر قبل وبعد العملية وقياسات التروية النسبية في كل من المجموعتين الوهمية والجراحية عدم وجود تغييرات ذات دلالة، مما أظهر أن تقنية التخمير الشرياني هذه نجحت في إغلاق موقع ثقب الشريان السباتي المشترك دون التأثير على تدفق الدم الدماغي (الشكل 1).

تمت مراقبة الفئران في المجموعة التي تم تشغيلها بشكل مستمر لمدة 28 يوما بعد العملية، دون ملاحظة أي وفيات. لم يظهر نشاطهم الحركي أي اختلافات مقارنة بمجموعة الو...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

في نماذج MCAO، فإن الحفاظ على ECA يعيد بشكل أفضل المرض السريري من خلال منع الضرر الإقفاري للوجه المرتبط بربط ECA وقطع الجسم. بينما يوفر النهج التقليدي لإدخال الخيط عبر ثقب CCA بساطة تقنية، إلا أنه يتطلب ربطا ثنائيا لموقع الثقب، مما يؤدي إلى تروية دماغية تعتمد على الدورة الدموية الجانبية Circle of Willis، وهو تمثيل غير مثالي لعلم الأمراض الحقيقي للسكتة الدماغية. تمكن تقنية الوسادة الدموية في وسادة الدهون المقدمة في هذه الدراسة من إصلاح الأوعية الدموية واستعادة تدفق الدم في نفس ال...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

شكر وتقدير

وقد دعم هذا العمل مشروع البحث العلمي التابع لإدارة الجمارك العامة (منحة رقم 2005HK006) تحت عنوان المشروع "البحث والتطوير وتطبيق تقنية الكشف عن مسببات الأمراض متعددة القنوات للأمراض المعدية المنقولة عبر الناقلات في المناطق الحدودية في شمال الصين". وقد دعم هذا العمل أيضا البرنامج الوطني للبحث والتطوير الرئيسي في الصين (المنحة رقم 2022YFC2302700) وبرنامج التعاون الدولي للعلوم والتكنولوجيا التابع لوزارة العلوم والتكنولوجيا (منحة رقم: KY201901014). يدين تطوير هذه الطريقة الناجحة لعلاج الدم الشرياني بتقدير عميق للبروفيسور بيري (رئيس تحرير دليل تجارب الفئران بيري) على إرشاده الخبير، ولشركة RWD Life Science Co., Ltd. (شنتشن) لتوفير نظام تصوير التباين بالليزر بالبقع الدقيقة. تم تقديم خالص الشكر للبروفيسور هان شياوهو، مرشدنا، ولشركة شنيانغ بيوهاو للتكنولوجيا الحيوية المحدودة، على دعمهم القيام. كما يعبر عن التقدير العميق لجميع المساهمين الذين جعلوا هذا البحث ممكنا.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
4-0 مع إبرة خياطة خيوطشركة شنغهاي بودونغ جينهوان لللوازم الطبية المحدودة
فأر Balb/Cشركة بكين هوافوكانغ للتكنولوجيا الحيوية المحدودة6-8 أسابيع، ذكر
فرن التدفئة والتجفيف من سلسلة DHGشركة شنغهاي ييهنغ للتكنولوجيا المحدودةDHG-9123A
الهيماتوكسيلين والإيوزين (H&) ه) مجموعة التلوين عالية الدقةسيرفيسبيوG1076-500ML
إيزوفلورانشركة شنتشن رويوودي لايف تكنولوجي المحدودةR510-22
محلل الليزر البقعشركة شنتشن رويوودي لايف تكنولوجي المحدودةRFLSI ZW
محلول صبغة NisslسيرفيسبيوG1036-100ML
آلة التضمين التنظيميلايكاهستوكور أركاديا H
نظام التصوير بالمسح الشرائحشركة شنتشن شنغتشيانغ للتكنولوجيا المحدودةSQS-40R
آلة تخدير الحيوانات الصغيرةشركة شنتشن رويوودي لايف تكنولوجي المحدودةR500
جهاز تجفيف الأنسجةلايكالؤلؤة HistoCore
نظام المياه فائقة النقاءالترمو50132370
الميكروتوم شبه الأوتوماتيكي فائق الرقةلايكاهيستوكور مولتيكت

المراجع

  1. Longa, E. Z., Weinstein, P. R., Carlson, S., et al. Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats. Stroke. 20 (1), 84-91 (1989).
  2. Yang, X. Y., Wang, K. K., Liu, D. N. Relationship between cerebral ischemia-reperfusion injury and mitochondrial autophagy in mice. Chin J Comp Med. 33 (2), 48-55 (2023).
  3. Wang, Y., Wang, T., Zhao, L., Li, L. The effect of local cerebral ischemia-reperfusion injury on TMEM166 gene and neuronal autophagy in mice. Chin J Comp Med. 28 (7), 28-32 (2018).
  4. Xue, J., Sun, F., Liu, T. The effect of mononucleoside on Wnt7a and APC expression in focal cerebral ischemia-reperfusion rats. Chin J Comp Med. 9, 9-13 (2014).
  5. Hu, Z., Zhao, J., Song, W., et al. Protective effect of ginkgo biloba extract on the brain in a cerebral ischemia-reperfusion injury rat model. Chin J Comp Med. 32 (9), 55-61 (2022).
  6. Chen, Z., et al. Cardiac damage after permanent focal cerebral ischemia in mice. CNS Neurosci Ther. 20 (11), 989-997 (2014).
  7. Wang, C., Ma, X. Experimental study on establishing atherosclerotic animal models using high-fat diet combined with arterial intimal mechanical injury. J Pract Tradit Chin Intern Med. 26 (6), 31-33 (2012).
  8. Zhang, C., Li, L., Qi, W., Zhao, Y., Zhang, H. Intervention effect of puerarin on restenosis after carotid artery balloon injury in rats based on Wnt signaling pathway analysis. J Integr Tradit Chin West Med Cardiovasc Cerebrovasc Dis. 21 (4), 662-665 (2023).
  9. Cai, B., Xie, M. Effect of Xiaoyu Tablet on the stability of atherosclerotic plaque in rabbit abdominal aorta. J Chin Med Pharm. 5, 855-857 (2006).
  10. Liu, Z. Study on the mechanism of detoxification and blood circulation formula promoting vascular re-endothelialization after balloon injury of rat thoracic aorta. , Jiangxi Univ Tradit Chin Med. (2023).
  11. Chen, H., et al. N-methyl-D-aspartate receptor-mediated spinal cord ischemia-reperfusion injury and its protective mechanism. Folia Neuropathol. 60 (3), 308-315 (2022).
  12. Comba, F. G., Smith, J. A., Jones, R. B. The mechanical properties of human adipose tissues and their relationships to the structure and composition of the extracellular matrix. Am J Physiol Cell Physiol. 325 (5), C1226-C1240 (2023).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

مقالات ذات صلة