مقالة منهجية

مقايسة السمية التنموية على أساس المراقبة في الوقت الفعلي لتعطيل إشارة عامل نمو الخلايا الليفية في الخلايا الجذعية متعددة القدرات التي يسببها الإنسان

956 مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/68910

⸱

أكتوبر 10, 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Faculty of Engineering, Yokohama National University, 2Division of Cellular & Molecular Toxicology, Center for Biological Safety & Research, National Institute of Health Sciences, 3Health and Medical Research Institute, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (AIST), 4Kanagawa Institute of Industrial Science and Technology (KISTEC)

في هذه المقالة

ملخص

في هذه الدراسة ، نقدم مقايسة الخلايا في المختبر لتحديد المواد الكيميائية المسخية. تم قياس ديناميكيات إشارات عامل نمو الخلايا الليفية (FGF) / عامل استجابة المصل (SRF) في خلايا المراسلة الجذعية متعددة القدرات (iPS) المستحثة البشرية ، وتم تقييم خطر المسخ عن طريق تحديد الاضطراب الكيميائي لمسار الإشارات هذا.

الملخص

عادة ما يتم تقييم السمية التنموية (Devtox) في النماذج الحيوانية. ومع ذلك ، هناك تحديات في ضمان الدقة ، مثل السلبيات الكاذبة بسبب الاختلافات بين الأنواع والمخاوف الأخلاقية المتعلقة برعاية. لذلك ، هناك حاجة إلى أنظمة اختبار جديدة لتقييم Devtox البشري والمساعدة في معالجة هذه المشكلات. افترضنا أن المسخات تعطل مسارات الإشارات المتعلقة بالسموم الدينية الضرورية للتشكل ، بغض النظر عن أهدافها الجزيئية. لاختبار هذه الفرضية ، قمنا بتطوير نظام مراسل عامل نمو الخلايا الليفية (FGF) باستخدام الخلايا الجذعية متعددة القدرات (iPS) المستحثة البشرية. يتيح هذا النظام القياس الكمي لتعطيل الإشارة الناجم عن المواد الكيميائية ، مما يحقق معدل دقة بنسبة 83٪ للمركبات المسخية وغير المسخية المعروفة. نظرا لأن نشاط إشارات Devtox يتغير بمرور الوقت ، فمن المهم التقاط ديناميكياته باستمرار بدلا من القياس عند نقطة نهاية واحدة. يعد استخدام نظام قياس اللمعان في الوقت الفعلي أمرا اختياريا، ولكنه يعزز الدقة الزمنية بعمالة أقل. يمكن إكمال الاختبار بأكمله في غضون أسبوع واحد ، من بذر الخلايا في لوحة الاستزراع إلى الحصول على بيانات اللمعان.

المقدمة

تسبب بعض المواد الكيميائية سمية تنموية (Devtox) ، بما في ذلك تأخر النمو والتشوهات والعجز الوظيفي والموت1. يعد تقييم Devtox أمرا ضروريا لضمان سلامة المستحضرات الصيدلانيةوالمبيدات الحشرية 2. تعتمد فحوصات Devtox الحالية عادة على نماذج حيوانية متعددة. ومع ذلك ، نظرا للاختلافات بين الأنواع ، فإن النماذج الحيوانية لها قيود متأصلة عند استقراء النتائج للبشر3. الثاليدومايد ، وهو مادة سامة تنموية معروفة ، تم وصفها لأول مرة للنساء الحوامل في أواخر الخمسينيات لتخفيف غثيان الصباح. على الرغم من عدم ملاحظة المسخ في القوارض ، فقد تم الإبلاغ عن تشوهات حادة في الأطراف عند الأطفال حديثي الولادة في جميع أنحاء العالم. سلطت هذه المأساة الضوء على قيود اختبار السلامة الحيوانية ودفعت الجهود الدولية لإدخال ومراجعة إرشادات اختبار Devtox4. بالإضافة إلى ذلك ، هناك مخاوف تتعلق برعاية ، فضلا عن الوقت والتكلفة الكبيرة المطلوبة للتجارب على. لذلك ، هناك حاجة إلى فحوصات بديلة في المختبر يمكنها التنبؤ بدقة ب Devtox البشري5.

هنا ، نقترح مقايسة في المختبر لتقييم المواد السامة التنموية بناء على تعطيل مسارات الإشارات التي تعتبر ضرورية للتطور الجنيني6،7،8. يتم إجراء الفحص باستخدام الخلايا الجذعية متعددة القدرات المستحثة البشرية (iPSCs) المعدلة وراثيا للتعبير عن NanoLuc luciferase (Nluc) ، وهو جين مراسل مضيء ، تحت سيطرة عنصر استجابة المصل (SRE). SRE هو موقع الربط لعامل استجابة المصل (SRF) ، وهو عامل نسخ في مسار إشارات عامل نمو الخلايا الليفية (FGF). يدمج SRF إشارات من روابط متعددة وينظم التعبير عن أكثر من 200 جين تلعب أدوارا أساسية في العمليات البيولوجية المتنوعة ، بما في ذلك التطور الجنيني9.

في هذا الاختبار ، تعرضت خلايا المراسلة لمادة كيميائية اختبار وتحفيزها باستخدام FGF لتنشيط الإشارات وتضخيم أي تداخل من قبل المادة الكيميائية. تتمثل إحدى السمات الرئيسية لهذا الاختبار في التقاط ديناميكيات نشاط الإشارات مع تغير شدة التلألؤ. نظرا لأن نشاط إرسال الإشارات يختلف بمرور الوقت، يمكن أن تكون قياسات نقطة النهاية في نقطة زمنية واحدة غير دقيقة10. في الواقع ، أظهرت القياسات في سبع نقاط زمنية على مدى فترة 24 ساعة دقة تنبؤية محسنة ، مع مساحة تحت المنحنى (AUC) قيمة 0.837.

يمكن استخدام مواد الاختبار الكيميائية بنطاق واسع من التركيزات ، من 0.01 نانوغرام / مل إلى 1000 ميكروغرام / مل ، اعتمادا على السمية الخلوية والذوبان. ما يقرب من 1.4 × 104 خلايا مطلوبة لزرع صفيحة واحدة مكونة من 96 بئرا. أحد قيود هذا الفحص هو أن المواد الكيميائية المسخة قد لا يمكن اكتشافها إذا كانت تعمل من خلال أهداف لم يتم التعبير عنها في خلايا iPS البشرية غير المتمايزة. بالإضافة إلى ذلك ، قد لا يلتقط هذا الاختبار نواتج الأيض المسخية. علاوة على ذلك ، فإنه لا يوفر معلومات عن الآليات التفصيلية الكامنة وراء السمية المسخية أو نتائجها المحددة.

يعمل استخدام نظام مراقبة اللمعان في الوقت الفعلي على تحسين دقة الوقت ، وتقليل العمالة المطلوبة للقياسات المستمرة ، وتقليل القطع الأثرية من المناولة المتكررة لألواح الاستزراع. هنا ، نقدم بروتوكولا مفصلا لمقايسة Devtox المستندة إلى تعطيل الإشارة. يمكن إكمال الإجراء بأكمله في غضون أسبوع واحد. يمكن أتمتة هذا النهج ، مما يجعله مناسبا للفحص الكيميائي ويساهم في تقليل التجارب على.

البروتوكول

تم استخدام خلايا iPS البشرية (201B7) في هذه الدراسة ، مع جين Nluc تحت سيطرة عنصر استجابة المصل (SRE) في موقع تكامل الفيروسات المرتبطة بالغدية 1 (AAVS1) باستخدام نظام CRISPR-Cas9 (الشكل 1 أ). تم الإبلاغ عن تفاصيل تحرير الجينات لخلايا المراسل (خلايا iPS البشرية SRE-Nluc-knocked-in) في مكان آخر6. ينقسم البروتوكول بشكل أساسي إلى ثلاث خطوات: 1) فحص السمية الخلوية لمادة كيميائية لتحديد الحد الأقصى لتركيز تعرضها ، 2) اختبار اضطراب الإشارة ، و 3) تحليل البيانات.

لتقليل تأثير التبخر المتوسط ، قم بإجراء جميع تجارب زراعة الخلايا باستخدام 60 بئرا مركزية للوحة مكونة من 96 بئرا ، وأضف الماء إلى الآبار الخارجية والمساحات بين الآبار. قم بتغطية اللوحة بغشاء مانع للتسرب منفذ للغاز أثناء الحضانة لتقليل التبخر بشكل أكبر.

1. تحضير الخلية

  1. خلايا مراسل المزرعة لمدة أسبوعين على الأقل بعد إذابة المخزون المجمد. حافظ على الخلايا وفقا لجدول تكرار لمدة 7 أيام واستخدم خلايا اليوم السابع للمقايسة. تحسين كثافة البذر إلى ~ 80٪ التقاء في يوم المرور.
  2. خلية مفردة بذرة عند 2.0 × 105 خلايا / بئر في صفيحة ستة آبار مطلية ب ECM مع 2 مل من وسط الصيانة الطازج المكمل بمثبط ROCK 10 ميكرومتر.
  3. بعد 24 ساعة ، استبدل الوسط ب 2 مل / بئر من وسط الصيانة الطازج.
  4. في 72 ساعة ، اجمع الخلايا باستخدام كاشف تفكك قائم على الإنزيم للحصول على معلق أحادي الخلية. البذور في 1.0 × 105 خلايا / بئر في صفيحة ستة آبار مطلية ب ECM مع 2 مل من وسط الصيانة الطازج المكمل بمثبط ROCK 10 ميكرومتر.
  5. بعد 24 ساعة ، استبدل الوسط ب 4 مل / بئر من وسط الصيانة الطازج.
  6. بعد 96 ساعة ، اجمع الخلايا كمعلق أحادي الخلية باستخدام كاشف تفكك قائم على الإنزيم. استخدم هذه الخلايا لمقايسة المراسل.

2. مقايسة السمية الخلوية

  1. الاختبار الأولي
    1. خلية مفردة بذرة عند 2.0 × 104 خلايا / بئر في صفيحة 96 بئرا مطلية ب ECM مع 200 ميكرولتر من وسط الصيانة الطازج المكمل بمثبط ROCK 10 ميكرومتر. أغلق اللوحة بغشاء نفاذ للغاز.
    2. في الساعة 24 ، استبدل الوسيط ب 200 ميكرولتر / بئر من وسيط الصيانة الطازج وأعد إغلاق اللوحة بغشاء منفذ للغاز.
    3. عند 72 ساعة ، استبدل الوسط ب 100 ميكرولتر / بئر من وسط الفحص وأعد إغلاق اللوحة بغشاء منفذ للغاز.
    4. عند 96 ساعة ، استبدل الوسط ب 100 ميكرولتر / بئر من وسط الفحص.
      ملاحظة: إذا لم يتم تحقيق التقاء بنسبة 100٪ ، فتوقف عن الفحص. نظرا لأن معدل النمو قد يختلف حسب خط الخلية ، قم بتحسين كثافة البذر لضمان التقاء كامل في يوم الفحص.
    5. قم بإذابة مادة الاختبار الكيميائية في وسط الفحص إلى أقصى قدر من الذوبان.
      ملاحظة: عند استخدام ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO) كمذيب ، يجب ألا يتجاوز التركيز النهائي ل DMSO 0.1٪.
    6. قم بإعداد تخفيف تسلسلي من خمس نقاط وخمسة أضعاف لمادة الاختبار الكيميائية في وسط الفحص باستخدام المحلول من الخطوة 2.1.5.
    7. أضف 11 ميكرولتر / بئر من المحاليل الكيميائية من الخطوة 2.1.6. للتحكم في السيارة ، أضف 11 ميكرولتر / بئر من وسط الفحص الذي يحتوي على نفس تركيز DMSO.
    8. بعد 48 ساعة ، احتضن الألواح عند 25 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
    9. أضف 111 ميكرولتر / بئر من كاشف مقايسة قابلية الخلية المضيئة القائم على ATP المتوازن مسبقا عند 25 درجة مئوية. بالنسبة للفراغ ، قم بإعداد بئر يحتوي على 111 ميكرولتر من وسط الفحص و 111 ميكرولتر من الكاشف.
    10. رج الطبق عند 300 دورة في الدقيقة لمدة دقيقتين باستخدام شاكر ميكروبلاتيك.
    11. انقل 200 ميكرولتر من الخليط إلى صفيحة سوداء لقياس التلألؤ. احتضن الأطباق على حرارة 25 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.
    12. قياس شدة التلألؤ لتقدير عدد الخلايا.
    13. احسب صلاحية الخلية باستخدام الصيغة التالية:
      بقاء الخلية (٪) = (RLU_sample − RLU_blank) / (RLU_vehicle − RLU_blank) × 100
      ملاحظة: حدد الخطوات اللاحقة بناء على صلاحية الخلية. إذا كانت الجدوى >50٪ في جميع التركيزات المختبرة ، فانتقل إلى الخطوة 2.2 بأقصى تركيز للذوبان. إذا تجاوزت الجدوى 50٪ ضمن النطاق المختبر، فانتقل إلى اختبار التحديد باستخدام أعلى تركيز مع قابلية للحياة >50٪. إذا كانت الجدوى <50٪ في جميع التركيزات ، كرر الاختبار الأولي بدءا من تركيز أقل.
  2. اختبار التحديد
    1. خلية مفردة بذرة عند 2.0 × 104 خلايا / بئر في صفيحة 96 بئرا مطلية ب ECM مع 200 ميكرولتر من وسط الصيانة الطازج المكمل بمثبط ROCK 10 ميكرومتر. أغلق اللوحة بغشاء نفاذ للغاز.
    2. في الساعة 24 ، استبدل الوسيط ب 200 ميكرولتر / بئر من وسيط الصيانة الطازج وأعد إغلاق اللوحة بغشاء منفذ للغاز.
    3. عند 72 ساعة ، استبدل الوسط ب 100 ميكرولتر / بئر من وسط الفحص وأعد إغلاق اللوحة بغشاء منفذ للغاز.
    4. عند 96 ساعة ، استبدل الوسط ب 100 ميكرولتر / بئر من وسط الفحص.
      ملاحظة: إذا لم يتم تحقيق التقاء بنسبة 100٪ ، فتوقف عن الفحص. تحسين كثافة البذر لضمان التقاء كامل في اليوم 4.
    5. قم بإذابة مادة الاختبار الكيميائية في وسط الفحص وفقا لنتائج الاختبار الأولي (الخطوة 2.1).
    6. قم بإعداد تخفيف تسلسلي من تسع نقاط وشقين لمادة الاختبار الكيميائية في وسط الفحص باستخدام المحلول من الخطوة 2.2.5.
    7. أضف 11 ميكرولتر/بئر من المحاليل الكيميائية من الخطوة 6.2.2. للتحكم في السيارة ، أضف 11 ميكرولتر / بئر من وسط الفحص الذي يحتوي على نفس تركيز DMSO.
    8. بعد 48 ساعة ، احتضن الألواح عند 25 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
    9. أضف 111 ميكرولتر / بئر من كاشف مقايسة قابلية الخلية المضيئة القائم على ATP المتوازن مسبقا عند 25 درجة مئوية. بالنسبة للفراغ ، قم بإعداد بئر يحتوي على 111 ميكرولتر من وسط الفحص و 111 ميكرولتر من الكاشف.
    10. رج الطبق عند 300 دورة في الدقيقة لمدة دقيقتين باستخدام شاكر ميكروبلاتيك.
    11. انقل 200 ميكرولتر من الخليط إلى صفيحة سوداء لقياس التلألؤ. احتضن الأطباق على حرارة 25 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.
    12. قياس شدة التلألؤ لتقدير عدد الخلايا.
    13. احسب صلاحية الخلية باستخدام الصيغة التالية:
      بقاء الخلية (٪) = (RLU_sample − RLU_blank) / (RLU_vehicle − RLU_blank) × 100
    14. قم بإنشاء منحنى استجابة الجرعة باستخدام بيانات من تسعة تركيزات واحسب IC50 من المنحنى.

3. فحص المراسل في الوقت الحقيقي (الشكل 1 ب)

  1. خلية مفردة للبذور عند 2.0 × 104 خلايا / بئر في صفيحة 96 بئرا مطلية ب ECM مع 200 ميكرولتر من وسط الصيانة الطازج المكمل بمثبط ROCK 10 ميكرومتر. أغلق اللوحة بغشاء نفاذ للغاز.
  2. في الساعة 24 ، استبدل الوسيط ب 200 ميكرولتر / بئر من وسيط الصيانة الطازج وأعد إغلاق اللوحة بغشاء منفذ للغاز.
  3. عند 72 ساعة ، استبدل الوسط ب 100 ميكرولتر / بئر من وسط الفحص وأعد إغلاق اللوحة بغشاء منفذ للغاز.
  4. عند 96 ساعة ، استبدل الوسيط ب 100 ميكرولتر / بئر من وسط الفحص الذي يحتوي على 1٪ ركيزة مضيئة.
    ملاحظة: إذا لم يتم تحقيق التقاء بنسبة 100٪ ، فتوقف عن الفحص. نظرا لأن معدل النمو قد يختلف حسب خط الخلية ، قم بتحسين كثافة البذر لضمان الالتقاء الكامل في اليوم 4.
  5. قم بإذابة مادة الاختبار الكيميائية في وسط الفحص بالتركيز المحدد في القسم 2.
  6. قم بإعداد تخفيف تسلسلي من ثماني نقاط وشقين لمادة الاختبار الكيميائية في وسط الفحص ، بدءا من المحلول المحضر في الخطوة 3.5.
  7. بعد ساعتين من التبادل المتوسط في الخطوة 3.4 ، أضف 11 ميكرولتر / بئر من المحاليل الكيميائية من الخطوة 3.6. للتحكم في السيارة ، أضف 11 ميكرولتر / بئر من وسط الفحص الذي يحتوي على نفس تركيز DMSO.
  8. بعد ساعة واحدة من بدء التعرض للمواد الكيميائية (الخطوة 3.7) ، أضف 12 ميكرولتر / بئر من وسط الفحص المحتوي على bFGF إلى تركيز نهائي قدره 2 نانوغرام / مل.
  9. قم بقياس التلألؤ بشكل مستمر لمدة 48 ساعة باستخدام نظام قياس التلألؤ في الوقت الفعلي تحت غلاف جوي مرطب ، 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 عند 37 درجة مئوية.
    ملاحظة: اضبط الوقت 0 عند نقطة إضافة FGF (انظر الشكل 1 ب).

4. تحليل البيانات (الشكل 1 ج)

  1. احسب تغيير log2 fold (LogFC) لشدة اللمعان عن طريق تطبيع مجموعة الاختبار إلى التحكم في السيارة:
    LogFC = السجل2 (Luc_sample / Luc_vehicle)
  2. قم بدمج LogFC على السلسلة الزمنية لمدة 48 ساعة لتقدير المنطقة بين المنحنيات (ABC) لمجموعات الاختبار والتحكم في المركبة.
  3. مجموع قيم ABC عبر جميع التركيزات لتحديد المدى الكلي لتعطيل الإشارة الناجم عن مادة الاختبار الكيميائية.
  4. إجراء تحليل منحنى خصائص تشغيل المستقبل (ROC) لتحديد عتبة تصنيف Devtox.

النتائج

في تجربتنا ، يعد مورفولوجيا الخلية مفيدا لتحديد ما إذا كان قد تم إجراء الفحص بشكل صحيح. يوضح الشكل 2 أ صور مجهرية متحد البؤر نموذجية للخلايا مباشرة قبل التعرض للمواد الكيميائية وبعدها. في نهاية الفحص ، يتم تغطية سطح الآبار بالكامل تقريبا بواسطة الخلايا. يوضح الشكل 2 ب صورا لتلوين الخلايا الحية / الميتة. عدد الخلايا الميتة الملطخة بيوديد بروبيديوم (PI) يزداد بعد التعرض للمواد الكيميائية; ومع ذلك ، فإن بقاء الخلية لا تقل عن 50٪ ، وجميع الخلايا تقريبا ملطخة ب calcein-AM.

يسرد الجدول 1 مواد الاختبار الكيميائية المستخدمة في دراساتنا السابقة7،8. توضح هذه الدراسات أنه يمكن تمييز المواد الكيميائية Devtox بدقة محسنة بناء على تعطيل إشارة FGF في خلايا iPS البشرية. النتيجة الرئيسية هي أن المراقبة المستمرة لنشاط الإشارات أمر بالغ الأهمية لأنه يتغير ديناميكيا بمرور الوقت. يوفر استخدام نظام قياس التلألؤ في الوقت الفعلي دقة زمنية أعلى بكثير مع عمل قياس أقل. هنا ، نصف بروتوكولا يستخدم نظام مراقبة في الوقت الفعلي.

يوضح الشكل 3 أ التغيرات في شدة التلألؤ على مدى 48 ساعة في ستة آبار مكررة في ظل نفس الظروف بدون مادة كيميائية للاختبار. المنحنيات الستة محاذاة تقريبا ، مما يشير إلى قابلية استنساخ جيدة من الآبار. على الرغم من عدم تحديده بوضوح في القياسات اليدوية على مدار 24 ساعة في دراساتنا السابقة ، إلا أن قمتين متميزتين - ذروة أولية مباشرة بعد إضافة تجنب FGF وذروة ثانية في حوالي 24 ساعة - تظهر في قياسات الوقت الفعلي لمدة 48 ساعة. يوضح الشكل 3 ب التغيرات في شدة التلألؤ عند التعرض لحمض الفالبرويك (VPA) ، وهو مادة سامة تنموية معروفة. VPA هو مثبط هيستون ديسيتيل يسبب عيوبا في الأنبوب العصبي والقلب والأطراف¹¹. يعطل VPA إشارات FGF بطريقة تعتمد على التركيز. التقط نظام القياس الآلي في الوقت الفعلي ديناميكيات الإشارة بشكل أكثر دقة من القياسات اليدوية.

figure-results-1
الشكل 1: مقايسة اضطراب إشارة FGF / SRF. (أ) الهندسة الوراثية لخلايا iPS البشرية لتوليد خلايا مراسل إشارة FGF / SRF. تم بناء بلازميد يحتوي على Nluc في اتجاه مجرى عنصر استجابة المصل ، وأذرع متجانسة للضربة القاضية المستهدفة ، وجين مقاومة البيوروميسين تحت سيطرة محفز كيناز الفوسفوغليسرات البشري. بعد اختيار بورومايسين ، تم إنشاء خلايا مراسل SRE-Nluc. (ب) الجدول الزمني للمقايسة. تم زرع خلايا المراسل في صفيحة مكونة من 96 بئرا ونمت لمدة 4 أيام لتغطية السطح بالكامل. تمت إضافة الركيزة المضيئة ومادة الاختبار الكيميائية قبل 3 و 1 ساعة من بدء القياس ، على التوالي. تم تحديد وقت إضافة ترابط FGF على أنه 0 ساعة ، وتم قياس شدة التلألؤ باستمرار على مدار 48 ساعة التالية. (ج) تحليل البيانات. تم تسجيل ديناميكيات الإشارة في الخلايا المعرضة وغير المعرضة للمواد الكيميائية للاختبار وتم تطبيعها للتحكم في السيارة لتقدير المنطقة بين المنحنيات كدرجة كمقياس لتعطيل الإشارة الناجم عن مادة كيميائية. تم الحصول على قيم ABC لكل مادة كيميائية بتركيزات مختلفة ، وتم حساب مجموعها. تم إجراء تحليل منحنى خصائص تشغيل المستقبل باستخدام جميع المواد السامة النمائية المعروفة التي تم اختبارها لتحديد العتبة. الاختصارات: iPS = الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات; RLU = وحدة الضوء النسبية ؛ AUC = المنطقة تحت المنحنى ؛ FGF = عامل نمو الخلايا الليفية. SRF = عامل استجابة المصل; SRE = عنصر استجابة المصل ؛ HA = ذراع متماثل ؛ L = اليسار ؛ R = يمين. PuroR = جين مقاومة البيورومايسين; hPGK = كيناز فوسفوجليسيرات الإنسان ؛ Nluc = NanoLuc لوسيفيراز. ROC = خاصية تشغيل جهاز الاستقبال؛ ABC = المنطقة بين المنحنيات. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-2
الشكل 2: مورفولوجيا الخلية وتلوين الخلايا الحية / الميتة. (أ) صور مجهرية متحد البؤر للخلايا قبل (اليوم 4) وبعد (اليوم 6) التعرض لمادة كيميائية اختبارية. الخلايا المتبقية التي تغطي سطح الآبار بالكامل تقريبا بعد الاختبار هي مؤشر على نجاح عملية الاختبار. تشير تغطية البئر شبه الكاملة في نهاية الفحص إلى تشغيل ناجح. (ب) تلطيخ الخلايا الحية / الميتة قبل وبعد التعرض لمادة كيميائية اختبارية. تم تلطيخ الخلايا الحية باللون الأخضر ب Calcein-AM ، وتم تلطيخ الخلايا الميتة باللون الأحمر مع يوديد البروبيديوم (PI). كانت ملطخة بالكالسين-AM (الأخضر) ، والخلايا الميتة مع يوديد بروبيديوم (PI ، أحمر). يجب أن تكون نسبة الخلايا الميتة أقل مما ينبغي أن تكون < 50٪ من إجمالي الخلايا. أشرطة المقياس = 100 ميكرومتر. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

figure-results-3
الشكل 3: أمثلة نموذجية لديناميكيات شدة التلألؤ. (أ) يغير تلألؤ المسار الزمني المسار الزمني للتلألؤ بعد تحفيز الترابط FGF، الذي يقاس باستخدام نظام قياس التلألؤ في الوقت الحقيقي. تمت مراقبة شدة اللمعان كل 22 دقيقة لمدة 48 ساعة. تمثل الخطوط الستة الملونة إشارات من آبار مختلفة. (ب) مقارنة قياسات اللمعان اليدوية وفي الوقت الحقيقي مع حمض الفالبرويك. لوحظ انقطاع الإشارة مع كلتا طريقتي القياس ، بينما التقطت المراقبة في الوقت الفعلي الإشارة المحسنة بشكل أكثر وضوحا عند الذروة الثانية. الاختصارات: RLU = وحدة الضوء النسبية ؛ VPA = حمض الفالبرويك. FGF = عامل نمو الخلايا الليفية. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. الرجاء النقر هنا لتنزيل هذا الجدول.

اختبار كيميائياختصاركاس لا.دراسة
(دراسة سابقة)		دراسة في المختبر
(هذه الدراسة)		مجموع قيم ABCأقصى تركيز
(ميكروغرام / مل)
حمض الريتينويك بالكامل عبرATRA302-79-4PP65.90.0100
هيدروكسي يورياهو127-07-1PP63.3149
حمض ميثوكسي أسيتيكما625-45-6PP225683
كلوريد ميثيل الزئبقMeHg115-09-3PP77.71.20
هيدرات الميثوتريكساتإم تي إكس133073-73-1PP80.55.00
ساليسيلات الصوديومش.م.م54-21-7PP38.7666
حمض الفالبرويكفي بي إيه99-66-1PP63.3100
6-أمينونيكوتيناميد6-أ329-89-5PN24.91.00
حمض البوريكبكالوريوس10043-35-3PN24.2250
5-برومو-2'-ديوكسيوريدينبردو59-14-3PP83.950.0
5،5-ثنائي ميثيل -2،4-أوكسازوليدينيديونDMO695-53-4PP50.3840
كلوريد الليثيومليكلر7447-41-8PN29.8250
5-فلورويوراسيل5-فو51-21-8PP92.42.65
سيكلوفوسفاميد أحادي الهيدراتCPA6055-19-2PN19.1400
إيماتينيب ميسيلاتمعهد العالم العربي220127-57-1PP42.412.5
ليناليدومايدليون191732-72-6PP94.735.0
بوماليدوميدبوم19171-19-8PP50.92.50
الثاليدومايدثا50-35-1PP53.312.0
أكريلاميدACA79-06-01NN37.1454
د-كافوركام464-49-3NN27.550.0
ديفينهيدرامين هيدروكلوريددي إتش إم147-24-0NP68.2262
ثنائي ميثيل بثالاتدي إم بي131-11-3NN24.4100
البنسلين G ملح الصوديومبنغ69-57-8NN22.11000
سكرين الصوديومكيس82385-42-0NN34.01000
اسيتامينوفينأبي أب103-90-2NN22.320.0
أموكسيسيلين ثلاثي هيدراتAMX61336-70-7NN28.425.0
سيميتيدينسم51481-61-9NN25.330.0
الاريثروميسين114-07-8NN20.015.0
هيدروكلوروثيازيدHCTZ58-93-5NN21.920.0
سلفاسالازينSSZ599-79-1NN30.8100
كيميائيالجامعة الأمريكية بالقاهرةعتبةحساسيةخصوصيهدقة
30 مادة0.81937.90.7780.9170.833

الجدول 1: المواد الكيميائية Devtox وغير Devtox المصنفة ضمن التجارب على والنتائج المقدرة مع وبدون اضطراب إشارة FGF. الاختصارات: P = إيجابي (Devtox) ؛ N = سالب (غير Devtox).

المناقشة

يتم تنظيم نمو الجنين والجنين بإحكام عن طريق شبكات الإشارات12. في حين أن التغذية الراجعة داخل هذه الشبكات توفر متانة ضد الضوضاء الداخلية والخارجية ، فقد افترضنا أن مواد Devtox الكيميائية يمكن أن تمارس تأثيرات تتجاوز هذا التخزين المؤقت. هنا ، نقدم بروتوكولا لتقدير مواد Devtox الكيميائية بناء على التعطيل المفرط لإشارات FGF / SRF. لا يوفر هذا النهج أي معلومات تتعلق بالآليات الجزيئية المسؤولة عن Devtox ، مثل البروتينات المستهدفة لمادة كيميائية ، ويركز فقط على إشارات FGF / SRF. ومع ذلك ، كان من الممكن تصنيف المواد الكيميائية Devtox بكفاءة ، بدقة 83٪ و AUC 0.819 (الجدول 1). ربما يرجع ذلك إلى أن كل مسار إرسال إشارات يرتبط ارتباطا وثيقا بالآخرين ويشكل شبكات إشارات كثيفة ، ويؤدي التعطيل داخل هذه الشبكات إلى انقطاع إشارة FGF / SRF.

يجب معالجة العديد من التحديات الفنية عند إنشاء خلايا المراسلة. Nluc أكثر إشراقا بحوالي 100 مرة من اللوسيفيراز التقليدي المشتق من اليراعات أو Renilla ، مما يسمح بالمراقبة المستمرة طويلة الأجل لتغيرات الإشارة13. تم استخدام Nluc الذي يحتوي على تسلسل PEST لالتقاط ديناميكيات نشاط الإشارات بشكل أكثر دقة. يعزز تسلسل PEST تدهور البروتين. في حين أن بروتين Nluc مستقر مع عمر نصف يزيد عن 6 ساعات ، فإن علامة PEST تسرع من التدهور عبر مسار اليوبيكويتين والبروتيزوم ، مما يقلل من عمر النصف إلى 10-30 دقيقة. علاوة على ذلك ، تم ضرب جين المراسل في موضع AAVS1 ، وهو "ملاذ آمن" جينومي ، مما يضمن عدم إسكات التعبير وعدم تعطل الجينات الأساسية عن طريق الخطأ14.

في تقييم طرق الاختبار ، من الأهمية بمكان اختيار المواد الكيميائية المرجعية ل Devtox وغير Devtox. اخترنا المواد الكيميائية المرجعية من القوائم في دراسة التحقق الدولية ECVAM ، وإرشادات ICH S5 (بما في ذلك الثاليدومايد) ، والدراسات الحيوانية7. قمنا بإدراج 30 مادة كيميائية من Devtox وغير Devtox ، ولكن يجب إضافة المزيد من المواد الكيميائية من مصادر موثوقة واختبارها. لذلك ، يجب اعتبار عتبة ROC (المجموع ABC = 37.9) المبلغ عنها هنا أولية وستتطلب التحقق من صحة مجموعة أكبر ومستقلة من المركبات لضمان المتانة الإحصائية. كان سيكلوفوسفاميد (CPA) واحدا من ثلاث مواد كيميائية ذات نتائج سلبية كاذبة. يتم هيدروكسيل CPA في الكبد إلى 4-hydroperoxycyclophosphamide ، و CPA ومنتجات التحلل الخاصة به ماسخة15. عادة لا تأخذ المقايسات في المختبر ، بما في ذلك نهجنا ، في الاعتبار عملية التمثيل الغذائي ولا يمكنها اكتشاف المواد الكيميائية التي تحفز Devtox عن طريق التمثيل الغذائي. وهذا قيد للنهج المقترح. بالإضافة إلى السلبيات الكاذبة المعتمدة على التمثيل الغذائي (على سبيل المثال ، CPA) ، لاحظنا أيضا إيجابية كاذبة مع هيدروكلوريد ديفينهيدرامين (DHM). لا تدعم الأدلة الوبائية بقوة الارتباط السببي بين DHM والتشوهات الخلقية ، ومع ذلك فقد صنفته العديد من الدراسات المختبرية على أنه مادة سامة في النمو. من المحتمل أن يكون هذا في تصنيفه الخاطئ في فحصنا. على العكس من ذلك ، فإن 6-أمينونيكوتيناميد (6-AN) لم يعطل إشارات FGF / SRF وبالتالي تم تصنيفه بشكل خاطئ ، مما يشير إلى أن آلية سمية النمو الخاصة به قد تستمر عبر مسارات لم يلتقطها هذا المراسل. تدعم هذه الأمثلة معا توسيع لوحة الفحص لتشمل مسارات إشارات تنموية إضافية لتقليل كل من الإيجابيات الخاطئة والسلبيات الكاذبة.

عدة عوامل لها تأثير كبير على هذا الفحص. أحد هذه العوامل هو تحضير الخلية قبل الفحص. لتقليل ذلك ، تم الحفاظ على الخلايا وفقا لجدول تكرار مدته 7 أيام لضمان جمع الخلايا المستخدمة في الفحص في نفس ظروف النمو. يتم زرع الخلايا يوم الاثنين ، ويتم تمريرها يوم الخميس ، ويتم استخدام جزء للفحص وزرعه في المقطع التالي. عامل آخر هو كثافة الخلايا في وقت التعرض لمادة كيميائية اختبارية. تم إجراء الفحص فقط عندما وصلت الخلايا إلى التقاء 100٪ في يوم التعرض للمواد الكيميائية. تأثيرات الحواف في ألواح 96 بئرا معروفة جيدا. في هذا الفحص ، تم استخدام 60 بئرا داخلية فقط من اللوحة المكونة من 96 بئرا لتجنب تأثيرات الحافة. بالإضافة إلى الاعتبارات العامة ، يمكن أن يحدث التباين التقني أثناء الفحص. كانت المشكلة الشائعة هي شدة التلألؤ غير المتسقة بين الآبار في مجموعة التحكم في المركبات ، والتي ربما تكون ناتجة عن بذر الخلايا غير المتكافئ أو جودة الخلية دون المستوى الأمثل. نوصي بالحفاظ على الخلايا عند التقاء 80٪ تقريبا لتقليل هذا التباين والتحقق من النمو المنتظم عبر الآبار في اليوم التالي للبذر. ضبط كثافة البذر iPSC يمكن أن يعزز أيضا قابلية التكاثر للمقايسة. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن أن يؤدي الموت المفرط للخلايا إلى تقلبات تلألؤ غير محددة لا علاقة لها بالإشارة التجريبية. لذلك ، قم بتقييم مورفولوجيا الخلية في نهاية الفحص للتأكد من أن الخلايا في حالة مناسبة أثناء القياس. في المقايسات اليدوية ، تؤدي إزالة اللوحة من الحاضنة في كل نقطة زمنية إلى تعريض الخلايا لتغيرات قصيرة في درجة الحرارة ومستويات ثاني أكسيد الكربون2. للحد من هذه التقلبات البيئية ، يجب إجراء القياسات بسرعة ومتسقة.

يمكن إجراء هذا الاختبار يدويا أو باستخدام نظام قياس في الوقت الفعلي. لا يتطلب النهج اليدوي معدات متخصصة ، لكن نظام القياس في الوقت الفعلي يتيح اكتشافا أكثر دقة لديناميكيات الإشارة. على الرغم من عدم تحديده في القياسات اليدوية ، فقد التقط نظام القياس في الوقت الفعلي بوضوح قمتين لإشارة اللمعان. في القياسات اليدوية ، حدثت فجوة قدرها 12 ساعة في الحصول على البيانات أثناء الليل ، مما قد يؤدي إلى التقليل من تقدير الذروة الثانية أو فقدانها. قد تكون هاتان القمتان ناتجة عن ردود فعل سلبية من إشارات FGF ووجود رابط FGF مستقر حراريا. والجدير بالذكر أن اضطراب إشارة FGF بواسطة مادة كيميائية بدا أحيانا أكبر في الذروة الثانية منه في الذروة الأولى (الشكل 3 ب).

يمثل هذا البروتوكول نهجا واعدا للفحص الكيميائي Devtox باستخدام مقايسة مراسل بشري قائم على iPSC لتقييم اضطراب إشارة FGF كميا. تم تطوير العديد من المقايسات البديلة في المختبر للسمية التنموية على مدى العقود القليلة الماضية ، بما في ذلك اختبار الخلايا الجذعية الجنينية للفأر (mEST) 16 ، واختبار الخلايا الجذعية الجنينية المستند إلى Hand1 (Hand1-EST) 17 ، و ReProGlo18. بالمقارنة مع هذه المقايسات التقليدية ، أظهرت هذه الطريقة دقة تنبؤية فائقة. في السنوات الأخيرة ، تم إدخال استراتيجيات بديلة مثل تلك التي تستخدم الخلايا الجذعية الجنينية البشرية أو أجنة أسماك الزرد كجزء من الجهود الدولية لإنشاء أنظمة اختبار غير حيوانية. أبلغت هذه الأساليب أيضا عن دقة تنبؤية عالية لتقييمات السمية التنموية. لزيادة تحسين أداء هذا الاختبار ، قد يكون من المفيد دمج مسارات إشارات إضافية تشارك في التطور الجنيني هناك العديد من مسارات الإشارات الرئيسية الأخرى في التشكل التنموي ، مثل Wnt / β-catenin و BMP / SMAD و Hedgehog / GLI19. قد توفر مجموعات مختلفة من خلايا المراسلة المستخدمة لتقييم مسارات الإشارات هذه تقييما أكثر شمولا للمواد الكيميائية المختلفة. تأثير مرحلة التمايز لخلايا iPS ، على سبيل المثال ، المرحلة الأولى التي تتشكل فيها الطبقات الجرثومية الثلاث - على حساسية الكشف عن هذا الفحص سيكون موضوع بحثنا المستقبلي. قد تستكشف الدراسات المستقبلية أيضا التحقق من صحة الأنواع المتقاطعة باستخدام أنظمة الخلايا الجذعية للقوارض أو الأرانب لتمكين المقارنة المباشرة مع مجموعات البيانات في الجسم الحي في تلك الأنواع ، بينما يظل تركيزنا الأساسي على خلايا iPS البشرية لزيادة الأهمية البشرية.

الإفصاحات

ليس لدى المؤلفين تضارب في المصالح للإفصاح عنها.

شكر وتقدير

تم دعم هذا العمل من قبل JSPS ، اليابان [أرقام منح KAKENHI 23K25021 و 25K03278] ؛ وزارة الصحة والطفل والعمل ، اليابان [رقم منح البرنامج 23 دينار كويتي و 1003 دينار كويتي 24 دينار كويتي] ؛ KISTEC ، اليابان ؛ و AMED ، اليابان [أرقام المنح JP23mk0101252 و 25mk0121314].

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
أنبوب الطرد المركزي الدقيق بسعة 1.5 ملفاست جينFG-MCT015Cتحضير المواد الكيميائية للاختبار
أنبوب طرد مركزي بحجم 15 ملفيولامو1-3500-21زراعة الخلايا
أنبوب PCR ذو 8 شرائطواتسون137-333Cتحضير المواد الكيميائية للاختبار
لوحة سفلى بئر 96 بئر بيضاء/شفافة، سطح TCثيرمو فيشر العلمي165306قياسات زراعة الخلايا والتلمعان
صفيحة دقيقة أسود ذات قاع مسطح 96ASONE3-3321-04لقياس التلميع في اختبارات السمية الخلوية
تنفس بسهولةتوهوBERM-2000فيلم ختم نافذ الغاز
اختبار قابلية بقاء الخلايا المضيئة CellTiter-GloبروميغاG7572اختبار السمية الخلوية
الطرد المركزي 5702 Rإبندورفالطرد المركزي
ClipTip 300، مفلتر، معقم، رفثيرمو فيشر العلمي94420513
ClipTip 50، مفلتر، معقم، رفثيرمو فيشر العلمي94420253
عداد الخلايا الآلي Countess 3 FLإنفيتروجينعد الخلايا
شرائح غرفة عد خلية كونتيسةإنفيتروجينC10312عد الخلايا
الثقافة بالتأكيد DMSO فوجي فيلم واكو031-24051مذيب للمواد الكيميائية
ثقافة شور Y-27632فوجي فيلم واكو036-24023مثبط الصخور لتلقيح iPSC
DMEM/F12 HEPES، بدون فينول ريدثيرمو فيشر العلمي11039-021الطلاء لزراعة خلايا iPS
مناصات F1-ClipTip متعددة القنوات، 30 إلى 300 وميكرو؛ Lثيرمو فيشر العلمي4661180N
معصبات F1-ClipTip متعددة القنوات، 5 إلى 50 وميكرو؛ Lثيرمو فيشر العلمي4661160N
شريحة الفلترواتسون
مصفوفة الغشاء الأساسي الخالي من LDEV من جيلتريكس لعامل نمو منخفضثيرمو فيشر العلميA1413202الطلاء لزراعة خلايا iPS
هييناي مات 01Rسيرة الكوزموHMAT01Rللحفاظ على استقرار درجة حرارة اللوحة أثناء التعامل مع زراعة الخلايا
سخان أنابيب HIENAI GX01سيرة الكوزموTWGX013للحفاظ على دفء الوسط أثناء التعامل التجريبي
بروتين bFGF المؤتلف المستقر للحرارة البشريةثيرمو فيشر العلميPHG0367تحفيز FGF لاختبار المراسل
الخلايا الجذعية متعددة القدرات (iPS) المستحثة بواسطة الإنسان201B7 (RCB Cat# HPS0063، RRID: CVCL_A324)بنك RIKEN BRC Cell
هزاز الصفيحة الدقيقةتايتك0089532-000اهتزاز الصفيحة لاختبار التوتوسيسيتي
قارئ متعدد الألواحبيركينإلمرARVO X4قياس التوهج
ركيزة الخلايا الحية من نانو-غلو إندورازينبروميغاN2571ركيزة التوهج
PBS (-) فوجي فيلم واكو166-23555الزراعة الخلوية
بارافيليمكواحد65-1681-93مخزن للوحة الطلاء
البيبيتوإبندورف
WSL-1563 كرونوس HTATTO3510140نظام قياس التلميع في الوقت الحقيقي&nb;
خزانBMBioBM-0850-1
STEMdif APEL2 Medium تقنيات الخلايا الستيميةST-05275وسيط الفحص
ستيم فليكس ميديومثيرمو فيشر العلميA3349401وسيط الصيانة
ماء معقم، خال من السموم الداخليةفوجي فيلم واكو196-15645التحكم في الرطوبة لزراعة خلايا iPS
لوحة زراعة الأنسجة VTC-P6فيولامو2-8588-01الزراعة الخلوية
إنزيم TrypL Select (1X)، بدون فينول أحمرثيرمو فيشر العلمي12563011زراعة الخلايا
حمض الفالبرويكفوجي فيلم واكو227-01071اختبار كيميائي

المراجع

  1. Gilbert-Barness, E. Teratogenic causes of malformations. Ann Clin Lab Sci. 40 (2), 99-114 (2010).
  2. DeSesso, J. M. Future of developmental toxicity testing. Curr Opin Toxicol. 3, 1-5 (2017).
  3. Teixidó, E., Krupp, E., Amberg, A., Czich, A., Scholz, S. Species-specific developmental toxicity in rats and rabbits: Generation of a reference compound list for development of alternative testing approaches. Reprod Toxicol. 76, 93-102 (2018).
  4. Vargesson, N. Thalidomide-induced teratogenesis: History and mechanisms. Birth Defects Res C Embryo Today. 105 (2), 140-156 (2015).
  5. van der Laan, J. W., Chapin, R. E., Haenen, B., Jacobs, A. C., Piersma, A. Testing strategies for embryo-fetal toxicity of human pharmaceuticals. Animal models vs. in vitro approaches: A workshop report. Regul Toxicol Pharmacol. 63 (1), 115-123 (2012).
  6. Kanno, S., et al. Luciferase assay system to monitor fibroblast growth factor signal disruption in human iPSCs. STAR Protoc. 3 (2), 101439(2022).
  7. Kanno, S., Okubo, Y., Kageyama, T., Yan, L., Fukuda, J. Integrated fibroblast growth factor signal disruptions in human iPS cells for prediction of teratogenic toxicity of chemicals. J Biosci Bioeng. 133 (3), 291-299 (2022).
  8. Kanno, S., et al. Establishment of a developmental toxicity assay based on human iPSC reporter to detect FGF signal disruption. iScience. 25 (2), 103770(2022).
  9. Miano, J. M. Role of serum response factor in the pathogenesis of disease. Lab Invest. 90 (9), 1274-1284 (2010).
  10. Purvis, J. E., Lahav, G. Encoding and decoding cellular information through signaling dynamics. Cell. 152 (5), 945-956 (2013).
  11. Paradis, F. -H., Hales, B. F. Exposure to valproic acid inhibits chondrogenesis and osteogenesis in mid-organogenesis mouse limbs. Toxicol Sci. 131 (1), 234-241 (2013).
  12. Bosman, S. L., Sonnen, K. F. Signaling oscillations in embryonic development. Curr Top Dev Biol. 149, 341-372 (2022).
  13. Hall, M. P., et al. Engineered luciferase reporter from a deep sea shrimp utilizing a novel imidazopyrazinone substrate. ACS Chem Biol. 7 (11), 1848-1857 (2012).
  14. DeKelver, R. C., et al. Functional genomics, proteomics, and regulatory DNA analysis in isogenic settings using zinc finger nuclease-driven transgenesis into a safe harbor locus in the human genome. Genome Res. 20 (8), 1133-1142 (2010).
  15. Hales, B. F. Comparison of the mutagenicity and teratogenicity of cyclophosphamide and its active metabolites, 4-hydroxycyclophosphamide, phosphoramide mustard, and acrolein. Cancer Res. 42 (8), 3016-3021 (1982).
  16. Genschow, E., et al. The ECVAM international validation study on in vitro embryotoxicity tests: Results of the definitive phase and evaluation of prediction models. Altern Lab Anim. 30 (2), 151-176 (2002).
  17. Suzuki, N., Ando, S., Yamashita, N., Horie, N., Saito, K. Evaluation of novel high-throughput embryonic stem cell tests with new molecular markers for screening embryotoxic chemicals in vitro. Toxicol Sci. 124 (2), 460-471 (2011).
  18. Uibel, F., et al. ReProGlo: A new stem cell-based reporter assay aimed to predict embryotoxic potential of drugs and chemicals. Reprod Toxicol. 30 (1), 103-112 (2010).
  19. Sanz-Ezquerro, J. J., Münsterberg, A. E., Stricker, S. Editorial: Signaling pathways in embryonic development. Front Cell Dev Biol. 5, 76(2017).

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

قياس التلألؤ البيولوجيمقايسة حيوية الخلايااختبار السمية الكيميائيةالتخفيف التسلسليالتصوير بتباين الطور
مقايسة السمية التنموية على أساس المراقبة في الوقت الفعلي لتعطيل إشارة عامل نمو الخلايا الليفية في الخلايا الجذعية متعددة القدرات التي يسببها الإنسان
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.