يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

رقاقة الموائع الدقيقة لبناء نماذج الإصابات المحورية وتمكين تحليل الأوميكس المتعدد

1.8K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/68915

⸱

أكتوبر 14, 2025

 ,  ,  ,  , 
1Beijing Advanced Innovation Center for Big Data-Based Precision Medicine, Beihang University, 2Interdisciplinary Innovation Institute of Medicine and Engineering, Beihang University, 3School of Biological Science and Medical Engineering, Beihang University, 4School of Software, Beihang University, 5School of Beijing, Beihang University

في هذه المقالة

ملخص

يصف هذا البروتوكول نظاما موائعا دقيقة ينمذجة ديناميكيات التمثيل الغذائي العصبية بعد الإصابة المحورية ، مما يتيح التصوير ، وتحليل الأوميكس المتعدد ، والدراسات الميكانيكية لإعادة تشكيل التمثيل الغذائي الجوهري.

الملخص

تستقطب الخلايا العصبية لتشكيل التشعبات والمحاور ، مما يتيح الاتصال بين الخلايا. تعطل الإصابة المحورية هذه الوصلات وتنقل إشارات التلف إلى السوما، مما يؤدي غالبا إلى تنكس الخلايا العصبية. وبالتالي ، فإن الحفاظ على التوازن المحوري أمر ضروري لتعزيز تجديد المحاور العصبية المحلية والحماية من التنكس العصبي. تعتمد هذه العملية على التمثيل الغذائي الخلوي لتزويد الطاقة وسلائف التخليق الحيوي وتدعمها الآليات التي تنظم توازن التمثيل الغذائي وتقضي على المنتجات الثانوية. ومع ذلك ، يتم تقسيم التمثيل الغذائي للخلايا العصبية بين سوما ومحور عصبي ويتأثر بشكل أكبر في الجسم الحي بالبيئة المكروية المحيطة ، مثل النشاط الأيضي المشتق من الخلايا النجمية (على سبيل المثال ، مكوك لاكتات الخلايا النجمية والخلايا العصبية). هذه العوامل تعقد التحقيق في آليات التمثيل الغذائي الجوهرية للخلايا العصبية. لمواجهة هذه التحديات ، قمنا هنا بتطوير منصة موائع دقيقة لزراعة الخلايا العصبية القشرية الأولية في المختبر التي تحافظ على الخصائص الأيضية الرئيسية التي لوحظت في الجسم الحي ، بما في ذلك التدفق الفسيولوجي لمحلل السكر وتنفس الميتوكوندريا. يوفر هذا النظام نموذجا مبسطا للتحقيق في إعادة تشكيل التمثيل الغذائي الجوهري في الخلايا العصبية بعد الإصابة المحورية. تدعم رقائق الموائع الدقيقة التقليدية نماذج الإصابات المحورية في المختبر وهي متوافقة مع تصوير الخلايا الحية ، وتلوين التألق المناعي ، وعلاج نقص الأكسجة. لاستيعاب تحليلات النسخ والتمثيل الغذائي واسعة النطاق التي تشمل ملايين الخلايا ، قمنا أيضا بتصميم وتصنيع رقائق الموائع الدقيقة عالية الإنتاجية مع بروتوكولات تشغيلية محسنة. يتميز الجهاز بغرف سوما ومحور عصبي مرتبة بالتناوب متصلة بقنوات دقيقة ، وتحدث الإصابة المحورية عن طريق شفط الفراغ للسائل من حجرة المحاور العصبية. تتيح هذه المنصة التقييم السريع لديناميكيات المستقلب والإنزيم ، مما يحسن دقة وقابلية استنساخ تحقيقات omics المتعددة.

المقدمة

تنشئ الخلايا العصبية نوعين متميزين من النتوءات بوظائف متخصصة ، المحاور والتشعبات ، عن طريق الاستقطاب أثناء التطور1،2. يشير تجديد الأعصاب إلى عملية إعادة نمو المحوري بعد الإصابة العصبية3 ، مع التركيز البحوثي على إصلاح الجهاز العصبي المركزي (الجهاز العصبي المركزي). على عكس الجهاز العصبي المحيطي ، فإن الجهاز العصبي المركزي لديه قدرة تجديدية محدودة4،5،6 ، مما يؤدي غالبا إلى إعاقات وظيفية مستمرة أو إعاقات دائمة في المرضى الذين يعانون من إصابات الحبل الشوكي أو إصابات الدماغ الرضحية7،8. وبالتالي ، فإن تطوير استراتيجيات لتعزيز إصلاح الجهاز العصبي المركزي وتوضيح الآليات الكامنة وراء تجديد المحوري أمر بالغ الأهمية.

أظهرت أجهزة الموائع الدقيقة ، التي تعمل كأنظمة زراعة متكاملة وفعالة من حيث التكلفة وعالية الإنتاجية في المختبر ، مزايا ملحوظة في أبحاث الخلايا والخلايا العصبية في السنوات الأخيرة9،10. بالمقارنة مع الطرق التقليدية ، تتيح تقنية الموائع الدقيقة التنظيم الدقيق لإجهاد قص السوائل ، وتدرجات التركيز ، والهياكل المكانية ، وبالتالي محاكاة البيئات الدقيقة الفسيولوجية والمرضية الأصلية عن كثب لتعزيز نمو الخلايا ، والهجرة ، والتمايز ، والتفاعلات11،12،13،14. تتيح نماذج الإصابات المحورية في المختبر القائمة على الموائع الدقيقة الزراعة المجزأة لأجسام الخلايا العصبية وعملياتها من خلال الاستقطاب المكاني ، مما يوفر أداة لا غنى عنها لاستكشاف القدرة التجديدية الجوهرية للخلايا العصبية وتكييفها الأيضي بعد الإصابة15،16،17،18. يوفر نافذة مهمة حول كيفية استجابة الخلايا العصبية للإصابة ، وتنظيم عمليات التمثيل الغذائي19 ، وتعزيز تجديد المحور العصبي20. ومع ذلك ، لا تزال منصات الموائع الدقيقة الحالية للإصابة المحورية وأبحاث التمثيل الغذائي تواجه تحديات ، بما في ذلك انخفاض إنتاجية الخلايا العصبية ، وانخفاض الدقة في قياسات التمثيل الغذائي ، ونقص الإجراءات التشغيلية الموحدة.

استجابة لهذه القيود ، طورت هذه الدراسة منصة جديدة للموائع الدقيقة على نطاق واسع تتيح الحث القياسي عالي الإنتاجية للإصابة المحورية وتوفر مادة خلوية كافية لتحليلات الأوميكس المتعددة المجزأة. يواجه هذا التصميم المتكامل بشكل مباشر الحاجة الحرجة غير الملباة في أبحاث الإصابات العصبية. على وجه التحديد ، تتميز الشريحة الدقيقة التي صممناها بترتيب متناوب للغرف الجسدية والمحورية المتصلة بأخاديد دقيقة ، مع القطع المحوري الذي يتم تحقيقه من خلال شفط الفراغ المتحكم فيه. هذا النهج مثالي للدراسات التي تتطلب نماذج إصابة محورية قابلة للتكرار وعالية الإنتاجية وتوصيف أيضي دقيق ، مثل التحقيق في آليات التمثيل الغذائي الكامنة وراء التجديد المحوري. بالمقارنة مع الطرق التقليدية ، توفر هذه التقنية إنتاجية أعلى ودقة أيضية أكبر والقدرة على إنشاء نماذج إصابات موحدة. على سبيل المثال ، أظهرت الدراسات السابقة أهمية انتقال الميتوكوندريا في تجديد المحوري20،21،22،23 ، بينما تكشف منصتنا أيضا عن دور استقلاب الجلوكوز في تجديد المحور بعد الإصابة. ينشئ هذا البروتوكول نظاما تقنيا لبضع المحرز على نطاق واسع وتحليل التمثيل الغذائي الذي يمكن التحقق منه بصريا وموحد من الناحية التشغيلية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

تم إجراء جميع التجارب وفقا لإرشادات لجنة الأخلاقيات بجامعة بيهانغ وتمت الموافقة عليها من قبل اللجنة (رمز الموافقة: BM20210060). يوضح الشكل 1 الجدول الزمني التجريبي.

1. تصميم جهاز الموائع الدقيقة التقليدي والواسع النطاق

  1. صمم جهاز الموائع الدقيقة باستخدام AutoCAD لإنشاء مخططات ثنائية الأبعاد (2D) ونماذج هيكلية ثلاثية الأبعاد (3D).
  2. استخدم هذه التصميمات لتصنيع قالب رئيسي على رقاقة سيليكون مع الطباعة الحجرية الضوئية السلبية SU-8.
  3. قم بتكرار القالب الرئيسي عن طريق صب بولي ديميثيل سيلوكسان (PDMS) ، مما ينتج عنه رقاقة موائع دقيقة وظيفية عالية الدقة.
  4. صمم كل قناة دقيقة بحيث يبلغ ارتفاعها 5 ميكرومتر ، مما يسمح فقط بمرور المحاور أثناء حجب السوما.
  5. اجعل القنوات الدقيقة بعرض 10 ميكرومتر لزيادة السعة المحورية.
  6. صمم الغرف بحيث يبلغ ارتفاعها 120 ميكرومتر وعرضها 220 ميكرومتر ، مما يوفر مساحة كافية للسوما العصبية.
  7. استخدم منصة الموائع الدقيقة هذه لمحاكاة الإصابة المحورية في الجسم الحي عن طريق التحكم في تدفق السوائل ووضع الخلايا العصبية.
  8. قم بإعداد عينات التمثيل الغذائي والنسخ باستخدام الجهاز لمعالجة الخلايا عالية الدقة ، وتمكين المعالجة عالية الإنتاجية لتحسين دقة العينة والصلاحية البيولوجية.

2. تصنيع الأجهزة التقليدية والكبيرة الدقيقة

  1. قم بوزن قاعدة PDMS وعامل المعالجة بنسبة 10: 1 (وزن / عرض) وضعها في أنبوب الطرد المركزي.
  2. ضع أنبوب الطرد المركزي الذي يحتوي على خليط PDMS في خلاط محرك الطرد المركزي. جهاز طرد مركزي عند 2000 × جم لمدة 4 دقائق للخلط ، ثم جهاز طرد مركزي مرة أخرى عند 2000 × جم لمدة 4 دقائق للديغاز.
  3. صب 13-15 جم من PDMS منزوع الغاز في قالب الموائع الدقيقة ، مما يضمن تغطية الجزء السفلي من القالب بالكامل.
  4. ضع القالب في مجفف فراغ. استخدم مضخة تفريغ لتفريغ الهواء لمدة 5-10 دقائق لإزالة الفقاعات تماما من PDMS.
  5. استخدم لمبة مطاطية للنقر برفق على سطح PDMS لكسر أي فقاعات سطحية متبقية.
  6. ضع القالب في فرن حراري واخبزيه على حرارة 80 درجة مئوية لمدة 100 دقيقة لعلاج PDMS.
  7. بمجرد معالجة PDMS تماما ، حرك طرف المشرط برفق أسفل حافة PDMS لرفعه بعناية وفصله عن القالب.
  8. استخدم ثقب خزعة بقطر 2.0-2.5 مم لعمل ثقوب في PDMS لتسريب وسط المزرعة وتحميل الخلايا.
  9. قم بإزالة أي شوائب سطحية من PDMS باستخدام شريط لاصق ، ثم ضعه في طبق زجاجي نظيف ولفه بورق الألمنيوم للتخزين.
  10. (اختياري) عالج سطح PDMS ببلازما الأكسجين (30 واط ، 20 ثانية) ثم اضغط عليه على سطح آخر للترابط الذي لا رجعة فيه.
  11. قبل التجربة ، قم بتعقيم جهاز الموائع الدقيقة عند 121 درجة مئوية و 101 كيلو باسكال لمدة 5 دقائق لضمان العقم.

3. تحضير الخلايا العصبية القشرية

  1. قم بتخدير 3 فئران سبراج داولي (SD) بعد الولادة (في غضون 12 ساعة بعد الولادة) عن طريق وضعها على الجليد لمدة 5 دقائق ، ثم قطع الرأس بسرعة.
  2. تشريح المنطقة الحركية للقشرة الدماغية ووضع الأنسجة في مخزن مؤقت للتشريح مبرد مسبقا (على سبيل المثال ، 2 مل من HBSS بدون الكالسيوم والمغنيسيوم).
    ملاحظة: قم بإجراء جميع إجراءات تشريح الأنسجة على الثلج باستخدام محاليل مبردة مسبقا.
  3. افرم الأنسجة إلى حوالي 1 مم3 قطع باستخدام مقص معقم ونقلها إلى أنبوب طرد مركزي 15 مل.
  4. اتركيه لمدة 5 دقائق ثم اشتف المادة الطافية بعناية لإزالة الدم المتبقي والتخزين المؤقت.
  5. أضف محلول غراء مسخن مسبقا (1 مجم / مل) في 5 مل من HBSS مع الكالسيوم والمغنيسيوم الذي تم تسخينه إلى 37 درجة مئوية.
  6. احتضان في حاضنة 37 درجة مئوية ، 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 لمدة 40 دقيقة ، اقلب الأنبوب برفق 3 مرات كل 10 دقائق.
  7. بعد الهضم ، قم بتشويه التعليق برفق 100 مرة باستخدام ماصة 200 ميكرولتر.
    ملاحظة: تجنب إدخال فقاعات الهواء لمنع إجهاد الخلية.
  8. جهاز طرد مركزي بحرارة 300 × جم لمدة 3 دقائق وتخلص من المادة الطافية.
  9. أضف محلول إنهاء يحتوي على 1 مجم / مل مثبط للبروتياز (على سبيل المثال ، 600 ميكرولتر من قارورة مثبط مجموعة أدوات تفكيك غراء في 5 مل من HBSS مع الكالسيوم والمغنيسيوم) لإعادة تعليق الخلايا.
  10. قم بتصفية تعليق الخلية من خلال مصفاة خلية 40 ميكرومتر واجمع المرشح في أنبوب طرد مركزي جديد.
  11. قم بالطرد المركزي للمرشح عند 200 × جم لمدة 10 دقائق وتخلص من المادة الطافية.
  12. أعد تعليق الحبيبات في 500 ميكرولتر من وسط زراعة الخلايا العصبية الكامل الذي يحتوي على 2٪ B27 و 1٪ GlutaMAX.
  13. عد الخلايا (حوالي 3 ملايين / فأر) واضبط الكثافة على 1 × 106 خلايا / مل للاستخدام لاحقا.

4. طلاء

ملاحظة: عالج الأغطية أو أطباق الاستزراع بمحلول بولي دي ليسين (PDL) لتحسين التصاق الخلايا العصبية وخلق بيئة مثالية لنمو الخلايا العصبية.

  1. طلاء الأغطية
    1. ضع غطاء مخصص لأجهزة الموائع الدقيقة التقليدية (Φ25 مم ، سمك 0.17 مم) في طبق مزرعة 35 مم ، وأضف 2 مل من محلول PDL 0.1 مجم / مل.
    2. احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 6 ساعات أو طوال الليل.
    3. بعد الحضانة ، استرجع محلول PDL بعناية لإعادة استخدامه أو التخلص منه بشكل صحيح.
    4. أضف 2 مل من الماء المعقم عالي النقاء إلى الطبق وقم بتدويره 50 مرة في اتجاه عقارب الساعة ، متبوعا ب 50 مرة عكس اتجاه عقارب الساعة (لأطباق متعددة ، قم بتدويرها في وقت واحد في طبق أكبر).
    5. استنشاق الماء باستخدام مضخة تفريغ متصلة بطرف ماصة معقمة ، وجمع النفايات في حاوية نفايات سائلة.
    6. كرر إجراء الغسيل (الخطوات 4.1.4-4.1.5) ثلاث مرات في المجموع.
    7. اترك الأغطية تجف في الهواء بشكل طبيعي في خزانة السلامة الحيوية قبل الاستخدام.
  2. طلاء طبق الثقافة
    1. أضف كمية مناسبة من محلول PDL 0.1 مجم / مل إلى طبق الاستزراع أو لوحة البئر (على سبيل المثال ، أضف 2 مل إلى طبق 35 مم للموائع الدقيقة التقليدية ، و 5 مل إلى طبق 10 سم للموائع الدقيقة واسعة النطاق).
      ملاحظة: تأكد من أن خزانة السلامة الحيوية تعمل بشكل صحيح مع تدفق هواء معقم لمنع التلوث.
    2. تأكد من أن المحلول يغطي الجزء السفلي بالكامل ، واحتضانه عند 37 درجة مئوية لمدة 6 ساعات أو طوال الليل.
    3. بعد استعادة محلول PDL ، اغسل طبق الاستزراع ثلاث مرات بكمية مناسبة من الماء المعقم عالي النقاء كما هو موضح في الخطوة 4.1.4.
    4. قم بإزالة أي ماء متبقي فائق النقاء وجفف طبق الاستزراع بالهواء في غطاء تدفق صفحي لاستخدامه لاحقا.

5. تحضير الوسط العصبي

  1. قم بإعداد الوسط الكامل لثقافة الخلايا العصبية الروتينية.
    1. قم بإزالة المكبس من حقنة سعة 50 مل يمكن التخلص منها. ضع المحقنة بحيث يكون الرأس المطاطي متجها لأعلى على مقعد نظيف داخل خزانة السلامة البيولوجية.
    2. أضف 500 ميكرولتر من البنسلين ستربتومايسين (PS) ، و 1 مل من B27 ، و 125 ميكرولتر من GlutaMAX ، و 500 ميكرولتر من مصل أبقار الجنين (FBS) في المحقنة بالتسلسل. قم بتغيير طرف الماصة لكل مكون لتجنب التلوث المتبادل.
      ملاحظة: أضف كل مكون بالترتيب المحدد للحفاظ على الاتساق.
    3. خذ أنبوب طرد مركزي جديد معقم سعة 50 مل. قم بتسميته على أنه "Neurobasal-A (NBA) + 2٪ B27 + 0.25٪ GlutaMAX + 1٪ FBS + 1٪ PS".
      ملاحظة: استخدام الدوري الاميركي للمحترفين إن لم يكن الخلايا العصبية الجنينية; استخدام العصبية القاعدية (ملحوظة) للخلايا العصبية الجنينية.
    4. قم بتوصيل مرشح حقنة 0.22 ميكرومتر بنهاية المحقنة.
      ملاحظة: تأكد من توصيل الفلتر بإحكام بالمحقنة لمنع التسرب.
    5. استخدم NBA لملء المحقنة بسائل يصل إلى 50 مل ، بما في ذلك حجم المواد المضافة. أعد تثبيت المكبس.
    6. ادفع المكبس ببطء بسرعة 2 مل / ثانية تقريبا لتصفية السائل في أنبوب الطرد المركزي المسمى.
    7. شد غطاء أنبوب الطرد المركزي. اقلب الأنبوب 3-5 مرات لخلط الوسط.
  2. وسط كامل يحتوي على [U-13C6] - جلوكوز (لتحليل تدفق التمثيل الغذائي): لتحليل التدفق الأيضي لاستقلاب الجلوكوز في الخلايا العصبية التالفة ، استخدم NBA الخالي من السكر لتحضير وسط كامل يحتوي على [U-13C 6] -جلوكوز.
    1. استخدم NBA الخالي من الجلوكوز كمحلول أساسي وأضف [U-13C6] -glucose إلى تركيز نهائي قدره 25 ملي مولار قبل الترشيح (إذا كان [U-13C6] - الجلوكوز صلبا ، فقم بحسابه ووزنه مسبقا). اتبع نفس التسلسل لإضافة مكونات أخرى ، بالإضافة إلى خطوات الترشيح والخلط ، كما هو موضح في القسم 5.1.

6. عد الخلايا

  1. امسح مقياس الدم جيدا بنسبة 75٪ إيثانول. تأكد من جفاف جميع الأسطح تماما قبل المتابعة.
  2. أضف 90 ميكرولتر من المحلول الملحي المعقم بالفوسفات (PBS) إلى أنبوب طرد مركزي معقم سعة 1.5 مل.
  3. أعد تعليق تعليق الخلايا العصبية التي تم جمعها برفق عن طريق سحب العينة لأعلى ولأسفل 3-5 مرات لضمان الخلط الشامل.
  4. باستخدام ماصة سعة 10 ميكرولتر ، انقل 10 ميكرولتر من تعليق الخلية المختلطة إلى أنبوب الطرد المركزي الذي يحتوي على 90 ميكرولتر من PBS (تخفيف 1:10).
  5. استخدم ماصة سعة 200 ميكرولتر لخلط المحلول برفق 10 مرات، مما يضمن عدم تكوين فقاعات.
  6. استبدل طرف الماصة بطرف جديد سعة 10 ميكرولتر. ارسم 10 ميكرولتر من الخليط وأضفه إلى حجرة العينة في مقياس الكريات الدموية.
  7. ضع مقياس الخلايا الدموية على مرحلة المجهر وركز باستخدام هدف 20x. حدد موقع الشبكة المركزية 4 × 4 وعد الخلايا في جميع المربعات ال 16 باتباع قواعد مقياس الدم القياسية.
  8. سجل إجمالي عدد الخلايا من جميع المربعات ال 16. احسب تركيز الخلية باستخدام الصيغة: (إجمالي العد × 10) × 104 خلايا / مل.
    ملاحظة: اعمل دائما في خزانة السلامة الحيوية مع معدات الحماية الشخصية المناسبة.

7. الثقافة في المختبر للخلايا العصبية القشرية في الأجهزة التقليدية أو واسعة النطاق الموائع الدقيقة

  1. البروتوكول أ (أجهزة الموائع الدقيقة التقليدية).
    1. تحقق من أن السطح الزجاجي في طبق الاستزراع مقاس 35 مم جاف تماما.
    2. باستخدام ملقط معقم ذو طرف ناعم ، ضع رقاقة الموائع الدقيقة المعقمة في وسط السطح الزجاجي مع توجيه القنوات الدقيقة لأسفل.
    3. اضغط برفق على الشريحة على السطح الزجاجي باستخدام طرف ماصة 200 ميكرولتر لضمان الالتصاق الكامل.
    4. ضع علامة على الحجرة اليسرى بنقطة (·) باستخدام علامة دائمة لتعيين حجرة سوما.
    5. استنشق 10 ميكرولتر من المعلق العصبي (10 ملايين خلية / مل) باستخدام ماصة 10 ميكرولتر.
    6. قم بتوزيع التعليق ببطء في منفذ التحميل فوق حجرة سوما المحددة.
    7. تأكد من تدفق السوائل المناسب إلى الخزان السفلي للغرفة اليسرى.
    8. انقل طبق الاستزراع إلى حاضنة مرطبة (37 درجة مئوية ، 5٪ ثاني أكسيد الكربون2) لمدة 20 دقيقة.
    9. قم بإزالة طبق الاستزراع من الحاضنة.
    10. باستخدام مجهر تباين الطور 20 × ، تأكد من نضح الوسائط من حجرة سوما إلى الحجرة المحورية من خلال القنوات الدقيقة.
    11. أضف 150 ميكرولتر من الوسط القاعدي العصبي إلى المنفذ العلوي للحجرة المحورية (الغرفة اليمنى) ، مما يسمح بالتدفق المدفوع بالجاذبية إلى الخزان السفلي.
    12. وبالمثل ، أضف 15 ميكرولتر من الوسط العصبي الكامل إلى المنفذ العلوي لحجرة سوما (الغرفة اليسرى).
      ملاحظة: في هذه المرحلة ، يجب أن تلتصق الخلايا العصبية بشكل واضح ، مع تدفق معظم بقايا الخلايا في البئر السفلي. لا تستبدل الوسيط أثناء الثقافة ؛ استخدم إضافة واحدة من الوسط العصبي الكامل كما هو موضح في الخطوة 5.1.3.
    13. صب 20 مل من الماء فائق النقاء في طبق مزرعة 150 مم لإنشاء غرفة رطوبة. ضع طبق الاستزراع 35 مم داخل الطبق الكبير.
    14. نقل نظام الاستزراع بالكامل إلى الحاضنة والحفاظ عليه للمدة المطلوبة (على سبيل المثال ، 7 أيام).
      ملاحظة: قم بإجراء جميع إجراءات زراعة الخلايا في ظروف معقمة في خزانة السلامة البيولوجية. ارتد معدات الحماية الشخصية المناسبة (معطف المختبر والقفازات). تطهير أسطح العمل قبل الإجراءات وبعدها.
  2. البروتوكول B (رقائق الموائع الدقيقة واسعة النطاق).
    ملاحظة: تبع البروتوكول القياسي للمواصفات التقليدية تعديلين.
    1. استخدم طبق بتري مقاس 10 سم لوضع الجهاز.
    2. اختر إما البذر بالقناة الكاملة أو القناة الفاصلة بناء على الاحتياجات التجريبية ، حيث تتطلب كل طريقة بروتوكولات إصابة محورية مختلفة.
    3. بعد اكتمال البذر ، أضف 5 مل من وسط زراعة الخلايا العصبية الكامل إلى طبق بتري 10 سم للحفاظ على نمو الخلايا العصبية.
    4. أضف 20 مل من الماء عالي النقاء إلى طبق كبير 150 مم لإنشاء غرفة رطوبة. ثم ضع الطبق مقاس 10 سم داخل الطبق الكبير.
    5. نفس الخطوة 7.1.14.

8. إنشاء نموذج إصابة محورية في المختبر في أجهزة الموائع الدقيقة التقليدية

  1. ضع علامة على الجانب الأيسر من جهاز الموائع الدقيقة على أنه الحجرة الجسدية (كما هو موضح في علامة "·") ، والجانب الأيمن كحجرة طرفية محورية.
  2. الخلايا العصبية القشرية في المقصورة الجسدية.
  3. قم بزراعة الخلايا العصبية في المختبر حتى اليوم 7 (DIV7) ، مما يسمح للمحاور بالامتداد عبر القنوات الدقيقة إلى الحجرة الطرفية المحورية.
  4. في DIV7 ، قم بإجراء إجراءات الإصابة المحورية في الحجرة الطرفية المحورية لإنشاء نموذج إصابة محورية في المختبر .
  5. خذ كمية مناسبة من وسط NBA وانقله إلى أنبوب طرد مركزي جديد سعة 15 مل لاستخدامه لاحقا.
  6. زراعة الخلايا العصبية القشرية في جهاز الموائع الدقيقة للفترة المحددة. ثم انقل الجهاز إلى مقعد نظيف.
  7. استخدم ورقا خاليا من النسالة لتجفيف قاع طبق الاستزراع مقاس 35 مم. استخدم ماصة سعة 200 ميكرولتر لشفط الوسيط من الفتحتين الأيمنتين لجهاز الموائع الدقيقة.
  8. قم بتوصيل أنبوب مضخة التفريغ بطرف ماصة معقم وخالي من المرشح سعة 200 ميكرولتر ، وقم بتشغيل مضخة التفريغ (معدل الشفط 60 لتر / دقيقة) ، ووجه الطرف عند نقطة الاتصال بين الفتحة السفلية للحجرة الطرفية المحورية والغرفة لشفط الوسط القديم (في هذه المرحلة ، تنكسر المحاور بسبب الضغط السلبي).
  9. استبدل طرف الماصة سعة 200 ميكرولتر واسحب 150 ميكرولتر من NBA، وأضفه ببطء من خلال الفتحة السفلية للحجرة اليمنى.
    ملاحظة: إذا كان تدفق السائل بطيئا جدا وتشكلت فقاعات ، فقم بطرد السائل بسرعة من الحافة لملء الغرفة بسرعة.
  10. قم بالتبديل باستخدام الفتحتين الأيمنتين لإضافة السائل: بعد كل إضافة NBA ، استخدم على الفور مضخة التفريغ لشفط السائل من الفتحة الأخرى لقطع المحاور. كرر هذه العملية 4 مرات ، وبعد الشفط الأخير ، استبدلها بوسط عصبي كامل جديد.
  11. استنشق الوسط القديم من الفتحة الجانبية لجسم الخلية وأضف وسط عصبي كامل جديد يحتوي على أدوية (إذا لزم الأمر).
  12. ضع جهاز الموائع الدقيقة مع طبق الاستزراع في طبق مزرعة 150 مم واستمر في الزراعة للوقت المحدد (على سبيل المثال ، 24 ساعة).
    ملاحظة: تتطلب عملية تلف المحور العصبي وسيط NBA ، حيث سينتج الوسط الكامل للعصبية فقاعات تؤثر على تأثير القطع.

9. إصابة محورية لجهاز الموائع الدقيقة على نطاق واسع

  1. الطريقة 1: إصابة محورية يدوية.
    1. الخلايا العصبية البذرية في جميع غرف جهاز الموائع الدقيقة.
    2. احتضان الجهاز عند 37 درجة مئوية في حاضنة مرطبة بنسبة 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 لمدة ثلاثة أيام ، ثم قم بإزالة جهاز الموائع الدقيقة بالكامل.
      ملاحظة: لتجنب الإجهاد الميكانيكي أو تمزق المحاور المزروعة في القنوات الدقيقة ، قم بإزالة جهاز الموائع الدقيقة في DIV3 بدلا من DIV7. هذا مهم بشكل خاص إذا كان التصميم التجريبي يتضمن مجموعة تحكم غير تالفة.
    3. في DIV7 ، قم بإزالة طبق الاستزراع الذي يحتوي على جهاز الموائع الدقيقة من الحاضنة وضعه على مرحلة معقمة.
    4. قم بإعداد مجهر بتكبير 20x وتعقيم منطقة العمل بنسبة 75٪ إيثانول.
    5. أمسك طرف ماصة مصفى معقم بسعة 10 ميكرولتر، وحدد حزم المحاور العصبية في القنوات المجهرية الأصلية تحت توجيه المجهر.
    6. قم بإجراء خدوش طولية على طول كل حزمة محورية باستخدام طرف الماصة.
    7. لاحظ كسر المحور العصبي تحت المجهر في الوقت الفعلي بعد الخدش.
      ملاحظة: عند التعامل مع الخلايا العصبية الحية ، ارتد قفازات النتريل واعمل في بيئة مختبرية معقمة بالأشعة فوق البنفسجية
  2. الطريقة 2: إصابة محورية بمساعدة الفراغ.
    1. الخلايا العصبية القشرية بالتناوب في جهاز الموائع الدقيقة كبير الحجم.
    2. قم بتشغيل مضخة التفريغ واضبطها على 60 لتر / دقيقة.
    3. قم بتوصيل نهاية أنبوب مضخة التفريغ بمنفذ غرفة المحور العصبي باستخدام طرف ماصة معقمة.
    4. استكمال فصل المحاور العصبي عن طريق تطبيق ضغط الفراغ من خلال بروتوكولات الموائع الدقيقة التقليدية.
    5. (اختياري) لجمع المحاور المصابة على وجه التحديد ، في نقطة زمنية محددة بعد بضع إبداع البحر ، قم بشفط محتويات حجرة جسم الخلية بسرعة باستخدام مضخة تفريغ (بمعدل شفط 60 لترا / دقيقة) لإزالة أجسام الخلايا ، وبالتالي ترك المحاور فقط داخل القنوات الدقيقة.

10. علاج نقص الأكسجين للأجهزة التقليدية أو الموائع الدقيقة على نطاق واسع

  1. الخلايا العصبية الأولية للبذور في جهاز الموائع الدقيقة والثقافة حتى DIV7 في ظل ظروف نورموكسيك (37 درجة مئوية ، 5٪ ثاني أكسيد الكربون2).
  2. ضع جهاز الموائع الدقيقة في غرفة حاضنة نقص الأكسجة وزودها بخليط غاز يتكون من 1٪ O2 و 5٪ CO2 و N2 متوازن.
  3. استخدم مقياس دوران للتحكم في معدل تدفق الغاز واضبطه على 25 لتر / دقيقة.
  4. اغسل الغرفة لمدة 5 دقائق لإزاحة الهواء.
  5. أثناء تثبيت مدخل غرفة نقص الأكسجين ، أغلق صمام تخفيض ضغط المخرج.
  6. قم بتثبيت أنبوب مخرج الغرفة الناقصة للأكسجين ، وأخيرا ، أغلق صمام أسطوانة الغاز بإحكام.
  7. احتضان جهاز الموائع الدقيقة في غرفة نقص الأكسجين عند 3 درجات مئوية لمدة 1 ساعة.

11. تحضير عينة من الخلايا العصبية المزروعة في المختبر باستخدام أجهزة الموائع الدقيقة واسعة النطاق لتحليل omics

  1. عينة لعلم النسخ.
    1. انقل جهاز الموائع الدقيقة مع المحاور التالفة إلى غطاء التدفق الرقائقي بعد 6 ساعات من اكتمال الإصابة المحورية.
    2. بعد التخلص من الوسط القديم ، اغسل الخلايا العصبية 2-3 مرات باستخدام PBS المعقم.
    3. استخدم مجموعة استخلاص الحمض النووي الريبي القياسية لعزل الحمض النووي الريبي وتنقيته وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
    4. قم بإجراء تسلسل الحمض النووي الريبي. إجراء تحليل متابعة للمعلوماتية الحيوية على بيانات التسلسل المكتسبة.
  2. عينة لتحليل التدفق الأيضي.
    ملاحظة: لمراقبة التغيرات في التدفق الأيضي للجلوكوز في الخلايا العصبية بعد الإصابة باستخدام جهاز موائع دقيقة واسع النطاق ، استخدمنا [U-13C6] - تحليل التدفق الأيضي لتتبع الجلوكوز24. بروتوكول إعداد العينات لتحليل LC-MS هو كما يلي:
    1. استخدم صغار الفئران P0 SD للتجارب. قم بتشريح الخلايا العصبية القشرية وزراعتها في المختبر إما على المدى القصير (DIV5-DIV7) أو طويل المدى (DIV15-DIV30).
    2. لكل من الخلايا العصبية الصغيرة (DIV5-DIV7) والناضجة (DIV15-DIV30) ، قم بإنشاء مجموعات إصابة ومجموعات تحكم غير مصابة.
    3. استبدل الوسط بوسط يحتوي على 25 ملي مولار [U-13C6] -جلوكوز (Neurobasal-A بدون جلوكوز ، 1٪ FBS ، 2٪ B27 ، 25 ملي مولار [U-13C6] -جلوكوز) واحتضان لمدة 4 ساعات عند 37 درجة مئوية.
      ملاحظة: لتجنب الإجهاد العصبي وموت الخلايا المبرمج الناجم عن التغيرات التناضحية أو الأس الهيدروجيني أثناء التبادل المتوسط ، قم بإعداد خلايا عصبية إضافية مزروعة في وسط يحتوي على 25 ملي مولار [U-13C6] - جلوكوز في وقت البذر ، واستخدم هذا الوسيط للتبادل.
    4. بعد الشطف برفق مرتين باستخدام 5 مل من HBSS المسخن مسبقا (يحتوي على الكالسيوم والمغنيسيوم) ، قم بتجميد العينات في النيتروجين السائل وتخزينها عند -80 درجة مئوية.
      ملاحظة: ارتد قفازات النتريل ومعطف المختبر عند التعامل مع النيتروجين السائل.

12. تلطيخ التألق المناعي العصبي على أساس أجهزة الموائع الدقيقة التقليدية وواسعة النطاق

ملاحظة: عند زراعة الخلايا العصبية في المختبر باستخدام أجهزة الموائع الدقيقة ، يجب على المرء أن يأخذ في الاعتبار الضرر المحتمل لمحاور الخلايا العصبية داخل القنوات الدقيقة التي قد تحدث أثناء تفكيك هذه الأجهزة لتثبيت الخلايا الحية.

  1. استخدم مضخة تفريغ نفايات صغيرة لإزالة وسط الاستزراع من الآبار الأربعة لجهاز الموائع الدقيقة.
    ملاحظة: احتفظ بالسائل في غرفتين طوال عملية تلطيخ التألق المناعي. يجب ألا تكون معلمات الشفط عالية جدا (2.5 لتر / دقيقة هي الأمثل) لتجنب إتلاف أو شفط أجسام الخلايا العصبية والمحاور.
  2. أضف 100 ميكرولتر من 1x PBS إلى كل من البئرين العلويين لجهاز الموائع الدقيقة (سوف يتدفق PBS بشكل طبيعي إلى الآبار السفلية).
  3. استبدل الطرف غير القابل للمرشح في نهاية مضخة التفريغ ، واستنشق PBS من الآبار السفلية ، وكرر العملية ثلاث مرات. في التكرار النهائي ، استنشق كل PBS من الآبار الأربعة.
  4. أضف 150 ميكرولتر من محلول بارافورمالديهايد 4٪ (PFA) إلى كل من البئرين العلويين ، وثبته في درجة حرارة الغرفة لمدة 10-15 دقيقة.
    ملاحظة: تجنب تفكيك الجهاز أثناء تثبيت الخلايا الحية للحفاظ على السلامة الهيكلية للخلايا العصبية. يساعد هذا النهج في التمييز بين مواقع السوما العصبية والمحاور بشكل أكثر وضوحا.
  5. اغسل ثلاث مرات باستخدام 1x PBS ، ثم احتضن الخلايا العصبية بمخزن مؤقت مانع يحتوي على 5٪ مصل الماعز ، و 0.3 M glycine ، و 2٪ ألبومين مصل البقر (BSA) ، و PBS ، و 0.1٪ (أو 0.5٪) Triton X-100 لمدة ساعة واحدة.
  6. قم بتخفيف الجسم المضاد الأساسي (على سبيل المثال ، βIII-tubulin ، الماوس ، 1: 2000) في المخزن المؤقت للحجب ، وأضف 100 ميكرولتر إلى البئر الأيسر العلوي ، و 50 ميكرولتر إلى البئر الأيمن العلوي ، واحتضان الخلايا العصبية طوال الليل عند 4 درجات مئوية.
  7. بعد شفط الجسم المضاد الأساسي ، اغسل ثلاث مرات باستخدام 1x PBS كما هو موضح في الخطوات 12.2-12.3. ثم أضف الجسم المضاد الثانوي المحضر بمخزن مؤقت مانع في الآبار العلوية لجهاز الموائع الدقيقة كما هو موضح في الخطوة 12.6 ، واحتضان في الظلام لمدة 30 دقيقة (قم بتغطيته بورق الألمنيوم إذا لزم الأمر).
  8. بعد الغسيل ثلاث مرات باستخدام 1x PBS ، اشطفها مرة واحدة بالماء عالي النقاء. استخدم ملاقط منحنية بعناية لإمساك الجهاز وإزالته من أعلى يمين إعداد الموائع الدقيقة.
  9. أضف 1 مل من PBS إلى طبق الاستزراع لفصل الغطاء الكبير عن الطبق.
  10. استخدم ماصة لسحب 15 ميكرولتر من وسيط التركيب وإسقاطها على الغطاء في الموقع المخصص للأغطية.
  11. اخفض جانب الخلية برفق على وسط التركيب ، ضع الغطاء ، وقم بإزالة السوائل الزائدة.
  12. اترك وسط التثبيت يجف تماما في درجة حرارة الغرفة.
  13. بمجرد أن يجف وسط التثبيت في درجة حرارة الغرفة ، استخدم مجهره متحد البؤر لإجراء التصوير.
  14. حدد هدفا هويا بمعدل 20 ضعفا ، واضبط وقت التعرض على 100-200 مللي ثانية لكل إطار ، واضبط طاقة الليزر على 5-10٪ من الحد الأقصى مع إثارة 488 نانومتر للبروتين الفلوري الأخضر (GFP) و / أو 561 نانومتر للبروتين الفلوري الأحمر (RFP).

13. تصوير الخلايا الحية في أجهزة الموائع الدقيقة التقليدية

  1. زراعة الخلايا العصبية القشرية في جهاز الموائع الدقيقة حتى DIV7.
  2. قم بإعداد صبغة الخلايا الحية (على سبيل المثال ، مسبار لإمكانات غشاء الميتوكوندريا) وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
  3. صبغة مخففة في وسط صيانة الخلايا العصبية المسخن مسبقا (37 درجة مئوية).
  4. قم بتحميل محلول الصبغة في الحجرة الجسدية لجهاز الموائع الدقيقة.
  5. احتضان لمدة 30 دقيقة في حاضنة 37 درجة مئوية ، 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 .
  6. اغسل المقصورات برفق 3 مرات باستخدام 3 مل من HBSS المسخن مسبقا (37 درجة مئوية) الذي يحتوي على الكالسيوم والمغنيسيوم.
  7. أضف محلول تصوير الخلايا الحية الخالي من الفينول الأحمر إلى شريحة الموائع الدقيقة.
  8. (اختياري) قم بتضمين GlutaMAX (0.25٪) و B27 (2٪) للتصوير المطول.
  9. ضع رقاقة الموائع الدقيقة على مرحلة المجهر مع الغرفة الجسدية على اليسار والغرفة الطرفية المحورية على اليمين.
  10. أضف قطرة من زيت الغمر إلى العدسة الشيئية ، مما يضمن ملامسة الزيت للغطاء أسفل الشريحة.
  11. استخدم هدفا بمعدل 40 ضعفا مع تعريض ضوئي يبلغ 150 مللي ثانية وطاقة ليزر قصوى تبلغ 10-15٪ للتصوير.
    ملاحظة: اضبط هذه المعلمات بناء على ثبات الصبغة الضوئية.

14. تحليل البيانات

  1. استخدم برنامج ImageJ لتحليل الصور المجهرية. تقييم جودة الحمض النووي الريبي باستخدام محلل حيوي. أداء وتحليل تسلسل الحمض النووي الريبي باستخدام منصة مناسبة.
  2. بالنسبة لدراسات التمثيل الغذائي ، استخرج بيانات قياس الطيف الكتلي الخام باستخدام برنامج MRMPROBS (الإصدار 2.60) ، واجمع معلومات عن المستقلبات المحددة ، بما في ذلك تفاصيل النظائر ومناطق الذروة.
  3. استخدم GraphPad Prism (الإصدار 8.4.3) لجميع التحليلات الإحصائية. ±استخدم اختبارات t ثنائية الذيل غير المزاوجة أو اختبارات Mann-Whitney لمقارنات المجموعة ، وقم بتطبيق ANOVA ثنائي الاتجاه للمقارنات بين النقاط الزمنية المتعددة داخل المجموعات (الأهمية: ns ، ليست مهمة ؛ * p < 0.05 ؛ **p < 0.01 ؛ *** p < 0.001).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

لإنشاء منصة بحثية شاملة لدراسة آليات تنظيم التمثيل الغذائي في الخلايا العصبية القشرية ، قمنا أولا بزراعة الخلايا العصبية القشرية في جهاز موائع دقيقة تقليدي ، والتحكم بدقة في نمو المحاور العصبية على طول القنوات الدقيقة (الشكل 2 أ). مع التصميم المناسب ، تم بناء القنوات الدقيقة بارتفاع منخفض (5 ميكرومتر) وعرض أكبر (10 ميكرومتر) ، مما يسمح لكل قناة باستضافة المزيد من المحاور دون السماح لأجسام الخلايا بالدخول. أكد تلطيخ التألق المناعي ل βIII-tubulin النمو المحوري ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

يعد إنشاء نماذج متقدمة في المختبر لدراسة الإصابة المحورية وتجديدها أمرا ضروريا للكشف عن الآليات الجزيئية والتمثيل الغذائي المشاركة في إصلاح الخلايا العصبية16،19. في هذه الدراسة ، نقدم سير عمل موحد يدمج أجهزة الموائع الدقيقة ، والثقافات العصبية واسعة النطاق ، وبروتوكولات الإصابة المحورية الدقيقة ، مما يتيح تحليلا قويا متعدد الأوميكس للخلايا العصبية القشرية المصابة.

يعتمد نجاح هذا النهج بشكل كبي...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

تم دعم هذا العمل من قبل مؤسسة بيجين للعلوم الطبيعية (المنحة رقم L222080 و F251031 و Z240011 و 7192103) والمؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (المنحة رقم 82271513)

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
Neurobasal-A وسطجيبكو10888022وسط الثقافة
أليكسا فلور 488 ماعز مضاد للفأرإنفيتروجينأ 21042التألق المناعي
الميزان التحليليشنغهاي Shunyu Hengping الصك العلمي المحدودةف1004الوزن الدقيق للكواشف / العينات
B27 (50x)جيبكو17504044وسط الثقافة
مقايسة بروتين BCAبوسترآر1189تركيزات البروتين
المحلل الحيويأجيلينتhttps://www.agilent.com/en/product/automated-electrophoresis/bioanalyzer-systems/bioanalyzer-instrument
ألبومين مصل الأبقارجينفيوFA016التألق المناعي
خلاط النمام بالطرد المركزيفكرأر -310مزيج PDMS وإزالة الغاز
محلل CLARIOstarPlus-ACUبي إم جي لابتيككلاريوستار بلستركيزات البروتين
حاضنة ثاني أكسيد الكربون 2< / sub>ثيرمو فيشر العلمية (آشفيل) ذ.م.م3111حضانة زراعة الخلايا عند 37 درجة ؛ ج ، 5٪ ثاني أكسيد الكربون؟
مضخة فراغ الحجاب الحاجز المقاومة للتآكلشنغهاي الحزاز بانغشي أداة التكنولوجيا المحدودةLC-85DLCشفط سائل النفايات وتوفير شفط لبضع القز
D-GLUCOSE (U-13< / sup>C6< / sub> ، 99٪)مختبرات كامبريدج للنظائرCLM-1396تدفق التمثيل الغذائي
DNase Iروش11284932001الثقافة العصبية
منصة Dr.TOM2 علم الجينوم BGIأداء وتحليل RNA-seq  ؛
فرن تجفيف كهربائي بالهواء الساخنبيوم هواهونغ بون / هواينغ بوسيDHG-9070Aعلاج PDMS
الميزان الإلكترونيشنغهاي Huachao الصناعية المحدودةHC313الوزن الروتيني للمواد
فلوروماونت مائي تصاعد وسطسيجما ألدريتشإف 4680التألق المناعي
جلوتا ماكسجيبكو35050061وسط الثقافة
الجلايسينسولاربيوجي 8200التألق المناعي
HBSSجيبكو14025092الثقافة العصبية
HBSS ، بدون كالسيوم ، بدون مغنيسيومجيبكو14175095الثقافة العصبية
معقم بالبخار عالي الضغطSTIK Instrument (شنغهاي) المحدودةإتش إم جي -54 أتعقيم معدات ووسائط المختبرات
غرفة نقص الأكسجينتقنيات الخلايا الجذعية27310علاج نقص الأكسجين
إيمج جيالمؤسسهتستخدم لتحليل الصور المجهرية
مجهر لايكالايكا مايكروسيستمز سي إم إس GmbHDMIL LED فلوالمراقبة الحية والفلورية
حل تصوير الخلايا الحيةإنفيتروجينA14291DJتصوير الخلايا الحية
صندوق تخزين طبي منخفض الحرارة (-80 درجة ؛ C)تشينغداو هاير الطب الحيوي المحدودةDW-86L388Jتخزين العينات على المدى الطويل عند -80 درجة ؛ C
مضخة فراغ سطح المكتب الصغيرةشركة Haimen Qilin-Bell Instrument Manufacturing Co.، Ltd.جي إل -805تطبيقات الفراغ الصغيرة
MitoTracker برتقالي CMTMRosإنفيتروجينم 7510تلطيخ غشاء الميتوكوندريا المحتمل
برنامج MRMPROBSالإصدار 2.60لاستخراج بيانات قياس الطيف الكتلي الخام   ؛
الوسط العصبي القاعديجيبكو21103049وسط الثقافة
Neurobasal-A بدون جلوكوزجيبكوA2477501وسط الثقافة
غراءورثينجتونLS003127الثقافة العصبية
بارافورمالدهيدسيجما ألدريتشص 6148تثبيت الخلية
نظام PDMSداو كورنينجالعاصمة 184تصنيع الجهاز
قارورة مثبطات طقم PDSورثينجتونLK003182الثقافة العصبية
البنسلين ستربتومايسينجيبكو15140122وسط الثقافة
الفوسفات المحلول الملحيبيوشاربBL302Aتمييع المواد وتنظيف حاويات الخلايا
منظف البلازماهاريك بلازماODC-32G-2التنشيط
بولي د يسينسيجما ألدريتشص 6407الثقافة العصبية
المنشور GraphPadالإصدار 8.4.3التحليلات الإحصائية
جهاز طرد مركزي مبردEppendorf AG (ألمانيا)5430Rفصل العينات في درجات حرارة خاضعة للرقابة
RNArep الخلية النقية / مجموعة استخراج الحمض النووي الريبي الكلي البكتيريتيانجنموانئ دبي 430النسخ
مقياس الدوراندوايرRMA-23-SSVالتحكم في انخفاض تدفق الأكسجين
مجهر ستيريوشركة أوليمبوسSZ2-ILSTعينة من الملاحظة والتشريح
ستيوارت مداري شاكركايلين بيلتي إس-200خلط مزارع / حلول الخلايا بسرعات قابلة للتعديل
تريتون X-100سيجما ألدريتشX100التألق المناعي
مضخة فراغ دوارة دوارة ULVACULVAC (نينغبو) المحدودةGLD-N202خلق فراغ للترشيح / التجفيف
&بيتا. III-tubulinبروميجاجي 7121التألق المناعي

المراجع

  1. Namba, T., et al. Pioneering axons regulate neuronal polarization in the developing cerebral cortex. Neuron. 81 (4), 814-829 (2014).
  2. Donato, A., Kagias, K., Zhang, Y., Hilliard, M. A. Neuronal sub-compartmentalization: a strategy to optimize neuronal function. Biol Rev Camb Philos Soc. 94 (3), 1023-1037 (2019).
  3. Anderson, M. A., et al. Required growth facilitators propel axon regeneration across complete spinal cord injury. Nature. 561 (7723), 396-400 (2018).
  4. Hilton, B. J., Bradke, F. Can injured adult CNS axons regenerate by recapitulating development. Development. 144 (19), 3417-3429 (2017).
  5. Li, Y., et al. Microglia-organized scar-free spinal cord repair in neonatal mice. Nature. 587 (7835), 613-618 (2020).
  6. Hilton, B. J., et al. An active vesicle priming machinery suppresses axon regeneration upon adult CNS injury. Neuron. 110 (1), 51-69 (2022).
  7. Alizadeh, A., Dyck, S. M., Karimi Abdolrezaee, S. Traumatic spinal cord injury: An overview of pathophysiology, models and acute injury mechanisms. Front Neurol. 10, 441408(2019).
  8. Anjum, A., et al. Spinal cord injury: Pathophysiology, multimolecular interactions, and underlying recovery mechanisms. Int J Mol Sci. 21 (20), 7533(2020).
  9. Zhao, P., et al. Microfluidic model to mimic initial event of neovascularization. J Vis Exp. (170), e62003(2021).
  10. Li, N., Sip, C., Folch, A. Microfluidic chips controlled with elastomeric microvalve arrays. J Vis Exp. (8), e296(2007).
  11. Chowdhury, A. N., et al. A customizable chamber for measuring cell migration. J Vis Exp. (121), e55264(2017).
  12. De Ninno, A., et al. Microfluidic co-culture models for dissecting the immune response in in vitro tumor microenvironments. J Vis Exp. (170), e61895(2021).
  13. Shahryari, V., et al. Pre-clinical orthotopic murine model of human prostate cancer. J Vis Exp. (114), e54125(2016).
  14. Kim, J., Hegde, M., Jayaraman, A. Microfluidic co-culture of epithelial cells and bacteria for investigating soluble signal-mediated interactions. J Vis Exp. (38), e1749(2010).
  15. Taylor, A. M., et al. A microfluidic culture platform for CNS axonal injury, regeneration and transport. Nat Methods. 2 (8), 599-605 (2005).
  16. Liu, R., Zhou, B. Harmine promotes axon regeneration through enhancing glucose metabolism. J Biol Chem. 301 (3), 108254(2025).
  17. Shrirao, A. B., et al. Microfluidic platforms for the study of neuronal injury in vitro. Biotechnol. Bioeng. 115 (4), 815-830 (2018).
  18. Van Laar, V. S., Arnold, B., Berman, S. B. Primary embryonic rat cortical neuronal culture and chronic rotenone treatment in microfluidic culture devices. Bio Protoc. 9 (6), e3192(2019).
  19. Huang, N., et al. Reprogramming an energetic AKT-PAK5 axis boosts axon energy supply and facilitates neuron survival and regeneration after injury and ischemia. Curr Biol. 31 (14), 3098-3114 (2021).
  20. Zhou, B., et al. Facilitation of axon regeneration by enhancing mitochondrial transport and rescuing energy deficits. J Cell Biol. 214 (1), 103-119 (2016).
  21. Cartoni, R., et al. The mammalian-specific protein armcx1 regulates mitochondrial transport during axon regeneration. Neuron. 92 (6), 1294-1307 (2016).
  22. Han, S. M., Baig, H. S., Hammarlund, M. Mitochondria localize to injured axons to support regeneration. Neuron. 92 (6), 1308-1323 (2016).
  23. Yang, L. Q., Chen, M., Ren, D. L., Hu, B. Dual oxidase mutant retards mauthner-cell axon regeneration at an early stage via modulating mitochondrial dynamics in zebrafish. Neurosci Bull. 36, 1500-1512 (2020).
  24. Yuan, M., et al. Ex vivo and in vivo stable isotope labelling of central carbon metabolism and related pathways with analysis by LC-MS/MS. Nat Protoc. 14 (2), 313-330 (2019).
  25. Mercimek, R., et al. On the effects of 3D printed mold material, curing temperature, and duration on polydimethylsiloxane (PDMS) curing characteristics for lab-on-a-chip applications. Micromachines (Basel). 16 (6), 684(2025).
  26. Derosa, B. A., et al. Convergent pathways in idiopathic autism revealed by time course transcriptomic analysis of patient-derived neurons. Sci Rep. 8 (1), 8423(2018).
  27. Cheng, X. T., Huang, N., Sheng, Z. H. Programming axonal mitochondrial maintenance and bioenergetics in neurodegeneration and regeneration. Neuron. 110 (12), 1899-1923 (2022).
  28. Huang, N., Sheng, Z. H. Microfluidic devices as model platforms of CNS injury-ischemia to study axonal regeneration by regulating mitochondrial transport and bioenergetic metabolism. Cell Regen. 11 (1), 33(2022).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

نموذج إصابة المحاور العصبيةتحليل الأوميكس المتعددالعصبونات القشريةإعادة التشكيل الأيضيتجدد المحاور العصبيةالتحليل الترانسكريبتوميتحليل التدفق الأيضيالموائع الدقيقة القائمة على PDMSإصابة الشفط بالتفريغ
رقاقة الموائع الدقيقة لبناء نماذج الإصابات المحورية وتمكين تحليل الأوميكس المتعدد
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.