مقالة منهجية

تقييم التدخلات العلاجية في نموذج الفأر الناقص-SHIP لالتهاب اللفائفي والتليف الشبيه بمرض كرون

DOI:

10.3791/68928

⸱

أكتوبر 14, 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Pediatrics, Division of Gastroenterology, University of British Columbia and BC Children's Hospital Research Institute

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يوضح هذا البروتوكول كيف يمكن استخدام التماثل Src 2 المجال المحتوي على 5'-فوسفاتيز الإينوزيتول (SHIP)-نموذج الفأر الناقصة لمرض كرون (CD) مثل التهاب اللفائفي والتليف لاختبار العلاجات الجديدة للقرص المضغوط.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

مرض كرون (CD) هو حالة التهابية مزمنة انتكاسية تتميز بالتهاب مقطعي عبر الجوال يمكن أن يؤثر على أي جزء من الجهاز الهضمي. السمة المميزة للقرص المضغوط هي ضعف وظيفة الحاجز المعوي ، والتليف المعوي هو من المضاعفات الشائعة. تتطور الفئران التي تعاني من نقص السفن (SHIP-/-) تلقائيا إلى خلل في حاجز الأمعاء ، والتهاب اللفائفي ، وأمراض ليفية ، وتلخص السمات الرئيسية لالتهاب اللفائفي الشبيه بالقرص المضغوط. تعمل فئران SHIP / - كنموذج قيم لاختبار العلاجات المضادة للالتهابات والألياف في القرص المضغوط.

هنا ، نصف طرق تقييم التدخلات العلاجية في هذا النموذج ، باستخدام ديكساميثازون كمثال على العلاج الفعال. نحن نقدم بروتوكولا خطوة بخطوة لتوصيف المرض والاستجابة للعلاج ، بما في ذلك التقييم في الجسم الحي لنفاذية الأمعاء التي تم قياسها بواسطة FITC-dextran ، بالإضافة إلى الفحص المرضي الإجمالي والتحليلات النسيجية التفصيلية. تتضمن التقييمات النسيجية تلطيخ الهيماتوكسيلين والإيوزين (H & E) للالتهاب ، وتلوين ماسون ثلاثي الألوان للتليف ، وتلوين Alcian الأزرق / الحمضي الدوري (PAS) لتضخم خلية الكأس وتضخمها. بالإضافة إلى ذلك ، يتم قياس السيتوكينات والعلامات الالتهابية في الأنسجة اللفائفية لتقييم الحالة الالتهابية. توفر هذه الطرق معا إطارا شاملا لتقييم فعالية العلاج في نموذج SHIP-/- الفأر لالتهاب اللفائفي الشبيه بالقرص المضغوط. هذا البروتوكول قابل للتطبيق على نطاق واسع على الباحثين الذين يدرسون التهاب الأمعاء والتئام الغشاء المخاطي والتليف المعوي.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

النوعان الرئيسيان من مرض التهاب الأمعاء (IBD) هما مرض كرون (CD) والتهاب القولون التقرحي (UC) ، وكلاهما يتميز بالتهاب الجهاز الهضمي المزمن (GI) الذي يمكن أن يتبع دورة انتكاسية أو متطورة1. على الرغم من أن مرض التهاب الأمعاء يعتبر تاريخيا مرضا يصيب الدول الغربية ، إلا أن حدوثه يتزايد بسرعة في البلدان النامية في جميع أنحاء أمريكا الجنوبية وآسيا وأفريقيا2. في الوقت نفسه ، يستمر الانتشار في الارتفاع في أمريكا الشمالية وأوروبا وأستراليا ، مع زيادة بنسبة 50٪ تقريبا في كل من الإصابة والانتشار بين عامي 1990 و 2019 ، مما يؤكد العبء الصحي العالمي المتزايد لمرض التهاب الأمعاء2،3. على الرغم من الجهود البحثية الكبيرة ، لا يزال السبب الكامن وراء مرض التهاب الأمعاء مجهولا. تشير الأدلة الحالية إلى تفاعل معقد بين القابلية الوراثية ، والخلل الوظيفي في الجهاز المناعي ، والمحفزات البيئية ، بما في ذلك التغيرات في الميكروبيوم4،5.

هناك اختلافات رئيسية بين القرص المضغوط و UC. في جامعة كاليفورنيا ، يقتصر الالتهاب على القولون ويتميز بالمشاركة المستمرة التي تقتصر على الطبقة المخاطية6،7. في المقابل ، يتميز القرص المضغوط بالتهاب متقطع وعبر الجواري يمكن أن يؤثر على أي جزء من الجهاز الهضمي ، والأكثر شيوعا في الدقاق الطرفي6،7. المضاعفات المميزة للقرص المضغوط هي التليف المعوي ، والذي يساهم في تكوين تضيقات وانسداد الأمعاء8. يتم تعريف التليف من خلال الترسب المفرط لمكونات المصفوفة خارج الخلية ، مثل الكولاجين ، وسماكة طبقات عضلات الأمعاء9،10. يصاب ما يقرب من 30٪ من الأشخاص المصابين بالقرص المضغوط بمرض تضيق في غضون 10 سنوات من التشخيص11. حاليا ، لا توجد علاجات تستهدف التليف بشكل مباشر ، وهي حاجة سريرية غير ملباة يمكن معالجتها باستخدام نماذج ما قبل السريرية المناسبة لدراسة هذه المضاعفات9،12.

لفهم التسبب في مرض التهاب الأمعاء بشكل أفضل وتسهيل تطوير علاجات جديدة ، تم إنشاء العديد من نماذج الفئران12. في حين أن هناك عددا كبيرا من نماذج التهاب القولون ، إلا أن عددا قليلا فقط يلخص الالتهاب اللفائفي والتليف المرتبط بالقرص المضغوط12. من بين هذه هي تماثل Src 2 المجال الذي يحتوي على 5'-اينوزيتول الفوسفاتيز نقص (SHIP-/-) الموصوفة هنا, وكذلك الفئران SAMP1 / YitFc والفئران TnfΔARE . تعكس هذه النماذج مجتمعة تعقيد القرص المضغوط البشري حيث أن كل منها مدفوع بآليات خلوية وجزيئية متميزة. ينتج المرض في الفئران SAMP1 / YitFc عن استعداد متعدد الجينات يؤثر على وظيفة الحاجز الظهاري والتنظيم المناعي13،14 ، في حين أن الفئران TnfΔARE تحمل حذفا للعناصر الغنية بالوحدة الأفريقية في TNF mRNA ، مما يؤدي إلى زيادة استقرار mRNA وزيادة إنتاج TNF15،16. على الرغم من قيمتها ، إلا أن هذه النماذج لها قيود. يعاني نموذج SAMP1 / YitFc من كفاءة تربية منخفضة ، مما يطرح تحديات في توليد أحجام أفواج كافية للدراسات17. بالإضافة إلى ذلك ، يتطلب نموذج TnfΔARE ما يصل إلى 24 أسبوعا لتطوير أمراض ليفية ملحوظة ، مما يجعلإجراء دراسات التدخل مكلفا وصعبا.

SHIP هو منظم سلبي لمسار إشارات الفوسفاتيديلينوسيتول -3-كيناز (PI3K) ويتم التعبير عنه في الغالب في الخلايا المكونة للدم. إنه يعمل عن طريق إزالة مجموعة الفوسفات 5 'من فوسفاتيديلينوسيتول 3،4،5-ثلاثي الفوسفات ، وبالتالي تخفيف إشارات PI3K النهائية18. تقدم فئران SHIP / - العديد من المزايا للدراسات قبل السريرية. من السهل نسبيا تكاثر هذه الفئران وتظهر عليها علامات التليف في وقت مبكر يصل إلى 8 أسابيع من سن19 عاما. من المحتمل أن تكون إعادة تشكيل الليف المتسارعة في هذا النموذج مدفوعة بالاستجابات الالتهابية المتزايدة بسبب مسار PI3K غير المنظم ، مما يؤدي إلى فرط تنشيط الخلايا المناعية وإعادة تشكيل الأنسجة السريعة اللاحقة. الأهم من ذلك ، لقد أظهرنا نحن ومجموعة كير بشكل مستقل أن فئران SHIP / - تصاب بالتهاب اللفائفي بميزات تشبه إلى حد كبير القرص المضغوط البشري19،20. دعما لأهمية هذا النموذج ، قللت مجموعة فرعية من الأفراد المصابين بالقرص المضغوط من نشاط SHIP في كل من الخزعات اللفائفية و PBMCs21. علاوة على ذلك ، يميل أولئك الذين يعانون من انخفاض نشاط SHIP إلى تجربة مسار مرض أكثر حدة ، وغالبا ما يتطلب عمليات جراحية متعددة22.

تبدأ الفرشة في تطوير التهاب معوي تلقائي متقطع موضعي في الدقاق البعيد في وقت مبكر يصل إلى 4 أسابيع من العمر ، مع وجود التهاب في جميع الفئران بحلول عمر 6 أسابيع منسن 20. بحلول عمر 8 أسابيع ، أنشأت الفئران أمراض ليفية ، تتميز بسماكة الجهاز العضلي الخارجي وتراكم الكولاجين على نطاق واسع في تحت الغشاء المخاطي وبين طبقات العضلات19. الالتهاب في هذا النموذج مدفوع بالإنترلوكين المشتق من البلاعم -1β (IL-1β) 21. كل من استنفاد البلاعم باستخدام الجسيمات الشحمية المحتوية على الكلودرونات والحصار الدوائي لإشارات IL-1 باستخدام مضاد مستقبلات IL-1 (anakinra) أدى إلى تحسن الالتهاب المعوي في الفئران SHIP-/-21. بالإضافة إلى التهاب اللفائفي ، تظهر الفئران SHIP-/- التهاب الرئة ، والذي استخدمناه لتقييم التأثيرات غير المستهدفة للعلاجات المصممة للولادة المعوية الموضعية23. أفاد آخرون أن تثبيط الكاسباز -8 مع Z-IETD-FMK يقلل بشكل كبير من التهاب اللفائفي والرئة في فئران SHIP-/-24 ، مما يدعم أمراض الرئة كميزة إضافية لتقييم التحكم في الالتهابات الجهازية.

تعيد هذه الورقة المنهجية النظر في عملنا المنشور مؤخرا حول العلاج الناجح بالديكساميثازون23 وتقدم وصفا مفصلا للإجراءات الفنية الرئيسية ، مع اعتبارات إضافية لاستخدام نماذج الفئران في الاختبارات الدوائية. على وجه التحديد ، نسلط الضوء على المعلمات القياسية لتقييم فعالية الدواء في نماذج مرض التهاب الأمعاء ، بما في ذلك تقييم نفاذية الأمعاء ، وعلم الأمراض الإجمالي ، وعلم الأنسجة المرضية ، والوسطاء والمؤثرات المؤيدة للالتهابات ، ونناقش كيفية دمج هذه البيانات للتوصل إلى استنتاجات حول الفعالية العلاجية الشاملة.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يجب إجراء الدراسات التي تشمل وفقا للبروتوكولات الأخلاقية المعتمدة من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدامها ووفقا لإرشادات مجالس البحوث الوطنية بشأن رعاية. اتبعت جميع إجراءات في هذا البروتوكول الإرشادات الأخلاقية للمجلس الكندي لرعاية وتمت الموافقة عليها من قبل لجنة رعاية بجامعة كولومبيا البريطانية (البروتوكول A21-0212).

ملاحظة: لتقييم التأثير العلاجي للدواء على أمراض الأمعاء لفئران SHIP-/- ، قم بتضمين SHIP +/+ كضوابط صحية للمقارنة. للتدخل العلاجي ، ابدأ العلاج في عمر 6 أسابيع ، عندما يتم تثبيت المرض بالكامل في النموذج. هنا ، تلقت كل من فئران SHIP +/+ و SHIP-/- تزقيما يوميا عن طريق الفم من ديكساميثازون بمعدل 3 مجم / كجم في 0.5٪ β-سيكلوديكسترين (مركبة) أو السيارة وحدها لمدة أسبوعين ، بحجم 10 ميكرولتر / جم.

1. مقايسة FITC-dextran لقياس نفاذية الحاجز الظهاري

  1. الفئران السريعة لمدة 4 ساعات قبل الفحص.
  2. قم بإذابة 4 كيلو دالتون FITC-dextran في معقم 1x PBS إلى تركيز نهائي قدره 80 مجم / مل.
  3. قم بإعداد ما يكفي ل 150 ميكرولتر لكل ماوس، بالإضافة إلى 50 ميكرولتر إضافي للمنحنى القياسي.
    ملاحظة: قلل من التعرض للضوء لمحلول FITC-dextran وعينات البلازما طوال الإجراء.
  4. كبح جماح كل فأر برفق وقم بإعطاء 150 ميكرولتر من محلول FITC-dextran عبر التزقيم عن طريق الفم.
    ملاحظة: ابدأ المؤقت مباشرة بعد إعطاء التزقيم الأول. انتظر من 10 إلى 15 دقيقة بين كل فأرة لاحقة للسماح بوقت كاف لتنفيذ القتل الرحيم وإجراءات المصب بطريقة متداخلة ، مما يقلل من التباين بسبب اختلافات التوقيت.
  5. حافظ على الفئران بدون طعام لمدة 4 ساعات.
  6. القتل الرحيم للفئران باستخدام 5٪ من الأيزوفلوران (مخدر مستنشق يتم توصيله ب 1.5 لتر أكسجين / دقيقة) متبوعا بثاني أكسيد الكربون وفقا للإجراءات المؤسسية القياسية. جمع الدم عن طريق ثقب القلب باستخدام إبر 25 جرام ومحاقن 1 مل.
  7. أضف على الفور 10 ميكرولتر من محلول حمض السيترات وسكر العنب إلى كل 100 ميكرولتر من الدم الذي تم جمعه كمضاد للتخثر. تخلط جيدا عن طريق الانعكاس.
  8. جهاز طرد مركزي عند 1500 × جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية ونقل البلازما (الطافية) بعناية إلى أنابيب الطرد المركزي الدقيقة المسمى 1.7 مل. احتفظ بالعينات على الجليد ومحمية من الضوء حتى تحليلها.
  9. خفف كل عينة بلازما 1: 2 و 1:10 باستخدام 1x PBS.
  10. أضف 100 ميكرولتر من كل تخفيف إلى صفيحة معتمة مكونة من 96 بئرا في نسخ مكررة.
  11. قم بإجراء تخفيفات تسلسلية بنسبة 1: 2 لمخزون FITC-dextan الأصلي 80 مجم / مل باستخدام 1x PBS لتحقيق التركيزات التالية: 3000 ، 1500 ، 750 ، 375 ، 187.5 ، 93.8 ، 46.9 ، 23.4 ، و 0 نانوغرام / مل. أضف 100 ميكرولتر من كل تركيز إلى لوحة 96 بئرا مكررة.
  12. قم بقياس التألق عند إثارة 485 نانومتر وانبعاث 535 نانومتر باستخدام قارئ الصفيحة الدقيقة.

2. تقييم علم الأمراض الإجمالي

  1. بعد جمع الدم لمقايسة FITC-dextran ، قم باستئصال الأمعاء الدقيقة بأكملها بعناية.
  2. قم بإزالة أي دهون وأنسجة ضامة متصلة برفق.
    ملاحظة: كن حذرا عند التعامل مع الأنسجة ، حيث يمكن أن تكون المناطق المريضة هشة وعرضة للتمزق.
  3. ضع الأمعاء بشكل مسطح على ورقة بيضاء فارغة للحصول على تباين مثالي. فحص الأنسجة بصريا بحثا عن علامات عيانية للمرض. عادة ما يكون الالتهاب موضعيا في 10 سم من الأمعاء الدقيقة البعيدة في الفأر SHIP-/-
    ملاحظة: تشمل الميزات العيانية الرئيسية التي يجب تقييمها تغيرات اللون ، حيث تظهر المناطق احمرارا مرئيا أو احتقان الدم بالنسبة للأنسجة المجاورة ذات المظهر الطبيعي. بالإضافة إلى ذلك ، افحص سماكة الأنسجة ، حيث قد تبدو المناطق المصابة منتفخة أو وذمية أو صلبة عند الجس اللطيف. ابحث عن وجود دم قد يظهر على شكل بقع نزفية مرئية أو تغير لون أحمر غامق أو دم ملتصق.
  4. قم بمحاذاة الأمعاء بجوار المسطرة للقياس والتقط صورة لتوثيق النتائج المرضية الإجمالية.

3. التقييم النسيجي

  1. قم بإزالة محتويات الأمعاء عن طريق شطف التجويف برفق باستخدام 1x PBS باستخدام حقنة. لا تضع الكثير من القوة على الأنسجة ، لأن هذا قد يشوه بنية الزغابات والسرباي.
  2. تحديد وحصاد ما يقرب من 1 سم من الدقاق البعيد الذي هو الأكثر تمثيلا لعلم الأمراض الإجمالي. قم بتضمين المناطق المتأثرة المرئية، إن وجدت. للمقارنات (SHIP +/+ مقابل SHIP-/-) ، تأكد من جمع الأنسجة من المواقع التشريحية المتطابقة.
    ملاحظة: للتقييم الأولي لفعالية العلاج ، يوصى بإعداد الدقاق على شكل لفة سويسرية. توفر هذه الطريقة تصورا عالميا للمرض وتقلل من تحيز أخذ العينات.
  3. ضع المنديل بشكل مسطح في شريط الأنسجة ، وضعه بين الإسفنج لمنع الطي.
  4. بالنسبة للهيماتوكسيلين والإيوزين (H & E) وتلوين ماسون ثلاثي الألوان ، قم بتثبيت الأنسجة في الفورمالين المحايد بنسبة 10٪ طوال الليل عند 4 درجات مئوية ، باستخدام ما لا يقل عن 10-20 ضعف حجم الأنسجة (حوالي 5 مل لكل كاسيت) والتأكد من غمر جميع الكاسيت بالكامل. انقل الكاسيت إلى 70٪ من الإيثانول للتخزين ، مع إبقائها مغمورة بالكامل حتى المعالجة.
    ملاحظة: 10٪ فورمالين ، مثبت يحتوي على 3.7٪ فورمالديهايد ، هو مهيج قوي للجهاز التنفسي ، وحساس جلدي ، ويصنف على أنه مادة مسرطنة للإنسان. يمكن أن يؤدي الاستنشاق أو الابتلاع أو ملامسة الجلد إلى سمية حادة ، بينما قد يزيد التعرض المزمن من خطر الإصابة بالسرطان. يجب تنفيذ جميع الإجراءات التي تنطوي على الفورمالين في غطاء دخان كيميائي معتمد أثناء ارتداء معدات الحماية الشخصية المناسبة (PPE) ، بما في ذلك معطف المختبر والقفازات المقاومة للمواد الكيميائية وحماية العين. اجمع النفايات في حاويات تحمل علامة "نفايات الفورمالين" بوضوح للتخلص منها بشكل صحيح وفقا لبروتوكولات النفايات الخطرة المؤسسية. يجب التعامل مع جميع المواد الملوثة بالفورمالين (مثل أطراف الماصات والأنسجة والقفازات) على أنها نفايات خطرة كيميائيا والتخلص منها باتباع إجراءات الصحة والسلامة البيئية المحلية (EHS).
  5. بالنسبة لتلوين Alcian blue / PAS ، قم بتثبيت الأنسجة في محلول Carnoy (60٪ إيثانول ، 30٪ كلوروفورم ، و 10٪ حمض الخليك الجليدي) عند 4 درجات مئوية طوال الليل ، باستخدام حوالي 5 مل لكل كاسيت أو 10-20 ضعف حجم الأنسجة. انقل الكاسيت إلى 100٪ إيثانول للتخزين حتى المعالجة.
    ملاحظة: يتكون محلول كارنوي من 60٪ إيثانول و 30٪ كلوروفورم و 10٪ حمض الخليك الجليدي. هذا الخليط شديد التقلب وقابل للاشتعال وسام. تعامل مع محلول Carnoy حصريا في غطاء الدخان وقم بتخزينه في حاويات محكمة الغلق بعيدا عن مصادر الحرارة أو الاشتعال. يجب جمع نفايات كارنوي في حاويات مخصصة للمذيبات العضوية المختلطة والتخلص منها وفقا للمبادئ التوجيهية المؤسسية للنفايات الخطرة. يجب التعامل مع جميع المواد الملوثة بمحلول كارنوي على أنها نفايات خطرة كيميائيا.
  6. قم بتضمين الأنسجة في البارافين وقطع أقسام 5 ميكرومتر للتلوين.
  7. قم بتصحيح الأقسام اللفائفية الملطخة ب H&E على مقياس من 16 نقطة وفقا للمعايير الواردة في الجدول 1. يتم تحديد درجة الضرر النسيجي النهائية من خلال حساب متوسط الدرجات من 2 مراجعين ، الذين تم إعفاؤهم عن الحالة التجريبية.
  8. قم بتقييم المقاطع العرضية الملطخة بالألوان الثلاثية لماسون باستخدام مقياس من 6 نقاط بناء على المعايير الواردة في الجدول 2. يتم حساب درجة التليف النهائية على أنها متوسط الدرجات التي حددها مراجعان مستقلان أعمى عن الظروف التجريبية.

4. تقييم السيتوكين

  1. بعد تشريح وإزالة عينة الأنسجة ، اجمع الجزء المتبقي من 10 سم البعيدة من الدقاق.
  2. جفف الأنسجة وسجل الوزن. قم بالتجميد السريع في النيتروجين السائل وتخزينه عند -80 درجة مئوية للمعالجة المستقبلية.
  3. عندما تكون جاهزا للمعالجة ، استرجع الأنسجة واحتفظ بها على الجليد في جميع الأوقات.
  4. وزن عينات الأنسجة. قم بإعداد مخزن مؤقت للتجانس كاف لجميع العينات عن طريق إضافة مثبطات البروتياز إلى 1x PBS (الأبروتينين والليوببتين ، كل منهما عند 10 ميكروغرام / مل). استخدم 10 ميكرولتر من المخزن المؤقت لكل ملغ من الأنسجة (على سبيل المثال ، يتطلب 100 مجم من الأنسجة 1 مل من المخزن المؤقت).
    ملاحظة: يجب تحضير المخزن المؤقت للتجانس طازجا في يوم التجانس لضمان فعالية مثبطات البروتياز
  5. قم بتجانس الأنسجة اللفائفية كاملة السماكة في عازلة التجانس المثلجة باستخدام الخالط على المنضدة. تأكد من أن المتجانس موحد وخالي من شظايا الأنسجة المرئية. اشطف طرف الخالط جيدا باستخدام PBS بين العينات لمنع انتقال التلوث.
  6. جهاز طرد مركزي ، يتجانس الأنسجة عند 10،000 × جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية.
  7. قم بتخصيص المواد الطافية الموضحة لتجنب دورات التجميد والذوبان وتخزينها عند -80 درجة مئوية للتحليل المستقبلي.
  8. قم بإجراء فحوصات الممتز المناعي المرتبطة بالإنزيم (ELISAs) على المواد الطافية الموضحة لتحديد السيتوكينات ذات الأهمية ، وفقا لتعليمات الشركات المصنعة.
    ملاحظة: تم قياس الكثافة البصرية عند 450 نانومتر باستخدام قارئ اللوحة الدقيقة Varioskan LUX مع برنامج Skanlt RE 7.0.2 ، بطول موجي مرجعي يبلغ 570 نانومتر للتصحيح. تم استخدام Microsoft Excel لتحليل البيانات ، وتم استيفاء قيم الامتصاص ضمن النطاق الخطي للمنحنى القياسي لتحديد تركيزات السيتوكين.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم تقويم الفئران SHIP +/+ و SHIP-/- البالغة من العمر 6 أسابيع عن طريق الفم مع 0.5٪ β-cyclodextrin (التحكم في السيارة ؛ ن = 6 / النمط الجيني) أو 3 مجم / كجم من ديكساميثازون (ن = 6 / النمط الجيني) يوميا لمدة أسبوعين. يعتمد توقيت العلاج ومدته على النموذج ويجب أن يأخذان في الاعتبار بداية المرض ومعدل تطوره، وكذلك ما إذا كان المقصود من التدخل أن يكون وقائيا أو علاجيا. يجب استخدام عدد متساو من الفئران من الذكور والإناث في التجارب. على الرغم من أننا لم نحدد الاختلافات القائمة على الجنس في التاريخ الطبيعي للمرض في فئران SHIP-/- ، إلا أن بروتوكولات العلاج المختلفة قد تظهر استجابات خاصة بالجنس. في هذا النموذج ، يمكن استخدام العلاج الوقائي من عمر 4-6 أسابيع لمنع ظهور الالتهاب والتليف ، بينما يمكن استخدام الأنظمة العلاجية التي يتم إجراؤها من عمر 6-8 أو 8-10 أو 6-10 أسابيع لتقييم فعالية العلاج للمرض الثابت. يجب أن تسترشد الجرعات والتوقيت الأمثل بالأدبيات ودراسات المعايرة بالتحليل الحجمي. لقد أظهرنا سابقا أن نظام الجرعات هذا للديكساميثازون فعال عند إعطائه بعد تطور الالتهاب اللفائفي.

الجدول الزمني الموصى به ليوم الحصاد موضح في الشكل 1 أ. لم يتسبب ديكساميثازون في أي أمراض معوية في فئران SHIP +/+ بناء على الفحص الإجمالي. أظهرت الفئران SHIP - / - مناطق مرئية من الاحمرار والسماكة ، مما يدل على الالتهاب. كانت هذه السمات المرضية الإجمالية غائبة في الفئران SHIP-/- المعالجة بالديكساميثازون (الشكل 1 ب). لتقييم وظيفة الحاجز المعوي ، تم قياس تركيزات البلازما من FITC-dextran بعد التزقيم الفموي. على الرغم من أنها ليست ذات دلالة إحصائية ، إلا أن فئران SHIP-/- لديها تركيزات مرتفعة من البلازما FITC-dextran مقارنة بضوابط SHIP +/+ ، مما يشير إلى زيادة نفاذية الأمعاء. قلل علاج ديكساميثازون من تركيزات FITC-dextran في فئران SHIP-/- إلى تركيزات مماثلة لتلك التي لوحظت في فئران SHIP +/+ (الشكل 1 ج).

كشف الفحص النسيجي للمقاطعات العرضية المعوية من الفئران SHIP- / - عن سمات مرضية مميزة ، بما في ذلك تسلل الخلايا المناعية ، وتعطل بنية سرداب الزغابات ، وتضخم / تضخم خلية الكأس ، وسماكة طبقة العضلات (الشكل 2 أ). انعكست هذه الخصائص في درجات الأضرار النسيجية أعلى بشكل ملحوظ مقارنة بفئران SHIP +/+ (ص = 0.0005 ، الشكل 2 ب). لم يلاحظ تلف نسيجي في فئران SHIP +/+ المعالجة بالديكساميثازون. تمشيا مع التحسينات التي شوهدت في علم الأمراض الإجمالي ووظيفة الحاجز ، قلل ديكساميثازون من علم الأنسجة المرضية في فئران SHIP-/- ، على الرغم من أن التأثير لم يكن ذا دلالة إحصائية (ص = 0.0981 ، الشكل 2 أ والشكل 2 ب). كشف تلطيخ ماسون ثلاثي الألوان عن ترسب كبير للكولاجين في أنسجة الأمعاء SHIP / - ، مصحوبا بدرجات تليف أعلى بكثير مقارنة بعناصر تحكم SHIP +/+ (الشكل 2 ج). خفف ديكساميثازون بشكل فعال من السمات الليفية في فئران SHIP-/- ، مما أدى إلى خفض درجات التليف إلى قيم مماثلة لتلك الخاصة بعناصر تحكم SHIP +/+ (الشكل 2 ج). بالإضافة إلى ذلك ، أكد تلطيخ Alcian blue / PAS تضخم / تضخم خلية الكأس في فئران SHIP-/- ، والذي تم تقليله عند العلاج بالديكساميثازون (الشكل 2 د).

لتقييم تركيزات السيتوكين الالتهابية ، تم إجراء ELISAs على متجانسات الأنسجة اللفائفية كاملة السماكة (الشكل 3 أ). كانت تركيزات IL-1β أعلى بشكل ملحوظ في فئران SHIP-/- مقارنة بضوابط SHIP +/+ (p = 0.0468) ، والتي تتوافق مع النتائج السابقة التي تربط تعبير IL-1β بشدة المرض في هذا النموذج. أدى علاج ديكساميثازون إلى تقليل تركيزات IL-1β بشكل ملحوظ في فئران SHIP-/- (p = 0.0023). تمشيا مع التقارير السابقة ، لم تختلف تركيزات IL-6 أو TNF عبر المجموعات التجريبية الأربع. قمنا أيضا بقياس تركيزات البروتينات المرتبطة بالعدلات المايلوبيروكسيداز (MPO) و lipocalin-2 (LCN-2) في متجانسات لفائفية كاملة السماكة كعلامات كيميائية حيوية إضافية للالتهاب (الشكل 3 ب). كانت تركيزات MPO و LCN-2 أعلى بشكل ملحوظ (p = 0.0031 و p = 0.0002 على التوالي) في فئران SHIP-/- مقارنة بضوابط SHIP +/+ ، على الرغم من أن الزيادة في LCN-2 كانت مدفوعة إلى حد كبير بالتركيزات العالية المقاسة في 2 من 6 فئران. أدى العلاج بالديكساميثازون إلى تقليل MPO وتقليل LCN-2 بشكل متواضع ، ولم تكن الاختلافات كبيرة. تشير هذه البيانات إلى أن MPO هي علامة مفيدة للالتهاب في فئران SHIP-/- ، في حين أن تركيزات LCN-2 ليست متسقة أو موثوقة.

للتحقيق في العلاقة بين السمات الالتهابية والليفية في نموذج SHIP-/- الفأر ، أجرينا تحليلات ارتباط سبيرمان باستخدام درجات الضرر النسيجي ، ودرجات التليف ، وتركيزات IL-1β من الأنسجة اللفائفية كاملة السماكة (الشكل 4). ترتبط تركيزات IL-1β ارتباطا إيجابيا بدرجات الضرر النسيجي (r = 0.6813) ، مما يشير إلى أن زيادة الالتهاب كانت مرتبطة بزيادة تلف الأنسجة (الشكل 4 أ). كما لوحظ وجود ارتباط معتدل بين تركيزات IL-1β ودرجات التليف (r = 0.4117) ، مما يشير إلى وجود صلة بين إنتاج السيتوكين الالتهابي وإعادة تشكيل التليف (الشكل 4 ب). بالإضافة إلى ذلك ، ترتبط درجات الضرر النسيجي ارتباطا كبيرا بدرجات التليف (ص = 0.6241) ، مما يشير إلى أن الضرر الهيكلي والتليف يتقدمان بالتوازي في فئران SHIP-/- (الشكل 4 ج).

figure-results-1
الشكل 1: يقلل ديكساميثازون من أمراض الأمعاء الإجمالية والنفاذية في فئران SHIP-/- تم تعطيم الفئران SHIP +/+ و SHIP-/- عن طريق الفم يوميا إما بنسبة 0.5٪ β-سيكلودكسترين كعنصر تحكم في السيارة (VC) أو ديكساميثازون (Dex ؛ 3 مجم / كجم) من عمر 6 إلى 8 أسابيع. (أ) الجدول الزمني التجريبي الموصى به. (ب) تم تقييم التشكل الإجمالي للأعور والدقاق البعيدة ، وتظهر الصور التمثيلية (ن = 4-6 فئران لكل مجموعة). تشير النجمة إلى مناطق الاحمرار غير المكتمل والسماكة التي لوحظت في الفحص الإجمالي. تهدف الصور إلى أن تكون بمثابة أمثلة تمثيلية لعلم الأمراض العام وليست مخصصة للتحليل الكمي. (ج) لتقييم نفاذية الأمعاء ، تم صيام الفئران لمدة 4 ساعات وتم تقويمها ب 80 مجم / مل FITC-dextran. بعد 4 ساعات إضافية من الصيام ، تم جمع الدم عن طريق ثقب القلب ، وتم قياس تركيزات FITC-dextran في البلازما. يتم تقديم البيانات على أنها متوسطة±SD. يمثل الشريط الرمادي نطاق تركيزات البلازما FITC-dextran التي لوحظت عادة في الفئران السليمة C57BL / 6 بعد أربع ساعات من التزقيم25. تم تحديد الدلالة الإحصائية باستخدام اختبار Kruskal-Wallis متبوعا باختبار Dunn للمقارنات المتعددة. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-2
الشكل 2: يقلل ديكساميثازون من درجات الضرر النسيجي ، والكولاجين ، وسمك العضلات ، وتضخم خلية الكأس وتضخم في الدقاق البعيد لفئران SHIP-/- . تم تعطيم الفئران SHIP +/+ و SHIP-/- عن طريق الفم يوميا إما بنسبة 0.5٪ β-سيكلودكسترين كعنصر تحكم في السيارة (VC) أو ديكساميثازون (Dex ؛ 3 مجم / كجم) من عمر 6 إلى 8 أسابيع. (أ) تم تصوير المقاطع العرضية اللفائفية الملطخة ب H & E من الفئران بتكبير 10 أضعاف ؛ قضبان المقياس = 200 ميكرومتر. (ب) درجات الضرر النسيجي للفئران SHIP +/+ و SHIP-/- معبرا عنها كمتوسط ± IQR. (ج) تم تلطيخ المقاطع العرضية اللفائفية الثابتة بثلاثي ألوان ماسون للتليف ؛ الكولاجين ملون باللون الأزرق. تم التقاط الصور بتكبير 10x. قضبان المقياس = 200 ميكرومتر. درجات التليف للفئران SHIP +/+ و SHIP-/- معبرا عنها كمتوسط ± IQR. (د) تم تلطيخ المقاطع العرضية اللفائفية الثابتة باللون الأزرق Alcian / PAS. تم تصوير الصور بزيادة 10× ؛ قضبان المقياس = 200 ميكرومتر. تمثل جميع الأقسام n = 6 فئران لكل مجموعة (باستثناء SHIP +/+ Dex و SHIP-/- Dex ، ن = 5). تم تحديد الدلالة الإحصائية لدرجة الضرر النسيجي باستخدام اختبار Kruskal-Wallis متبوعا باختبار Dunn للمقارنات المتعددة. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-3
الشكل 3: يقلل ديكساميثازون من تركيزات IL-1β في المتجانسات اللفائفية كاملة السماكة من فئران SHIP-/-. تم تعطيم الفئران SHIP +/+ و SHIP-/- عن طريق الفم يوميا إما بنسبة 0.5٪ β-سيكلودكسترين كعنصر تحكم في السيارة (VC) أو ديكساميثازون (Dex ؛ 3 مجم / كجم) من عمر 6 إلى 8 أسابيع. (أ) تم قياس تركيزات IL-1β و TNF و IL-6 في متجانسات لفائفية كاملة السماكة. (ب) تم قياس تركيزات المايلوبيروكسيداز (MPO) وليبوكالين -2 (LCN-2) في متجانسات الأنسجة اللفائفية كاملة السماكة. تم تقديم البيانات كمتوسط ± SD. تم إجراء التحليلات الإحصائية باستخدام اختبار Kruskal-Wallis متبوعا باختبار Dunn للمقارنات المتعددة. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-4
الشكل 4: ترتبط تركيزات IL-1β ارتباطا إيجابيا بالضرر النسيجي ويرتبط التليف والتليف بدرجة الضرر النسيجي في فئران SHIP-/- تم إجراء تحليل ارتباط سبيرمان لتقييم العلاقات بين درجة الضرر النسيجي ، ودرجة التليف ، وتركيزات IL-1β في الأنسجة اللفائفية كاملة السماكة من فئران SHIP-/- لوحظت ارتباطات إيجابية ذات دلالة إحصائية بين (أ) درجة الضرر النسيجي وتركيزات IL-1β (ص = 0.6813) ، (ب) درجة التليف وتركيزات IL-1β (ص = 0.4117) ، و (ج) درجة الضرر النسيجي ودرجة التليف (ص = 0.6241). تمثل كل نقطة بيانات ماوس فردي. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

مكون الضررنقاط
فقدان بنية السرداب0 = لا شيء
1 = خسارة <25٪
2 = خسارة 25-50٪
3 = خسارة 50-75٪
4 = خسارة >75٪
تسلل الخلايا المناعية0 = لا شيء
1 = خلية مناعية عرضية في الصفيحة المخصوصة
2 = زيادة الخلايا المناعية في الصفيحة المخصوصة
3 = الخلايا المناعية المتجمعة في الصفيحة المخصوصة واختراق الغشاء المخاطي
4 = تسلل الخلايا المناعية في جميع أنحاء القسم
تضخم خلية الكأس وتضخم0 = لا شيء
1 = زيادة بنسبة <50٪ في عدد خلايا الكأس وحجمها
2 = زيادة بنسبة >50٪ في عدد خلايا الكأس وحجمها
تقرح0 = لا شيء
1 = تقرح متوسط
2 = تقرح كبير
ذمه0 = لا شيء
1 = <50٪ من القسم
2 = >50٪ من القسم
سماكة العضلات0 = لا شيء
1 = سماكة متوسطة
2 = سماكة كبيرة

الجدول 1: درجات الضرر النسيجي. يتم تسجيل الضرر النسيجي للمقطع العرضي اللفائفي من فئران SHIP +/+ و SHIP-/- الملطخة ب H & E بناء على السمات الرئيسية لالتهاب اللفائفي التي تميز نموذج SHIP-/- الفأر ، بما في ذلك فقدان الهندسة المعمارية (0-4) ، وتسلل الخلايا المناعية (0-4) ، وتضخم خلية الكأس وتضخمها (0-2) ، والتقرح (0-2) ، والوذمة (0-2) ، وسماكة العضلات (0-2).

مكون التليفنقاط
الكولاجين المفرط0 = الهندسة المعمارية العادية ؛ لا يوجد كولاجين زائد
1 = زيادة طفيفة في الكولاجين. يقتصر على تحت الغشاء المخاطي أو تحت المصل
2 = توسع معتدل في الكولاجين إلى تحت الغشاء المخاطي والعضلي الجزئي ، مع حزم غير منظمة
3 = كولاجين واسع وكثيف يحل محل البنية الطبيعية ، بما في ذلك تحت الغشاء المخاطي والعضلات (عبر الجدار)
تضخم العضلي الليفي / العضلات / طمس العضلات تحت الغشاء المخاطي0 = لا يوجد ، محتوى طبيعي تحت الغشاء المخاطي للعضلات
1 = زيادة طفيفة في محتوى العضلات
2 = كمية كبيرة من العضلات في تحت الغشاء المخاطي ، تؤثر على التشكل ولكن الهيكل الطبيعي
3 = طمست العضلات المساحة تحت المخاطية بأكملها

الجدول 2: تسجيل التليف. تم تسجيل التليف في المقطع العرضي اللفائفي من الفئران SHIP +/+ و SHIP-/- الملطخة بثلاثي ألوان ماسون بناء على السمات الرئيسية للتليف المعوي التي لوحظت في نموذج SHIP- / - ، بما في ذلك ترسب الكولاجين المفرط (0-3) وتضخم العضل الليفي أو الطمس العضلي تحت الغشاء المخاطي (0-3). يتم تقييم الكولاجين من حيث المدى والاضطراب المعماري ، بينما يتم تقييم التغيرات العضلية بناء على درجة تسلل العضلات وتشويه البنية تحت المخاطية.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يحدد هذا البروتوكول إجراءات تقييم التهاب اللفائفي والتليف المعوي في فئران SHIP-/- ، وهو نموذج فئران لالتهاب الأمعاء الشبيه بالقرص المضغوط مع علم الأمراض الليفية المصاحب. يلخص نموذج الفأر SHIP / - ميزات القرص المضغوط التي لا تظهر بشكل شائع في نماذج الفئران الأخرى لالتهاب الأمعاء ، وتحديدا التوطين اللفائفي ، والالتهاب غير المكتمل والعابر ، وعلم الأمراض الليفية19،26. إلى جانب سهولة التكاثر والوقت القصير لظهور المرض ، فإن نموذج SHIP-/- في وضع جيد كأداة قوية للبحث الانتقالي في القرص المضغوط19.

في هذه الدراسة ، تم تقييم الدلالة الإحصائية لمقايسة FITC-dextran والتسجيل النسيجي باستخدام اختبار Kruskal-Wallis ، حيث لم تفي مجموعات البيانات هذه بافتراضات الحالة الطبيعية المطلوبة لتحليل المولود الطويل والضالع أحادي الاتجاه ، وتمثل الدرجات النسيجية متغيرات متقطعة وغير بارامترية. في حين أن تحليلاتنا لم تسفر عن فروق ذات دلالة إحصائية بين المجموعات المعالجة بالديكساميثازون والمجموعات المعالجة بالمركبات، فقد لاحظنا اتجاهات واضحة. قلل ديكساميثازون من نفاذية الأمعاء وعلم الأنسجة المرضية لفئران SHIP-/- ، وربما تكون هذه التأثيرات قد وصلت إلى أهمية مع أحجام عينات أكبر.

قد تنشأ العديد من التحديات الفنية عند تنفيذ هذا البروتوكول. فيما يتعلق بالتعامل مع الأنسجة ، تتطلب SHIP-/- ilea تلاعبا لطيفا أثناء التشريح لأنها عرضة للتمزق. هذا مهم بشكل خاص عند تحضير الأنسجة للتصوير الإجمالي. يعد تثبيت الأنسجة عاملا حاسما آخر للتحليل النسيجي. الأنسجة الثابتة بالفورمالين مناسبة لكل من تلطيخ H & E و Masson ثلاثي الألوان ولكنها غير متوافقة مع تلطيخ Alcian Blue / PAS. في المقابل ، فإن أنسجة كارنوي الثابتة مناسبة لتلوين H & E و Alcian Blue / PAS ولكن ليس لثلاثي الألوان لماسون. يؤدي تثبيت كارنوي إلى تلطيخ أزرق داكن مكثف ومنتشر ، مما يحجب الكولاجين وتصور طبقة العضلات. لتحليل السيتوكين ، من الضروري معالجة العينات على الجليد لأن السيتوكينات حساسة للغاية للتحلل. من الأهمية بمكان أن تكون متجانسات الأنسجة المصفاة مباشرة بعد المعالجة. يمكن أن تؤدي دورات التجميد والذوبان المتكررة إلى الإضرار بشكل كبير بسلامة السيتوكين وتقويض أي اختلافات محتملة بين الأنماط الجينية و / أو مجموعات العلاج. أخيرا ، لضمان القياس الكمي الدقيق ، نوصي بإجراء تخفيفات متعددة لكل عينة للتأكد من أن القراءات تقع ضمن النطاق الخطي للمنحنى القياسي للمقايسة ولتقليل التداخل المحتمل من مصفوفة الأنسجة المعقدة. تعد معالجة هذه الاعتبارات الفنية أمرا ضروريا لتوليد نتائج قابلة للتكرار وقابلة للتفسير ، ولكن يجب أيضا إدارة التباين البيولوجي المتأصل في فئران SHIP-/- بعناية.

هناك العديد من الجوانب الحاسمة لفئران SHIP-/- التي يجب أيضا أخذها في الاعتبار والتحكم فيها بعناية لضمان قابلية التكاثر وتقليل المتغيرات المربكة. ميكروبيوم الأمعاء له تأثير عميق على تطور المرض والاستجابات العلاجية في نماذج مرض التهاب الأمعاء27،28. أظهر عملنا السابق أن التهاب الأمعاء في فئران SHIP / - يعتمد على الجراثيم ويمكن تحسينه بالمضادات الحيوية29. لذلك ، يجب استخدام الضوابط القضائية للحد من التباين المدفوع بالميكروبيوم ، ويجب موازنة مجموعات العلاج لأصل القفص30. بالإضافة إلى ذلك ، فإن المطابقة الدقيقة للجنس ضرورية. على الرغم من عدم ملاحظة أي اختلافات على أساس الجنس في الاختراق أو شدة المرض في فئران SHIP-/- ، إلا أن نماذج التهاب اللفائفي الأخرى مثل SAMP1 / YitFc ، تظهر بداية مبكرة وزيادة شدة المرض عند الإناث14،31. نظرا لأن الهرمونات الجنسية يمكن أن تعدل أيضا التركيب الميكروبي32 ، فإن المطابقة مع الجنس أمر بالغ الأهمية لتقليل المربكات المحتملة في دراسات العلاج. علاوة على ذلك ، قد يكون للعلاجات الفردية التي يتم تقييمها فعالية تفاضلية في الفئران الذكور والإناث. على الرغم من أن النتائج الحالية التي توصلنا إليها لا تكشف عن الاختلافات المتعلقة بالجنس في المرض أو الاستجابة العلاجية للديكساميثازون ، إلا أنه يجب إجراء مطابقة الجنس في جميع دراسات العلاج.

بالإضافة إلى اعتبارات الميكروبيوم والجنس الموضحة أعلاه ، من المهم تضمين فئران SHIP +/+ في دراسات العلاج لتقييم تأثيرات السيارة والعوامل العلاجية في حالة عدم وجود التهاب معوي. هذا يضمن عدم تسبب الدواء أو طريقة توصيله أو تساهم في علم الأمراض في الأمعاء السليمة ، وبالتالي تحسين تفسير الفعالية العلاجية والسلامة.

يعد توقيت التدخل العلاجي ضروريا أيضا ويجب تعديله وفقا للأهداف التجريبية ، حيث توجد اختلافات كبيرة في كل من الالتهاب والتليف في الفئران في عمر 4 و 8 و 12 أسبوعا منعمر 19،26. تصاب الفئران بالتهاب معوي في وقت مبكر يصل إلى 4 أسابيع من العمر ، مع إصابة جميع الفئران بالتهاب بحلول عمر 6 أسابيع ، ويمكن قياس علامات علم الأمراض الليفية في وقت مبكر من عمر 6 أسابيع وتكون راسخة بحلول 8 أسابيع من عمر19،26. وبالتالي ، يجب أن تبدأ العلاجات التي تستهدف الالتهاب اللفائفي في عمر 6 أسابيع. يمكن البدء في التدخلات المضادة للتليف بشكل وقائي في 6 أسابيع أو علاجيا بين 8-10 أسابيع. ومع ذلك ، قد تختلف بداية المرض وشدته باختلاف البيئة الميكروبية ، والتي تختلف بين المرافق. يجب على المحققين أولا تحديد حركية المرض في مستعمرتهم قبل تنفيذ بروتوكولات العلاج. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن أن تقدم الفئران SHIP / - انخفاضا في الوزن بنسبة تصل إلى 17٪ بمقدار 4-5 أسابيع ، مع 5٪ أخرى بحلول 8-10 أسابيع33. يجب استبعاد التي تظهر فقدانا عميقا للوزن من الدراسات ، لأن هذا يعكس مظهرا شديدا للمرض وقد يقوض نتائج العلاج المتعلقة بأمراض الأمعاء.

أحد الاعتبارات المهمة عند تحليل تطور المرض في نموذج SHIP-/- هو اختيار العلامات الالتهابية المناسبة. استنادا إلى خبرتنا الواسعة مع ماوس SHIP-/- ، يركز تنميط السيتوكين عادة على وسطاء محددين ، مثل IL-1β ، المعروف أنه يتم تنظيمه أثناء تطور المرض. ومع ذلك ، من أجل التوصيف الأولي للاستجابات الالتهابية أو عند تقييم الاستراتيجيات العلاجية الجديدة ، ينصح بتحليل السيتوكين متعدد الإرسال. يتيح هذا النهج غير المتحيز تنميطا أوسع للبيئة الالتهابية وقد يكشف عن أهداف غير متوقعة ذات صلة بالتسبب في المرض أو الاستجابة للعلاج.

يوفر نموذج الماوس SHIP / - مزايا عملية تسمح بالتكاثر والكفاءة. SHIP-/- تصاب الفئران بالتهاب وتليف تليف تلقائي ومتسق دون الحاجة إلى محفزات خارجية. هذا يزيل التباين المرتبط بإعداد الكاشف وبروتوكولات الجرعات غير الموحدة عند إحداث التهاب معوي. ظهور المرض سريع ، حيث يتضح الالتهاب في عمر 4-6 أسابيع والتليف بعمر 8 أسابيع ، مما يجعل النموذج فعالا من حيث الوقت والتكلفة. بالإضافة إلى ذلك ، من السهل تكاثر الفئران SHIP-/- وصيانتها ، والتنميط الجيني واضح ومباشر ، ولا يلزم وجود استراتيجيات تربية متخصصة. هذا يبسط إدارة المستعمرة ، ويقلل من عبء العمل الفني ، ويقلل من خطر إدخال التباين الجيني غير المقصود19،21،26. يمكن تقييم المرض بشكل موثوق باستخدام التقنيات المتاحة على نطاق واسع في معظم البيئات البحثية ، بما في ذلك مقايسة FITC-dextran ، وتلوين H&E و Masson ثلاثي الألوان ، و ELISA. تدعم هذه الميزات المدمجة تصميم الدراسة الفعال ، وتقليل الحواجز المالية والتقنية ، وتعزيز توليد البيانات بشكل متسق بين المختبرات.

في حين أن نموذج SHIP-/- يقدم مزايا فريدة ، فإن النموذج له أيضا قيود. كما هو الحال مع جميع النماذج قبل السريرية ، لا يمكنها تكرار الطبيعة المعقدة ومتعددة العوامل لمرض التهاب الأمعاء البشري ، والتي تتأثر بالعوامل الوراثية والمناعية والبيئية34. لا تزال طرازات DSS و TNBS تحظى بشعبية واسعة نظرا لبساطتها وفعاليتها من حيث التكلفة. عند دمجها مع التعديلات الجينية ، يمكن أن تكون هذه النماذج الكيميائية بمثابة أدوات فعالة لفهم المساهمات الخاصة بالجينات في وظيفة الحاجز35. ومع ذلك ، فإن فائدتها الرئيسية تكمن في نمذجة الإصابة الظهارية الحادة. إنهم لا يرقون إلى مستوى التقاط علم الأمراض المزمن بوساطة المناعة الذي يميز القرص المضغوط ، وآلية الضرر الظهاري الناجم عن العوامل الكيميائية التي تفتقر إلى الأهمية السريرية المباشرة36. قد يؤدي الاعتماد الحصري على نموذج واحد إلى تقييم غير مكتمل و / أو مضلل للإمكانات العلاجية ، ويوصى باستخدام نماذج متعددة للتأكد من فعالية العلاج.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعلن المؤلفون عدم وجود تضارب في المصالح.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يتم دعم هذا العمل من قبل مرفق رعاية في معهد أبحاث مستشفى الأطفال في كولومبيا البريطانية وتمويل من مجلس أبحاث العلوم الطبيعية والهندسة في كندا من خلال شبكة علم السكر الكندية (GlycoNet ، شبكة مركز التميز) والمعاهد الكندية للبحوث الصحية (MOP-133607 إلى LS). KS و WM حاصلان على منح الدكتوراه TRIANGLE (TRaIning جيل جديد من الباحثين في أمراض الجهاز الهضمي وبرنامج LivEr).

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
أنبوب ميكرو بسعة 1.7 مل من غطاء  دياميدSPE155-N
1x DPBS (بدون كلوريد الكالسيوم، بدون كلوريد المغنيسيوم)جيبكوالمرجع 14190-144
25G x figure-materials-1” إبرة BDالمرجع 305122بالنسبة للثقب القلبي
26G x figure-materials-2” إبرBDالمرجع 305110تدفق الأمعاء
حمض الخليكسيغما-ألدرتشA6283علم الأنسجة
محلول ديكستروز بحمض سترات (38 ململ حمض الستريك، 107 ملليمول سترات الصوديوم، 136 ملليمول ديكستروز)ميليبور سيغماC3821
إبرة تغذية، غير معقمة، قابلة لإعادة الاستخدام، من النوع 304SSميليبور سيغما  CAD7900 بالنسبة لجافاج<بر/> مستقيم<بر/> الحجم: 24 جرام، <بر/> لكسديام. 1 إنش. × 1.25 مم،
كرة
أبروتينينشركة كايمان للكيماويات9087-70-1مخزن التجانس
حقنة BD Luer-Lok معقمة، للاستخدام الواحد، 5 ملBDالمرجع 309646تدفق الأمعاء
مجموعة BD OptEIA IL-6 ELISAبكالوريوس العلوم الحيوية555240
مجموعة ELISA II من فأر BD OptEIAبكالوريوس العلوم الحيوية558534
BD® حقنة Luer Slip Tim معقمة، للاستخدام الواحد، 1 ملBDالمرجع 309659
وسادات الرغوة الخزعة مربعة، 30.2 × 25.4 × 2 مم H.سسيمبريت ساينتيفكالمرجع M476-1علم الأنسجة
الفورمالد-فريش المخزن (الفورمالين منخفض الرائحة 10٪)فيشر كيميكالSF93-4علم الأنسجة
ألواح مناعية شفافة ذات قاع مسطح وغير معقمة من 96 بئرثيرمو ساينتفيك439454
جهاز الطرد المركزي المبرد Eppendorf 5415R مارشال ساينتفكEP-5415R
كحول الإيثيل اللامائيجرينفيلد جلوبالP016EAANعلم الأنسجة
شريط نسيج فيشربراند TRU-FLOWفيشر ساينتيفك15-200-403علم الأنسجة
FITC-dextran، 3-5kDa (1g)ميليبور سيغمارقم CAS FD4-1G
: 60842-46-8
ليوبتينميليبور سيغما103476-89-7مخزن التجانس
Mouse IL-1 beta/IL-1F2 DuoSet ELISA R& دي سيستمزDY401
لوحة متعددة الشاشات ذات 96 بئر، قاع صلبميليبور سيغماMSSWNFX40أبيض، غير معقم، غير معالج
كلوروفورم أومني بورميليبور سيغما3150علم الأنسجة
متجانس بوليترون PT-MR2100كينيماتيكا إيه جي632081
قارئ الميكرولوح متعدد الوضع من Varioskan Luxثيرمو ساينتفيكVL0L00D0

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Khor, B., Gardet, A., Xavier, R. J. Genetics and pathogenesis of inflammatory bowel disease. Nature. 474 (7351), 307-317 (2011).
  2. Ng, S. C., et al. Worldwide incidence and prevalence of inflammatory bowel disease in the 21st century: a systematic review of population-based studies. Lancet. 390 (10114), 2769-2778 (2017).
  3. Wang, R., Li, Z., Liu, S., Zhang, D. Global, regional and national burden of inflammatory bowel disease in 204 countries and territories from 1990 to 2019: a systematic analysis based on the Global Burden of Disease Study 2019. BMJ Open. 13 (1), e065186(2023).
  4. Xavier, R. J., Podolsky, D. K. Unravelling the pathogenesis of inflammatory bowel disease. Nature. 448 (7152), 427-434 (2007).
  5. Guan, Q. A comprehensive review and update on the pathogenesis of inflammatory bowel disease. J Immunol Res. 2019, 7247238(2019).
  6. Chang, J. T. Pathophysiology of inflammatory bowel diseases. N Engl J Med. 383 (27), 2652-2664 (2020).
  7. Graham, D. B., Xavier, R. J. Pathway paradigms revealed from the genetics of inflammatory bowel disease. Nature. 578 (7796), 527-539 (2020).
  8. Li, J., et al. Pathogenesis of fibrostenosing Crohn's disease. Transl Res. 209, 39-54 (2019).
  9. Rieder, F., Mukherjee, P. K., Massey, W. J., Wang, Y., Fiocchi, C. Fibrosis in IBD: from pathogenesis to therapeutic targets. Gut. 73 (5), 854-866 (2024).
  10. D'Alessio, S., et al. Revisiting fibrosis in inflammatory bowel disease: the gut thickens. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 19 (3), 169-184 (2022).
  11. Louis, E., et al. Behaviour of Crohn's disease according to the Vienna classification: changing pattern over the course of the disease. Gut. 49 (6), 777-782 (2001).
  12. Iliopoulou, L., Kollias, G. Harnessing murine models of Crohn's disease ileitis to advance concepts of pathophysiology and treatment. Mucosal Immunol. 15 (1), 10-26 (2022).
  13. Rivera-Nieves, J., et al. Emergence of perianal fistulizing disease in the SAMP1/YitFc mouse, a spontaneous model of chronic ileitis. Gastroenterology. 124 (4), 972-982 (2003).
  14. Pizarro, T. T., et al. SAMP1/YitFc mouse strain: a spontaneous model of Crohn's disease-like ileitis. Inflamm Bowel Dis. 17 (12), 2566-2584 (2011).
  15. Kontoyiannis, D., Pasparakis, M., Pizarro, T. T., Cominelli, F., Kollias, G. Impaired on/off regulation of TNF biosynthesis in mice lacking TNF AU-rich elements: implications for joint and gut-associated immunopathologies. Immunity. 10 (3), 387-398 (1999).
  16. Steiner, C. A., et al. The TNFΔARE mouse as a model of intestinal fibrosis. Am J Pathol. 193 (8), 1013-1028 (2023).
  17. Li, J., et al. Mouse models of intestinal fibrosis. Methods Mol Biol. 2299, 385-403 (2021).
  18. Pauls, S. D., Marshall, A. J. Regulation of immune cell signaling by SHIP1: a phosphatase, scaffold protein, and potential therapeutic target. Eur J Immunol. 47 (6), 932-945 (2017).
  19. McLarren, K. W., et al. SHIP-deficient mice develop spontaneous intestinal inflammation and arginase-dependent fibrosis. Am J Pathol. 179 (1), 180-188 (2011).
  20. Kerr, W. G., Park, M. Y., Maubert, M., Engelman, R. W. SHIP deficiency causes Crohn's disease-like ileitis. Gut. 60 (2), 177-188 (2011).
  21. Ngoh, E. N., et al. Activity of SHIP, which prevents expression of interleukin 1β, is reduced in patients with Crohn's disease. Gastroenterology. 150 (2), 465-476 (2016).
  22. Fernandes, S., et al. SHIP1 deficiency in inflammatory bowel disease is associated with severe Crohn's disease and peripheral T cell reduction. Front Immunol. 9, 9(2018).
  23. Ma, W. J., et al. Bespoke plant glycoconjugates for gut microbiota-mediated drug targeting. Science. 388 (6706), 1410-1416 (2025).
  24. Park, M. Y., et al. Impaired T-cell survival promotes mucosal inflammatory disease in SHIP1-deficient mice. Mucosal Immunol. 7 (6), 1429-1439 (2014).
  25. Tsai, K., et al. Highly sensitive, flow cytometry-based measurement of intestinal permeability in models of experimental colitis. Cell Mol Gastroenterol Hepatol. 15 (2), 425-438 (2023).
  26. Lo, Y., Sauve, J. P., Menzies, S. C., Steiner, T. S., Sly, L. M. Phosphatidylinositol 3-kinase p110δ drives intestinal fibrosis in SHIP deficiency. Mucosal Immunol. 12 (5), 1187-1200 (2019).
  27. Sellon, R. K., et al. Resident enteric bacteria are necessary for development of spontaneous colitis and immune system activation in interleukin-10-deficient mice. Infect Immun. 66 (11), 5224-5231 (1998).
  28. Taurog, J. D., et al. The germfree state prevents development of gut and joint inflammatory disease in HLA-B27 transgenic rats. J Exp Med. 180 (6), 2359-2364 (1994).
  29. Dobranowski, P. A., Tang, C., Sauvé, J. P., Menzies, S. C., Sly, L. M. Compositional changes to the ileal microbiome precede the onset of spontaneous ileitis in SHIP-deficient mice. Gut Microbes. 10 (5), 578-598 (2019).
  30. Robertson, S. J., et al. Comparison of co-housing and littermate methods for microbiota standardization in mouse models. Cell Rep. 27 (6), 1910-1919.e2 (2019).
  31. Goodman, W. A., et al. Loss of estrogen-mediated immunoprotection underlies female gender bias in experimental Crohn's-like ileitis. Mucosal Immunol. 7 (5), 1255-1265 (2014).
  32. Org, E., et al. Sex differences and hormonal effects on gut microbiota composition in mice. Gut Microbes. 7 (4), 313-322 (2016).
  33. Helgason, C. D., et al. Targeted disruption of SHIP leads to hemopoietic perturbations, lung pathology, and a shortened life span. Genes Dev. 12 (11), 1610-1620 (1998).
  34. Boyapati, R., Satsangi, J., Ho, G. T. Pathogenesis of Crohn's disease. F1000Prime Rep. 7, 44(2015).
  35. Mizoguchi, E., Low, D., Ezaki, Y., Okada, T. Recent updates on the basic mechanisms and pathogenesis of inflammatory bowel diseases in experimental animal models. Intest Res. 18 (2), 151-167 (2020).
  36. Koboziev, I., Karlsson, F., Zhang, S., Grisham, M. B. Pharmacological intervention studies using mouse models of the inflammatory bowel diseases: translating preclinical data into new drug therapies. Inflamm Bowel Dis. 17 (6), 1229-1245 (2011).
  37. Raftery, A. L., Pattaroni, C., Harris, N. L., Tsantikos, E., Hibbs, M. L. Environmental and inflammatory factors influencing concurrent gut and lung inflammation. Inflamm Res. 73 (12), 2123-2139 (2024).
  38. Maxwell, M. J., et al. Genetic segregation of inflammatory lung disease and autoimmune disease severity in SHIP-1-/- mice. J Immunol. 186 (12), 7164-7175 (2011).

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

SHIP FITC

مقالات ذات صلة