مقالة منهجية

الطفرات القائمة على كريسبر-كاس9 في الدودة الخيطية الممرضة للحشرات ستاينيرنيما خنثى وصيانة خطوط الطفرات

DOI:

10.3791/68932

⸱

ديسمبر 30, 2025

 , 
1Division of Biosphere Sciences and Engineering, Carnegie Institution for Science

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

توضح هذه المقالة هندسة الجينوم بوساطة CRISPR-Cas9 في ديدان Steinernema hermaphroditum، وهي دودة ممرضة للحشرات (EPN: حشرية-طفيلية) ونموذج جيني ناشئ. التقنية الموصوفة مفيدة لإنشاء الطفرات، مما يسمح بتوضيح وظائف الجينات في بيولوجيا الديدان الخيطية ذات الصلة بالتعايش المتبادل والطفيلي.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تحافظ الديدان الخيطية الممرضة للحشرات (EPNs) في جنس ستاينيرنيما والتهاب التحول الجنسي على تفاعلات متبادلة مع البكتيريا التعايشية Xenorhabdus وPhotorhabdus على التوالي. معا، تصيب هذه الأزواج من الديدان الخيطية والبكتيريا مضيفات الحشرات التي هي في الغالب يرقات من رتبة حرشفيات الأجنحة والخنافس، مما يشكل نظاما ثلاثيا قابلا للحل لتحليل الأساس الجزيئي للتبادل والتطفل. خطوة رئيسية نحو الاستفادة الكاملة من هذا النموذج هي تطوير أدوات جينية مستقرة وعابرة للأجيال في الشبكات الوراثية المبكرة. هنا، نعرض منصة تحرير جينوم موثوقة من نوع CRISPR–Cas9 في النموذج الناشئ Steinernema hermaphroditum، وهو نوع يحافظ عليه بسهولة في الجسم الحي، وفي المختبر، وقابل جدا للحقن الدقيق في الغدد التناسلية. ومن المهم أن تكاثره الخنثوي يسهل بشكل كبير توليد وصيانة خطوط الطفرات المتماثلة الزيجوت. نقدم بروتوكولا مفصلا لاضطراب الجينات الفعال والموجه باستخدام توصيل مجمعات الريبونوكليوبروتين Cas9 عبر الحقن الدقيقة. كدليل على المفهوم، قمنا بتعديل الجين المرتبط بالعضلات المحفوظة unc-22، مما أدى إلى ظهور نمط ظاهري مميز يرتجف يؤكد الطفرات المستهدفة في هذا النظام. تفتح هذه المنصة من كريسبر–كاس9 الباب أمام التلاعب الجيني المستقر في S. hermaphroditum، مثل التعبير عن الجينات المنقولة، وتوفر إطارا يمكن توسيعه ليشمل أنواع إضافية من الحمض النووي الجريء ذات الأهمية الزراعية والبيئية.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الديدان الخيطية الممرضة للحشرات (EPNs) هي طفيليات تقتل الحشرات وتشكل شراكات تبادلية خاصة بأنواع معينة مع متعايشاتها البكتيرية1. تتكون التغذية النارية من عائلتين: ستاينرماتيداي وهيتيرورهابديتيداي، والتي ترتبط بالبكتيريا سالبة الجرام من نوع فوتورهابدوس وزينورهابدوس على التوالي2،3. خلال المرحلة العدية العاشة للعدوى (IJ) لديدان ستاينيرنيما، تحتزن بكتيريا زينورهابدوس داخل جيب معوي من الديدان يعرف باسم الحاوية، وعند اختراق المضيف الحشري إلى الهيموكويل تطلق البكتيريا، وبعدها تتكاثر وتقتل الحشرة عن طريق تعفن الدم 3,4. في هذه العلاقة المتبادلة، تنتج البكتيريا مركبات مضادة للميكروبات ومبيدة للحشرات، تحمي من الاستجابة المناعية للمضيف وتوفر الدعم الغذائي للدودةالخيطية. وبالمقابل، تستفيد البكتيريا من الحماية التي يوفرها مضيف الديدان ضد الميكروبات البيئية ويتم تسهيل انتشراها إلى فرائس الحشرات الجديدة 6,7.

على مدى العقود القليلة الماضية، تم تأسيس شراكة ستاينرنيما-زينورهابدوس كنظام تجريبي قوي لدراسة جوانب مختلفة من التفاعلات الطفيلية والتبادلية، مثل سلوكيات البحث عن المضيف لدى الحشرات3، واستعمار البكتيريا في مضيف الديدان8، والسلوكيات التكيفية للبكتيريا التعايشية التي تسهل انتقالها بين الديدان الخيطية الحشراتالمضيفة 9. كما أن النيكات الإنتاجية المبكرة هي أنواع مهمة في استدامة التربة وتستخدم كعوامل عضوية لمكافحة الآفات لتعزيز الإنتاجية الزراعية10,11.

على الرغم من التطور السريع للأدوات الجينية في البكتيريا التعايشية Xenorhabdus وPhotorhabdus12، إلا أن الأدوات الجينية المتسقة في الحمض النووي النادر كانت نادرة. تم تأسيس حقن الغدد التناسلية بنجاح في كل من التهاب الهيتيرورهابديتس وديدان ستاينيرنيما 13,14. سابقا، كان الحقن الدقيق للغدد التناسلية في التهاب البكتيريا الهريرورهابدورا يستخدم لتوصيل حمض نووي RNA مزدوج السلسلة بشكل مستمر لإزالة الجين بين الجيل الأول من النسل13,15. مؤخرا، تم تطوير تحرير الجينوم بتقنية CRISPR-Cas9 في ستاينرنما، ويتم تقديمه عبر الحقن الدقيق للغدد التناسلية، وأسفر عن طفرات دقيقة ومستقرة وقابلة للوراثة14.

تم إثبات أن إحدى أنواع ستاينيرنيما، S. hermaphroditum، قابلة للتعامل مع الجميع ولديها إمكانات كبيرة كنموذج جيني ناشئ 4,14. تم عزله أصلا من التربة في إندونيسيا16 وأعيد عزله في الهند17، ويتميز S. hermaphroditum بالخنثى بشكل متسق، مع عدد قليل من الذكور في كل جيل، وهما ميزتان تسهلان تكيف الأدوات الجينية من الدودة الخيطية الكلاسيكية C. elegans4. بالإضافة إلى ذلك، تم تسلسل وتركيب جينوم S. hermaphroditum في كروموسومات، مما سهل مهمة تحديد مواقع الأهداف المحتملة ل Cas9 وتصميم البادئات18.

أثناء الحقن الدقيق ل EPN، يتم توصيل خليط حقن يحتوي على كواشف مناسبة، مثل dsRNAs أو بروتين Cas9 أو RNA التوجيهي، إلى الغدد التناسلية المخلية عبر إبرة مأخوذة من شعيرات كوارتز. الحجم والضغط المناسبان للحقن ينتجان عن تدفق مرئي للسائل عبر ذراع الغدد التناسلية. نظرا لأن هذه الديدان الخيطية لديها زوج من الغدد التناسلية المخلفية المكونة من نوى جرثومية تشترك في نفس السيتوسول19، فإن هذا النهج الميكروي يسمح بالوصول إلى عدة خلايا جرثومية للتعديل قبل حدوث التحريك الخلوي، مما يفصل نوى الخط الجرثومي إلى بويضاتمتطورة 20. على الرغم من أن الحقن الدقيق للغدد التناسلية يعد تقنية ثابتة للتعديل الجيني في عدة أنواع من الديدان الخيطية غير النموذجية14، 21، 22، 23، 24، 25، من الضروري تكييف تقنيات الحقن مع الهياكل الناسية المناسبة، ومرحلة الحياة، والحالة الفسيولوجية لكل نوع من الديدان لضمان النجاح والكفاءة العالية في التوصيل. تقنيات الاسترداد بعد الحقن وصيانة خطوط الطفرة كلاهما مهم لضمان أن تكون هذه التقنية فعالة من حيث التكلفة.

تظهر هذه الدراسة بروتوكول تحرير الجينوم CRISPR-Cas9 في Steinernema hermaphroditum. يتم وصف الحقن الدقيق في الغدد التناسلية في مرحلة الشباب، وهي مرحلة مقاومة للحقن المجهري عالي الضغط وقادرة على تعديل الجينات14. بالإضافة إلى ذلك، يتم توفير طرق مفصلة تصف الحفاظ على خطوط الطفرات الوراثية والمستقرة، سواء عبر الحفظ بالتجميد أو التكاثر عبر الحشرات.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

المواد المستخدمة والمواد المستخدمة مدرجة في جدول المواد.

1. تحضير الديدان الخيطية قبل الحقن الدقيق

  1. تحضير صفائح وسط نمو الديدان الخيطية (NGM) مزروعة ببكتيريا Xenorhabdus griffiniae وComamonas aquaticus.
    ملاحظة: ازرع ديدان S. hermaphroditum على بكتيرتها التعايشية الأصلية Xenorhabdus griffiniae قبل الحقن الدقيق لتعظيم نمو النيماتود، واستعادة المحقونة على بكتيريا Comamonas aquaticus لزيادة البقاء بعد الحقن14.
    1. بكتيريا السلسلة X. griffiniae على صفائح LB-بيروفات أجار (2.5 جرام مستخلص الخميرة، 5 جرام تريبتون، 2.5 جرام كلوريد الصوديوم، 0.5 جرام من الصوديوم بيروفات، 7.5 جرام أجار في 500 مل ماء) وتحضن طوال الليل عند 30 درجة مئوية.
    2. بكتيريا C. aquaticus على صفائح الأجار LB وتحتضن طوال الليل عند درجة حرارة 37 درجة مئوية.
    3. اختر مستعمرة واحدة من البكتيريا لتحصين وسط سائل LB داكن (5 جرام مستخلص الخميرة، 10 جرام تريبتون، 5 جرام كلوريد الصوديوم في 1 لتر ماء). يزرع البكتيريا خلال الليل (16 ساعة كحد أقصى) مع التهوية (X. griffiniae عند 30 درجة مئوية وC. aquaticus عند 37 درجة مئوية).
    4. تحضير أجار NGM: (3 جرام NaCl، 2.5 جرام بيبتون، و20 جرام أجار مضافة إلى 975 مل ماء، مع 1 مل كوليسترول، 1 مل 1 M CaCl2، 1 مل 1 M MgSO4، 25 مل 1 M KPO4 مضاف بعد الأوتوكلاف) 10 مل لكل طبق بتري 60 مم × 15 مم.
    5. بكتيريا البذور: أضف بعض القطرات من الزراعة البكتيرية الليلة على كل لوح أجار NGM، ثم هزه بلطف لتوزيع القطرات البكتيرية في رقعة.
    6. حضن صفائح NGM المزروعة بالبكتيريا في درجة حرارة الغرفة للسماح للأجار بالجفاف والبكتيريا بالنمو.
      ملاحظة: يجب استخدام أطباق بذور X. griffiniae في أقرب وقت ممكن؛ يمكن تخزين أطباق C. aquaticus في درجة حرارة الغرفة لمدة أسبوع إلى أسبوعين.
  2. مرحلة الديدان الخيطية
    ملاحظة: اختر مرحلة J3 من الخنثى في الليلة التي تسبق الحقن، واختر مرحلة J3 في يوم الحقن.
    1. اجمع أو قم بتقطيع دودة S. hermaphroditum على صفائح NGM المحضرة المزروعة ب X. griffiniae. حضن عند درجة حرارة 25-28 درجة مئوية للحصول على أفضل نموه.
    2. في الليلة التي تسبق الحقن الدقيق، اقطف مرحلة J3 من الخنثى على أجار NGM المزروع ب X. griffiniae. كما هو موضح في الشكل 1A، تقدر مرحلة J3 بحجم الدودة الخيطية وشكل الغدد التناسلية والفرج.
    3. في يوم الحقن الدقيق، اجمع الخنثى الشابة (الشكل 1B).

2. تحضير CRISPR-Cas9 للحقن الدقيق

  1. اختيار CRNas وتخزين الكواشف الخاصة ب CRISPR
    1. استخلاص تسلسل الجين المستهدف من جينوم Steinernema hermaphroditum المرجعي باستخدام BlastP، PRJNA982879.
    2. اختر تسلسل إكسون ترميز مبكر، إذا أمكن، ويفضل أن يكون الإكسون الأول، وأدخل التسلسل في CRISPRScan باستخدام الإعداداتالافتراضية 26 لتوليد قائمة ب CRNas الممكنة ل CRISPR RNAs.
    3. قم بتفجير أعلى crRNA ضد جينوم S. hermaphroditum لضمان اختيار crRNA فريدة فقط.
      ملاحظة: اختياري: تأكيد تسلسل المنطقة المستهدفة من الجينوم عن طريق تضخيم PCR وتسلسل سانجر قبل تصميم crRNA، لضمان ارتباط فعال لل crRNA.
    4. تخزين RNA كريسبر (crRNAs) وRNA كريسبر التحويل الشامل (tracrRNAs) عند 100 ميكرومولار لكل منهما في مخزن مزدوج عند -80 درجة مئوية.
    5. خزن بروتين Cas9 عند 10 ملغ/مل عند -20 °م أو -80 °م. تخزين 1 متر كيلو سي لتر عند 4 درجات مئوية.
  2. صنع وسادة أغاروز بنسبة 2٪ للحقن (مقتبسة من بيركوفيتز وآخرون 27)
    1. اذيب 2٪ أغاروز في الماء باستخدام فرن ميكروويف.
    2. انقل 50 ميكرولتر من الأجاروز المذاب إلى زجاج تغطية (48 × 60 مم رقم 1). غط قطرة الأغاروز فورا بكأس غطاء آخر.
    3. اترك الأغاروز يجف في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة. أزل الزجاج العلوي. ضع علامة على الجانب الأمامي من وسادة الأغاروز.
      ملاحظة: اختياري: اخبز وسادة الأغاروز على حرارة 37 درجة مئوية طوال الليل لتجفيف وسادة الأغاروز أكثر.
    4. احتفظ بفوط الأغاروز بنسبة 2٪ في درجة حرارة الغرفة لأشهر إلى سنوات.
  3. تحضير الإبر
    1. تصنيع إبر الكوارتز باستخدام المعلمات التالية على جهاز سحب خيوط الليزر. مع أداة سحب الإبر المستخدمة في هذه الدراسة، البرنامج المقترح هو كما يلي: الحرارة: 700، الخيط: 4، السرعة: 60، التأخير: 145، السحب: 175.
    2. اسحب إبر الكوارتز (القطر الزائد: 1.0 مم، المعرف: 0.7 مم) قبل الحقن مباشرة، أو مسبقا، وخزنها في صندوق تخزين الماصة.
      ملاحظة: بدلا من ذلك، نجحنا أيضا في الحقن بإبر بوروسيليكات (قطر البحر: 1.2 مم، المعرفة: 0.68 مم). لاحظ أن أحجام الإبر المختلفة تتطابق مع أحجام حامل الإبر المختلفة.

3. حقن CRISPR-Cas9 الدقيق واستعادة الديدان الخيطية بعد الحقن الدقيق

  1. تحضير خليط الحقن الدقيق CRISPR-Cas9 (مقتبس من Wang وآخرون 28)
    1. تحضير دوبلكسات RNA إرشادية جديدة عن طريق خلط crRNA المختارة وRNA tracrRNA الشامل بنسبة 1:1، أي إجمالي crRNA إلى tracrRNA في أنبوب PCR:
      crRNA #1 (100 ميكرومتر) - 1.5 ميكرولتر
      crRNA #2 (100 ميكرومتر) - 1.5 ميكرولتر
      tracrRNA (100 ميكروM) - 3.0 ميكرولتر
      ملاحظة: إذا استخدمت co-CRISPR، فإن crRNA #1 يستهدف جين علامة unc-22 ، بينما يمكن استبدال crRNA #2 بتسلسل آخر يستهدف جينا ثانيا محل اهتمام.
    2. حضن أنبوب PCR في جهاز دورة حرارية على درجة حرارة 94 درجة مئوية لمدة دقيقتين ثم تبرد إلى درجة حرارة الغرفة.
    3. قم بتجميع خليط الحقن بدمج ما يلي، ثم حضن لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة:
      Cas9 (10 ملغ/مل) - 2 ميكرولتر
      1M KCl - 0.58 ميكرولتر
      دوبلكسات gRNA (من الخطوة 3.1.1) - 2.7 ميكرولتر
    4. اخلط ثلاث مرات عن طريق تحريك أنبوب PCR، ثم دوران قصير (10-15 ثانية) في جهاز طرد مركزي صغير لجمع محتويات الأنبوب. بعد المزج النهائي، قم بتدوير القرص لفترة أطول، لمدة تصل إلى دقيقة واحدة.
  2. حمل وكسر الإبرة
    1. قم بتحميل الإبرة بخليط حقن من 1-2 ميكرولتر باستخدام رأس التحميل الدقيق.
    2. قم بتجميع الإبرة إلى حامل الماصة (حامل الإبرة)، ثم اكسر طرف الإبرة بسحب الإبرة عبر قطعة من الشريط المزدوج الوجه مغطاة بزيت الهالوكربون. اختبر فتحة الإبرة باستخدام وظيفة CLEAN في الحقن الدقيق .
  3. حقن دقيق في الغدد التناسلية المخلية لدودة خيطية شابة بالغة
    1. انقل قطرة صغيرة من زيت الهالوكربون إلى وسادة أغاروز بنسبة 2٪.
    2. تحت جهاز التشريح، استخدم سلكا رفيعا (ناعما) من البلاتين لالتقاط دودة خنثى صغيرة بالغة وغسلها في مخزن M9 (لكل لتر: 3 جرام KH2PO4، 11.3 جرام Na2HPO4، 5 جرام NaCl، مع إضافة 1 مل 1 M MgSO4 بعد التعقيم الطبيعي) لإزالة البكتيريا (انظر الديدان الخيطية الشابة في الشكل 1).
    3. انقل الدودة الخيطية المغسولة إلى وسادة أغاروز وضعها في قطرة زيت الهالوكربون. استخدم سلكا بلاتينا ناعما لمسح الدودة الخيطية بلطف حتى يصبح ثابتا.
    4. ضع وسادة الأغاروز بعناية على مرحلة الحقن الدقيقة. يجب أن يكون اتجاه التنسيق التناسلي التناسلي متجها نحو الإبرة بزاوية حوالي 45°. ابدأ بتكبير 5x، ثم انتقل إلى تكبير 20x و40x للحقن.
    5. تأكد من أن الإبرة تخترق السينيتيوم، ثم استخدم وظيفة CLEAN لحقن الميكرو لإدخال خليط الحقن عند حوالي 99 psi حتى يلاحظ تدفق واضح للسائل المحقون في الغدد التناسلية لضمان وصول الكواشف إلى الخلايا الجرثومية في تساقط الغدد التناسلية.
    6. إذا كان الذراع التناسلية الثانية متاحة، حرك المرحلة لوضع الإبرة لحقنها في الذراع الثانية.
  4. تعافي الديدان الخيطية بعد الحقن
    1. بعد الحقن مباشرة، أعد تعليق المحقون في 1-2 ميكرولتر من حاجز M9 على وسادة الأغاروز.
    2. باستخدام سلك بلاتين رفيع، التقط الدودة الخيطية المحقونة من وسادة الأغاروز واغسل الزيت باستخدام مخزن M9.
    3. استرجع الديدان الخيطية على صفائح NGM باستخدام عشب من بكتيريا C. aquatica (تحضير صفيحة NGM: انظر الخطوة 1.1)، مما يزيد من معدل بقاء الديدان الخيطية بعد الحقن14. حضن عند 25 درجة مئوية طوال الليل.
    4. في اليوم التالي، عزل كل ديدان خيطية (P0) تم حقونها على صفيحة NGM فردية مزروعة ب X. griffiniae. دع P0 تنتج نسل F1 بين ليلة وضحاها (إما عن طريق وضع البيض أو التجميع) للنمذجة الظاهرية والتصنيف الجيني (انظر الخطوة 4).

4. الفحص لتأكيد الإقصاء البالأقصى بنظام كريسبر-كاس9

  1. شاشة النيكوتين (CAUTION) لنموذج التشنج عند استخدام unc-22 كعلامة كريسبر مشتركة
    1. نقل نسل F1 من المحقونة P0 إلى نقطة تحتوي على محلول نيكوتين بنسبة 2٪.
    2. اختر واحدا يرتجف من بقعة النيكوتين واستعاد فورا على آجار NGM المزروع ب X. griffiniae. عزل كل F1 مرتجف على صفيحة فردية ودعها تنتج F2 لعملية التصنيف الجيني (انظر الخطوة 4.2).
  2. التصنيف الجيني
    1. اختر ثمانية نسل من F2 أو F3 من كل خط ارتعاش F1 للتصنيف الجيني. من المرجح أن تشمل هذه كل من المتغايرة الزيجوت +/mut ومتجانسة الزيجوت متشابكة/متجانسة الزيجوت.
    2. تحضير محلول استخراج الحمض النووي الجديد بإضافة 20 ميكرولتر من بروتيناز K (10 ملغ/مل) إلى 180 ميكرولتر من محلول تحلل الدودة (50 ملليمولار، 10 ملليمولار تريس pH 8.0، 2.5 ملليمولار ملغي كلول2، 0.45٪ NP-40، 0.45٪ Tween 20، 0.01٪ جيلاتين).
    3. أضف الديدان الخيطية إلى 10 ميكرولتر من مخزن استخراج الحمض النووي في أنابيب PCR. حضن على حرارة 65 درجة مئوية لمدة 10 دقائق، ثم 95 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة لاستخراج الحمض النووي الجيني.
    4. قم بتحديد الديدان الجينية عن طريق تضخيم منطقة Cas9 المستهدفة بتقنية PCR وفقا لتعليمات الشركة المصنعة، باستخدام 1-2 ميكرولتر من اللايزات من الخطوة 4.2.2. من المهم توفير مساحة كافية، إن أمكن (على الأقل 300 bp)، بين مواقع قطع Cas9 ومواقع ربط البرايمر في حال حدوث حذف كبير.
      ملاحظة: يمكن استخدام الرحلان الكهربائي بجل الأغاروز لتأكيد نجاح التضخيم قبل التسلسل.
    5. نظف منتج PCR وفقا لتعليمات الشركة المصنعة لضمان تحليل دقيق لتسلسل سانجر.
    6. تسلسل مضخمات PCR المولدة في الخطوة 4.2.4 باستخدام تسلسل سانجر وتحليل الكروماتوغرامات باستخدام برنامج ICE29.
    7. إذا تم تأكيد الأليلات الطفرة في الخطوة 4.2.6، عد إلى صفيحة F1 الأصلية المرتعشة وعزل ما لا يقل عن ثمانية خنثى على الصفائح الفردية. اسمح لكل دودة خيطية واحدة بإنتاج نسل، ثم نكتيب النسل بشكل جماعي لتأكيد التماثل الزيجوسي. يمكن الحفاظ على الخطوط المتماثلة في المختبر كما هو موضح في الخطوة 5.

5. صيانة خطوط كريسبر

ملاحظة: هناك ثلاث طرق رئيسية لصيانة الخطوط. تشمل هذه الحفظ بالتبريد القائم على الترهالوز-DMSO (الخطوة 5.1)، والمرور في الجسم الحي عبر ديدان الشمع (الخطوة 5.2)، والصيانة المخبرية على ألواح NGM (الخطوة 5.3).

  1. الحفظ بالتبريد بنظام تريهالوز-DMSO لخطوط النوع البري والطفرة
    ملاحظة: باستخدام طريقة الحفظ بالتبريد من نوع تريهالوز-DMSOرقم 4، يمكن تخزين S. hermaphroditum بشكل مستقر لفترة طويلة عند -80 درجة مئوية واستعادتها على وسط NGM. يتم تجميد الديدان الخيطية في قوارير تجميد بسعة 2 مل. يتم تحقيق التجميد الأمثل من خلال التبريد التدريجي باستخدام حاوية رغوة من البوليسترين.
    1. ازرع S. hermaphroditum على NGM المزروع ب X. griffiniae (انظر الخطوة 1.1) حتى يصبح غالبية السكان J1 أو خنثى في الكيس.
      ملاحظة: تجنب مراحل العدوى الصغار (IJ) لأنها لا تتجمد جيدا باستخدام هذه الطريقة.
    2. اغسل ديدان الديدان الخيطية من صفائح الأجار NGM في مخزن M9 وتجمع في أنابيب مخروطية بحجم 15 مل حتى علامة 5 مل. التركيز عن طريق الطرد المركزي (1372 × جرام لمدة 1-2:30 دقيقة يكفي).
    3. قم بإزالة المادة الفائقة واغسل مرة واحدة في 5 مل من محلول تجميد Trehalose-DMSO بدرجة حرارة الغرفة بواسطة الطرد المركزي وفقا للمعايير المقدمة في الخطوة 5.1.2.
    4. أعد تعليق الديدان في حاجز تجميد تريهالوز-DMSO بدرجة حرارة غرفة 5 مل. حضن الأنبوب في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة مع وضع الأنبوب على جانبه. هذا يزيد من معدل البقاء.
    5. وزع 1 مل لكل أنبوب في 4 قوارير تبريدية.
    6. ضع القوارير في صناديق رغوة البوليسترين في الفريزر بدرجة حرارة -80 درجة مئوية.
    7. بعد أسبوع، أجريت اختبار إذابة إحدى القوارير.
    8. انقل بقية القوارير إلى صناديق تجميد بدرجة حرارة -80°م وخزنها بشكل دائم.
    9. اختبار الذوبان أو الاسترداد ل S. hermaphroditum من المخزونات المجمدة
      1. أخرج قارورة من الفريزر واتركها تذوب تماما في درجة حرارة الغرفة.
      2. اسكب محتوى السائل على طبق NGM جديد. لاحظ أن إضافة بكتيريا تكافلية ليست ضرورية لأن المخزون المجمد عادة ما يحتوي على كمية كافية من البكتيريا التعايشية. يجب أن تبدأ الديدان في التعافي خلال دقائق إلى ساعات.
      3. راقب حركة الديدان الخيطية وتكاثرها. بعد يوم أو يومين، انقل عدة دودة خيطية إلى صفائح NGM جديدة مزروعة ب X. griffiniae.
  2. الصيانة الحية عبر جاليريا ميلونيلا
    ملاحظة: للنمو الحي، تنقل خطوط S. hermaphroditum المتحولة عبر يرقات Galleria mellonella (دودة الشمع) من المرحلة الخامسة. هذه الطريقة مفيدة بشكل خاص للخطوط التي لا تكون صالحة بعد الحفظ بالتبريد. يمكن العثور على بروتوكول مفصل ومشابه لتكاثر الديدان الخيطية الممرضة للحشرات الطبيعية عبر الحشرات، ووسائط أخرى لنمو EPN في (McMullen وآخرون 30). باختصار:
    1. دع الديدان الخيطية تموت جوعا وتصبح IJs على صفائح NGM.
    2. استخدم مخزن M9 لإزالة IJs من ألواح NGM.
    3. نقل IJs لإصابة حشرات جاليريا باستخدام فخ الأبيض.
  3. للصيانة المختبرية على ألواح NGM، اتبع الخطوات:
    1. صفائح NGM البذور تحتوي على حوالي 100 ميكرولتر من الزراعة السائلة الطازجة للسيمبيونت S. hermaphroditum ، X. griffiniae.
    2. اترك البقعة البكتيرية لتجف تماما قبل نقل الديدان الخيطية إلى الطبق.
    3. تخزين الدودان عند درجة حرارة 25 درجة مئوية وانقل الديدان الخيطية إلى أطباق طازجة البذور تقريبا مرة واحدة في الشهر.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم تصميم اثنين من RNA من كريسبر (تم تحديدهما برقم موقع Pam - Pam 3 و Pam 5) يستهدفان نظير S. hermaphroditum ل unc-22 في مواقعPam 14 المنشورة سابقا (الشكل 2A). كل crRNA مركب مع tracrRNA لتكوين RNA مرشد واحد (sgRNA) وتم دمجه في Cas9 لتكوين الريبونوكليوبروتين كما هو موضح في الخطوة 3.1. في هذا البروتوكول، تم تصميم اثنين من crRNA لاستهداف نفس الجين؛ ومع ذلك، إذا استخدمت طريقة co-CRISPR المطورة للاستخدام في C. elegans<...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

توفر أنظمة النموذجية الجينية غير التقليدية فرصا قيمة لدراسة وظيفة جينات حقيقية النواة ضمن السياقات البيئية والفسيولوجية التي تظهر فيها هذه الصفات بشكل طبيعي، على سبيل المثال، في وجود مضيف طفيلي أو ميكروبيوم كائن حي طبيعي. في الدودة الخيطية الممرضة للحشرات (EPNs)، اعتمدت التلاعبات الجينية على بعض الحالات من النهج المعتمدة على RNAi 13,32. على الرغم من أن RNAi يتيح الدراسات الجينية الوظيفية في بعض الأنواع، إلا أنه محدود بالطبيعة المؤقتة ل dsRN...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعلن المؤلفون أنه لا يوجد تضارب مصالح.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نشكر مارغريت ماكفول-نغاي وإدوارد روبي على استخدام المجهر الكونفوكلي الخاص بهما. نشكر أليكسيس (كودي) هارغادون وغريشا تشين على تدريبهما على المجهر الكونفوكلي، وكارلي ر. مايرز على المساعدة في الحصول على الصور وتحليل مقاطع الفيديو المرتجفة. نشكر أيضا ستيفاني هامبتون على تخصيص الأموال لشراء نظام الحقن الدقيق. دعمت مؤسسة كارنيجي للعلوم هذا العمل.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
آجار (80-100 شبكة)فيشر ساينتيفكBP26411يستخدم أيضا في صفائح LB Pyruvate
أغاروزفيشر ساينتيفك16500500يستخدم أيضا في التصنيف الجيني
الترجمة الريفية البديل CRISPR-Cas9IDT1072532
Alt-R S.p. Cas9 Nuclease V3IDT1081058
إبر البوروسيليكاتجهاز الدقة العالمي1B120F-4
كلوريد الكالسيوم (CaCl2)سيغما ألدريتشC4901
الكوليسترول  VWR4335 ملغ/مل من الإيثانول
Comamonas aquatica (DA1877)
غطاء زجاجي لوسادة الأغاروزمختبرات أبحاث الدماغ#4860-1D48 × 60 مم سمك no1
كريسبرسكانhttps://www.crisprscan.org/
كبريتات ثنائي الميثيل (DMSO)سيغما-ألدرتش4723010.5 م
DNA Clean and Concentrator-5 زيمو للأبحاثD4014
جهاز FemtoJet 4x Microinjector مع مجموعة رأس مقبض، 4 حجم حامل إبرة 0إبندورف/كاليبر5253000017
يرقات جاليريا ميلونيلا من الدرجة الخامسةجروب كوhttps://www.grubco.com/index.cfm
نظام التصوير الهلاميAzure400AZI400-01
صبغة تحميل الجلثيرمو فيشر العلميB72
الجيلاتين (2٪)سيغما ألدريتشG1393
جيل ريدالبيوتيوم#41003
بادئات التصنيف الجيني: قليغو الحمض النووي، 25 نانومولIDTلا يوجد
جيبكو باكتو بيبتونفيشر ساينتيفكDF0118-17-0
جيبكو باكتو تريبتونفيشر ساينتيفكDF0123-17-3يستخدم أيضا في صفائح Dark LB، LB Pyruvate  
مستخلص خميرة جيبكو باكتوفيشر ساينتيفكDF0127-17-9يستخدم أيضا في صفائح Dark LB، LB Pyruvate  
مجموعة رأس المقبض، 4 حجم حامل إبرة 1العيارEPE-5196083008(مقترنة بإبرة بوروسيليكات 1B120F-4)
زيت هالوكربون 700سيغما ألدريتشH8898
أداة دودة من السلك البلاتيني الصلب للصيانة اليوميةأبحاث ترايتيكPT-9901
استنتاج تعديلات كريسبر (ICE)سينثيغولا يوجدبرنامج يستخدم لتحليل تسلسلات سانجر لتحديد الإندل
KClسيغما ألدريتشP9541
جهاز سحب الإبرة بالليزر P-2000ساترP-2000G
كلوريد المغنيسيوم (MgCl2)سيغما ألدريتشM8266
كبريتات المغنيسيوم (MgSO4)سيغما ألدريتشM7506بالنسبة لمخزن M9، يستخدم أيضا في NGM
نصيحة الميكرولودر 2x96STالعيار930001007
محول تثبيت الميكرو مانبوليتور لجهاز Zeiss Axio Observer وAxiovert 200أبحاث ترايتيكNZ-19-2
المجهرترايتيكSMT1
النيكوتينسيغما ألدريتشN3876
NP-40ثيرمو فيشر العلمي85124
مخزن مزدوج خال من النوكليازIDT11-01-03-01
OneTaq MasterMixNEBM0486
صندوق تخزين البيبيتساتر إنسترومنتسBX10
كلوريد البوتاسيوم (KCl)سيغما ألدريتش793590
فوسفات البوتاسيوم، ثنائي البازي (K2HPO4)سيغما ألدريتشP3786KOH ل NGM
فوسفات البوتاسيوم، أحادي الأساس (KH2PO4)سيغما ألدريتشP5655بالنسبة لمخزن M9، يستخدم أيضا في NGM
إنزيم البروتيناز Kسيغما ألدريتشP6556
إبر الكوارتزساتر إنسترومنتسQF100-70-10
جينوم S. hermaphroditiumNCBIhttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/datasets/genome/GCA_030435675.1/
sh-unc-22 Alt-R CRISPR-Cas9 crRNAIDTلا يوجد
كلوريد الصوديوم (NaCl)VWRSS0430تستخدم أيضا في صفائح M9، داكنة LB، LB بيروفيات
فوسفات الصوديوم، ثنائي القاعدي (Na2HPO4.7H20)سيغما ألدريتشS9390بالنسبة لمخزن M9
بيروفات الصوديومسيغما ألدريتشP2256يستخدم أيضا في صفائح LB Pyruvate  
أداة دودة سلكية ناعمة من البلاتين للحقن الدقيقشوربيور كيميتالز6824بلاتين 90٪، إيريديوم 10٪ سلك ألمنيوم، قطر 0.002 بوصة × 5 أقدام
حامل الإبر القياسيأبحاث ترايتيكHI-7
Steinernema hermaphroditum
المجهر الستيريولايكاإنفيتا 3
تريهالوزكول-بارمرEW-88195-990.08 م
تريس فيشر ساينتيفكAM9855Gالرقم الهيدروجيني 8.0
20 سنةسيغما ألدريتشP1379
محول تثبيت الميكرو مانيبوليتر الرأسيأبحاث ترايتيكNR2
Xenorhabdus griffiniae (HGB2511)

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Stock, S., Blair, H. G. Entomopathogenic nematodes and their bacterial symbionts: The inside out of a mutualistic association. Symbiosis. 46, 65-75 (2008).
  2. Murfin, K. E., et al. Nematode-bacterium symbioses--cooperation and conflict revealed in the "omics" age. Biological Bull. 223 (1), 85-102 (2012).
  3. Dillman, A. R., et al. An entomopathogenic nematode by any other name. PLoS Pathog. 8 (3), e1002527(2012).
  4. Cao, M., Schwartz, H. T., Tan, C. -H., Sternberg, P. W. The entomopathogenic nematode Steinernema hermaphroditum is a self-fertilizing hermaphrodite and a genetically tractable system for the study of parasitic and mutualistic symbiosis. Genetics. 220 (1), iyab170(2022).
  5. Sergeant, M., et al. Identification, typing, and insecticidal activity of Xenorhabdus isolates from entomopathogenic nematodes in United Kingdom soil and characterization of the xpt toxin loci. Appl Environ Microbiol. 72 (9), 5895-5907 (2006).
  6. Walsh, K. T., Webster, J. M. Interaction of microbial populations in Steinernema (Steinernematidae, Nematoda) infected Galleria mellonella larvae. J Invertebr Pathol. 83 (2), 118-126 (2003).
  7. Herbert, E. E., Goodrich-Blair, H. Friend and foe: The two faces of Xenorhabdus nematophila. Nat Rev Microbiol. 5 (8), 634-646 (2007).
  8. Flores-Lara, Y., Renneckar, D., Forst, S., Goodrich-Blair, H., Stock, P. Influence of nematode age and culture conditions on morphological and physiological parameters in the bacterial vesicle of Steinernema carpocapsae (Nematoda: Steinernematidae). J Invertebr Pathol. 95 (2), 110-118 (2007).
  9. Cao, M., Goodrich-Blair, H. Ready or Not: Microbial adaptive responses in dynamic symbiosis environments. J Bacteriol. 199 (15), e00883-e00916 (2017).
  10. Lacey, L. A., et al. Insect pathogens as biological control agents: Back to the future. J Invertebr Pathol. 132 (C), 1-41 (2015).
  11. Campos-Herrera, R., et al. Intraspecific virulence of entomopathogenic nematodes against the pests Frankliniella occidentalis (Thysanoptera: Thripidae) and Tuta absoluta (Lepidoptera: Gelechiidae). J Nematol. 53 (1), 1-14 (2021).
  12. Rill, A., Zhao, L., Bode, H. B. Genetic toolbox for Photorhabdus and Xenorhabdus: pSEVA based heterologous expression systems and CRISPR/Cpf1 based genome editing for rapid natural product profiling. Microb Cell Fact. 23 (1), 98(2024).
  13. Ratnappan, R., et al. RNAi-mediated gene knockdown by microinjection in the model entomopathogenic nematode Heterorhabditis bacteriophora. Parasit Vectors. 9 (1), 160(2016).
  14. Cao, M. CRISPR-Cas9 genome editing in Steinernema entomopathogenic nematodes. bioRxiv. , (2023).
  15. Heryanto, C., Ratnappan, R., O'Halloran, D. M., Hawdon, J. M., Eleftherianos, I. Culturing and genetically manipulating entomopathogenic nematodes. J Vis Exp. (181), e63885(2022).
  16. Stock, S. P., Griffin, C. T., Chaerani, R. Morphological and molecular characterisation of Steinernema hermaphroditum n. sp. (Nematoda: Steinernematidae), an entomopathogenic nematode from Indonesia, and its phylogenetic relationships with other members of the genus. Nematology. 6 (3), 401-412 (2004).
  17. Bhat, A. H., Chaubey, A. K., Shokoohi, E., William Mashela, P. Study of Steinernema hermaphroditum (Nematoda, Rhabditida), from West Uttar Pradesh, India. Acta Parasitol. 64 (4), 720-737 (2019).
  18. Schwarz, E. M., et al. Genomes of the entomopathogenic nematode Steinernema hermaphroditum and its associated bacteria. bioRxiv. , (2025).
  19. Haglund, K., Nezis, I. P., Stenmark, H. Structure and functions of stable intercellular bridges formed by incomplete cytokinesis during development. Commun Integr Biol. 4 (1), 1-9 (2011).
  20. Ghanta, K. S., Ishidate, T., Mello, C. C. Microinjection for precision genome editing in Caenorhabditis elegans. STAR Protoc. 2 (3), 100748(2021).
  21. Gang, S. S., et al. Targeted mutagenesis in a human-parasitic nematode. PLoS Pathog. 13 (10), e1006675(2017).
  22. Adams, S., Pathak, P., Shao, H., Lok, J. B., Pires-daSilva, A. Liposome-based transfection enhances RNAi and CRISPR-mediated mutagenesis in non-model nematode systems. Sci Rep. 9 (1), 483(2019).
  23. Culp, E., et al. Genome editing in the nematode Caenorhabditis briggsae using the CRISPR/Cas9 system. Biol Methods Protoc. 5 (1), bpaa003(2020).
  24. Hellekes, V., et al. CRISPR/Cas9 mediated gene editing in non-model nematode Panagrolaimus sp. PS1159. Front Genome Ed. 5, 1078359(2023).
  25. Patel, R., et al. The generation of stable transgenic lines in the human-infective nematode Strongyloides stercoralis. G3 (Bethesda). 14 (8), jkae122(2024).
  26. Moreno-Mateos, M. A., et al. CRISPRscan: Designing highly efficient sgRNAs for CRISPR-Cas9 targeting in vivo. Nat Methods. 12 (10), 982-988 (2015).
  27. Berkowitz, L. A., Knight, A. L., Caldwell, G. A., Caldwell, K. A. Generation of stable transgenic C. elegans using microinjection. J Vis Exp. (18), e833(2008).
  28. Wang, H., Park, H., Liu, J., Sternberg, P. W. An efficient genome editing strategy to generate putative null mutants in Caenorhabditis elegans using CRISPR/Cas9. G3 (Bethesda). 8 (11), 3607-3616 (2018).
  29. Conant, D., et al. Inference of CRISPR Edits from Sanger Trace Data. CRISPR J. 5 (1), 123-130 (2022).
  30. McMullen, J. G. 2nd, Stock, S. P. In vivo and in vitro rearing of entomopathogenic nematodes (Steinernematidae and Heterorhabditidae). J Vis Exp. (91), e52096(2014).
  31. Kim, H., et al. A co-CRISPR strategy for efficient genome editing in Caenorhabditis elegans. Genetics. 197 (4), 1069-1080 (2014).
  32. Ciche, T. A., Sternberg, P. W. Postembryonic RNAi in Heterorhabditis bacteriophora: A nematode insect parasite and host for insect pathogenic symbionts. BMC Dev Biol. 7 (1), 101(2007).
  33. Du, X., McManus, D. P., French, J. D., Jones, M. K., You, H. CRISPR/Cas9: A new tool for the study and control of helminth parasites. Bioessays. 43 (1), e2000185(2021).
  34. Quinzo, M. J., Perteguer, M. J., Brindley, P. J., Loukas, A., Sotillo, J. Transgenesis in parasitic helminths: A brief history and prospects for the future. Parasit Vectors. 15 (1), 110(2022).
  35. Schwartz, H. T., Tan, C. -H., Peraza, J., Raymundo, K. L. T., Sternberg, P. W. Molecular identification of a peroxidase gene controlling body size in the entomopathogenic nematode Steinernema hermaphroditum. Genetics. 226 (2), (2024).
  36. Dokshin, G. A., Ghanta, K. S., Piscopo, K. M., Mello, C. C. Robust genome editing with short single-stranded and long, partially single-stranded DNA donors in Caenorhabditis elegans. Genetics. 210 (3), 781-787 (2018).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

مقالات ذات صلة