مقالة منهجية

نموذج الفأر للانسداد الميكروأوعية الدموية للمجهر ثنائي الفوتون في الجسم الحي باستخدام مجهر البوليسترين الفلورية

DOI:

10.3791/68939

⸱

نوفمبر 21, 2025

 ,  ,  ,  ,  , 
1Biomedical Engineering and Physics, Amsterdam University Medical Center, University of Amsterdam, 2Amsterdam Neuroscience, neurovascular disorders, 3Amsterdam Cardiovascular Sciences

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يحتوي هذا البروتوكول على وصف شامل لنهج خطوة بخطوة لنموذج فأر نافذة جمجمة مزمنة وميكروفوعية وعائية محسن للتصوير بمجهر ثنائي الفوتون في الجسم الحي باستخدام مجهر بوليسترين فلوري.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الانسدادات الدقيقة في الدماغ شائعة نسبيا لكنها لا تزال غير مدروسة بشكل كاف. معدل الأحداث، والعواقب طويلة الأمد، وآليات التصفية المحتملة غير معروفة إلى حد كبير. النماذج الحالية المستخدمة لدراسة هذه الأحداث، مثل الجلطة الضوئية وحقن الجدة الدقيقة، لكل منها مزاياها وقيودها الخاصة. طورت هذه الدراسة بروتوكولا مفصلا يجمع بين تحضير نافذة جمجمة مزمنة وتحفيز الانصنامات الميكروفوعية الدماغية عبر حقن الكرات الدقيقة داخل الشريان في الفئران. يتيح هذا الإعداد التصوير طويل الأمد داخل الجسم الحية للأوعية الدموية الدقيقة والانسدادات الدقيقة باستخدام المجهر ذو الفوتونين. يتم توصيل الكرات الدقيقة عبر قسطرة موضوعة في الشريان السباتي الخارجي (ECA)، والذي يربطه بشكل دائم. ومن المهم أن الشريان السباتي المشترك (CCA) والشريان السباتي الداخلي (ICA) يبقيان سليمين طوال وبعد الإجراء، مما يقلل من اضطراب تدفق الدم الدماغي. لتسهيل التصوير الفوري في الجسم الحي ومنع تجمع الميكروسفير أو التصاقها بأطراف الماصة والقسطرة، تعلق الكرات الميكروسفيرية في مزيج من FITC-Dextran و0.1٪ Tween 20. تم التحقق من صحة تقنية الحقن باستخدام التصوير ثلاثي الأبعاد بعد الوفاة في الموقع لتحديد توزيع الكرات المجهرية. تظهر هذه الدراسة فائدتها أكثر من خلال مثال مجهر ثنائي الفوتون في الجسم . يوفر هذا النهج طريقة متسقة وقوية لتحفيز ودراسة الانصصالات الميكروفوعية الدموية، مما يمكن من دراسة تأثيرها وديناميكيات التخليص باستخدام التصوير الحية عالي الدقة.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

السكتة الدماغية الإقفاري الناتجة عن انسداد في شريان دماغي كبير هي حدث حاد وغالبا ما يكون مدمرا1. قد يحدث الانصمام أيضا في الأوعية البعيدة. نتيجة لذلك، قد تتطور احتشاءات دماغية صامتة (SBIs)؛ كما يوحي الاسم، تبقى هذه الأعراض غير واضحة، وغالبا ما يتم اكتشافها بالصدفة أثناء التصوير لأسباب غير مرتبطة 2,3. تعد حالات الإصابة الدماغية الدماغية شائعة وتحتل مرتبة من أكثر الحالات الدماغية الوعائية الوعائية في تشريح كبار السن 4,5. أظهرت الدراسات الوبائية انتشارا بنسبة 20٪ لدى الأفراد الذين ليس لديهم تاريخ من السكتة الدماغية. تساهم الجراحات العضلية في الخلل الإدراكي والخرف، وتزيد من معدل الوفيات بشكل عام، وتشكل عامل خطر للسكتة الدماغيةالمستقبلية 6,7,8. عادة ما يكون قطر الاحتشاءات بضعة مليمترات فقط، ويرتبط بانسداد شرايين تخترق بأقطار تقارب 100 ميكرومتر. هذه الاختراقات تنتج طبقة واسعة من الشريان والشعيرات الدموية. من المرجح أن يبقى الجلطة الدقيقة الصغيرة التي تمر عبر الشرايين المخترقة وتلتصق في الدورة الدموية الدقيقة أسفل مجرى النهر غير قابلة للكشف في تصوير الأوعيةالدموية 9. ومع ذلك، قد يتم إفراز العديد من الميكروترومبوم في الرجفان الأذيني، واللويحات التصلب الشرايي، ومن مصادر أخرى10، 11، 12، 13، 14. بالإضافة إلى الجلطات الدقيقة، قد تسبب جسيمات دقيقة أخرى (MPs)، بما في ذلك جزيئات الدهون، والتجمعات الخلوية، وحتى الجسيمات البلاستيكية الدقيقة، في حدوث انسدامات وعائية دقيقة. تظهر عدة دراسات وجود منشطات بيضانية بلاستيكية في الدم والدماغ أكبر من قطر الشعيرات الدموية البالغ 5 ميكرومتر15,16.

لا تزال الانسدادات الدقيقة الوعائية غير مدروسة بشكل كاف مقارنة بالسكتة الدماغية الحادة وSBI. لا يعرف الكثير عن معدل الحدث، والعواقب طويلة الأمد، وآليات التطهير المحتملة. ومع ذلك، يزداد الاهتمام بسرعة بعد الإدخال السريري الناجح لاستئصال الجلطة الميكانيكية في السكتة الدماغية، حيث قد تسبب الانصنامات الميكروأوعية الدموية ضعفا في إعادة تروية الأوعية الدقيقة بعد إعادة الانتقال الناجحة على ما يبدو للشريان الكبير17. بالإضافة إلى ذلك، هناك زيادة في الأبحاث حول الجسيمات البلاستيكية الدقيقة، والتي قد تؤثر جزئيا من خلال الانصمام الوعائي الدقيق 18,19,20.

يمكن دراسة الانسدادات الدقيقة في قشرة الفأر من خلال، من بين أمور أخرى، باستخدام المجهر متعدد الفوتونات باستخدام نافذة قحفية. النماذج الأكثر استخداما لدراسة الانسدادات الوعائية الدقيقة الدماغية هي النموذج الضوئي الخثاري والنموذج الميكروسفير. يستخدم النموذج الضوئي الجلثومبوتية أصباغ حساسة للضوء لتحفيز الانسداد في أوعية مختارة (عادة الأوعية غير الشعيرية) عبر التنشيط الضوئي. ومع ذلك، لا يسمح هذا النموذج بدراسة الانصمام لفترة أطول بسبب تنشيط النظام الليفي الذي يذيب الانسداد21,22. علاوة على ذلك، فإن تنشيط الصبغة الحساسة للضوء ينتج أنواع أكسجين مفردة، مما يسببضررا في بطانة الرحم وحاجز الدم والدماغ (BBB). بالنسبة للدراسات حول وظيفة البطانة وكتلة الدماغ الدقيقة أثناء الانسداد الدماغي، والتأثيرات طويلة الأمد على الدورة الدموية ووظائف الدماغ، يفضل نموذج الميكروسفير. يستخدم نموذج حقن الميكروسفير الميكروكرات المحقونة في الدورة الدموية الدماغية لحجب الأوعية الدموية الدقيقة الدماغية 9,24,25,26,27,28,29,30. العيب المحتمل لهذا النموذج يكمن في أنه لا يمكن تحديد موقع الانصنافات مسبقا، على عكس الطريقة الضوئية31,32. الميزة هي أنه يمكن حقن كرات دقيقة بأقطار محددة جيدا، مما يستهدف بذلك الأوعية (الميكرو-) ذات الأقطار المحددة 33,34,35.

على مر السنين، تم تطوير عدة طرق لحقن الكرات الدقيقة في الدورة الدموية الدماغية للقوارض. تجد هذه البروتوكولات توافقا في الوصول إلى مثلث السباتي، الذي يتكون من الشريان السباتي المشترك (CCA)، الشريان السباتي الداخلي (ICA)، والشريان السباتي الخارجي (ECA) لحقن المجهرية داخل الشريان. تختلف طريقة الحقن بالميكروسفير داخل الشريان بين البروتوكولات بعدة طرق. أولا، استخدمت الدراسات إما حقنة 9,26,27,29,33,34 أو قسطرة 25,28,30,36. ثانيا، هناك تفاوت كبير في عدد وحجم الكرات الدقيقة المحقونة. تتراوح أقطار الميكروسفير عادة بين 10 و50 ميكرومتر، ويعتمد الاختيار على حجم الوعاء المستهدف. كقاعدة عامة، كلما كانت الكرات الدقيقة أكبر، كان الرقم الأول الذي يجب حقنه أقل، حيث توجد شرايين أقل من الشعيرات الدموية25، 26، 30.

لا يزال تحقيق حقن ميكروسفير داخل الشريان بشكل منتظم تحديا. في الواقع، يتم حقن أعداد كبيرة من الميكروكرات الدقيقة، لكن جزءا منها فقط يصل إلى الدورة الدموية الدماغية. وهذا يمثل مشكلة خاصة عند دراسة تأثيرات الميكروكرات العالقة باستخدام التصوير المجهر ثنائي الفوتون في الجسم الحي ، حيث يعتمد نجاح هذه التقنية على وجود كرات مجهرية في الطبقات الخارجية لقشرة الفأر داخل الرؤية من خلال نافذة الجمجمة المحضرة. اختيار الأصباغ الفلورية المناسبة للميكروسفيرات أمر بالغ الأهمية، حيث أن دمجها مع نماذج الفئران المعدلة وراثيا والتلوين داخل الأوعية الدموية قد يكون تحديا بسبب الفلورة الشديدة للميكروسفيرات وطيف الانبعاث المتداخلة.

تدرس الانسدادات الدقيقة في نماذج القوارض، وقد تم إثبات تأثيرات تآزرية لعدة ميكروكرات سابقا في أدمغة القوارض خارج الجسم 9، بالإضافة إلى التمدد الظاهر لمثل هذه الجسيمات، وهي عملية تسمى الوعمالوعمي 33,35,37,38. ولتمكين تحقيقهم في الجسم الحي، تم تطوير طرق للمجهر متعدد الفوتونات في الفئران ذات النوافذ القحفية. الغرض من الدراسة الحالية هو تطوير وتقديم تقرير عن بروتوكول مفصل للحقن داخل الشريان للميكروكرات في الفئران يهدف إلى تحسين دراسة تأثيراتها على أنسجة الدماغ ومصيرها. الميزة الرئيسية لهذا البروتوكول هي تحسين كفاءة التوصيل، مما يقلل من فقدان الميكروسفير ويزيد من احتمال وجودها في منطقة الشريان الدماغي الأوسط (MCA) داخل منطقة تصوير نافذة الجمجمة. يتم تقييم بروتوكول حقن الميكروسفير المحسن باستخدام المجهر ثنائي الفوتون في الجسم الحي والتصوير ثلاثي الأبعاد بعد الوفاة في الموقع مع ميكروتوم تجميد مخصص39.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

جميع الإجراءات المتعلقة بالحيوانات اتبعت دليل العناية واستخدام المختبرية. منحت اللجنة المركزية لتجارب في هولندا الموافقة الكاملة (AVD11400202316817).

ملاحظة: تم استخدام فئران ذكور وإناث تتراوح أعمارهم بين شهرين وسنة واحدة. عند الوصول، تم تأقلم لمدة 7 أيام قبل أي إجراء تجريبي. تم إيواء بحد أقصى 4 في كل قفص، مع توفير الطعام والماء بإجازة، وتم الحفاظ عليها على دورة ضوء وظلام لمدة 12 ساعة. تم الحصول على فئران NG2-DsRed وTIE2-GFP (انظر جدول المواد للتفاصيل) وتم تربيتها داخليا.

1. زرع نافذة الجمجمة

  1. التخدير والرعاية قبل الجراحة
    1. أضف 0.06 ملغ/مل من الكاربروفين إلى ماء الشرب قبل يوم واحد من بدء جراحة نافذة الجمجمة.
    2. وزن الفأر وأعط 5 ملغ/كغ من الكاربروفين و2 ملغ/كغ ديكساميثازون تحت الجلد قبل 30 دقيقة من الجراحة.
    3. جهز منطقة الجراحة عن طريق وضع وسادة تدفئة مع نظام تغذية راجعة على إطار الستيريوتاكتيك وتغطيته بقطعة قماش معقمة.
    4. ضع جميع الأدوات الجراحية المعقمة على قطعة قماش معقمة ثانية.
    5. قم بتخدير الفأر في غرفة تحفيز بخليط هواء بقوة 1 لتر/دقيقة (30٪ أكسجين و70٪ هواء طبي) و3-4٪ إيزوفلوران، ثم الحفاظ على التخدير بنسبة 1.5-2٪ إيزوفلوران باستخدام قناع الوجه.
    6. ثبت الفأرة في إطار ستيريوتاكتيكي وأدخل مسبار مقياس الحرارة في وسادة التدفئة بشكل مستقيم باستخدام مادة تشحيم. ضع مرهم العين لمنع الجفاف واثبت وسادة التدفئة على 37 درجة مئوية.
    7. أعط 1.5 ملغ/كغ روبيفاكائين تحت الجلد عند خط الجرح الجراحي قبل 5 دقائق من الجراحة.
    8. نظف الجلد فوق الجمجمة من الرقبة حتى ما بعد العينين باستخدام رأس قطني.
  2. التحضير الجراحي لتثبيت قضيب الرأس والنوافذ
    1. باستخدام ملقط معقم ومقص جراحي، قم بعمل شق أولي في الجلد فوق الجمجمة الخلفية. قم بتمديد الشق من غرزة لامبدا إلى الأمام على طول الخط الأوسط إلى الغرز الأمامية مباشرة أمام البريغما (الشكل 1A). قم بسحب الجلد وإزالته بعناية لكشف عضلات الصدغ بالكامل على كلا الجانبين.
    2. ضع حوالي 0.1 مل من الليدوكائين بنسبة 1٪ على الجمجمة لتقليل النزيف.
    3. قم بإزالة الشغاج وخدش جميع مناطق الجمجمة حيث سيتم تثبيت قضيب الرأس باستخدام شفرة جراحية. اجعل الخدوش عمودية عبر الجمجمة لضمان التصاق رأس القضبان بإحكام.
    4. نظف أي دم متبق برأس قطني وجفف الجمجمة باستخدام الهواء المضغوط.
  3. تثبيت قضيب الرأس
    1. تحضير خليط غراء الأسنان في وعاء خزفي بارد (4 درجات مئوية) بإضافة 100 ميكرولتر من المونومر إلى 0.1 جرام من البوليمر والخلط. أضف قطرة واحدة من المحفز إلى الخليط لبدء تصلب الغراء بسرعة.
    2. ضع الغراء على أسفل قضيب الرأس. اميل قضيب الرأس قليلا نحو الجانب الجانبي الأيسر من الجيب السهمي واضغط على الجمجمة. ضع غراء إضافيا على حواف قضيب الرأس لإغلاق جميع الفتحات. وهذا يضمن التصاق قوي.
    3. اصنع خليط إسمنت الأسنان عن طريق خلط 100 ميكرولتر من سائل الأسمنت السني مع 0.1 جرام مسحوق. ضع الأسمنت على جميع جوانب قضيب الرأس مع منع تدفق الأسمنت إلى الجمجمة عند منطقة الحفر. أضف طبقة إضافية من الأسمنت السني فوق قضيب الرأس لتشكيل بئر، مما يتيح تطبيق السوائل على نافذة الجمجمة (الشكل 1B).
    4. اترك غراء الأسنان والإسمنت ليجفا لمدة لا تقل عن 10 دقائق.
    5. تأكد من التصاق رأس قضيب الرأس بالضغط بلطف على الجمجمة حيث سيتم إجراء شق الجمجمة. يلتصق رأس القضيب بشكل صحيح عندما لا تتحرك الجمجمة ولا يظهر أي سائل بين الأسمنت السني والجمجمة.
  4. فتح الجمجمة
    1. ثبت الفأر على حامل التصوير باستخدام قضيب الرأس أو احتفظ به في إطار المجسم لتثبيت رأس بإحكام أثناء عملية قطع الجمجمة.
    2. حدد هدف حفر بالجمجمة (قطر 4 مم) باستخدام علامة دقيقة النقطة. حدد موقع MCA المرئي من خلال الجمجمة لضمان وضع نافذة القحف بشكل مثالي، تغطي أكبر قدر ممكن من MCA. للتأكد من الحجم الصحيح وموقع هدف الحفر، ارفع زجاج الغطاء فوق المنطقة المحددة وقم بتعديل حجم هدف الحفر حسب الحاجة.
    3. ابدأ بالحفر في دوائر عند العلامات دون الضغط على الجمجمة، لمنع توليد الحرارة (الشكل 1C). قم بتبريد الجمجمة بوضع محلول ملحي كل 30 ثانية. أثناء التبريد، نظف وتبريد رأس المثقاب بغمره في الماء ثم تجفيفه بمنشفة ورقية. قم بإزالة كل غبار العظام بانتظام باستخدام الهواء المضغوط. تأكد من حجم فتحة الجمجمة بوضع زجاج الغطاء على الجمجمة وضبط الحفر إذا لزم الأمر.
    4. استمر في الحفر في دوائر حتى يصبح العظم مخففا بشكل كاف. تظهر تشققات في منطقة الحفر بمجرد أن تكاد الجمجمة أن تكون مثقوبة. تأكد من أن العظم مخفف بما فيه الكفاية بإضافة محلول ملحي لتليين الجمجمة المخففة والضغط بلطف على منتصف عظم الجمجمة داخل منطقة الحفر. تكون منطقة الحفر رقيقة بما يكفي عندما تتحرك الجمجمة للأسفل بشكل متساو من جميع جوانب منطقة الحفر تحت ضغط لطيف. استمر في الحفر حتى تصل إلى هذه النقطة. لا تثقب الجمجمة؛ وهذا قد يعرض الجافة للأنسجة الدماغية والجسم الدماغي للخطر. حافظ على منطقة الحفر مبللة ب aCSF إذا تضررت المادة الجافية أو حدث نزيف.
      ملاحظة: قبل إزالة الجمجمة، تأكد من إزالة كل غبار العظام من منطقة الحفر. يمكن لجزيئات العظام المتبقية على الجافية أن تبدأ نمو العظام تحت النافذة.
    5. قم بإزالة جميع غبار العظام تماما باستخدام aCSF والهواء المضغوط. طبق aCSF على المنطقة المحفورة حتى تغمر الجمجمة بالكامل. باستخدام إبرة قياس 27 (0.4 مم × 16 مم) أو 30 قياس (0.3 مم × 13 مم)، ثقب الجمجمة المخففة أفقيا بحذر (~180°)، لتجنب تلف الجافة والدماغ. ادفع العظم بلطف للأعلى حتى ينفصل، مع استخدام أقل قدر من القوة. إذا لم ينفصل العظم بسهولة، استمر في الحفر. قم بإزالة الجمجمة المنفصلة باستخدام الملقط، مع إبقاء الدماغ مغمورا في العضلات الدماغية الصلبة (الشكل 1D).
    6. اشطف الدماغ ب aCSF، ثم ضع إسفنجة خنزير معقمة وماصة من جيلاتين الخنزير مشبعة ب aCSF على الدماغ للتحكم في النزيف الموضعي لمدة دقيقتين. أزل الإسفنجة بحذر، مع إبقاء الدماغ مغمورا في aCSF. استمر في الغسل باستخدام aCSF للتأكد من عدم بقاء غبار العظام أو الدم على الدماغ. إذا استمر النزيف، ضع إسفنجة دموية جديدة وماصة ومتصة مشبعة ب aCSF على الدماغ.
      ملاحظة: النزيف الطفيف شائع أثناء إزالة العظام. تأكد من توقف النزيف قبل وضع الزجاج، لأن النزيف المتبقي قد يقلل من وضوح النافذة.
  5. وضع زجاج الغطاء
    1. امتصاص ال aCSF الذي يغطي الدماغ برأس قطني، تاركا طبقة رقيقة فقط متبقية. ضع زجاج الغطاء على الدماغ واضغطه بلطف في فتحة الجمجمة باستخدام ملقط دقيق مثني. تأكد من أن زجاج الغطاء يقع قليلا تحت مستوى الجمجمة وموضوعه موازيا لقضيب الرأس.
      ملاحظة: يجب ضغط الزجاج بقوة على الدماغ لمنع تكون التسوس والحفاظ على جودة النوافذ. الحفاظ على زجاج الغطاء موازيا لقضيب الرأس يضمن أنه عمودي على هدف المجهر، مما يحسن جودة الصورة.
    2. ثبت زجاج الغطاء على الجمجمة وقضيب الرأس باستخدام غراء الإيبوكسي، وضعه على الجوانب مع تثبيت الزجاج بإحكام وبشكل مواز لقضيب الرأس.
    3. أغلق جميع حواف الزجاج المغلف بالغراء لمنع تعرض الدماغ. احتفظ بقطرة واحدة من aCSF على الدماغ أثناء التطبيق لمنع تسرب الغراء تحت النافذة أو ملامسته للجافة (الشكل 1E).
    4. دع الغراء يتصلب لمدة 5 دقائق.

figure-protocol-1
الشكل 1: نظرة عامة على بروتوكول بصق الجمجمة. صور مفصلة ورسومات تخطيطية لخطوات حاسمة خلال جراحة فتح الجمجمة وتركيب قضيب الرأس. (أ) إزالة الجلد (الخطوة 2.2). (ب) تثبيت قضيب الرأس (الخطوة 2.3). (ج) حفر عملية فتح الجمجمة بقطر 4 مم (الخطوة 2.4.3). (د) إزالة الجمجمة (الخطوة 1.4.5). (ه) وضع زجاج الغطاء (الخطوة 1.4.7). يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

  1. الرعاية بعد الجراحة
    1. أعط 5 ملغ/كغ من الكاربروفين تحت الجلد.
    2. انقل إلى قفص تعافي بدرجة حرارة 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. ثم أعيده إلى قفصه المنزلي مع 0.06 ملغ/لتر من الكاربروفين في ماء الشرب لمدة تصل إلى يومين بعد الجراحة.
    3. قدم الطعام المنقوع في 0.06 ملغ/لتر من الكاربروفين حتى يعود إلى وزنه قبل الجراحة.
    4. اترك للحيوان يتعافى لمدة لا تقل عن 7 أيام قبل إجراء نموذج الجراحة الميكروأوعية الدموية.

2. نموذج الفأر للانصصال الميكروفوعي

  1. تركيب القسطرة
    1. أدخل طرف قسطرة دقيقة بطول 20 سم (معرف 0.23114 OD 0.27432 مم) في قسطرة شفافة (ID 0.31 OD 0.64 مم) وأغلق الاتصال بغراء الإيبوكسي والشريط اللاصق. تأكد أن الطول الكلي للقسطرة كاف لحمل ما لا يقل عن 160 ميكرولتر.
    2. أدخل إبرة لوير-لوك بقياس 27 (0.1 مم × 16 مم) في الطرف المقابل للقسطرة الشفافة. أغلق الطرف بغراء الإيبوكسي والشريط اللاصق.
    3. املأ حقنة بحجم 1 مل بمحلول ملحي ووصلها بقفل اللور في إبرة القسطرة. اغسل بمحلول ملحي بسعة 0.7 مل، لضمان عدم بقاء أي تسرب أو فقاعات هواء.
    4. املأ القسطرة ب 80 ميكرولتر من المحلول الملحي وحدد المستوى الذي وصلت إليه القسطرة.
  2. التخدير والرعاية قبل الجراحة
    1. زود الفأر ماء شرب يحتوي على 0.06 ملغ/مل من الكاربروفين قبل يوم واحد من جراحة الانصمام الميكروفوعي.
    2. ضع وسادة تدفئة مع نظام تغذية راجعة تحت قطعة قماش معقمة واضبطها على 37 درجة مئوية.
    3. ضع جميع الأدوات الجراحية المعقمة على قطعة قماش معقمة ثانية.
    4. زن الفأر وأعط 5 ملغ/كغ من الكاربروفين تحت الجلد قبل 30 دقيقة من العملية.
    5. تخدير الفأر باستخدام 3-4٪ إيزوفلوران في غرفة حث بتدفق غازي 1 لتر/دقيقة يتكون من 30٪ أكسجين و70٪ هواء جراحي.
    6. انقل الفأر إلى طاولة الجراحة وحافظ على التخدير عبر قناع وجه يوفر 1.5-2٪ إيزوفلوران بمعدل 1 لتر/دقيقة مع 30٪ أكسجين و70٪ هواء.
    7. ضع مسبار درجة حرارة مستقيم مزلق وضع مرهم للعين لمنع الجفاف.
    8. ضع حقنة بسعة 2 مل تحت عنق الفأر المستلقى على ظهره لتسهيل الوصول إلى منطقة الجراحة.
    9. ثبت الأقدام الأمامية بلطف على طاولة الجراحة باستخدام شريط لاصق.
    10. احلق منطقة الجراحة وضع البيتادين ثم الليدوكائين.
  3. شق
    1. تحقق من عمق التخدير باستخدام قرص إصبع القدم.
    2. قم بعمل شق في منتصف المسار بطول حوالي 0.5 سم فوق القصبة الهوائية أسفل الفك السفلي باستخدام مقص جراحي وملقط تشريح.
    3. قم بتشريح النسيج الضام السطحي للفافة العنقية باستخدام ملقط دقيق يربط بالخياطة لكشف عضلات القص اللومي الأساسية.
    4. افصل عضلات القص العظمي الأيسر والأيمن عن طريق تمزيق النسيج الضام بينهما برفق. اسحب عضلة الأومو هيويد اليمنى من الذيل الجانبي باستخدام خطاف نسيج. تأكد من أن مثلث السباتي الأيمن، بما في ذلك CCA وICA وECA، مرئي بوضوح.
  4. التحضير الجراحي لسرطان الرحم الخلفي (CCA)، وICA، وECA، والشريان الجدوري الخلفي (PPA)
    ملاحظة: تجنب الإمساك أو الضغط على العصب المبهم؛ حركه بلطف فقط لمنع الآثار السلبية على صحة. لا تلمس القصبة الهوائية، لأن ذلك قد يسبب مشاكل في الجهاز التنفسي. حدد الشريان القذالي (OA)، الذي يتفرع من ICA في منتصف الطريق بين التفرع على شكل Y لمنطقة ICA وأصل ECA، والشريان العلوي للغدة الدرقية (TA)، الذي يتفرع من الجانب الإنسي للشريان القذالي. هذه الشرايين هشة ويجب التعامل معها بحذر شديد.
    1. قم بإزالة أي لفافة متبقية وأنسجة دهنية حول ال CCA.
    2. افصل بحذر بين ال CCA والعصب المبهم.
    3. ضع خيوطين 4/0 1.5 حول CCA واربطهما بشكل فضفاض. تأكد من أن العقد لا تعيق تدفق دم CCA.
    4. قم بإزالة اللفافة والأنسجة الدهنية من ICA وPPA. ربط مؤقت PPA وجميع فروع ICA الجانبية، بما في ذلك OA، عن طريق ربط عقدة بخيط 4/0 1.5.
    5. إزالة اللفافة والأنسجة الدهنية من ECA وTA. ضع عقدتين فضفاضتين حول ECA وTA باستخدام 4/0 1.5 خيوط. ضع الخيط الأبعد بعيدا قدر الإمكان عن التفرع على شكل حرف Y واستخدمه لربط ECA وTA. اترك العقدة القريبة غير مربوطة.
  5. تحضير محلول الميكروسفير وتحميل القسطرة
    ملاحظة: جهز محلول FITC-Dextran/Microsphere قبل الحقن بقليل لتقليل التصاق الميكروسفير بالقسطرة.
    1. قم بتجانس وسونيك الكرات الدقيقة بحجم 10 ميكرومتر (7.2 × 106 ميكروكرات في مل) للحصول على تعليق منتظم للجسيمات الفردية.
    2. حضر 140 ميكرولتر من FITC-Dextran بوزن 25 ملغ/مل 70 كيلو دالتون يحتوي على 0.1٪ Tween20، ثم أضف 20 ميكرولتر من الميكروكرويات المتجانسة للحصول على 160 ميكرولتر من خليط FITC-Dextran/Tween20/ميكروسفيرات يحتوي على 1.44 × 105 ميكروسفير.
    3. اسحب الحقنة المتصلة بالقسطرة لفترة وجيزة لإنشاء غرفة هواء.
    4. اغمر طرف القسطرة في خليط FITC-Dextran/Tween20/microsphere المحضر واسحب الحقنة ببطء حتى يصبح الخليط في القسطرة.
    5. تأكد من عدم وجود فقاعات هواء في القسطرة. إذا كان موجودا، أفرغ الخليط في حاوية بسعة 0.5 مل وكرر الخطوات 2.5.3 و2.5.4.
    6. ضع الحقنة مع القسطرة المحملة في مضخة الحقنة. اضبط المضخة على 10 ميكرولتر/دقيقة وشغل حتى تظهر قطرة صغيرة من خليط الميكروسفير عند طرف القسطرة.
  6. إدخال القسطرة وحقن الميكروسفير
    ملاحظة: تجنب حقن فقاعات الهواء في الجهاز الوعائي، لأن ذلك قد يسبب آثارا جانبية خطيرة أو وفاة. قد تنتج فقاعات الهواء عن تحميل غير صحيح للقسطرة أو تسربات في الأنابيب.
    1. ضع مشبك وعاء على ICA وشد إحدى العقد القريبة المعدة مسبقا حول CCA (انظر الخطوة 2.4.3).
    2. باستخدام المقص الدقيق، قم بعمل شق قطري صغير في ECA على بعد حوالي 0.5 مم من خيط الربط. تأكد من أن حجم الشق أصغر قليلا من قطر القسطرة.
    3. امتصاص أي دم باستخدام قطعة قماش أو نسيج معقم، لضمان عدم استمرار تسرب الدم عبر الربط ومشبك الأوعية.
      ملاحظة: يجب أن يبقى المثلث الوعائي خاليا من الدم بعد شق ECA. يمكن أن يؤدي الدم المتبقي إلى تكون جلطة، مما قد يسبب أحداثا إقفارية دماغية كبيرة عند استعادة تدفق السباتين السباتي أو يسد ECA، مما يمنع حقن الميكروسفير.
    4. ابدأ مضخة الحقنة لفترة وجيزة لتشكيل قطرة من خليط الميكروسفير عند طرف القسطرة، مما يؤكد عدم بقاء هواء في طرف القسطرة.
    5. افتح شق ECA وأدخل القسطرة باستخدام ملقط دقيق دقيق. تجنب لمس الأسطح الأخرى أثناء الإدخال لمنع فقدان خليط الميكروسفير أو دخول الهواء إلى القسطرة. إذا فشل الإدخال أو لامس طرف القسطرة سطحا، كرر الخطوة 2.6.4 قبل إعادة المحاولة.
    6. ثبت القسطرة في ECA عن طريق شد الخيط القريب (انظر الخطوة 2.4.5) حول ECA.
    7. تأكد من عدم وجود تسرب أو فقاعات هواء داخل الأوعية الدموية عن طريق تشغيل مضخة الحقنة بسرعة 10 ميكرولتر/دقيقة. إذا كان أي منهما موجودا، افصل القسطرة وارجع إلى الخطوة 2.6.4.
    8. إذا لم يتم اكتشاف تسرب أو فقاعات هواء، استمر في الضخ بسرعة 10 ميكرولتر/دقيقة لزيادة الضغط تدريجيا في القسطرة والأوعية الدموية حتى يلاحظ تضخم مرئي في الشريان. لمطابقة ضغط الشريان لدى، قم بإنشاء ضغط كاف في القسطرة والأوعية الدموية قبل إعادة فتح ICA وCCA. عندما يستعاد تدفق الدم في CCA وICA، قد يدخل بعض الدم إلى القسطرة، لكنه سيعاد حقنه لاحقا في ICA. تأكد بصريا من حقن خليط الميكروسفير في ECA وأن تراكم الضغط كان ناجحا من خلال مراقبة صبغة FITC الخضراء وهي تملأ الشرايين. إذا لم يلاحظ ذلك، أوقف مضخة الحقنة، أزل القسطرة، وكرر الخطوات من 2.6.4 إلى 2.6.8.
    9. قم بإزالة مشبك الوعاء من ICA، ثم زد معدل تدفق مضخة الحقنة إلى 20 ميكرولتر/دقيقة. تأكيد نجاح حقن الميكروسفير من خلال التحقق من أن ICA البعيد عن تشعب PPA مملوء بصبغة FITC. إذا تم التأكيد، انتقل إلى الخطوة 2.6.11؛ إذا لم يكن كذلك، تابع إلى الخطوة 2.6.10.
    10. أوقف مضخة الحقنة وقم بفك ربط PPA. أعد وضع ربط PPA بعيدا عن تقسيم ICA-PPA، ثم شد الربط. ارجع إلى الخطوة 2.6.9.
    11. إزالة الخيط الذي ربط CCA لتمكين خليط الميكروسفير من التدفق إلى ICA.
    12. استكشاف الأخطاء في حالة التدفق العكسي أثناء حقن خليط الميكروكروي:
      1. إذا حدث تدفق عكسي لخليط الميكروسفير إلى CCA، قلل تدفق مضخة الحقنة إلى 10 ميكرولتر/دقيقة.
      2. إذا استمر التدفق الرجعي، اضغط بلطف على ECA وICA وCCA باستخدام ملقط دقيق لضمان عدم وجود انسداد في التدفق بسبب الجلطة.
      3. تأكد بصريا من عدم وجود انسداد هوائي داخل الأوعية الدموية. يمكن التعرف على الانصمام الهوائي كجزء شفاف داخل الأوعية الدموية.
      4. إذا كان هناك انسداد هوائي، أوقف مضخة الحقنة وانقل الانسداد الهوائي إلى ECA عن طريق الضغط اللطيف على الشريان باستخدام ملقط دقيق. قم بربط CCA ووضع مشبك وعاء على ECA. أزل القسطرة والانسداد الهوائي وارجع إلى الخطوة 2.6.4.
      5. إذا لم يكن هناك عائق، لكن التدفق الرجعي استمر، أغلق CCA باستخدام مشبك وعاء وارجع إلى الخطوة 2.6.10.
        ملاحظة: يجب ألا يحدث تدفق عكسي لخليط الميكروسفير إلى CCA، لأنه قد يشير إلى عدم كفاية إعادة فتح ICA، أو انسداد هوائي، أو تكوين جلطات قد تكون سلبية على نتيجة التجربة.
    13. توقف حقن الميكروسفير عن طريق إيقاف مضخة الحقنة بمجرد وصول الخليط في القسطرة إلى علامة 80 ميكرولتر (انظر الخطوة 3.1.4). يتم حقن ما مجموعه 80 ميكرولتر من FITC-Dextran/Tween20 مع 7.2 ×10 4 ميكروسفيرات.
  7. إكمال الإجراء
    1. قم بربط CCA باستخدام العقدة المتبقية المحضرة (انظر الخطوة 2.4.3) وأغلق ICA بمشبك الوعاء.
    2. قم بإزالة القسطرة من ECA مع الحفاظ على الخيط الذي يثبت القسطرة في ECA في نفس الوضع.
    3. ربط ECA بشكل دائم عن طريق شد الخيط الذي ثبت القسطرة.
    4. قم بإزالة مشبك الوعاء والخيوط حول CCA وICA وPPA لاستعادة تدفق الدم. بلل منطقة الجراحة ببضع قطرات من محلول ملحي.
    5. خياط الجلد بإبرة منحنية مقاس 3/8 مقاس 12 مم وخياطة حرير غير قابلة للامتصاص 3-0 (USP).
  8. الرعاية بعد الجراحة
    1. أعط 5 ملغ/كغ من الكاربروفين تحت الجلد.
    2. انقل إلى قفص التعافي (~33 درجة مئوية) لمدة 30-60 دقيقة. أعد إلى قفصه المنزلي بمجرد تعافيه الكامل.
    3. في أول يومين، انقع الطعام لمدة 10 دقائق في 0.06 ملغ/مل من الكاربروفين وقدمه للحيوان، وأضف ماء الشرب ب 0.06 ملغ/مل من الكاربروفين. بعد هذه الفترة، استمر في تقديم الطعام المنقوع بدون الكاربروفين حتى يعود إلى وزنه قبل الجراحة.
    4. راقب عدة مرات يوميا خلال أول يومين، ثم ثلاث مرات في الأسبوع بعد ذلك. قم بقتل الرحيم إذا وصلت إلى نقطة إنسانية.
      ملاحظة: يتم تعريف نقاط النهاية البشرية وفقا للتوجيه 2010/63/الاتحاد الأوروبي للبرلمان الأوروبي. بالإضافة إلى ذلك، قم بقتل أي إذا ظهرت عليه علامات نقص التروية، مثل السلوك الدائري أو الشلل، لأن نموذج الانصمام الوعائي الدقيق لا ينبغي أن يسبب حدثا إقفاريا كبيرا.

figure-protocol-2
الشكل 2: جراحة الانصمام الوعائي الدقيق. أمثلة على صور مفصلة ورسومات تخطيطية لخطوات حاسمة خلال جراحة الانصمام الوعائي الدقيق. (أ) إعداد الالتزامات CCA (مرتين)، ECA (مرتين)، TA، OA، وPPA (الخطوة 2.4). (ب) ربط (صدغي) لجهاز CCA (الفتحة الأولى) وECA، يليه إغلاق فتحتي الفتحات المفتوحة وPPA والإغلاق المؤقت لل ICA بمشبك وعائي، مما يمكن من شق في ECA دون نزيف (الخطوة 2.6.2). (ج) وضع القسطرة في القسطرة المقسمة، والتي ترتبط بالخياطة الثانية (الخطوة 2.6.7). (د) فتح الغرز القريب حول CCA وإزالة مشبك الوعاء من ICA لاستعادة تدفق الدم، تليها حقن خليط الميكروسفير في ICA (الخطوة 2.6.10). CCA = الشريان السباتي الشائع؛ ECA = الشريان السباتي الخارجي؛ TA = الشريان الغرقي؛ OA = الشريان القذالي؛ PPA = الشريان الجميلي الحنك؛ ICA = الشريان السباتي الداخلي. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

3. التصوير في الجسم الحي

  1. المجهر ذو الفوتونتين
    1. ضع في حامل التصوير ذو الفوتونتين في المجهر للتصوير الحي . حافظ على تخدير خفيف مع 1.2٪ إيزوفلوران في خليط 1 لتر/دقيقة من 30٪ أكسجين و70٪ هواء، وراقب تكرار وعمق التنفس. انظر الجدول التكميلي 1 لتفاصيل إعداد المجهر.
    2. حدد موقع الميكروكرات العالقة عبر نافذة الجمجمة باستخدام إضاءة هدف 10x (10x/0.30 DRY) ومصباح الزئبق. ثم انتقل إلى تصوير بفوتونين مع هدف غمر 25x في الماء (25x/0.95 ماء). انظر الجدول التكميلي 2 لإعدادات التصوير.
    3. سجل أكوام Z حول الميكروسفير المعني.

4. تحليل ما بعد الوفاة

  1. نقطة النهاية التجريبية للتصوير في الموقع
    1. عند الوصول إلى نقطة التجربة، قم بقتل عن طريق خلع عنق الرحم تحت > 4٪ إيزوفلوران في خليط 1 لتر/دقيقة يحتوي على 30٪ أكسجين و70٪ هواء طبي.
  2. تصوير الدماغ في الموقع
    1. استخرج الدماغ، وغمره في مذيب الصوديوم الكربوكسي ميثيل سيلولوز بنسبة 3.0٪ (سيغما) ممزوج بحبر أسود بنسبة 0.1٪ (VWR)، وتجميده عند −20 درجة مئوية لمدة لا تقل عن 24 ساعة.
    2. صور الدماغ باستخدام نظام تصوير فلوري ثلاثي الأبعاد صغير مخصص (small-3D-FICS) الذي وصفه جوتش ر.ن.س. وآخرون. اضبط النظام لتقسيم الدماغ عموديا إلى 16 ميكرومتر والصورة بدقة 13.66 × 13.66 ميكرومتر. راجع الجدول التكميلي 3 والجدول التكميلي 4 لإعدادات التصوير ومواصفات النظام. حلل الصور باستخدام برنامج Articulus41.
  3. تصوير الفأر الكامل في الموقع
    1. أزل جلد وأسنانه وذيله.
      ملاحظة: إزالة الذيل اختيارية لكنها تزيد من سرعة التصوير.
    2. قم بإدخال في مذيب الصوديوم الكربوكسي ميثيل سيلولوز بنسبة 3.0٪ (سيغما) ممزوجا بحبر أسود بنسبة 0.1٪ (VWR)، وتجميده عند −20 درجة مئوية لمدة لا تقل عن 24 ساعة.
    3. صور باستخدام نظام تصوير فلوري ثلاثي الأبعاد كبير مخصص (large-3D-FICS) كما تم وصفه سابقا 42. اضبط النظام لقطع مقاطع بحجم 25.9 ميكرومتر بدقة داخل المستوى تبلغ 26.09 ميكرومتر. انظر الجدول التكميلي 5 والجدول التكميلي 6 لإعدادات التصوير ومواصفات النظام. حلل الصور باستخدام برنامج Articulus41.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

التصوير الميداني بعد الوفاة

تم تأكيد نجاح جراحة الانصمام الوعائي الدقيق من خلال تصوير ميداني كامل الجسم والدماغ الكامل بعد 4 أيام من جراحة الانصمام الوعائي الدقيق (الشكل 3A). تظهر الشريحة السهمية للفأر وجود كرات دقيقة في الدماغ. تظهر الأشكال 3B,C مثالا على دماغ فأر مستخرج، بعد يوم واحد من جراحة الانصمام الميكروأوعية الدموية. كانت الميكروكرات متمركزة بشكل رئيسي في نصف الكرة النفسي الجانبي، في منطقة تدفق الشرايين الدماغية الوسطى والأمامية. زاد عدد الميكروسفير في شرائح الدماغ بشكل ملحوظ عند إضافة Tween20 إلى الخليط (الشكل 3E). تظهر مراقبة الوزن أثناء التعافي بعد جراحة الانصمام الدقيق أن الفئران فقدت وزنا أقل وتعافت بشكل أسرع بعد الجراحة عند حقنها بخليط ميكروسفير يحتوي على Tween20 (الشكل 3F).

figure-results-1
الشكل 3: توزيع الكرات الدقيقة في الفأر بعد جراحة الانصمام الوعائي الدقيق. تم تصور الموقع الميداني لميكروكرات بحجم 10 ميكرومتر في الفأرة باستخدام برنامج Articulus41. (أ) مثال على مستوى الساجيتال لفأر كامل تم تصويره باستخدام تقنية الثلاثية الأبعاد الكبيرة بعد جراحة الانصمام الميكروأوعية الدموية. (B-D) صور محورية وتاجية وسهمية ممثلة لدماغ فأر، تم تصويرها باستخدام تقنية الخيال ثلاثي الأبعاد الصغيرة. (ه) متوسط عدد الكرات الميكروكروية المكتشفة لكل مقطع إكليل دماغي بحجم 50 ميكرومتر عند حوالي بريغما ± 0.5 مم لظروف التحكم وTween20. تمثل الشرائط متوسط ± انحراف معياري. تعرض القياسات الفردية كنقاط. تم إجراء المقارنة الإحصائية باستخدام اختبار t غير مقترن؛ يتم الإشارة إلى قيمة p في الرسم البياني. تم تحديد القيم الشاذة وإزالتها باستخدام طريقة المدى الرباعي (IQR) (n = 1 لكلا المجموعتين)، مما أدى إلى حجم المجموعة النهائي n = 3 للمجموعة الضابطة وn = 14 للمجموعة الثلاثية العشرة. (و) تغيرات الوزن الطبيعية مع مرور الوقت بعد جراحة الانصمام الميكروفوعي عند النقطة الزمنية 0. تم تطبيع الأوزان حسب خط الأساس لكل أثناء الجراحة. تظهر الخطوط متوسط ± SD لكل مجموعة (ضابطة، n = 4؛ Tween20، n = 5) مع التحكم باللون الأزرق وTween20 باللون البرتقالي الداكن. تم تقييم الدلالة الإحصائية بين المجموعات في كل نقطة زمنية باستخدام اختبارات t ثنائية الذيل غير المتوافقة. (* = p < 0.05، ** = p < 0.01) يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

حقن الميكروسفير والمجهر ذو الفوتونين في الجسم الحي

أثناء حقن الميكروكروي، أظهرت القسطرة المغطاة ب 5٪ من BSA أن العديد من الميكروكرات التصقت بسطح القسطرة، وغالبا ما كانت الميكروكرات المتدفقة متجمعة، مما قد يسبب انسدادات أكبر (انظر الفيديو التكميلي 1). بالإضافة إلى ذلك، إضافة 5٪ من BSA في خليط الميكروسفير لمنع الالتصاق والتجمع غير مرغوب فيه بسبب الاستجابة المناعية المحتملة عند الحقن 43,44. لتجاوز ذلك، تم استخدام محلول Tween20 بنسبة 0.1٪ في خليط الميكروسفير، مما أدى إلى زيادة ملحوظة في عدد الميكروكرات التي تتدفق عبر القسطرة وعدد الميكروكرات المطلوبة (> 20) في نافذة التصوير (الشكل 4 والفيديو التكميلي 2). يظهر الشكل 4A,B صورة عامة لمجهر الفلورة لقشرة الدماغ بعد 0.5 ساعة من جراحة الانصمام الوعائي الدقيق. كل نقطة بيضاء تمثل كرة دقيقة تحجب شعيرا دمويا في الأوعية الدموية الدقيقة الدماغية. يعرض الشكل 4C,D صور z-stack ذات فوتونين الإسقاط ثنائي الأبعاد كمثال. تسبب الكرات المجهرية انسدامات في الأوعية الدماغية الدقيقة مع ضعف في التروية، ويتضح ذلك بغياب الصبغة داخل اللمعان أسفل الميكروسفير (الشكل 4E والفيديو التكميلي 3). بالإضافة إلى ذلك، تسبب هذه الانصنادات اضطرابا في الكتلة الخشبية مع انتشار صبغة FITC-ديكستران (الشكل 4F,G).

تتوافق هذه النتائج مع قلة عدد الكرات الدقيقة الملتصقة بالقسطرة وقلة تجمع الميكروسفير، وهو ما لوحظ في القسطرة أثناء حقن خليط الميكروسفير وتويين. ومع ذلك، تجمعت عدد كبير من الكرات الدقيقة معا في ال 20 ميكرولتر النهائي من خليط الميكروسفير في القسطرة، والتي لا ينبغي حقنها لمنع حدوث احتشاء كبير محتمل (انظر الفيديو التكميلي 4).

figure-results-2
الشكل 4: مجهر ثنائي الفوتون في الجسم الحي للمجهرات العالقة. أمثلة على صور فلورية في الجسم الحي وصور فوتونتين لميكروكرات عالقة في قشرة الفأر. (أ) نظرة فلورية من خلال نافذة الجمجمة في مجهر الأحافل. (ب) صورة فلورية للعائد على الاستثمار المختار. (C,D) صور مجهرية بفوتونين للميكروكرات المحبوسة في الدورة الدموية الدماغية مع عائد على الاستثمار المختار للتصوير التفصيلي. يتم تصوير صور المكدس Z في الأبعاد ثنائية الأبعاد عن طريق حساب الانحراف المعياري لشدة البكسل على طول مكدس Z. (E-G) صور مجهرية ثنائية الفوتون ممثلة في الجسم الحي تظهر ثلاثة انصنامات دقيقة وعوية دماغية. تسهم حمراء تبرز مناطق تسرب FITC-Dextran، مما يشير إلى اضطراب BBB وتسرب الصبغة. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الجدول التكميلي 1: مواصفات نظام المجهر ذو الفوتونين. يرجى الضغط هنا لتحميل هذا الجدول.

الجدول التكميلي 2: إعدادات المجهر بفوتونين لتصوير FITC-dextran والميكروسفير. يرجى الضغط هنا لتحميل هذا الجدول.

الجدول التكميلي 3: إعدادات نظام تصوير فلوري ثلاثي الأبعاد صغير لتصوير دماغ الفأر باستخدام ميكروكرات زرقاء. يرجى الضغط هنا لتحميل هذا الجدول.

الجدول التكميلي 4: مواصفات نظام تصوير فلوري ثلاثي الأبعاد صغير لتصوير دماغ الفأر باستخدام ميكروكرات زرقاء. يرجى الضغط هنا لتحميل هذا الجدول.

الجدول التكميلي 5: إعدادات نظام تصوير فلوري ثلاثي الأبعاد كبير لتصوير الفأر الكامل باستخدام ميكروكرات حمراء. يرجى الضغط هنا لتحميل هذا الجدول.

الجدول التكميلي 6: مواصفات نظام التصوير الفلوري ثلاثي الأبعاد الكبير لنظام التصوير الفلوري ثلاثي الأبعاد للتصوير الكامل للفأر باستخدام ميكروكرات حمراء. يرجى الضغط هنا لتحميل هذا الجدول.

فيديو تكميلي 1: قسطرة مغطاة ب BSA بنسبة 5٪ مع التصاق ميكروسفير بجدار القسطرة وتجمع الميكروسفير في خليط 25 ملغ/مل من FITC-Dextran الميكروسفير أثناء الحقن. يرجى الضغط هنا لتحميل هذا الفيديو.

الفيديو التكميلي 2: قسطرة مغطاة ب Tween20 بنسبة 0.1٪ مع بعض التصاق الميكروسفير بجدار القسطرة ولكن بدون تجمع ميكروسفير في FITC-Dextran بسعة 25 ملغ/مل مع خليط 0.1٪ Tween20 مع ميكروكرات أثناء الحقن. يرجى الضغط هنا لتحميل هذا الفيديو.

الفيديو التكميلي 3: تقسيم ثلاثي الأبعاد للانسدادات الميكروفوعية بواسطة الكرات الدقيقة. يرجى الضغط هنا لتحميل هذا الفيديو.

الفيديو التكميلي 4: الحجم النهائي لحقن الميكروسفير بتركيز عالي في الميكروسفير بسعة 25 ملغ/مل FITC-Dextran مع خليط 0.1٪ Tween20. يرجى الضغط هنا لتحميل هذا الفيديو.

الملف التكميلي 1: الالتزام بالميكروسفير بالتحقق من أطراف الماصة. يرجى الضغط هنا لتحميل هذا الملف.

الملف التكميلي 2: تقييم الغلاف المناعي الكيميائي لتغطية CD45 في اليوم 1 و7 و28 بعد جراحة الانسداد الدقيق مقارنة نصفي الكرة المثلية ومقابليه. يرجى الضغط هنا لتحميل هذا الملف.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

لنمذجة الانصنامات الوعائية الدقيقة، تم وصف بروتوكول لحقن الكرات المجهرية في الدورة الدموية الدماغية للفئران يسمح بدراسة الانصمام الدقيق باستخدام المجهر ذو الفوتونتين في الجسم الحي . حسنت هذه الطريقة حبس الميكروسفير في الدماغ، حيث تم احتجاز عدة ميكروكرات داخل أول 500 ميكرومتر من القشرة المثلية المقابلة، مما مكن من تصوير فوتونيين فعال.

يعد عدد الميكروسفيرات العالي في المنطقة القشرية من الدماغ ضروريا للتصوير الثنائي الفوتوني داخل الجسم الحي. تم تقليل فقدان الكرات الدقيقة أثناء تحضير خليط الميكروسفير عن طريق تغطية أطراف الماصات ب 5٪ BSA أو 0.1٪ Tween20، مما يقلل من التصاق الميكروسفير (انظر الملف التكميلي 1). بينما لم يكن بالإمكان قياس العدد الدقيق للميكروكرات الملتصقة، أظهرت قياسات الشدة المتوسطة تأثير الطلاءات. بالإضافة إلى ذلك، بدا أن Tween20 يمنع تجمع الكرات الدقيقة داخل القسطرة، مما أدى إلى تدفق عدد أكبر بصريا من الكرات الميكروكروية المفردة عبر القسطرة، رغم أن هذا غير محدد. يقلل هذا من خطر انسداد الأوعية الدموية الكبيرة وإمكانية تكوين مناطق إقفاري ونقص أكسجة كبيرة، وهو أمر غير مرغوب فيه نظرا لهدف نمذجة الانصمام الميكروأوعي. علاوة على ذلك، أظهرت الفئران فقدانا أقل للوزن وتعافت إلى أوزان ما قبل الجراحة بشكل أسرع عند حقنها بخليط ميكروسفير يحتوي على تركيزات منخفضة من Tween20. Tween20 هو مادة مشتتة شائعة الاستخدام 45,46,47، لذلك لا يتوقع أن تسبب التركيزات المنخفضة المستخدمة في هذه الدراسة أي سمية أو آثار سلبية على سلامة BBB. بالإضافة إلى ذلك، تظهر بياناتنا أن تسرب BBB يحدث فقط بالقرب من (أو بعد مرور) الميكروكرة وليس بشكل منهجي، دون أن يسبب زيادة كبيرة في إجمالي تغطية الكريات البيضاء (انظر الملف التكميلي 2)، مما يدعم استخدام نسبة 0.1٪ من التوين 20. بشكل عام، تساهم إضافة Tween20 في تقليل تكتل الكرات المجهرية وزيادة في توصيل الميكروكرات إلى الدورة الدموية الدماغية، كما يؤكد ذلك من خلال عد الميكروسفير في شرائح الدماغ، وينتج عنه عدد كاف من الكرات المجهرية المرئية لتصوير المجهرتين الفوتونية. على الرغم من أن استخدام Tween20 يزيد من عدد الكرات المجهرية المغروسة في الدماغ، إلا أن تباين حقن الميكروسفير لا يزال قائما. قد تسهم عدة عوامل في هذا التغير. أولا، يمكن أن يتسبب تكوين الجلطات داخل القسطرة أو الأوعية الدموية في التصاق الكرات الدقيقة بالجلطة. ثانيا، قد يتداخل وجود فقاعات الهواء مع التوصيل السلس. أخيرا، يمكن أن يؤدي الاستعادة غير الكاملة لتدفق الدم في CCA أو ICA إلى تغيير ديناميكا الدم، مما قد يعزز التصاق الميكروسفير بجدار الأوعية الدموية أو التجمع داخل التجويف. للأسف، لا يمكن اكتشاف هذه الانحرافات أثناء إجراء الحقن.

كرات البوليستيرين الميكروسفيرية أكثر كثافة من الماء، مما يؤدي إلى توزيع غير متساو بمجرد تحميل خليط الميكروسفير في القسطرة. تستقر معظم الكرات الميكروكفرية بالقرب من جدار القسطرة، حيث يبطئ احتكاك السائل حركتها مقارنة بالتدفق المركزي الأسرع. ينتج عن ذلك في النهاية تراكم الكرات المجهرية داخل ال 20 ميكرولتر النهائي من القسطرة. يجب تجنب حقن هذا الجزء المركز، لأنه قد يسبب انصمام كبير وأحداث إقفارية. لمنع ذلك، يجب تحضير حجم خليط الميكروسفير بضعف حجم الحقن المقصود.

تتطلب جراحة الانصمام الوعائي الدقيق تدريبا ودقة كبيرة. واحدة من أكثر الخطوات تحديا تقنيا تتضمن وضع خياطة حول PPA وOA والفروع الجانبية من ICA لضمان توصيل خليط الميكروسفير بدقة إلى دائرة ويليس ومنطقة MCA. تعقد هذه الخطوة بسبب قرب العصب المبهم بالقرب من CCA، وصغر قطر الأوعية الدموية، ومساحة العمليات المحدودة، مما يصعب وضع الغرز دون التسبب في تلف الأعصاب أو إصابة الأوعية الدموية.

بينما قد يعتبر مشبك الوعاء بديلا لربط PPA مؤقتا باستخدام خياطة، فإنه يدخل مخاطر إضافية. يمكن أن تنفصل المشابك عن غير قصد، مما يؤدي إلى إعادة فتح الوعاء. علاوة على ذلك، فإن استخدام مشبك ثان عند PPA بجانب المشبك الموجود في ICA يزيد من احتمال انفصال مقطع ICA بسبب المساحة المحدودة. إذا حدث ذلك، فسيسبب نزيفا كبيرا، وبدون تدخل فوري قد يؤدي إلى إنهاء التجربة مبكرا. لذلك، لا ينصح بإغلاق PPA باستخدام مشبك الوعاء.

يستخدم البروتوكول الحالي قسطرة بدلا من حقنة33 لحقن الميكروسفير. يوفر هذا النهج تحكما أفضل في سرعة الحقن وحجمه، كما يتيح حقن الكرات الدقيقة في أماكن أبعد (مثلا، داخل طريقة تصوير مثل المجهر أو ماسح الرنين المغناطيسي).

اختيار ECA بدلا من CCA كنقطة دخول يمكن CCA من البقاء مفتوحا بالكامل أثناء إجراء الحقن، مما يساعد في الحفاظ على تدفق التروية الدماغية الفسيولوجي طوال العملية الجراحية. بالإضافة إلى ذلك، فإن حقن الكرات الدقيقة عبر ECA بدلا من CCA له مزايا أخرى48: 1) تقليل وقت التشغيل الكلي أثناء إعادة التروية؛ 2) تقليل خطر النزيف أثناء الحقن وبعد إتمام الجراحة؛ 3) باستخدام طريقة دخول CCA، يتكون تضيق وجلطة غير مستقرة في CCA بعد إزالة الإبرة49. هذا سيسبب اضطرابا في تدفق الدم، بالإضافة إلى خطر تكوين الجلثات الدقيقة التي قد تصل إلى الدماغ. بالإضافة إلى ذلك، فإن الدخول عبر CCA ينطوي على خطر كبير في إغلاق CCA بشكل دائم، مما قد يؤدي إلى إعادة تروية دماغية غير مثالية خلال فترة البقاء بعد الجراحة، ويتفاقم بسبب التفاوت الكبير في دائرة ويليس في الفئران50,51

على الرغم من أنه محسن بالكامل، إلا أن البروتوكول يعاني من بعض القيود. أولا، تشير الملاحظة بأن الميكروكرات تتحرك ببطء أكبر على طول جدران القسطرة ولا تكون موزعة بشكل متساو أثناء الحقن إلى أن عددا أقل من الميكروكرات يتم تسليمها إلى ICA مما كان متوقعا. على الرغم من استخدام Tween-20 لتقليل الالتصاق، إلا أن بعض الكرات الدقيقة لا تزال تلتصق بأطراف الماصة، وأنبوب إيبندورف، والقسطرة. وبالتالي، من المرجح أن يكون العدد الفعلي للميكروكرات المحقونة أقل من العدد المحسوب 7.2 ×10 4 جسيمات لكل فأر. ومع ذلك، تصل كمية كافية من الميكروكرات إلى الدورة الدموية الدماغية للسماح بالتصوير عبر مجهر ثنائي الفوتون. بروتوكول الحقن وتركيبة الخليط محسنة لميكروكرات البوليسترين بحجم 10 ميكرومتر. إذا تم تعديل المواد المستخدمة (الأطراف، الأنابيب، القسطرة) أو حجم الكرات المجهرية، يجب إعادة تقييم كل من المحلول وإجراء الحقن وفقا لذلك. ثانيا، أظهرت الدراسات التي تحقق أفضل طريقة لانسداد الأوعية الدموية الكبيرة عبر الانسداد داخل الضوئي لعضلة MCA أن دخول الجهاز الوعائي عبر الربط الدائم لل ECA يؤدي إلى نقص التروية في عضلات المضغ والبلع52. وقد يؤدي ذلك إلى انخفاض تناول الفئران للطعام، وبالتالي فقدان الوزن المفرط، وضعف الوظائف الحركية، وزيادة العجز العصبي. ومع ذلك، تم تناقض هذا التصريح من قبل آخرين48. في هذه الدراسة، أظهر مراقبة الوزن انخفاضا متوقعا بعد الجراحة ولكن تعافي سريع إلى أوزان ما قبل الجراحة خلال عدة أيام، مما يشير إلى أن الفئران تتعافى وتأكل وتشرب بشكل طبيعي بعد ربط ECA الدائم. على الرغم من مراقبة وزن، إلا أن هذا مجرد مؤشر غير مباشر على رفاهية ولا يستبعد تماما الإعاقات الوظيفية مثل العجز العضلي أو الحركي الموضعي. لم تجرى تقييمات مباشرة على التعافي الوظيفي، وهو ما يمثل قيدا في هذه الدراسة. قارنت دراسة أخرى دخول الجهاز الوعائي عبر CCA أو ECA وأظهرت أن الدخول عبر CCA يمكن أن يؤدي إلى ضعف إعادة تروية الدورة الدموية الدماغية، وخلصت إلى أن طريقة الدخول ECA هي المفضلة53. ثالثا، وضع القسطرة بشكل صحيح وآمن دون إدخال فقاعات هواء أو جلطات دموية أو تسرب أو تسرب، ودون عرقلة تدفق القسطرة في CCA وICA يتطلب ممارسة كبيرة. وأخيرا، وعلى عكس طرق الانسداد الدقيق الأخرى مثل الجلثات الضوئية باستخدام حقن روز-بنغال22، لا يمكن التنبؤ بمكان استقرار الكرات الدقيقة في الدورة الدموية في النهاية.

الدراسة الحالية لا تشمل عمدا مجموعات الضابط السلبية (الزائفة) أو الإيجابية (الجلطة الضوئية)، لأنها لن توفر قيمة إضافية للهدف الأساسي. يتحدد نجاح هذا النموذج بعدد الكرات المجهرية الموجودة داخل الدورة الدموية الدماغية الدقيقة، خصوصا في منطقة نافذة الجمجمة، لتمكين المجهر الحي عالي الدقة. الإجراء الوهمي سيكون، بحكم التعريف، لا ينتج عن ميكروكرات في المنطقة المستهدفة، وبالتالي لا يقدم مقارنة ذات صلة لنقطة التصوير الحية النهائية. وبالمثل، فإن إدراج نموذج تخثرات ضوئية سيعالج آلية مرضية مختلفة جوهريا، وبالتالي فهو خارج نطاق هذا العمل الذي يركز على توصيف نموذج الانصمام الوعائي الدقيق بدلا من مقارنة المنهجيات. لم تتبع تحليلات نسيجية أوسع للانصنامات وتأثيرها المحتمل على نسيج BBB أو الأنسجة العصبية المحلية، حيث صممت الدراسة لإعطاء الأولوية للتصور ثلاثي الأبعاد في الجسم الحي على التحقق من مستوى الأنسجة.

يدعم البروتوكول الجراحي المفصل لكل من تحضير نافذة الجمجمة ونموذج الانصمام الوعائي الدقيق تحقيقا موثوقا وقابلا للتكرار في التغيرات الميكروأوعية الدموية المرتبطة بالانسداد الوعائي الدقيق وحدوث احتشاءات دماغية صامتة في جميع أنحاء نصف الكرة النفسي المقابل. التحضير الأمثل وحقنه لخليط الميكروسفير يعزز أكثر اتساق وصحة هذا النهج التجريبي.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعلن المؤلفون عدم وجود تضارب مصالح.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يرغب المؤلفون في التعبير عن امتنانهم الصادق للدكتور إيوان دوبي لتطويره برنامج Articulus ، الذي استخدم في إعادة بناء الصور ثلاثية الأبعاد في الموقع. نشكر أيضا البروفيسور الدكتور نيكولاوس بليسنيلا على تكرمه بتوفير فئران TIE2-GFP (مختبر جاكسون، المخزون رقم 003658) المستخدمة في التربية الداخلية.

تم تمويل هذه الدراسة من قبل مركز أمستردام للعلوم العصبية (813294 إلى I.M.)، وأمستردام لعلوم القلب والأوعية الدموية (الاتصال بالمعدات 2021 و2023 إلى I.M.) ومؤسسة القلب الهولندية (03-006-2021-T019 إلى I.M.).

يتم تمويل هذا البحث أيضا من قبل مؤسسة القلب الهولندية ومؤسسة الدماغ الهولندية، ويجرى بالتعاون مع ودعم التحالف الهولندي للقلب والأوعية الدموية، 01-002-2022-0126 CONTRAST 2.0. بالإضافة إلى ذلك، تم تمويل هذا العمل جزئيا من خلال تمويل غير مقيد من قبل سترايكر، ميدترونيك وبينومبرا. لم تكن مصادر التمويل مشاركة في تصميم الدراسات، أو المراقبة، أو جمع البيانات، أو التحليلات الإحصائية، أو تفسير النتائج، أو كتابة المخطوطات.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
إبرة قياس 27 (0.1x16 مم)تيرومو-إبرة قياس 27 (الخطوة 2.1.2.)
برنامج أرتيكولوس--برنامج التحليل ثلاثي الأبعاد (الخطوة 4.2.2 و4.3.3)
بيتادين 30 مل (100 ملغ/مل)ميلان8712207037612بيتادين/اليود (الخطوة 1.1.8. & 2.2.10.)
C& مونومر Bصن ميديكال7111مكون الغراء الفائق (الخطوة 1.3.1.)
شفرات جراحة من الفولاذ الكربوني (رقم 15)سوان-مورتون205شفرة لخدش الجمجمة (الخطوة 1.2.4.)
كاربروفين (50 ملغ/مل)زويتيس-أدوية تخفيف الألم (الخطوات 1.1، 1.6، 2.2 و2.8)
المحفزصن ميديكال7110مكون الغراء الفائق (الخطوة 1.3.1.)
القسطرة (ID 0,31 OD 0.64 مم)فرويدنبرغ228-0661قسطرة شفافة (الخطوة 2.1.1.)
خطاف النسيج المصنوع من كوستوم--خطاف النسيج (الخطوة 2.3.4.)
رؤوس قطنية--رأس القطن (الخطوة 1.1.8، 1.2.4 و 1.5.1.)
زجاج الغطاءأدوات وارنر64-0724زجاج غطاء النوافذ الجمجفي (الخطوة 1.4.2.)
عارضة رأس فأرة مصممة خصيصا--عارضة رأس لحامل التصوير الداخلي (الخطوة 1.3.2). 
حامل تصوير الفأرة المخصص  --حامل الفأرة التصويري (الخطوة 1.4.1. و 3.1.1.)
إطار ستيريوتاكتيكي مخصص--إطار الستيريوتاكتيك (الخطوة 1.1.7.)
سائل كامنت الأسنانكولزر64707937مكون من الأسمنت السني (الخطوة 1.3.3.)
مسحوق السمنت السنيكولزر64707945مكون من الأسمنت السني (الخطوة 1.3.3.)
مثقاب الأسنان  سايشين  L-206التدريب: الخطوة 1.4.3.)
ديكساميثازون (4 ملغ/مل)سنترافارم-الدواء قبل العملية (الخطوة 1.1.4.)
تشريح الملقطبراون-أسكولابBD023Rالملقط (الخطوة 1.2.2. & 2.3.2.)
رأس الحفر PK/100.5 (0.5 مم)العلوم الدقيقة19007-05رأس الحفر (الخطوة 1.4.3.)
دوراتيارس (3.5 جم)ألكون-مرهم العين (الخطوة 1.1.8. & 2.2.7.)
غراء الإيبوكسي (1 جرام)باتكس9H PSMG3Xغراء الإيبوكسي (الخطوة 1.5.2. & 2.1.1.)
ملقط دقيق دقيق مستقيمأدوات العلوم الدقيقةدومونت #5ملقط دقيق دقيق (الخطوة 2.6.6.)
FITC-ديكسترن (70 كيلو ديار)سيغما-ألدرتشFD70Sحل FITC-Dextran (الخطوة 2.5.2.)
إيزوفلوران (1000 ملغ/غ)مختبرات كاريزو S.A.118938التخدير (الخطوة 1.1.6. & 2.2.5.)
تصوير فلوري ثلاثي الأبعاد كبير للتصوير الفلوري Cryomicrotome&nb;صنع حسب الطلب-خيالات ثلاثية الأبعاد كبيرة (الخطوة 4.3.3)
ليدوكائين (100 ملغ/مل)آسبن-مخدر موضعي (الخطوة 1.2.3. و2.2.10)
مقص صغير فاناس 3-3/8 بوصةبراون-أسكولابOC498Rالمقص الصغير (الخطوة 2.6.2)
ملقط ربط الغرز الدقيق بمقبض دائريبراون-أسكولابFD280Rميكروفورسيبس (الخطوة 2.3.3.)
ملقط ربط الغرز الصغير مع مقبض دائري مثنيبراون-أسكولابFD281Rالميكروفورسيبس المنحني (الخطوة 1.5.1. & 2.3.3.)
مقطع الأوعية الدموية الدقيقةبراون-أسكولابFD562Rمشبك الوعاء (الخطوة 2.6.1.)
القسطرة الدقيقة (التعريف 0.23114 مم OD 0.27432 مم)ميكرولومينالقسطرة الدقيقة (الخطوة 2.1.1.)
وسادة تسخين الفأر ومسبار المستقيمستولتينغ53800Rوسادة التدفئة (الخطوة 1.1.2. و 2.2.2.)
فئران NG2-DsRedمختبر جاكسون، بار هاربور، الولايات المتحدة الأمريكية، رقم المخزون 008241
بولي إيثيلين غليكول سوربيتان مونولاوراتسيغما-ألدرتش9005-64-5Tween20 (الخطوة 2.5.2.)
فلور كرات البوليسترين الأزرق (365/415)إنفيتروجينF8829الميكروكرات الزرقاء (الخطوة 2.5.1.)
بوليسترين فلور سفيرز الأحمر (580/605)إنفيتروجينF8834الميكروسفير الأحمر (الخطوة 2.5.1.)
قفص التعافي--قفص التعافي (الخطوات 1.6.2. & 2.8.2.)
إبرة منحنية بحجم 3/8 (12 مم) مع خياطة عكسيةبراون0762067الخياطة (الخطوة 2.7.5)
روبيفاكا ويومل؛ NE (2 ملغ/مل)--الأدوية   (الخطوة 1.1.5.)
تصوير فلوري ثلاثي الأبعاد صغير للتصوير الفلوري Cryomicrotome&nb;  صنع حسب الطلبقصص ثلاثية الأبعاد صغيرة (الخطوة 4.2.2)
إسبونغوستانإثيكونMS0005سبونغوستان (الخطوة 1.4.6.)
المجهر الجراحييوروميكس ميكروسكوبن بي.في.نيوزيلندا.1903-بالمجهر للجراحة (الخطوة 1.2. 2.1.1.)
المقص الجراحيبراون-أسكولابBC303Rالمقص الجراحي (الخطوة 1.2.2. و 2.3.2.)
مضخة الحقنة (لحقن بسعة 1 مل)جهاز هافارد70-2208مضخة حقنة سعة 1 مل (الخطوة 2.5.6).
Thread، 100m،   4/0 1.5   براونF11340354/0.15 خيوط (الخطوة 2.4.3.)
فئران TIE2-GFPمختبر جاكسون، بار هاربور، الولايات المتحدة الأمريكية، رقم المخزون 003658
الغبار فائق النقيثورلابزCA6-EUالهواء المضغوط (الخطوة 1.2.5.)
يونيفرسال بوليمر كليرصن ميديكالT058Eمكون الغراء الفائق (الخطوة 1.3.1.)

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Hilkens, N. A., Casolla, B., Leung, T. W., de Leeuw, F. E. Stroke. Lancet. 403 (10446), 2820-2836 (2024).
  2. Bernick, C., et al. Silent MRI infarcts and the risk of future stroke: the cardiovascular health study. Neurology. 57 (7), 1222-1229 (2001).
  3. Saini, M., et al. Silent stroke: not listened to rather than silent. Stroke. 43 (11), 3102-3104 (2012).
  4. Smith, E. E., Schneider, J. A., Wardlaw, J. M., Greenberg, S. M. Cerebral microinfarcts: the invisible lesions. Lancet Neurol. 11 (3), 272-282 (2012).
  5. Adachi, T., Kobayashi, S., Yamaguchi, S. Frequency and pathogenesis of silent subcortical brain infarction in acute first-ever ischemic stroke. Intern Med. 41 (2), 103-108 (2002).
  6. Bokura, H., et al. Silent brain infarction and subcortical white matter lesions increase the risk of stroke and mortality: a prospective cohort study. J Stroke Cerebrovasc Dis. 15 (2), 57-63 (2006).
  7. Vermeer, S. E., et al. Silent brain infarcts and the risk of dementia and cognitive decline. N Engl J Med. 348 (13), 1215-1222 (2003).
  8. Gupta, A., et al. Silent brain infarction and risk of future stroke: a systematic review and meta-analysis. Stroke. 47 (3), 719-725 (2016).
  9. Georgakopoulou, T., van der Wijk, A. E., Bakker, E., van Bavel, E. Quantitative 3D analysis of tissue damage in a rat model of microembolization. J Biomech. 128, 110723(2021).
  10. Martinez Bravo, G., et al. Platelets in thrombosis and atherosclerosis: a double-edged sword. Am J Pathol. 194 (9), 1608-1621 (2024).
  11. Kell, D. B., Lip, G. Y. H., Pretorius, E. Fibrinaloid microclots and atrial fibrillation. Biomedicines. 12 (4), 494(2024).
  12. Hubbard, W. B., Dong, J. F., Cruz, M. A., Rumbaut, R. E. Links between thrombosis and inflammation in traumatic brain injury. Thromb Res. 198, 62-71 (2021).
  13. Dupré, N., Drieu, A., Joutel, A. Pathophysiology of cerebral small vessel disease: a journey through recent discoveries. J Clin Invest. 134 (10), e176987(2024).
  14. Idicula, T. T., Naess, H., Thomassen, L. Microemboli-monitoring during the acute phase of ischemic stroke: is it worth the time. BMC Neurol. 10, 79(2010).
  15. Bai, C. L., et al. A review on micro- and nanoplastics in humans: implication for their translocation of barriers and potential health effects. Chemosphere. 361, 142424(2024).
  16. Guan, Q., et al. The landscape of micron-scale particles including microplastics in human enclosed body fluids. J Hazard Mater. 442, 130138(2023).
  17. Alves, H. C., et al. Thrombus migration paradox in patients with acute ischemic stroke. Stroke. 50 (11), 3156-3163 (2019).
  18. Ragusa, A., et al. Plasticenta: first evidence of microplastics in human placenta. Environ Int. 146, 106274(2021).
  19. Rotchell, J. M., et al. Microplastics in human urine: characterisation using µFTIR and sampling challenges using healthy donors and endometriosis participants. Ecotoxicol Environ Saf. 274, 116208(2024).
  20. Marfella, R., et al. Microplastics and nanoplastics in atheromas and cardiovascular events. N Engl J Med. 390 (10), 900-910 (2024).
  21. Knezic, A., Broughton, B. R. S., Widdop, R. E., McCarthy, C. A. Optimising the photothrombotic model of stroke in the C57Bl/6 and FVB/N strains of mouse. Sci Rep. 12 (1), 7598(2022).
  22. Talley Watts, L., Zheng, W., Garling, R. J., Frohlich, V. C., Lechleiter, J. D. Rose bengal photothrombosis by confocal optical imaging in vivo: a model of single vessel stroke. J Vis Exp. (100), e52794(2015).
  23. Dietrich, W. D., Watson, B. D., Busto, R., Ginsberg, M. D., Bethea, J. R. Photochemically induced cerebral infarction. I. Early microvascular alterations. Acta Neuropathol. 72 (4), 315-325 (1987).
  24. Demura, N., Mizukawa, K., Ogawa, N., Yamashita, K., Kanazawa, I. A cerebral ischemia model produced by injection of microspheres via the external carotid artery in freely moving rats. Neurosci Res. 17 (1), 23-30 (1993).
  25. Takeo, S., et al. Sustained damage to energy metabolism of brain regions after microsphere embolism in rats. Stroke. 23 (1), 62-68 (1992).
  26. Georgakopoulou, T., van der Wijk, A. E., Bakker, E. N. T. P., van Bavel, E. Recovery of hypoxic regions in a rat model of microembolism. J Stroke Cerebrovasc Dis. 30 (6), 105739(2021).
  27. Georgakopoulou, T., van der Wijk, A. E., van Bavel, E., Bakker, E. Perivascular clearance of blood proteins after blood-brain barrier disruption in a rat model of microinfarcts. Microvasc Res. 148, 104515(2023).
  28. Mayzel-Oreg, O., et al. Microsphere-induced embolic stroke: an MRI study. Magn Reson Med. 51 (6), 1232-1238 (2004).
  29. Silasi, G., She, J., Boyd, J. D., Xue, S., Murphy, T. H. A mouse model of small-vessel disease that produces brain-wide-identified microocclusions and regionally selective neuronal injury. J Cereb Blood Flow Metab. 35 (5), 734-738 (2015).
  30. Shen, Y., et al. Histochemistry of microinfarcts in the mouse brain after injection of fluorescent microspheres into the common carotid artery. Neural Regen Res. 17 (4), 832-837 (2022).
  31. Inoue, K., Asaka, M., Lee, S., Ishikawa, K., Yanagihara, D. Gait disorders induced by photothrombotic cerebellar stroke in mice. Sci Rep. 13 (1), 15805(2023).
  32. Nowak, B., et al. Animal models of focal ischemic stroke: brain size matters. Front Stroke. 2, 15(2023).
  33. van der Wijk, A. E., et al. Microembolus clearance through angiophagy is an auxiliary mechanism preserving tissue perfusion in the rat brain. Acta Neuropathol Commun. 8 (1), 195(2020).
  34. van der Wijk, A. E., et al. Extravasation of biodegradable microspheres in the rat brain. Drug Deliv. 30 (1), 2194579(2023).
  35. van der Wijk, A. E., et al. Extravasation of microspheres in a rat model of silent brain infarcts. Stroke. 50 (6), 1590-1594 (2019).
  36. Rapp, J. H., et al. Cerebral ischemia and infarction from atheroemboli <100 µm in size. Stroke. 34 (8), 1976-1980 (2003).
  37. Lam, C. K., Yoo, T., Hiner, B., Liu, Z., Grutzendler, J. Embolus extravasation is an alternative mechanism for cerebral microvascular recanalization. Nature. 465 (7297), 478-482 (2010).
  38. Grutzendler, J., et al. Angiophagy prevents early embolus washout but recanalizes microvessels through embolus extravasation. Sci Transl Med. 6 (226), 226ra31(2014).
  39. Spaan, J. A. E., et al. Visualisation of intramural coronary vasculature by an imaging cryomicrotome suggests compartmentalisation of myocardial perfusion areas. Med Biol Eng Comput. 43 (4), 431-435 (2005).
  40. Juch, R. N. S., et al. Home-use hyaluronic acid jet injectors: unreliable and unsafe. Dermatol Surg. 50 (1), 62-68 (2024).
  41. Dobbe, J. G. G., Roo, M. G. A. D., Visschers, J. C., Strackee, S. D., Streekstra, G. J. Evaluation of a quantitative method for carpal motion analysis using clinical 3-D and 4-D CT protocols. IEEE Trans Med Imaging. 38 (4), 1048-1057 (2019).
  42. Demkes, E., et al. Human cardiac microtissues display improved engraftment and survival in a porcine model of myocardial infarction. J Cardiovasc Transl Res. 18 (3), 512-528 (2025).
  43. Lei, H. Y., Lee, S. H., Leir, S. H. Antigen-induced anaphylactic death in mice. Int Arch Allergy Immunol. 109 (4), 407-412 (1996).
  44. Wiedmeier, S. E., Chung, H. T., Cho, B. H., Kim, U. H., Daynes, R. A. Murine responses to immunization with pertussis toxin and bovine serum albumin: I. Mortality observed after bovine albumin challenge is due to an anaphylactic reaction. Pediatr Res. 22 (3), 262-267 (1987).
  45. Weiszhár, Z., et al. Complement activation by polyethoxylated pharmaceutical surfactants: Cremophor-EL, Tween-80 and Tween-20. Eur J Pharm Sci. 45 (4), 492-498 (2012).
  46. Castro, C. A., Hogan, J. B., Benson, K. A., Shehata, C. W., Landauer, M. R. Behavioral effects of vehicles: DMSO, ethanol, Tween-20, Tween-80, and Emulphor-620. Pharmacol Biochem Behav. 50 (4), 521-526 (1995).
  47. Kelava, T., Ćavar, I., Čulo, F. Influence of small doses of various drug vehicles on acetaminophen-induced liver injury. Can J Physiol Pharmacol. 88 (10), 960-967 (2010).
  48. Hu, Y., et al. CCA repair or ECA ligation-which middle cerebral artery occlusion is better in the reperfusion mouse model. iBrain. 9 (3), 258-269 (2023).
  49. Dittmar, M. S., et al. The role of ECA transection in the development of masticatory lesions in the MCAO filament model. Exp Neurol. 195 (2), 372-378 (2005).
  50. Zhao, L., Mulligan, M. K., Nowak, T. S. Substrain- and sex-dependent differences in stroke vulnerability in C57BL/6 mice. J Cereb Blood Flow Metab. 39 (3), 426-438 (2019).
  51. Bonnin, P., Mazighi, M., Charriaut-Marlangue, C., Kubis, N. Early collateral recruitment after stroke in infants and adults. Stroke. 50 (9), 2604-2611 (2019).
  52. Dittmar, M., Spruss, T., Schuierer, G., Horn, M. External carotid artery territory ischemia impairs outcome in the endovascular filament model of middle cerebral artery occlusion in rats. Stroke. 34 (9), 2252-2257 (2003).
  53. Smith, H. K., Russell, J. M., Granger, D. N., Gavins, F. N. Critical differences between two classical surgical approaches for middle cerebral artery occlusion-induced stroke in mice. J Neurosci Methods. 249, 99-105 (2015).

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

FITC Dextran

مقالات ذات صلة