يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

في الجسم الحي تسجيل مشبك التصحيح للخلية الكاملة للخلايا العصبية الببتيدرجي تحت المهاد في يرقات الزرد

780 مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/68943

⸱

أغسطس 22, 2025

 ,  ,  , 
1School of Life Sciences, Shanghai University, 2Division of Biology and Biological Engineering, California Institute of Technology

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

تقدم هذه المقالة بروتوكولا للتسجيل في الجسم الحي للنشاط الكهربائي للخلايا العصبية الببتيدرجية تحت المهاد باستخدام الفيزيولوجيا الكهربية لمشبك الرقعة للخلية الكاملة في يرقات الزرد السليمة.

الملخص

منطقة ما تحت المهاد هي منطقة دماغية قديمة تنظم جوانب متنوعة من علم وظائف الأعضاء والسلوك ، بما في ذلك النوم واليقظة والشهية وتوازن الطاقة والقلق والاكتئاب والتفاعل الاجتماعي. تمارس مجموعات الخلايا العصبية المحددة في منطقة ما تحت المهاد آثارها عن طريق الإفراج عن الناقلات العصبية والببتيدات العصبية. يعد تسجيل مشبك التصحيح للخلية بأكملها نهجا لا غنى عنه لدراسة أدوار هذه العوامل في الانتقال المشبكي ووظيفة الدماغ. ومع ذلك ، من الصعب الوصول إلى الخلايا العصبية تحت المهاد للتسجيلات الفيزيولوجية الكهربية في الثدييات السليمة نظرا لموقعها في أعماق الدماغ. نتيجة لذلك ، فإن فهمنا للخصائص الجوهرية والوظائف الفسيولوجية للخلايا العصبية تحت المهاد محدود. يعتبر سمك الزرد اليرقي نموذجا بديلا مفيدا لدراسة الخلايا العصبية تحت المهاد نظرا لدماغها الفقاري الشفاف والصغير ، ولكن المحفوظ جيدا. هنا ، نقدم بروتوكولا لتسجيلات مشبك التصحيح للخلية الكاملة في الجسم الحي للخلايا العصبية تحت المهاد في يرقات الزرد السليمة. باستخدام هذه التقنية ، يمكننا التسجيل من الخلايا العصبية الببتيدرجيكية في منطقة ما تحت المهاد ، وفحص استجابات هذه الخلايا العصبية للمنبهات الحسية ، واستكشاف تأثيراتها على الخلايا العصبية النهائية. وبالتالي ، توفر هذه التقنية التجريبية نهجا مفيدا لدراسة الوظائف الفسيولوجية للخلايا العصبية العصبية تحت المهاد في السليمة.

المقدمة

كنموذج حيواني شائع للفقاريات ، تستخدم أسماك الزرد (Danio rerio) على نطاق واسع في أبحاث علم الأعصاب ولها العديد من المزايا1. يتم الحفاظ على مجموعتها من الجينات وبنية الدماغ بشكل كبير مع الثدييات ، ولديها ذخيرة سلوكية غنية ، مما يجعلها مفيدة لدراسة الآليات الجينية والعصبية التي تكمن وراء السلوكيات مثل النوم والقلق والاكتئاب والتفاعل الاجتماعي2،3،4،5،6. حجمها الصغير وتكاليف الصيانة المنخفضة تجعلها مثالية للفحص عالي الإنتاجية للجينات أو الأدوية التي تهدف إلى علاج الأمراض العصبية والنفسية7،8. أخيرا ، فإن الشفافية البصرية لسمك الزرد اليرقي ، جنبا إلى جنب مع تقنيات المجهر الورقي الضوئي المتقدمة ، وتوافر العديد من مراسلي الفلورسنت ، تجعلها مناسبة بشكل خاص لمراقبة النشاط العصبي والنجمي بدقة خلوية عبر الدماغبأكمله 9،10،11.

يتم حفظ منطقة ما تحت المهاد لسمك الزرد ، الموجود في أعماق الدماغ البطني ، تشريحيا وجزيئيا مع منطقة ما تحت المهاد للثدييات ، ولكنه أصغر بمقدار 2-3 أوامر من حيث الحجم ، مما يوفر نظاما أبسط لدراسة وظيفة منطقة ما تحتالمهاد 12. تشكل الخلايا العصبية تحت المهاد روابط متشابكة واسعة النطاق مع مناطق متعددة من الدماغ ، بما في ذلك المهاد وجذع الدماغ والغدة النخامية والدماغ ، والتي من خلالها تنظم التوازن الفسيولوجي ، وإشارات الغدد الصم العصبية ، والسلوكيات اللاإرادية13،14. يعتمد هذا التعديل للسلوك وعلم وظائف الأعضاء إلى حد كبير على الببتيدات العصبية ، وهي أحماض أمينية قصيرة السلسلة تعمل عن طريق الارتباط بالمستقبلات المقترنة ببروتين G (GPCRs)15. على عكس إطلاق الناقل العصبي للأحماض الأمينية سريع المفعول في المشبك ، قد تنتشر الببتيدات العصبية على مسافات أطول عن طريق نقل الحجم ، وتتوسط في التأثيرات المعدلة البطيئة على الانتقال المشبكي واستثارة الخلايا العصبية16.

كشفت الدراسات الحديثة التي أجريت على أسماك الزرد عن وظائف متنوعة للببتيدات العصبية تحت المهاد من خلال مناهج متعددة التخصصات مثل تصوير الكالسيوم في الدماغ بالكامل ، وتسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية ، والتحليل السلوكي عالي الإنتاجية ، ورسم خرائط الدوائر العصبية4،12،17،18. لقد غيرت هذه التقنيات الناشئة قدرتنا على توصيف التنوع الخلوي على نطاق واسع ، وربط الآليات الجزيئية بوظائف الببتيد العصبي على مستوى الدائرة ، ورسم خريطة للدوائر العصبية التي تكمن وراء سلوكيات محددة19،20. ومع ذلك ، تظل هذه الأساليب محدودة في قدرتها على حل الديناميكيات الفسيولوجية السريعة والآليات المشبكية الدقيقة التي تكمن وراء وظيفة الببتيد العصبي.

تظل تقنية المشبك الرقعة ، التي طورها Neher و Sakmann ، هي المعيار الذهبي للتحقيق في فسيولوجيا الخلايا العصبية نظرا لدقتها الزمنية التي لا مثيل لها ودقتها الفيزيائية الحيوية ، مما يتيح القياس المباشر لتقلبات إمكانات الغشاء ، والتيارات المشبكية ، وديناميكيات القناة الأيونية21،22. هذه التقنية لا تقدر بثمن بشكل خاص لدراسة الخلايا العصبية ، التي تتطلب أنماط الانفجار المميزة وتأثيراتها المعدلة العصبية قياسا فيزيولوجيا كهربيا مباشرا لفهم أدوارها في السلوك والتوازنبشكل كامل 15،16،23.

هنا ، قمنا بتطوير بروتوكول محسن يتيح تسجيلات موثوقة لخلية كاملة من الخلايا العصبية الببتيدرجي تحت المهاد ، على الرغم من التحديات التقنية التي يفرضها الموقع التشريحي العميق لهذه الخلايا العصبية. توفر هذه المنهجية وصولا مباشرا إلى النشاط الكهربائي لهذه الخلايا ، مما يسمح بإجراء تحقيق مفصل في استجاباتها للتحفيز البصري والسمعي (الشكل 1). من خلال دمج الفيزيولوجيا الكهربية للمشبك مع علم البصريات الوراثي ، يمكننا توصيف الاتصال الوظيفي بدقة بين دوائر ما تحت المهاد والخلايا العصبية النهائية (الشكل 2 والشكل 3) ، مما يسهل دراسة الببتيدات العصبية في التوازن الفسيولوجي والتحكم السلوكي. يسد هذا النهج فجوة حرجة في أبحاث علم الأعصاب ، مما يسمح بالاستكشاف الميكانيكي لوظيفة الخلايا العصبية تحت المهاد على المستويات الفيزيائية الحيوية والخلوية والدوائر في وقت واحد.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

تمت الموافقة على جميع التجارب من قبل لجنة الرعاية المؤسسية والاستخدام (IACUC) في جامعة شنغهاي (بروتوكول YS 2025-169) و IACUC في معهد كاليفورنيا للتكنولوجيا (بروتوكول 1836). تم تغذية أسماك الزرد بعد 5 إلى 7 أيام من الإخصاب (dpf) بالروتيفر واستخدامها في التجارب. في هذه المرحلة من التطور ، لا يتم تحديد الجنس. تم استخدام أسماك الزرد البالغة على الصدف [mitfa (w2 / w2)]خلفية 24 للتكاثر.

1. الحلول والوصفات

  1. تحضير وسط E3 يحتوي على 5 ملي كلوريد الصوديوم ، و 0.17 ملي كلوريد كلوريد ، و 0.33 ملي كالسيلون2 ، و 0.33 ملي مولار MgSO4. اضبط المحلول بواسطة هيدروكسيد الصوديوم على الرقم الهيدروجيني 7.2. يحفظ في درجة حرارة الغرفة للاستخدام في غضون 1 شهر.
  2. تحضير المحلول خارج الخلية الذي يحتوي على 134 ملي كلوريد الصوديوم ، و 2.9 ملي كلوريد كلوريد ، و 2.1 ملي كلورالملكسيوم 2 ، و 1.2 ملي ملي كلوريد2 ، و 10 ملي مولار HEPES ، و 10 ملي جلوكوز. الأسمولية للمحلول خارج الخلية هي ~ 290 مللي أوسمول L-1. اضبط المحلول بواسطة هيدروكسيد الصوديوم على الرقم الهيدروجيني 7.8. يحفظ في درجة حرارة 4 درجات مئوية للاستخدام في غضون شهر واحد.
  3. تحضير المحلول داخل الخلايا الذي يحتوي على 100 ملي مولار من K-gluconate و 10 ملي مولار KCl و 2 ملي CaCl2 و 2 ملي مولار Mg-ATP و 0.3 ملي Na-GFP و 10 ملي مولار HEPES و 10 ملي مولار EGTA. أسمولية المحلول داخل الخلايا هي ~ 280 مللي أوسمول L-1. اضبط المحلول بواسطة KOH على درجة الحموضة 7.4. Aliquot 100 ميكرولتر من المحلول الداخلي في أنابيب الطرد الدقيق وتخزينها في -20 درجة مئوية للاستخدام في غضون 1 سنة.
    ملاحظة: يوصى بإضافة Mg-ATP وNa-GTP للتسجيلات المطولة والمستقرة. يجب ترشيح المحلول داخل الخلايا من خلال غشاء 0.22 ميكرومتر ، والذي يزيل الجسيمات والملوثات الميكروبية التي يمكن أن تضر بتكوين مانع التسرب أو يؤدي إلى انسداد الماصة.
  4. α-بنجاروتوكسين: قم بإذابة 1 ملغ من α-بنجاروتوكسين في 1 مل من وسط E3 إلى تركيز نهائي قدره 1 مجم / مل. Aliquot 20 ميكرولتر من المحلول في أنابيب الطرد الدقيق وتخزينها في -20 درجة مئوية للاستخدام في غضون 1 سنة.
  5. الاغاروز منخفض نقطة الانصهار: قم بإذابة 0.75 جم من الاغاروز في 50 مل من وسط E3 في زجاجة زجاجية بتركيز نهائي 1.5٪. سخني الخليط في فرن الميكروويف حتى يذوب الاغاروز ويبدو المحلول واضحا ومتجانسة. حافظ على الاغاروز المذاب عند 42-45 درجة مئوية في حمام مائي للاستخدام في غضون شهر واحد.

2. تحضير وتشريح أسماك الزرد

  1. ضع الأسماك البالغة من الذكور والإناث التي تحتوي على جين معدل وراثيا مرغوب فيه ، على سبيل المثال ، Tg (hcrt: RFP) fish25 ، في حوض تزاوج وافصلها بواسطة مقسم واضح طوال الليل. في صباح اليوم الثاني ، قم بإزالة الحاجز للسماح بتكاثر الأسماك. اجمع الأجنة المخصبة في قاع الخزان وأعد الأسماك البالغة إلى أحواض منازلها بحلول وقت مبكر من بعد الظهر.
  2. ارفع الأجنة في طبق بتري بقطر 9 سم مع وسط E3 بما في ذلك 0.0005٪ ميثيلين بلو. ضع الأجنة في حاضنة عند 28.5 درجة مئوية مع 14:10 ساعة من الظلام: دورات الظلام. قم بتغيير حل E3 كل يوم.
    ملاحظة: يستخدم الميثيلين الأزرق في وسط E3 لمنع نمو الفطريات حتى 3 أيام بعد الإخصاب (dpf) ، ولكن يتم استبداله بوسط E3 وحده عند 3 dpf ، لأن الميثيلين الأزرق قد يؤثر على التمثيل الغذائي الخلوي ووظيفة الميتوكوندريا في مراحل لاحقة من التطور26.
  3. فحص أسماك اليرقات تحت مجهر مجهر مجسم مضان epi مع أقصى تكبير (~ 115x) يبدأ من حوالي 3 dpf. ضع الأسماك الفردية في قطرات الماء (أكبر من حجم جسمها) لتسهيل الفرز. بالنسبة للأسماك التي يزيد عمرها عن 3 dpf ، قم بتخدير الأسماك باستخدام 3 مل من وسط E3 الذي يحتوي على 0.01٪ ثلاثي الأبعاد لقمع النشاط الحركي التلقائي. اجمع اليرقات ذات التعبير الفلوروفوري اللامع في منطقة ما تحت المهاد.
    ملاحظة: ارتد قفازات النتريل ونظارات السلامة ومعطف المختبر عند التعامل مع التريكيين. يجب التخلص من التريكيين الزائد كنفايات كيميائية وفقا للبروتوكولات الحيوانية.
  4. بعد الفحص ، اغسل التريكيين باستخدام وسيط E3 على الفور ، وأعد هذه اليرقات إلى الحاضنة. أضف ~ 5 مل من محلول التغذية الذي يحتوي على روتيفر في طبق بتري بدءا من 5 dpf حتى يوم التجارب. قم بتغيير محلول E3 وإطعام السمك بالروتيفر كل يوم.
  5. عند 5-7 dpf ، اجمع أسماك اليرقات التي تبدو صحية وتظهر حركة نشطة. انقلها إلى طبق بتري صغير (قطره 3.5 سم) باستخدام ماصة زجاجية.
  6. قم بإزالة الماء حول السمك ، وأضف 20 ميكرولتر من 1 مجم / مل α-بنجاروتوكسين على السمك لمدة ~ 30 ثانية. ثم اغسل الدواء بإضافة ~ 3 مل من وسط E3 إلى طبق بتري.
    ملاحظة: ارتد قفازات النتريل ونظارات السلامة ومعطف المختبر عند التعامل مع α-بنجاروتوكسين. يجب التخلص من α-bungarotoxin الزائدة كنفايات كيميائية وفقا للبروتوكولات الحيوانية.
  7. غطي طبق بتري بورق الألمنيوم لإبقاء السمك في الظلام ويصاب بالشلل تدريجيا.
    ملاحظة: α-bungarotoxin هو مانع لمستقبلات الأسيتيل كولين يعمل على وجه التحديد على الوصلة العصبية العضلية ، وبالتالي يشل الأسماك دون التأثير على الجهاز العصبي. لا يزال بإمكان الأسماك الشعور بالمحفزات البيئية ، ووظيفة المخ طبيعية ، بعد الشلل9،27.
  8. تحقق من الشلل بعد ~ 15 دقيقة باستخدام المجهر المجسم واختر سمكة مشلولة تظهر ضربات قلب طبيعية ودورة دموية قوية في الدماغ والجسم.
  9. انقل السمكة إلى غرفة تسجيل مخصصة ، وهي عبارة عن طبق بتري مقاس 35 مم مع فتحة قطرها 10 مم في المنتصف وغطاء زجاجي مقاس 20 × 20 مم يتم لصقه في الأسفل لتغطية الحفرة. قم بإزالة الماء وأضف ~ 200 ميكرولتر من 1.5٪ من الاغاروز منخفض الذوبان.
  10. ضع الجانب الظهري للسمكة لأعلى في الاغاروز باستخدام الملقط (Dumont # 5). عندما يتجمد الاغاروز تماما ، أضف المحلول خارج الخلية لتغطية الاغاروز. يستغرق الأمر من 5 إلى 10 دقائق حتى يتجمد الاغاروز بالكامل.
  11. قطع وإزالة الاغاروز فوق رأس السمكة باستخدام سكين صغير. ثم قم بعمل شق صغير في الجلد فوق بطين الدماغ بين التكتوم البصري والمخيخ باستخدام ماصة زجاجية دقيقة مع فتحة طرف ~ 1 ميكرومتر للماصة التي تتقدم إلى الدماغ الخطوة التالية.
  12. قم بإزالة بقايا الأنسجة أو الجلطات الدموية حول فتحة التشريح باستخدام ماصة زجاجية مكسورة.

3 تسجيل مشبك التصحيح للخلية الكاملة

  1. قم بإعداد ماصات دقيقة مسجلة بفتحة طرف ~ 1 ميكرومتر ومقاومة ~ 20 MΩ باستخدام الشعيرات الدموية البورسليكات في يوم التجربة. قم بتخزين الماصات الدقيقة المسحوبة في وعاء واستخدمها في نفس اليوم لمنع التلوث.
  2. قم بتشغيل الكمبيوتر وكاميرا CCD والشاشة ومكبر الصوت والمحول الرقمي والملاعب الدقيقة والبرامج المرتبطة بها. يجب تشغيل مكبر الصوت والمحول الرقمي قبل فتح البرنامج.
  3. انقل السمكة بعناية إلى جهاز الفيزيولوجيا الكهربية حيث سيتم إجراء تجربة مشبك التصحيح.
  4. قم بتفريخ الأسماك بمحلول مؤكسج خارج الخلية بمعدل ~ 2 مل في الدقيقة باستخدام مضخة تمعجية للحفاظ على صحة الأسماك وصلاحية الخلايا.
  5. حرك غرفة التسجيل باستخدام مترجم XY (حسب الطلب) لتوسيط السمكة في المجال البصري لهدف 4x تحت مجهر مستقيم.
  6. قم بالتبديل إلى هدف 60x وحرك المترجم لتصور منطقة ما تحت المهاد المستهدفة. اضبط تباين التداخل التفاضلي Nomarski (DIC) مع ضوء الأشعة تحت الحمراء 900 نانومتر للحصول على أفضل تصور للخلايا.
  7. قم بتشغيل مصدر ضوء الإثارة الفلورية (على سبيل المثال ، لمبة الزئبق) واستخدمه لتصور الخلايا العصبية الفلورية في منطقة ما تحت المهاد. حدد موقع الخلايا العصبية السليمة التي تظهر مضان ساطع وحدود خلوية واضحة ، والتي غالبا ما تشير إلى صحة خلوية جيدة وتسهل التسجيلات الفيزيولوجية الكهربية عالية الجودة.
  8. قم بإعادة ملء الماصة الدقيقة المسجلة ببطء بمحلول داخل الخلايا باستخدام طرف محمل دقيق دقيق.
  9. قم بتثبيت القطب الكهربائي على مقدمة مكبر الصوت وشد المقبض لمنع تسرب الهواء. قم بتطبيق ضغط إيجابي طفيف (~150-200 ملي بار) على الجزء الداخلي من الماصة الدقيقة من خلال الأنبوب المتصل بالحامل، مما يمنع الملوثات الموجودة في واجهة محلول الهواء من دخول طرف القطب.
  10. قم بخفض الماصة الدقيقة في محلول الحمام باستخدام معالج دقيق في الوضع السريع وضع طرف الماصة الدقيقة فوق الفتحة المقطوعة أسفل الهدف 4x.
  11. قم بتبديل أداة المعالجة الدقيقة إلى الوضع البطيء ، وقم بتغيير الهدف إلى 60x. ادفع طرف الماصة الزجاجية ببطء عبر فتحة التشريح ، وعلى طول البطين بين نصفي الكرة الأرضية.
  12. أحضر طرف الماصة بشكل متعامد نحو خلية فلورية مستهدفة يتم عرضها باستخدام كل من DIC والفلورة. بمجرد أن يلامس طرف الماصة غشاء الخلية ، يتم تشكيل فجوة صغيرة.
    ملاحظة: لتصور الأنسجة العميقة مثل منطقة ما تحت المهاد ، يتم استخدام 900 نانومتر IR-DIC مع مرشحات المستقطب والمحلل التي يتم ضبطها بدقة ل IR-DIC.
  13. إن تحرير الضغط الإيجابي بسرعة عندما يلامس الطرف خلية يمكن الخلية من تكوين ختم باستخدام الماصة. في الوقت نفسه ، قم بتطبيق ضغط سلبي قصير عبر الأنبوب المتصل بالحامل.
    ملاحظة: يجب أن تزيد قيمة المقاومة على البرنامج بسرعة إلى > 1 GΩ ، مما يشير إلى تشكيل ختم عالي المقاومة. عندما يتم تسجيل الخلية تحت المهاد الفلورية بنجاح ، يجب أن يكون هناك غشاء خلية فلورية داخل طرف الماصة الدقيقة المسجلة.
  14. قم بتثبيت الخلية عند -60 مللي فولت وانتظر لمدة 1-2 دقيقة حتى يصبح خط الأساس ومقاومة الوصول مستقرة. ضع نبضة كهربائية قصيرة أو شفطا لطيفا عن طريق الفم لتمزيق غشاء الخلية أسفل طرف الماصة الدقيقة.
  15. تعويض التيار السعوي ومقاومة السلسلة في تكوين برنامج الفيزيولوجيا الكهربية. تجاهل البيانات إذا كانت مقاومة السلسلة أكبر من 100 MΩ وتختلف > 20٪ في التسجيلات.
  16. قم بتطبيق نبضة جهد 1 ثانية -10 مللي فولت في وضع الجهد لمراقبة مقاومة الغشاء الجوهري قبل التجارب وبعدها. تخلص من الخلية إذا كانت مقاومة الغشاء أو إمكانات الغشاء تختلف كثيرا.
  17. السجل الأول في وضع مشبك الجهد (VC) عندما يتم الاحتفاظ بالخلية عند قيمة سالبة. بعد إنشاء تسجيل مستقر ، قم بالتبديل إلى وضع المشبك الحالي (IC) إذا لزم الأمر.
    ملاحظة: قد لا يكون ختم الجيجا مستقرا بعد فترة وجيزة من التمزق ، لذا فإن تثبيت الخلية عند -60 مللي فولت تحت وضع VC لبضع دقائق في بداية التجربة يمكن أن يوفر ظروفا خلوية أفضل.
  18. قم بمعالجة تحليل البيانات الفيزيولوجية الكهربية واكتشاف السنبلة في وضع عدم الاتصال باستخدام MATLAB بعد اكتمال التجربة.
  19. بعد التجارب ، قم بالقتل الرحيم للأسماك اليرقية باستخدام 1.5٪ هيبوكلوريت الصوديوم (NaClO) والتخلص منها وفقا لبروتوكولات رعاية المؤسسية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

في هذه المخطوطة ، نقدم تقنية تسجيل مشبك رقعة محسنة في الجسم الحي للتحقيق في الخلايا العصبية تحت المهاد في أسماك الزرد السليمة ، مع التركيز بشكل خاص على الخلايا العصبية hypocretin (Hcrt).

كما هو موضح في الشكل 1 ، تتيح منهجيتنا تسجيلات فيزيولوجية كهربية مباشرة من هذه الخلايا العصبية في أعماق الدماغ في سليم (الشكل 1 أ) ، والتغلب على قيود الشرائح التقليدية في المختبر أو مستحضرات الدماغ التشريح. تقع الخلايا العصبية Hcrt ف...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

يتيح البروتوكول الموصوف هنا تسجيلات المشبك الرقعة للخلايا العصبية الببتيدرجي في منطقة ما تحت المهاد الزرد اليرقاتية ، وهي واحدة من أعمق مناطق الدماغ وأكثرها تحديا من الناحية الفنية للوصول إليها. نظرا للصعوبة الكامنة في هذا المستحضر، تتطلب تسجيلات المشبك الرقعة الناجحة اهتماما دقيقا ببعض المعلمات الهامة، وهي جودة الماصة، وتقنية الاقتراب، ونقاء المحلول، وصحة الأنسجة. تحدد هذه العوامل بشكل جماعي احتمالية تحقيق تسجيلات جيجا سختم مستقرة والحفاظ عليها. أولا، يعد التصور الواضح للخلايا المستهدفة...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

ولا يعلن أصحاب البلاغ عن أي تضارب في المصالح ولا ما يفصحون عنه.

شكر وتقدير

نود أن نشكر الدكتور دانيال واجنار على مساعدته في تصميم أجهزة لتجارب البصريات الوراثية. تم دعم هذا العمل من خلال منح R35 NS122172 و R34 NS126800 من المعاهد الوطنية للصحة إلى DAP ، وبرنامج شنغهاي لتعريف المواهب الخارجية إلى R.Z.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
مكبراكسون700 ب
الشعيرات الدموية الزجاجية البورسليكاتسوترBF100-58-10
كاميرا CCDداج إم تي آيIR-1000
أجهزة كمبيوتر للتسجيلات الفيزيولوجية الكهربيةديلالطراز Precision 3660
ديجيداتااكسون1440 أ
قفص فارادايحسب الطلب
ملقطف.س.ت.دومون # 5
حاضنهلونرويجي زيد بي -150 ب
مرشح الغشاءميليبور سيجماSLGV004SL
سكين صغيرف.س.ت.10318-14
هدفأوليمبوسMplan 5X / 0.1 ؛ UMPlanFI / IR 60X / 0.9W
مضخة تمعجيةأطولBT100-1L
حامل ماصةناريشيجي[ه-7]للتشريح
ساحبهأداة سوترف -97
مجهر مجسم لفحص الفلورسنت والتشريحأوليمبوسطالع SZX16
مشجعاإيه إم بي آيماستر 8
مناور دقيق ثلاثي الأبعادأداة سوترإم بي سي -325
مجهر DIC بالأشعة تحت الحمراء المستقيمأوليمبوسBX51WI
طاولة عازل الاهتزازTMC61-541-06
مراقب الفيديوسونسبوSP-717
حمام مائيييهنغإتش دبليو إس -12
مترجم XYحسب الطلب

المراجع

  1. Bradbury, J. Small fish, big science. PLoS Biology. 2, e148(2004).
  2. Rihel, J., et al. Zebrafish behavioral profiling links drugs to biological targets and rest/wake regulation. Science. 327, 348-351 (2010).
  3. Oikonomou, G., Prober, D. A. Attacking sleep from a new angle: Contributions from zebrafish. Curr Opin Neurobiol. 44, 80-88 (2017).
  4. Lovett-Barron, M., et al. Multiple convergent hypothalamus-brainstem circuits drive defensive behavior. Nat Neurosci. 23, 959-967 (2020).
  5. Wagle, M., et al. Brain-wide perception of the emotional valence of light is regulated by distinct hypothalamic neurons. Mol Psychiatry. 27, 3777-3793 (2022).
  6. Dreosti, E., Lopes, G., Kampff, A. R., Wilson, S. W. Development of social behavior in young zebrafish. Front Neural Circuits. 9, 39(2015).
  7. MacRae, C. A., Peterson, R. T. Zebrafish as tools for drug discovery. Nat Rev Drug Discov. 14, 721-731 (2015).
  8. Zon, L. I., Peterson, R. T. In vivo drug discovery in the zebrafish. Nat Rev Drug Discov. 4, 35-44 (2005).
  9. Ahrens, M. B., et al. Brain-wide neuronal dynamics during motor adaptation in zebrafish. Nature. 485, 471-477 (2012).
  10. Mu, Y., et al. Glia Accumulate Evidence that Actions Are Futile and Suppress Unsuccessful Behavior. Cell. 178, 27-43 (2019).
  11. Yang, E., et al. A brainstem integrator for self-location memory and positional homeostasis in zebrafish. Cell. 185, 5011-5027.e20 (2022).
  12. Machluf, Y., Gutnick, A., Levkowitz, G. Development of the zebrafish hypothalamus: Hypothalamic neuronal specification. Ann N Y Acad Sci. 1220, 93-105 (2011).
  13. Tessmar-Raible, K., et al. Conserved sensory-neurosecretory cell types in annelid and fish forebrain: Insights into hypothalamus evolution. Cell. 129, 1389-1400 (2007).
  14. Bonnavion, P., et al. Hubs and spokes of the lateral hypothalamus: Cell types, circuits, and behaviour: LHA cell types and circuits. J Physiol. 594, 6443-6462 (2016).
  15. van den Pol, A. N. Neuropeptide transmission in brain circuits. Neuron. 76, 98-115 (2012).
  16. Watts, A. G. Neuropeptides and the integration of motor responses to dehydration. Annu Rev Neurosci. 24, 357-384 (2001).
  17. Lovett-Barron, M., et al. Ancestral circuits for the coordinated modulation of brain state. Cell. 171, 1411-1423.e17 (2017).
  18. Chiu, C. N., et al. A zebrafish genetic screen identifies neuromedin U as a regulator of sleep/wake states. Neuron. 89, 842-856 (2016).
  19. Chowdhury, S., et al. Brainstem neuropeptidergic neurons link a neurohumoral axis to satiation. Cell. 188, 1563-1579 (2025).
  20. Herget, U., Ryu, S. Coexpression analysis of nine neuropeptides in the neurosecretory preoptic area of larval zebrafish. Front Neuroanat. 9, 1-11 (2015).
  21. Sakmann, B., Neher, E. Single-Channel Recording. , Springer. New York. (2009).
  22. Zhang, R., Du, J. In vivo whole-cell patch-clamp recording in the zebrafish brain. , Springer. New York. (2016).
  23. Barrios, J. P., et al. Hypothalamic dopamine neurons control sensorimotor behavior by modulating brainstem premotor nuclei in zebrafish. Curr Biol. 30, 4606-4618 (2020).
  24. White, R. M., et al. Transparent adult zebrafish as a tool for in vivo transplantation analysis. Cell Stem Cell. 2, 183-189 (2008).
  25. Liu, J., et al. Evolutionarily conserved regulation of hypocretin neuron specification by Lhx9. Development. 142, 1113-1124 (2015).
  26. Nipu, N., et al. Methylene blue at recommended concentrations alters metabolism in early zebrafish development. Commun Biol. 8, 1-11 (2025).
  27. Du, W., et al. The locus coeruleus modulates intravenous general anesthesia of zebrafish via a cooperative mechanism. Cell Rep. 24, 3146-3155.e3 (2018).
  28. Singh, C., Oikonomou, G., Prober, D. A. Norepinephrine is required to promote wakefulness and for hypocretin-induced arousal in zebrafish. Elife. 4, 1-22 (2015).
  29. Lin, J. Y., et al. ReaChR: A red-shifted variant of channelrhodopsin enables deep transcranial optogenetic excitation. Nat Neurosci. 16, 1499-1508 (2013).
  30. Zhang, R., Wei, H., Xia, Y., Du, J. Development of light response and GABAergic excitation-to-inhibition switch in zebrafish retinal ganglion cells: Functional development of zebrafish retinal ganglion cells. J Physiol. 588, 2557-2569 (2010).
  31. Zhang, R., Du, W., Prober, D. A., Du, J. Müller Glial cells participate in retinal waves via glutamate transporters and AMPA receptors. Cell Rep. 27, 2871-2880.e2 (2019).
  32. Kole, M. H. P., Stuart, G. J. Signal processing in the axon initial segment. Neuron. 73, 235-247 (2012).
  33. Petersen, C. C. H. Whole-cell recording of neuronal membrane potential during behavior. Neuron. 95, 1266-1281 (2017).
  34. Jin, K., et al. Brain-wide cell-type-specific transcriptomic signatures of healthy ageing in mice. Nature. 638, 182-196 (2025).
  35. Scala, F., et al. Phenotypic variation of transcriptomic cell types in mouse motor cortex. Nature. 598, 144-150 (2021).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

اتصل بنا
أوصِ بها للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

2026 © حقوق الطبع والنشر MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.