يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

إنشاء وقياس العدوى اللايتية بدي نوفو بواسطة فيروس الهربس المرتبط بساركوما كابوسي الخالي من الخلايا

1.2K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/68959

⸱

أغسطس 15, 2025

 ,  ,  , 
1Program in Molecular and Cellular Oncogenesis, The Wistar Institute, 2Section of Infection and Immunity, Herman Ostrow School of Dentistry, University of Southern California

في هذه المقالة

ملخص

يصف هذا البروتوكول نظاما في المختبر لنمذجة العدوى اللايتية من جديد لفيروس الهربس المرتبط بساركوما كابوسي باستخدام الفيروسات المشتقة من BAC16. تتيح هذه الطريقة التحقيق في التكاثر الفيروسي المبكر وانتشاره. يتم قياس إنتاج الفيروسات المعدية من خلال فحوصات الوحدات المعدية القائمة على GFP و PCR في الوقت الفعلي للجينومات الفيروسية المغلفة.

الملخص

يمكن أن يخضع فيروس الهربس المرتبط بالساركوما (KSHV) ، وهو فيروس غاماهيربس متورط في العديد من الأورام الخبيثة البشرية ، لتكاثر الحالة أثناء العدوى الأولية ، وهي عملية تساهم في انتشار الفيروس ، والتهرب المناعي ، والتسبب في المرض. ومع ذلك ، فإن الافتقار إلى أنظمة قوية في المختبر للعدوى الحالة من جديد قد حد من الأفكار حول أحداث العدوى المبكرة. هنا ، نقدم بروتوكولا قابلا للتتبع يستخدم خلايا سرطان القولون والمستقيم البشرية HCT 116 كأهداف للإصابة بالفيروسات الخالية من الخلايا المشتقة من الخلايا المنتجة للكروموسوم الاصطناعي البكتيري KSHV 16 (BAC16) المعاد تنشيطها. يلخص هذا النموذج الخطوات الرئيسية في العدوى الأولية ، بما في ذلك دخول الفيروس ، وتوصيل الجينوم ، والتعبير الجيني المحلل ، وإنتاج النسل. تتم مزامنة العدوى عن طريق التطعيم ومراقبتها مؤقتا. يتم قياس إنتاج الفيروس باستخدام نظام قراءة مزدوج يشتمل على فحوصات الوحدة المعدية القائمة على البروتين الأخضر (GFP) (GFP) و qPCR للحمض النووي الفيروسي المغلف. تتيح هذه الأساليب تحليلا مفصلا لحركية تكاثر الفيروس. بينما يركز البروتوكول الحالي على الكشف عن الأحداث في المرحلة المتأخرة ، فإن النظام قابل للتكيف لدراسة المراحل المبكرة من العدوى من خلال النقاط الزمنية المعدلة لأخذ العينات. من خلال توفير منصة قابلة للتكرار وقابلة للتطوير للعدوى المنتجة من جديد ، يعالج هذا النظام فجوة منهجية في أبحاث KSHV ويدعم الدراسات الميكانيكية للتفاعل بين مضيف فيروس الهربس والاستراتيجيات المضادة للفيروسات.

المقدمة

فيروس الهربس المرتبط بساركوما كابوسي (KSHV) هو فيروس جاما هربس بشري مرتبط مسببيا بساركوما كابوسي (KS) ، وسرطان الغدد الليمفاوية الانصبابي الأولي (PEL) ، ومرض كاسلمان متعدد المراكز (MCD) ، ومتلازمة السيتوكين الالتهابية KSHV1،2. مثل جميع فيروسات الهربس ، يؤسس KSHV ثباتا مدى الحياة في المضيف ، بالتناوب بين المرحلتين الكامنة والمرحلتين اللايتية. بينما يسود زمن الوصول في معظم الخلايا المصابة ، يمكن أن تدخل مجموعة فرعية في الدورة اللايتية إما أثناء الإصابة الأولية (de novo) أو من خلال إعادة التنشيط من زمن الوصول3. يتضمن النسخ المتماثل لليتيك سلسلة منظمة من التعبير الجيني الفيروسي ، وتبلغ ذروتها في تكرار الجينوم ، وتجميع الفيروسات ، وإطلاق النسل. هذه العملية ضرورية لانتشار الفيروس وتطورالمرض 4،5. غالبا ما اعتمدت الدراسات المبكرة لتكرار LITIC KSHV على التعبير خارج الرحم للجينات الفيروسية الفردية في الأنظمة غير المتجانسة. على الرغم من كونها مفيدة ، إلا أن هذه الأساليب لم تلتقط التنظيم الجيني المنسق والتفاعل بين الفيروس والمضيف الموجود أثناء الإصابة الحقيقية. مكن تطوير BAC-16 ، وهو كروموسوم اصطناعي بكتيري مؤتلف (BAC) يحمل جينوم KSHV كامل الطول ، من إنتاج فيروسات قابلة للتلاعب وراثيا تحتفظ بكفاءة التكاثر وإنتاج الفيروسات المعدية6. يسهل هذا النظام الطفرات المستهدفة والتحليل الوظيفي للجينات الفيروسية في سياق الجينوم الكامل. أصبحت نماذج إعادة التنشيط التي تستخدم خلايا iSLK أو BCBL-1 المصابة كامنة مع BAC-16 أو KSHV منذ ذلك الحين معيارا لدراسة النسخ المتماثل للتحلل KSHV. تسمح هذه الأنظمة بالحث المتزامن للدورة اللايتية باستخدام عوامل مثل الدوكسيسيكلين (Dox) وزبدات الصوديوم7،8. ومع ذلك ، نظرا لأن نماذج إعادة التنشيط تتحايل على خطوات العدوى المبكرة - بما في ذلك دخول الفيروس ، والاتجار داخل الخلايا ، والقرار الأولي بين الكمون والتكاثر المحلل - لا يمكنها تلخيص ديناميكيات العدوى الأولية بالكامل.

وتوفر نماذج العدوى من جديد إطارا تكميليا لمعالجة هذه الثغرات. ثبت أن العديد من نماذج الخلايا الأولية ، مثل الخلايا الظهارية البطانية واللثة البشرية ، تدعم التكاثر المحلل بعد عدوى KSHV de novo 3،9،10،11. ومع ذلك ، فإن عمرها المحدود وتكلفتها العالية وضعف قابليتها للتلاعب الجيني تحد من قابليتها للتكاثر وقابليتها للتوسع في الدراسات الميكانيكية. في هذا البروتوكول ، نصف نموذجا قابلا للتتبع وقابلا للتطوير للعدوى الانحلال من جديد KSHV de novo باستخدام خط خلايا سرطان القولون والمستقيم البشري HCT 116. على الرغم من أنها ليست هدفا طبيعيا ل KSHV ، إلا أن خلايا HCT116 تظهر تساهلا قويا للعدوى وتوفر منصة مستقرة وفعالة من حيث التكلفة مناسبة للدراسات الميكانيكية والتطبيقات عالية الإنتاجية. نظرا لقدرة KSHV المحدودة على تكوين اللويحات في الثقافة ، فإننا نستخدم نظام BAC16 الذي يشتمل على مراسل GFP لتوليد فيروس خال من الخلايا للعدوى. يتيح ذلك التصور المباشر للخلايا المصابة والقياس الكمي للعيار المعدي عبر فحوصات الوحدة المعدية القائمة على GFP (IU)12. لاستكمال ذلك ، يتم قياس الحمض النووي المرتبط بالفيريون عن طريق تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي في الوقت الفعلي (qPCR) بعد علاج DNase ، مما يوفر طريقة حساسة للكشف عن الجينومات الفيروسية المغلفة. تسمح هذه المقايسات معا بالتحليل الكمي الذي تم حله مؤقتا لديناميكيات النسخ المتماثل أثناء العدوى الأولية.

يوفر هذا البروتوكول منصة موثوقة ومرنة لنمذجة العدوى اللايتية KSHV de novo في المختبر ، مما يسهل تشريح الأحداث المبكرة في دورة حياة الفيروس ، مما يتيح تقييم وظيفة الجينات والنشاط المضاد للفيروسات.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

يصنف KSHV على أنه مسببات الأمراض البشرية من المستوى 2 (BSL-2). قم بتنفيذ جميع الإجراءات التي تنطوي على مواد معدية في خزانة السلامة البيولوجية BSL-2 المعتمدة. تطهير أسطح العمل بنسبة 70٪ من الإيثانول قبل وبعد كل إجراء. التخلص من جميع النفايات وفقا للوائح السلامة البيولوجية المؤسسية والمبادئ التوجيهية لمنظمة الصحة العالمية BSL-2. يتم توفير نظرة عامة تخطيطية لسير العمل الكامل في الشكل 1. يتضمن الإجراء توليد KSHV الخالية من الخلايا المشتقة من BAC16 من خلايا iSLK المعاد تنشيطها ، وعدوى جديدة لخلايا HCT 116 ، والقياس الكمي لعيارات الفيروس عن طريق مقايسة الوحدة المعدية (IU) ، وتحليل qPCR للحمض النووي الفيروسي المرتبط بالفيريون. الكواشف والمعدات المستخدمة مدرجة في جدول المواد.

1. إنتاج KSHV الخالية من الخلايا المشتقة من BAC16

  1. قم بزرع خمسة قوارير T75 من خلايا iSLK المحفزة ل Dox التي تحتوي على نوع عريض (WT) KSHV BAC 16 (iSLK-BAC16) عند التقاء 80٪ تقريبا. احتضان عند 37 درجة مئوية في حاضنة مرطب بنسبة 5٪ ثاني أكسيد الكربون 2 لمدة 24 ساعة.
  2. تحفيز إعادة تنشيط الحالة عن طريق إضافة 1 ميكروغرام / مل دوكس و 1 ملي مولار زبدات الصوديوم إلى كل قارورة. استمر في الحضانة لمدة 72-96 ساعة.
  3. مراقبة الخلايا يوميا عن طريق الفحص المجهري بتباين الطور. اجمع المادة الطافية مرة واحدة >90٪ من الخلايا تظهر تقريبا ، وانفصالا عن سطح القارورة ، و / أو تحلل مرئيا ، وهي السمات المميزة لتأثير الاعتلال الخلوي (CPE) التي تدل على تفاعل لايتي قوي. بعد جمع المواد الطافية ، قم بتطهير والتخلص من خلايا iSLK-BAC16 المستحثة محليا باستخدام 10٪ مبيض.
  4. قم بالطرد المركزي للطافية التي تم جمعها عند 1,500 × جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية لإزالة الحطام. قم بتصفية المادة الطافية الموضحة من خلال مرشح غشاء بولي إيثر سلفون (PES) 0.45 ميكرومتر دون إزعاج الحبيبات.
  5. انقل المواد الطافية المفلترة إلى أنابيب الطرد المركزي الفائقة. قم بتحبيير الجسيمات الفيروسية عن طريق الطرد المركزي عند 25,000 × جم لمدة 3 ساعات عند 4 درجات مئوية باستخدام دوار SW28.
  6. تخلص من المادة الطافية بعناية في مبيض بنسبة 10٪. أعد تعليق الحبيبات الفيروسية في 1 مل من Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) الخالي من المصل.
  7. Aliquot الفيروس المعلق في أنابيب معقمة لولبية 1.5 مل لأجهزة الطرد المركزي الدقيقة. قم بتخزين الكميات عند -80 درجة مئوية حتى الاستخدام. تحديد العيار المعدي لمخزون الفيروس باستخدام فحوصات الوحدة المعدية القائمة على GFP (IU) في خلايا SLK (انظر الخطوة 3).

2. عدوى من جديد لخلايا HCT116

ملاحظة: يعد التعدد العالي للعدوى (MOI) أمرا بالغ الأهمية لبدء النسخ المتماثل المحلل بكفاءة في خلايا HCT116 بعد عدوى دي نوفو KSHV. تتيح هذه الحالة التعبير الجيني الفيروسي القوي والتكاثر المثمر دون الحاجة إلى محفزات خارجية. يتم توفير نتيجة تمثيلية توضح التأثير المعتمد على وزارة الداخلية على إنتاج الفيروسات في الشكل التكميلي 1 أ.

  1. البذور 1 × 105 خلايا HCT116 لكل بئر في صفيحة زراعة الأنسجة المكونة من 12 بئر. احتضان لمدة 24 ساعة عند 37 درجة مئوية في حاضنة مرطب بنسبة 5 ٪ ثاني أكسيد الكربون.
  2. تمييع مخزون الفيروس المركز في DMEM الدافئ مسبقا وخالي من المصل إلى حجم نهائي قدره 250 ميكرولتر لتحقيق تعدد العدوى (MOI) 10.
  3. وسط ثقافة الشفط من كل بئر. أضف 250 ميكرولتر من الفيروس المخفف مباشرة إلى الخلايا.
  4. جهاز الطرد المركزي للوحة عند 1,500 × جم لمدة ساعة واحدة عند 30 درجة مئوية لمزامنة العدوى (التطعيم). انقل اللوحة على الفور إلى حاضنة 37 درجة مئوية واستمر في الحضانة لمدة 1 ساعة إضافية.
  5. شفط اللقاح واغسل الخلايا ثلاث مرات باستخدام PBS الدافئ مسبقا لإزالة الفيروس المتبقي. أضف 1 مل من DMEM الكامل إلى كل بئر.
  6. مراقبة تعبير GFP في الخلايا المصابة عن طريق المجهر الفلوري في 36 ساعة و 60 ساعة و 96 ساعة بعد الإصابة. في كل نقطة زمنية ، اجمع 1 مل من المادة الطافية من كل بئر.
    ملاحظة: بعد جمع المواد الطافية ، يمكن الاحتفاظ بخلايا HCT116 المصابة ب KSHV للتطبيقات النهائية مثل استخراج الحمض النووي الريبي أو تحليل البروتين أو التألق المناعي أو قياس التدفق الخلوي ، بناء على الأهداف التجريبية.
  7. قم بالطرد المركزي للطافية التي تم جمعها عند 1,500 × جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية لإزالة بقايا الخلية. انقل المواد الطافية الموضحة إلى أنابيب جديدة. قم بالتجميد في النيتروجين السائل وتخزينه في درجة حرارة -80 درجة مئوية لمزيد من التحليل.

3. فحص الوحدات المعدية (فحص IU)

ملاحظة: خلايا SLK متساهلة بدخول KSHV وتدعم التعبير الجيني المبكر عن الحالة يحدد هذا الاختبار الوحدات المعدية بناء على تعبير GFP في خلايا SLK المصابة بعد التعرض للمواد الطافية المحتوية على الفيروس المخففة بشكل متسلسل.

  1. بذرة 1 × 104 خلايا SLK لكل بئر في صفيحة 96 بئرا قبل 24 ساعة من الإصابة. تأكد من توزيع الخلايا بالتساوي والوصول إلى ~ 60٪ -70٪ التقاء في يوم الإصابة.
  2. قم بتسمية تسعة أنابيب طرد مركزي دقيقة سعة 1.5 مل للتخفيفات التسلسلية ذات الطفين: الأنبوب 1 (غير مخفف ، 1: 1) ، الأنبوب 2 (1: 2) ، الأنبوب 3 (1: 4) ، الأنبوب 4 (1: 8) ، الأنبوب 5 (1:16) ، الأنبوب 6 (1:32) ، الأنبوب 7 (1:64) ، الأنبوب 8 (1: 128) ، والأنبوب 9 (1: 256).
  3. أضف 200 ميكرولتر من المادة الطافية للفيروس إلى الأنبوب 1. أضف 100 ميكرولتر من DMEM الدافئ مسبقا والخالي من المصل إلى كل من الأنابيب من 2 إلى 9. لبدء سلسلة التخفيف ، انقل 100 ميكرولتر من الأنبوب 1 إلى الأنبوب 2 واخلطه جيدا عن طريق سحب العينات لأعلى ولأسفل. ثم انقل 100 ميكرولتر من الأنبوب 2 إلى الأنبوب 3 وكرر هذه العملية بالتتابع من خلال الأنبوب 9 ، واخلطه جيدا في كل خطوة.
    ملاحظة: يجب أن يحتوي كل أنبوب على حجم نهائي يبلغ 100 ميكرولتر ، قم بإجراء جميع التخفيفات في ثلاث نسخ.
  4. استنشق وسط الثقافة من خلايا SLK. أضف 100 ميكرولتر من كل تخفيف للفيروس إلى الآبار المخصصة. استخدم 27 بئرا في المجموع (3 آبار لكل تخفيف من 1: 1 إلى 1: 256).
  5. جهاز الطرد المركزي للوحة 96 بئر عند 1,500 × جم لمدة ساعة واحدة عند 30 درجة مئوية لتعزيز امتصاص القارورة. انقل اللوحة إلى حاضنة CO2 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة إضافية.
  6. قم بإزالة اللقاح وأضف برفق 100 ميكرولتر من DMEM الكامل إلى كل بئر. احتضان اللوحة لمدة 24 ساعة عند 37 درجة مئوية.
  7. حصاد الخلايا وتحليل تعبير GFP عن طريق قياس التدفق الخلوي. سجل عدد الخلايا الإيجابية ل GFP لكل بئر.
  8. احسب الوحدات المعدية لكل مل (وحدة دولية / مل) باستخدام الصيغةالتالية 13:
    وحدة دولية / مل = [(عدد الخلايا الإيجابية ل GFP لكل بئر) / حجم اللقاح (مل)] × عامل التخفيف. تحديد عيار الفيروس النهائي باستخدام التخفيف الأخير مع الخلايا الموجبة ل GFP التي يمكن اكتشافها

4. القياس الكمي للجينومات الفيروسية المغلفة بواسطة qPCR

  1. أضف DNase I إلى التركيز النهائي من 100 وحدة / مل إلى 400 ميكرولتر من المادة الطافية المصفاة (انظر الخطوة 1 لتوضيح المادة الطافية وإزالة الحطام). احتضان لمدة 15 دقيقة عند 37 درجة مئوية لهضم الحمض النووي الفيروسي والخلوي غير المغلف. تظهر نتيجة تمثيلية توضح خصوصية وفعالية علاج DNase في الشكل التكميلي 1 ب.
  2. أضف EDTA إلى تركيز نهائي قدره 50 ملي مولار لإيقاف تفاعل DNase. احتضن عند 75 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة لتعطيل DNase I.
  3. استخرج الحمض النووي الفيروسي من المادة الطافية المعالجة ب DNase باستخدام مجموعة DNA المصغرة وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة.
  4. قم بتخفيض الحمض النووي الفيروسي في 30 ميكرولتر من المخزن المؤقت للشطف. استخدم 5 ميكرولتر من الحمض النووي المملوث لكل تفاعل qPCR.
  5. تضخيم إطار القراءة المفتوح KSHV 73 (ORF 73) باستخدام الاشعال التالية: إلى الأمام: 5'-CCGAGGACGAAATGGAAGTG-3'; العكس: 5'-GGTGATGTTCTGAGTACATAGCGG-3.
  6. قم بإعداد تفاعلات qPCR ثلاث نسخ باستخدام SYBR Green Master SuperMix. قم بإعداد ظروف ركوب الدراجات على النحو التالي: التمسخ الأولي: 95 درجة مئوية لمدة 3 دقائق ؛ التضخيم: 40 دورة من 95 درجة مئوية لمدة 10 ثوان ، و 52 درجة مئوية لمدة 30 ثانية ، و 72 درجة مئوية لمدة 30 ثانية ؛ تحليل منحنى الانصهار: منحدر قياسي لخصوصية الامبليكون.
  7. قم بإنشاء منحنى قياسي باستخدام تخفيفات تسلسلية بمقدار 10 أضعاف من الحمض النووي الفيروسي المشتق من BAC-16 ، تتراوح من 109 إلى 101 نسخة لكل تفاعل. ارسم قيم Ct مقابل السجل10 من رقم نسخة الإدخال لتقييم خطية الفحص. يظهر منحنى قياسي تمثيلي في الشكل التكميلي 1 ج.
  8. حدد رقم نسخة الجينوم الفيروسي من خلال مقارنة قيم Ct بالمنحنى القياسي. تطبيع النتائج والإبلاغ عنها كنسخ من الحمض النووي الفيروسي لكل مل من المادة الطافية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

لتحديد عيار الفيروس المعدي ، تعرضت المواد الطافية التي تم حصادها بعد 72 ساعة من إعادة تنشيط الخلايا اللايتية لخلايا iSLK-BAC16 للتخفيف التسلسلي المزدوج واستخدامها لإصابة خلايا SLK. يظهر عدد خلايا SLK الإيجابية ل GFP في كل تخفيف في الشكل 2 أ ، وتم حساب الوحدات المعدية المقابلة (IU) لكل مل وتقديمها في الشكل 2 ب. لتقييم كفاءة النسخ المتماثل من جديد ، أصيبت خلايا HCT 116 بفيريونات مشتقة من i...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

لطالما أعاقت نمذجة العدوى من جديد للتحلل ل KSHV بسبب الميل القوي للفيروس إلى إنشاء زمن انتقال في معظم أنواع الخلايا المتساهلة. على الرغم من أن بعض الخلايا الأولية ، مثل الخلايا البطانية والخلايا الظهارية الفموية ، قد ثبت أنها تدعم التكاثر المحلل بعد الإصابة من جديد 9،10 ، إلا أن عمرها المحدود وتكلفتها العالية والصعوبة التقنية في الحفاظ على الثقافة تقلل من قابلية التكاثر وقابلية التوسع. أظهرت الدراسات الحديثة أيض...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

لم يتم الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

شكر وتقدير

يود المؤلفون أن يشكروا الدكتور جاي يو جونغ (كليفلاند كلينك) على مشاركة خط خلايا iSLK-BAC16 الذي ينتج KSHV المؤتلف. تم إنشاء التصميم الجرافيكي باستخدام BioRender.com ، والتي يمتلك المؤلفون ترخيصا لها. تم دعم هذا العمل من خلال جوائز المعاهد الوطنية للصحة R21 DE028256 و R01 CA140964 و R01 CA262631 إلى C. Liang (PI) ، وجائزة Wistar Science Accelerator لما بعد الدكتوراه ل Q. Zhu.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
0.45 & م مرشح بولي إيثرسلفوم (PES)   ؛VWR76479-020
بيوريندربيوريندرغير متاحتم إنشاء التصميم الجرافيكي
باستخدام BioRender.com ، حيث يمتلك المؤلفون ترخيصا
CFX Opus 96 نظام PCR في الوقت الحقيقيبيو راد184-5072
أكمل DMEMوسط النسر المعدل من Dulbecco (DMEM; سيجما ألدريتش) مكمل بمصل أبقار الجنين بنسبة 10٪ (v / v) (FBS; جيبكو) ، 2 ملي لام-جلوتامين (جيبكو) ، و 100 وحدة / مل البنسلين - الستربتومايسين (Pen-Strep; GenClone).
DNase Iنيو إنجلاند بيولابسطراز M0303S
الدوكسيسيكلينسيجما ألدريتشD9891
LSR II 18 مقياس التدفق الخلويBD Bioscienceغير متاح
PerfeCTa SYBR جرين ماستر سوبر ميكسكوانتابيو95054-02 ك
QIAamp الحمض النووي مصغرة كيتكياجين56304
زبدات الصوديوم (NaB)سيجما ألدريتشب 5887
UltraPure 0.5M EDTA ، درجة الحموضة 8.0ثيرمو فيشر15575020

المراجع

  1. Mesri, E. A., Cesarman, E., Boshoff, C. Kaposi's sarcoma herpesvirus/human herpesvirus-8 (KSHV/HHV8), and the oncogenesis of Kaposi's sarcoma. Nat Rev Cancer. 10 (10), 707(2010).
  2. Cesarman, E. Gammaherpesvirus and lymphoproliferative disorders in immunocompromised patients. Cancer Lett. 305 (2), 163-174 (2011).
  3. Golas, G., Alonso, J. D., Toth, Z. Characterization of de novo lytic infection of dermal lymphatic microvascular endothelial cells by Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus. Virology. 536, 27-31 (2019).
  4. Dittmer, D. P., Damania, B. Kaposi sarcoma-associated herpesvirus: immunobiology, oncogenesis, and therapy. J Clin Invest. 126 (9), 3165-3175 (2016).
  5. Chang, H. H., Ganem, D. A unique herpesviral transcriptional program in KSHV-infected lymphatic endothelial cells leads to mTORC1 activation and rapamycin sensitivity. Cell Host Microbe. 13 (4), 429-440 (2013).
  6. Brulois, K. F., et al. Construction and manipulation of a new Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus bacterial artificial chromosome clone. J Virol. 86 (18), 9708-9720 (2012).
  7. Myoung, J., Ganem, D. Generation of a doxycycline-inducible KSHV producer cell line of endothelial origin: Maintenance of tight latency with efficient reactivation upon induction. J Virol Methods. 174 (1-2), 12-21 (2011).
  8. Grundhoff, A., Ganem, D. Inefficient establishment of KSHV latency suggests an additional role for continued lytic replication in Kaposi sarcoma pathogenesis. J Clin Invest. 113 (1), 124-136 (2004).
  9. Gao, S. J., Deng, J. H., Zhou, F. C. Productive lytic replication of a recombinant Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus in efficient primary infection of primary human endothelial cells. J Virol. 77 (18), 9738-9749 (2003).
  10. Atyeo, N., Chae, M. Y., Toth, Z., Sharma, A., Papp, B. Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus immediate early proteins trigger FOXQ1 expression in oral epithelial cells, engaging in a novel lytic cycle-sustaining positive feedback loop. J Virol. 97 (3), e0169622(2023).
  11. Lagunoff, M., et al. De novo infection and serial transmission of Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus in cultured endothelial cells. J Virol. 76 (5), 2440-2448 (2002).
  12. ViejoBorbolla, A., Schulz, T. F. Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus and innate immunity. J Gen Virol. 98 (2), 271-284 (2017).
  13. Chandran, B. Early events in Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus infection of target cells. J Virol. 84 (5), 2188-2199 (2010).
  14. Zhu, Q., et al. Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus induces mitochondrial fission to evade host immune responses and promote viral production. Nat Microbiol. 10 (6), 1501-1520 (2025).
  15. Lee, S. C., et al. Hypoxia and HIF-1alpha promote lytic de novo KSHV infection. J Virol. 97 (11), e0097223(2023).
  16. White, I. E., Campbell, T. B. Quantitation of cell-free and cell-associated Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus DNA by real-time PCR. J Clin Microbiol. 38 (5), 1992-1995 (2000).
  17. Bechtel, J., Grundhoff, A., Ganem, D. RNAs in the virion of Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus. J Virol. 79 (16), 10138-10146 (2005).
  18. Lin, X., Li, X., Liang, D., Lan, K. MicroRNAs and unusual small RNAs discovered in Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus virions. J Virol. 86 (23), 12717-12730 (2012).
  19. Watzinger, F., et al. Real-time quantitative PCR assays for detection and monitoring of pathogenic human viruses in immunosuppressed pediatric patients. J Clin Microbiol. 42 (11), 5189-5198 (2004).
  20. Cho, H. J., et al. Antiviral activity of angelicin against gammaherpesviruses. Antiviral Res. 100 (1), 75-83 (2013).
  21. Coen, N., Duraffour, S., Snoeck, R., Andrei, G. KSHV targeted therapy: An update on inhibitors of viral lytic replication. Viruses. 6 (11), 4731-4759 (2014).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

العدوى التحللية لفيروس KSHVالعدوى المستحدثةفيروس KSHV الخالي من الخلاياخلايا HCT116فيروس BAC16التلقيح بالطرد المركزيمقايسة GFPقياس التدفق الخلويتفاعل البوليميراز المتسلسل الكميالتضاعف الفيروسي
إنشاء وقياس العدوى اللايتية بدي نوفو بواسطة فيروس الهربس المرتبط بساركوما كابوسي الخالي من الخلايا
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.