Method Article

مقايسة الربط المتوازية على نطاق واسع لفحص أخطاء الربط الناجمة عن المتغيرات الداخلية المرتبطة بالأمراض

DOI:

10.3791/68984

⸱

September 9th, 2025

 ,  ,  ,  ,  , 
1Institute of Molecular Biology, Academia Sinica, 2Genome and Systems Biology Degree Program, Academia Sinica and National Taiwan University, 3Institute of Statistical Science, Academia Sinica

* These authors contributed equally

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هنا ، نقدم بروتوكولا مفصلا لإجراء فحوصات التضفير المتوازية على نطاق واسع (MaPSY) ، والتي تستخدم تركيبات الجينات الصغيرة لتقييم المتغيرات الداخلية بشكل منهجي بكميات كبيرة. يتيح هذا النهج تحليلا عالي الإنتاجية لتغيرات التضفير الناجم عن المتغير في الخلايا من خلال تسلسل الأمبليكون ، مما يوفر تقييمات وظيفية لتأثيرها على التضفير المسبق للرنا المرسال.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تمثل أخطاء الربط 10-30٪ من الطفرات المسببة للأمراض المسؤولة عن الاضطرابات الوراثية النادرة. يضمن تضفير الحمض النووي الريبي التعبير الجيني الصحيح عن طريق الانضمام الانتقائي إلى exons وإزالة الإنترونات ، مع وجود التسلسلات التنظيمية الرئيسية داخل الإنترونات. يتفاعل موقع لصق 5 بوصات وموقع الفرع مع الحمض النووي الريبي النووي الصغير لتشكيل مركب التعرف على الجسيم الرسولي ، في حين أن عناصر مثل مجرى البولي بيريميدين ومحسنات / كاتمات صوت الربط تجند البروتينات لتنظيم تجميع الجسيم. يعد التنبؤ باضطرابات الربط من المتغيرات الداخلية أمرا صعبا بسبب تعقيد هذه التفاعلات.

قد تؤدي المتغيرات الداخلية ، التي تشكل 90٪ من الاختلافات الجينية البشرية الطبيعية ، إلى تعطيل التضفير الكنسي وتؤدي إلى الإصابة بالمرض. للتحقيق في هذا الاحتمال ، قمنا بتطوير مقايسة التضفير المتوازية على نطاق واسع (MaPSY) لتقييم المتغيرات الداخلية التي يحددها المريض. تم ربط قليل النوكليوتيدات المركبة مع التسلسلات المرجعية أو المتغيرة في الجينات المصغرة التي تحتوي على إشارات المحفز والبولي أدينيل. تضمن كل بناء إكسونين ثابتين يحيطان بإكسون متوسط يؤوي تسلسل تقاطع الإنترون والإكسون المتغير ذي الاهتمام. تمت مقارنة كفاءة الربط الخلوي للتسلسلات المتغيرة بنظيراتها المرجعية ، مما يسمح لنا بتحديد الاضطرابات الكبيرة كمتغيرات الربط.

يمكن التحقق من صحة نتائج MaPSy من خلال مناهج إضافية ، مثل فحوصات الجينات الصغيرة أو تحرير الجينوم بوساطة كريسبر في الجسم الحي. علاوة على ذلك ، يمكن أن يوفر التحليل الكلي للوصلات المعطلة رؤى أعمق لآليات الربط والأساس الجزيئي للأمراض المرتبطة بأخطاء الربط.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ربط الحمض النووي الريبي هو عملية حاسمة تنضم إلى exons للترجمة وتزيل الإنترونات ، مما يسهل تصدير الحمض النووي الريبي ويحافظ على توازن الحمض النووي. تعمل هذه الآلية المنظمة بإحكام بطريقة زمنية ومكانية ، مما يساهم في تنوع النسخ وتعقيده1. يتم توجيه الربط من خلال الإشارات الرئيسية ، بما في ذلك موقع لصق 5 بوصات (5'ss) ، وموقع الفرع ، وموقع لصق 3 's (3'ss) ، جنبا إلى جنب مع العناصر التنظيمية الإضافية مثل مجرى البولي بيريميدين في اتجاه مجرى النهر من موقع الفرع ومنطقة استبعاد ثنائي النوكليوتيدات AG ، والتي تساعد في التعرف على 3 's 2. ميكانيكيا ، يقترن الحمض النووي الريبي النووي الصغير U1 (snRNA) مع 5's ss ، بينما يتفاعل موقع الفر....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. توليف مكتبة قليلة النوكليوتيدات (oligo) MaPSy

  1. هيكل oligo الأساسي: صمم كل oligo في تجمع 155-nuncleotide (nt) ليشمل تسلسلا خارجيا 35-nt وتسلسل داخلي 80-nt ، مما يشكل منطقة خاصة بالجين 115 nt محاطة بتسلسلات فتيلة مشتركة 20 nt في كل طرف (الشكل 2 أ).
  2. مجموعة المتغيرات: للاحتفاظ بسلامة الحافز والتركيز على المناطق التنظيمية التي تؤثر على التضفير ، اجمع المتغيرات الداخلية وهي:
    -78 إلى +10 nt من 3
    -3 إلى +30 nt من 5
    ملاحظة: يمكن الحصول على المتغيرات السريرية من ClinVar19 ، وإدخالات منخفضة التردد في dbSNP20 ، والمنشورات ذات الصلة ، وقواعد البيانات السر....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

بعد الربط الخلوي لتركيبات MaPSy ، توجد كل من المنتجات المقسمة وغير المقسمة كخليط. نظرا لتنوع حجم المكتبة وإمكانية الربط غير المتعارف عليه ، قد يبدو كلا النوعين من المنتجات منتشرين إلى حد ما على مادة هلامية. في التركيبات التي تستهدف نهاية 3 '، يميل الإنترون الثاني، الذي يحتوي على تسلسلات فيروسية غدية جزئية، إلى اللصق بقوة شديدة (الشكل 4 أ).

في تجارب MaPSy ، يظهر ما يقرب من 10-30٪ من المتغيرات ذات الصلة بالأمراض تغيرا في التضفير ، حيث أظهرت غالبية الحالات المهمة انخ.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تتيح إشارة EGFP الجوهرية في بنية MaPSy الكشف القائم على التألق لتخطي exon. إذا كان التسلسل في الإكسون الأوسط أو الإنترونات يعزز تخطي exon ، فإن ربط الإكسونات الأولى والثالثة ينتج إشارة EGFP يمكن اكتشافها بواسطة FACS ، مما يجعل هذه طريقة قيمة لتحديد المتغيرات التي تؤثر على تخطي exon وتسهيل التصور القائم على المجهر لمتغيرات الربط13. ومع ذلك ، فإن نهج تسلسل مكبر الصوت الموصوف هنا لا يلتقط منتجات تخطي exon ، لأنها تفتقر إلى معلومات المكتبة وبالتالي لا يتم تسلسلها. وبا.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعلن المؤلفون عدم وجود تضارب في المصالح.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم توفير الدعم التمويلي لهذا العمل من خلال جائزة التطوير الوظيفي ، وبرنامج أبحاث السحابة الصحية متعدد التخصصات ، ومنحة التحدي الكبير لبذور أكاديميا سينيكا (AS-CDA-108-M03 ، و AS-PH-109-01-3 و AS-GCS-113-L03) ، وجائزة التطوير الوظيفي للمعاهد الوطنية للبحوث الصحية ، تايوان (NHRI-EX112-10908BC) ، ومنح أبحاث الباحثين الشباب الممتازين وجائزة Ta-You Wu التذكارية للمجلس الوطني للعلوم والتكنولوجيا ، تايوان (MOST 112-2628-B-001-009-MY3 و 108-2118-M-001-013-MY5).

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
مجموعة Direct-zol RNA MiniPrep Plusأبحاث زيمو2072 راند
دولبيكو النسر المعدل s متوسط (DMEM)ثيرمو فيشر العلمي11965084
مصل الأبقار الجنينية (FBS)ثيرمو فيشر العلمي26140079
لام-الجلوتامينثيرمو فيشر العلميA2916801 
ليبوفيكتامين 3000 ثيرمو فيشر العلميL3000015
البنسلين - الستربتومايسينثيرمو فيشر العلمي15140122
pGint البلازميدأدجين24217
Phusion عالية الدقة بوليميراز الحمض النوويثيرمو فيشر العلميF530L
طقم استخراج الجل QIAquickكياجين28706
طقم تنقية QIAquick PCR   ؛كياجين28106
طقم فحص الحمض النووي QIAxcel (2400)كياجين929004
النسخ العكسي SuperScript IVثيرمو فيشر العلمي18090010

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Baralle, F. E., Giudice, J. Alternative splicing as a regulator of development and tissue identity. Nat Rev Mol Cell Biol. 18 (7), 437-451 (2017).
  2. Gooding, C., et al. A class of human exons with predicted distant br....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Splicing ErrorsIntronic VariantsRNA SplicingMassively Parallel AssaySplicing MinigenesExon JunctionSpliceosome AssemblyGenome EditingSplicing EfficiencyDisease Mutations

Related Articles