مقالة منهجية

مقايسة الربط المتوازية على نطاق واسع لفحص أخطاء الربط الناجمة عن المتغيرات الداخلية المرتبطة بالأمراض

DOI:

10.3791/68984

⸱

سبتمبر 9, 2025

 ,  ,  ,  ,  , 
1Institute of Molecular Biology, Academia Sinica, 2Genome and Systems Biology Degree Program, Academia Sinica and National Taiwan University, 3Institute of Statistical Science, Academia Sinica

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هنا ، نقدم بروتوكولا مفصلا لإجراء فحوصات التضفير المتوازية على نطاق واسع (MaPSY) ، والتي تستخدم تركيبات الجينات الصغيرة لتقييم المتغيرات الداخلية بشكل منهجي بكميات كبيرة. يتيح هذا النهج تحليلا عالي الإنتاجية لتغيرات التضفير الناجم عن المتغير في الخلايا من خلال تسلسل الأمبليكون ، مما يوفر تقييمات وظيفية لتأثيرها على التضفير المسبق للرنا المرسال.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تمثل أخطاء الربط 10-30٪ من الطفرات المسببة للأمراض المسؤولة عن الاضطرابات الوراثية النادرة. يضمن تضفير الحمض النووي الريبي التعبير الجيني الصحيح عن طريق الانضمام الانتقائي إلى exons وإزالة الإنترونات ، مع وجود التسلسلات التنظيمية الرئيسية داخل الإنترونات. يتفاعل موقع لصق 5 بوصات وموقع الفرع مع الحمض النووي الريبي النووي الصغير لتشكيل مركب التعرف على الجسيم الرسولي ، في حين أن عناصر مثل مجرى البولي بيريميدين ومحسنات / كاتمات صوت الربط تجند البروتينات لتنظيم تجميع الجسيم. يعد التنبؤ باضطرابات الربط من المتغيرات الداخلية أمرا صعبا بسبب تعقيد هذه التفاعلات.

قد تؤدي المتغيرات الداخلية ، التي تشكل 90٪ من الاختلافات الجينية البشرية الطبيعية ، إلى تعطيل التضفير الكنسي وتؤدي إلى الإصابة بالمرض. للتحقيق في هذا الاحتمال ، قمنا بتطوير مقايسة التضفير المتوازية على نطاق واسع (MaPSY) لتقييم المتغيرات الداخلية التي يحددها المريض. تم ربط قليل النوكليوتيدات المركبة مع التسلسلات المرجعية أو المتغيرة في الجينات المصغرة التي تحتوي على إشارات المحفز والبولي أدينيل. تضمن كل بناء إكسونين ثابتين يحيطان بإكسون متوسط يؤوي تسلسل تقاطع الإنترون والإكسون المتغير ذي الاهتمام. تمت مقارنة كفاءة الربط الخلوي للتسلسلات المتغيرة بنظيراتها المرجعية ، مما يسمح لنا بتحديد الاضطرابات الكبيرة كمتغيرات الربط.

يمكن التحقق من صحة نتائج MaPSy من خلال مناهج إضافية ، مثل فحوصات الجينات الصغيرة أو تحرير الجينوم بوساطة كريسبر في الجسم الحي. علاوة على ذلك ، يمكن أن يوفر التحليل الكلي للوصلات المعطلة رؤى أعمق لآليات الربط والأساس الجزيئي للأمراض المرتبطة بأخطاء الربط.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ربط الحمض النووي الريبي هو عملية حاسمة تنضم إلى exons للترجمة وتزيل الإنترونات ، مما يسهل تصدير الحمض النووي الريبي ويحافظ على توازن الحمض النووي. تعمل هذه الآلية المنظمة بإحكام بطريقة زمنية ومكانية ، مما يساهم في تنوع النسخ وتعقيده1. يتم توجيه الربط من خلال الإشارات الرئيسية ، بما في ذلك موقع لصق 5 بوصات (5'ss) ، وموقع الفرع ، وموقع لصق 3 's (3'ss) ، جنبا إلى جنب مع العناصر التنظيمية الإضافية مثل مجرى البولي بيريميدين في اتجاه مجرى النهر من موقع الفرع ومنطقة استبعاد ثنائي النوكليوتيدات AG ، والتي تساعد في التعرف على 3 's 2. ميكانيكيا ، يقترن الحمض النووي الريبي النووي الصغير U1 (snRNA) مع 5's ss ، بينما يتفاعل موقع الفرع مع U2 snRNA3. يسهل النشاط المنسق لموقع الفرع ، ومسار البولي بيريميدين ، و 3 s ارتباط البروتينات النووية الصغيرة U2 (snRNPs) والعوامل المساعدة U2 ، مما يؤدي إلى تثبيت الرصيد ووضع نقطة التفرع للهجوم النووي على 5 ، وبالتالي بدء الربط.

مع التقدم السريع لتقنيات التسلسل ، تستمر تكلفة تسلسل الجينوم الكامل في الانخفاض ، مما يؤدي إلى كتالوج متزايد باستمرار للمتغيرات الجينية البشرية. تشير التقديرات إلى أن 10-30٪ من الطفرات المرتبطة بالأمراض في الاضطرابات الوراثية النادرة تؤثر على تضفير الحمض النووي الريبي4،5،6 ، وغالبا ما تنتج منتجات جينية شاذة قد تكون بمثابة أهداف علاجية. ومع ذلك ، فإن تقييم التأثير الوظيفي للمتغيرات الداخلية لا يزال يمثل تحديا بسبب تعقيد إشارات الربط ، والتي غالبا ما تكون زائدة عن الحاجة ومتدهورة. في حين أن مواقع لصق 5 و 3 تتميز بخصائص جيدة نسبيا ، فإن مواقع الفروع ومسالك البولي بيريميدين والعناصر التنظيمية الأخرى للربط تظهر تباينا كبيرا في التسلسل والموضعية في حقيقيات النوى الأعلى. أظهرت دراسات رسم الخرائط واسعة النطاق أيضا أن مواقع فرع متعددة يمكن أن توجد داخل إنترون واحد7،8،9،10 ، مما يعقد تفسير الاختلافات في حدود الإنترون-إكسون.

تم استخدام التعلم العميق لتقييم كيفية مساهمة التسلسلات الأولية في التعرف على موقع لصق4،11،12 ، مما يكشف عن أن متغيرات الربط تتجمع في مواقع لصق أساسية بينما تمتد بشكل ضئيل إلى exon ومنطقة 3 'من الإنترونات. يتماشى هذا النمط مع الفهم الراسخ بأن اختيار موقع لصق 5 بوصات يتم إملاءه بشكل أساسي من خلال تسلسلات الإجماع ، بينما يعتمد التعرف على موقع لصق 3 بوصات على عناصر داخلية إضافية ، مثل مواقع الفروع ومسالك البولي بيريميدين. ومع ذلك ، فقد تم تدريب النماذج الحالية على التمييز بين مواقع لصق التأسيس والمواقع البديلة أو الاصطناعية بدلا من التركيز على المتغيرات الداخلية على وجه التحديد. نتيجة لذلك ، تظهر هذه الأدوات الحسابية دقة تنبؤية معتدلة فقط ، حيث تحدد بشكل أساسي مواقع لصق ومتغيرات الربط الخارجية13،14،15،16. بالإضافة إلى النماذج التنبؤية ، فإن النظام التجريبي القادر على التحقق من صحة متغيرات الربط بكميات كبيرة من شأنه أن يعزز بشكل كبير تحديد وتوصيف عيوب الربط.

تظل بيانات تسلسل الحمض النووي الريبي الشاملة التي تربط المتغيرات الداخلية المرتبطة بالأمراض بالأنماط الظاهرية للتضفير نادرة بسبب ترددها المنخفض وصعوبة التنبؤ بنتائج التضفير من مجموعات البيانات الحالية. لمعالجة هذه الفجوة ، تم تطوير فحوصات الربط عالية الإنتاجية والنماذج الحسابية لتحليل متغيرات الربط بشكل منهجي. تم تصميم فحوصات مراسل الربط المتوازية على نطاق واسع (MaPSy) لتقييم تأثير التسلسلات المتغيرة على اختيار موقع لصق. من خلال دمج اختلافات التسلسل بالقرب من مواقع لصق 5 و 3 أو امتد مناطق إنترون-إكسون بأكملها داخل العمود الفقري الجيني المصغر الثابت ، يتيح MaPSy تقييما وظيفيا لتعديلات الربط. ومع ذلك ، نظرا لقيود تخليق قليل النوكليوتيدات السائبة ، لا يتم التقاط المتغيرات الإنترونية العميقة وتنشيط exon الزائف في هذا النهج.

تم التحقق من صحة متانة MaPSy باستخدام 70 جينا صغيرا مستقلا للربط ، مما ينتج عنه ارتباط بيرسون 0.8917. والجدير بالذكر أن ما يقرب من 90٪ من متغيرات مانحي الربط (+1 و +2) أظهرت عيوبا في الربط ، مما يسلط الضوء على دقة الفحص. بالإضافة إلى ذلك ، كشفت MaPSy مع تسلسلات موقع الفرع العشوائية عن الطبيعة المتدهورة للتعرف على موقع الفرع واعتماده على البروتينات الأساسية U218. علاوة على ذلك ، تم استخدام تصميم MaPSy المنفصل GFP إلى جانب فرز الخلايا المنشط بالتألق (FACS) للتحقيق في أحداث تخطي exon الناتجة عن الاختلافات الجينية. كشف هذا النهج أن 54٪ من المتغيرات المسببة لاضطراب الربط موجودة في المناطق الداخلية ، بما في ذلك مواقع لصق الربطالكنسية 13 ، مما يؤكد الدور المهم للعناصر الداخلية في تنظيم الربط. بشكل جماعي ، تعزز هذه النتائج أهمية التسلسلات الداخلية في التحكم في الربط وتوضح فائدة MaPSy في تحديد عيوب الربط المرتبطة بالأمراض (الشكل 1).

figure-introduction-1
الشكل 1: التصميم التجريبي لمقايسة الربط المتوازية على نطاق واسع (MaPSy) للطفرات الداخلية القريبة من exon. تم جمع المتغيرات الموثقة في قواعد بيانات الأمراض البشرية وتصنيعها على شكل 5,307 زوجا من oligos. يحتوي كل زوج من oligo على مرجع وأليل متغير عبر المناطق الخارجية ذات 78 نيوكليوتيد (nt) و 35-nt. يحيط ب oligos مواقع فتيلة مشتركة للتضخيم والربط في جينات صغيرة للتضفير 3-exon. وفقا لذلك ، تشتمل المنطقة المركبة على 3 s من exon الثاني من الجين المصغر. بعد تجميع الجينات الصغيرة ، تم تقطيع الجينات الصغيرة المجمعة في خلايا الكلى الجنينية البشرية (HEK293T). تم حصاد الأشكال الإسوية المقسمة الناتجة وحلها عن طريق تسلسل الأمبليكون. تم تكييف هذا الرقم بإذن من Chiang et al.17. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. توليف مكتبة قليلة النوكليوتيدات (oligo) MaPSy

  1. هيكل oligo الأساسي: صمم كل oligo في تجمع 155-nuncleotide (nt) ليشمل تسلسلا خارجيا 35-nt وتسلسل داخلي 80-nt ، مما يشكل منطقة خاصة بالجين 115 nt محاطة بتسلسلات فتيلة مشتركة 20 nt في كل طرف (الشكل 2 أ).
  2. مجموعة المتغيرات: للاحتفاظ بسلامة الحافز والتركيز على المناطق التنظيمية التي تؤثر على التضفير ، اجمع المتغيرات الداخلية وهي:
    -78 إلى +10 nt من 3
    -3 إلى +30 nt من 5
    ملاحظة: يمكن الحصول على المتغيرات السريرية من ClinVar19 ، وإدخالات منخفضة التردد في dbSNP20 ، والمنشورات ذات الصلة ، وقواعد البيانات السريرية الإضافية. يمكن استخدام إحداثيات الجينوم لتقاطع المتغيرات مع المناطق الجينومية المرغوبة (على سبيل المثال ، باستخدام BEDTools21). يجب اختيار تعدد أشكال النوكليوتيدات أحادية النوكليوتيدات فقط (SNPs) والإدخالات / الحذف الصغيرة (indels) التي تقل عن 15 nt لتقليل تباين الحجم داخل مجموعة oligo للتوليف السائب.
  3. بنية الجين المصغر الأساسي: للحفاظ على بنية تقاطع الربط ، يحتوي كل عمود فقري صغير على ثلاثة إكسونات: اثنان من الإكسونات الخارجية الثابتة تشفر أجزاء من EGFP (من pGint ، Addgene Plasmid # 24217) وإكسون متوسط مشتق من exon 15 من CAMTA2 البشري (الشكل 2 ب). قم بهضم كل من جزء CAMTA2 و pGint باستخدام إنزيمات تقييد BamHI و SalI وربط جزء CAMTA2 في pGint بين exons EGFP ، مما يؤدي إلى إنشاء جينات صغيرة ثلاثية exon pGint-CAMTA2 (ملف تكميلي 1).
    ملاحظة: يجب أن يظهر الإكسون الأوسط ، أي CAMTA2 exon 15 ، كفاءة ربط وسيطة عند التعبير عنها في الخلايا المستهدفة. هذه الخاصية ضرورية لأنها توفر خط أساس متوازنا ، مما يسمح باكتشاف كل من الزيادات والنقصانات في كفاءة الربط بسبب التأثيرات المتغيرة.
  4. تصميم موقع التحضير: قم بإلحاق تسلسل موقع الإدراج بطرفي المكتبة بحيث يحتوي كل oligo على ~ 20-nt تسلسلات جانبية تتداخل مع موقع الإدراج المقصود داخل exon / intron الأوسط (الشكل 2 أ).
    ملاحظة: إذا تم تصميم تجمع oligo لتركيبات متعددة minigene ، فيمكن دمج مواقع تحضير متعددة.
  5. تصميم الباركود: بالنسبة للمتغيرات الداخلية ، تعد الرموز الشريطية الخارجية ضرورية لتمييز الأنماط الجينية عن المنتجات المقسمة ، حيث يتم فقدان التسلسلات الداخلية بعد الربط. لتجنب أي تغييرات في الربط بسبب تسلسلات الباركود (أي تأثير الباركود) ، ضع الرموز الشريطية بعيدا داخل الإكسونات ، بعيدا عن مواقع اللصق (أي بجوار موقع التحضير الخارجي مباشرة).
    ملاحظة: يوصى باستخدام رموز شريطية متعددة لكل متغير حيثما أمكن ذلك. يعتمد طول الرمز الشريطي المطلوب على مدى تعقيد المكتبة. على سبيل المثال:
    يكفي الرمز الشريطي 1-nt إذا أزواج أليل مرجعي مع متغير واحد فقط.
    يفضل استخدام الرمز الشريطي 2-nt إذا أزواج الأليل المرجعي بستة متغيرات مختلفة.
    قد تزيد المكتبات التي تحتوي على متغيرات متعددة مرتبطة ارتباطا وثيقا بأليل مرجعي واحد (على سبيل المثال ، تختلف بنيوكليوتيد واحد فقط) من تعقيد التحليل.
  6. ترتيب oligos: اطلب oligos بتنسيق ملف FASTA ، مع إقران كل تقاطع متغير جنبا إلى جنب مع الأليل المرجعي الخاص به.
    ملاحظة: بالنسبة للوصلات ذات المتغيرات المتعددة ، هناك حاجة إلى أليل مرجعي واحد فقط لكل تقاطع. تتوفر خدمات توليف التسلسل المجمع من شركات مثل GeneScript (https://www.genscript.com/gentitan-oligo-pools.html) و Twist Bioscience (https://www.twistbioscience.com/products/oligopools) و IDT (https://sg.idtdna.com/pages/products/custom-dna-rna/dna-oligos/custom-dna-oligos/opools-oligo-pools) و Agilent (https://www.agilent.com/en/product/oligo-pools-oligo-gmp-manufacturing/pooled-oligo-synthesis). قد يختلف طول التوليف وسعة المكتبة والتكاليف حسب المزود والمنطقة.

figure-protocol-1
الشكل 2: تصميم Oligo والربط minigene ل MaPSy. (أ) تصميم لتوليف oligo المجمع لنهاية الإنترونات. توضح الرسوم البيانية الهيكل الأساسي ل oligos 155-nt. تعتمد القدرة الفعلية لتخليق oligo على الشركة المختارة للإنتاج. (ب) تصميم الجينات الصغيرة MaPSy. تم تعديل الجين المصغر ثلاثي الإكسون (ii) من pGint البلازميد (i) ، وتم استبدال مواقع لصق ب oligos المجمعة لإدخال اختلافات إشارة الربط (ثالثا). الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

2. بناء قوالب الحمض النووي لمكتبة MaPSY

  1. تضخيم أولي عند استلام مجموعة oligo
    1. عند استلام تجمع oligo ، قم بتضخيم 10-50 نانوغرام من مكتبة oligo مع مواقع التحضير المرافقة المصممة بواسطة تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) 100 ميكرولتر باستخدام بوليميراز الحمض النووي عالي الدقة لتحويل oligos إلى خيوط مزدوجة (بادئات LibF و LibR في الجدول 1 ، إعدادات التدوير الحراري في الجدول 2).
    2. تنظيف منتجات PCR باستخدام أعمدة التنقية. بالتفصيل ، اربط منتج تفاعل البوليميراز المتسلسل بغشاء العمود ، ثم اغسله بمخازن تحتوي على 70٪ من الإيثانول لإزالة الاشعال والأملاح والبوليميراز المتبقية. أخيرا ، قم بإزالة منتج تفاعل البوليميراز المتسلسل المنقى باستخدام ماء منخفض الملح أو خالي من النوكلياز.
    3. تحقق من حجم oligo المضخم عن طريق الرحلان الكهربائي للجل. قم بتحميل 5 ميكرولتر من منتج تفاعل البوليميراز المتسلسل المنقى على جل الاغاروز بنسبة 1.5٪ محضر في 1× محلول TAE (40 ملي مولار قاعدة تريس ، 20 ملي مولار حمض الخليك ، 1 ملي مولار EDTA ، درجة الحموضة 8.0).
      ملاحظة: قلل من دورات تضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل إلى 15 لمنع التضخيم المفرط وتحيز تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR). قد يشير النطاق الضبابي الثانوي ، الذي عادة ما يكون أكبر من المنتج المستهدف ، إلى التضخيم المفرط والتلدين غير المكتمل داخل مجموعة oligo. احتفظ بجزء من منتجات PCR وقم بتسلسل مجمع oligo لتقييم الجودة ومعدلات الخطأ قبل المتابعة (نقطة التوقف).
  2. بناء الجينات المصغرة للربط MaPSy - تفاعل البوليميراز المتسلسل الأولي.
    1. شظايا العمود الفقري: استخدم 0.5 نانوغرام من العمود الفقري البلازميد pGint-CAMTA2 كمصدر لشظايا تفاعل البوليميراز المتسلسل الرئيسيتين
      1. منتج PCR 1: تضخيم مروج CMV ، أول exon (N-terminal EGFP) ، وجزء من الإنترون الأول (الجدول 1 والجدول 2).
      2. منتج PCR 3: تضخيم جزء من الإكسون الأوسط (إكسون CAMTA2 15) ، والإنترون الثاني ، والإكسون الثالث (C-terminal EGFP) ، وإشارة البولي أدينيل SV40 (الشكل 3 ، الجدول 1 ، والجدول 2).
    2. مكبر للصوت في المكتبة: منتج PCR 2: بالنسبة لمكتبة 3 ، قم بتضخيم مكبرات المكتبة بتسلسلات متداخلة في كل طرف لتتناسب مع الأطراف الداخلية لمنتج PCR 1 ومنتج PCR 3 ، مما يسمح بالتكامل الفعال في 3 من إكسون CAMTA2 15 (الشكل 3 ، الجدول 1 ، والجدول 2).
      ملاحظة: بالنسبة لمكتبة 5 ، استبدل الطرف 5 من تقاطع exon الأوسط بتسلسل المكتبة.
  3. بعد تفاعل البوليميراز المتسلسل ، قم بتنظيف جميع المنتجات باستخدام أعمدة التنقية كخطوة 2.1.2. لمنع التلوث من ناقل القالب ، قم بتنقية المنتجات المرغوبة من PCR1 و PCR3 عن طريق استخراج هلام الاغاروز. على وجه التحديد ، بعد الرحلان الكهربائي ، قم باستئصال ~ 100 مجم من هلام الاغاروز الذي يحتوي على منتج تفاعل البوليميراز المتسلسل المستهدف وقم بإذابته في المخزن المؤقت الربط. اربط محلول الجل المذاب بغشاء العمود ، ثم تابع بروتوكول تنقية تفاعل البوليميراز المتسلسل القياسي.
  4. بناء الجينات المصغرة للربط MaPSy - امتداد التداخل PCR: قم بإجراء جولة واحدة أو متسلسلة من تفاعل البوليميراز المتسلسل المتداخل لربط الأجزاء الثلاثة الرئيسية (منتج PCR 1 ، ومكبر المكتبة ، ومنتج PCR 3 ؛ استخدم ~ 20 نانوغرام لكل منهما كقالب) في جين صغير للربط كامل الطول (استخدم معظم البادئات الخارجية CAMGFPF و CMVGFPR في الجدول 1 ، وإعدادات التدوير الحراري في الجدول 2).
    ملاحظة: يحتوي المنتج النهائي على محفز CMV وثلاثة إكسونات مع أول 3 من مشتقة من مكتبة قليل النوكليوتيدات ، وهو جاهز للتعداء للتجارب القائمة على الخلايا.
  5. بعد التجميع ، قم بتنظيف قوالب الحمض النووي كاملة الطول باستخدام أعمدة تنقية PCR. إذا لوحظت أشرطة غير محددة في الجل ، فقم بإجراء استخراج الجل لعزل المنتج المطلوب بطول كامل بدقة كخطوة 2.3.
    ملاحظة: قد تؤدي التسلسلات المتشابهة إلى حد كبير في المكتبة إلى تجميع غير مكتمل. إذا كان التجميع الكامل في تفاعل تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل الواحد صعبا ، فقد تتم محاولة تفاعل البوليميراز المتسلسل المتداخل (بدءا من جزأين ، ثم إضافة جزء ثالث). لتحسين خصوصية تفاعل البوليميراز المتسلسل ، ضع في اعتبارك ضبط درجة حرارة التلدين أو تنفيذ تفاعل البوليميراز المتسلسل للهبوط لتعزيز خصوصية الربط للقوالب المعقدة. قم بإعداد تركيبات MaPSy كافية لإجراء أربع تجارب مستقلة على الأقل. احفظ حصة صغيرة من كل بناء لتسلسل الجيل التالي للتحقق من سلامة التسلسل ، حيث قد لا تتضخم بعض قليل النوكليوتيدات بكفاءة وتؤدي إلى تجميعات غير مكتملة (نقطة توقف).

figure-protocol-2
الشكل 3: سير عمل بناء المكتبة. (أ) البادئات المستخدمة في تفاعل البوليميراز المتسلسل المتداخل (انظر أيضا الجدول 1). (ب) إجراء تداخل تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR). باختصار ، تم تضخيم تجمعات oligo والأجزاء الأخرى من الجينات المصغرة للتضفير بواسطة 25 دورة PCR. تم خياطة الجزء الذي يحتوي على المروج والإكسون الأول (منتج PCR 1) في تجمع oligo (منتج PCR 2) عن طريق تداخل تفاعل البوليميراز المتسلسل باستخدام 20 دورة تضخيم. بعد ذلك ، تم خياطة المنتج المخيط (منتج PCR 1 + 2) بشكل أكبر في الجزء الذي يحتويعلى إشارة exon 3 و polyadenylation (منتج PCR 3) باستخدام 20 دورة تضخيم للحصول على التركيب النهائي (منتج PCR 1 + 2 + 3). تم تكييف هذا الرقم بإذن من Chiang et al.17. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

بناء كتاب MaPSY-library التمهيديملاحظه
CMVGFPFCCGCCATGCATTAGTTATTAATAGمنتج PCR 1
ليبر2كاجكتككاجككاج كاجمنتج PCR 1
ليبفGGCTGGGGCCTGAAGACCTGمنتج PCR 2
ليبرAAGGCGCACATGACCCCGGGمنتج PCR 2
ليب إف 2CCCGGGGTCATGTGCGCCTTمنتج PCR 3
CMVGFPRGGACAAACCACAACTAGAATGCمنتج PCR 3
برايمر PCR لمكتبة MaPSy لتسلسل المضخم
P7-Lib0FGTCTCGTGGGCTCGGGGGGTGTATAAGAGACAGAAGTTCAGCGTCCGGCGA
ص 7 - ليب1 إفGTCTCGTGGGCTCGGGGGTGTATAAGAGACAGNAAGTTCAGCGTCCGGCGA
ص 7-ليب2 إفGTCTCGTGGGCTCGGGGGTGTATAAGAGAGNNAAGTTCAGCGTCCGGCGA
P7-Lib3FGTCTCGTGGGCTCGGGGGTGTATAAGAGACAGNNNAAGTTCAGCGTCCGGCGA
P5-Lib0RITCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAGCGAAGGCTCCTGTCTCTGTAGT
P5-Lib1RITCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAGNCGAAGGCTCCTGTCTCTGTAGT
P5-Lib2RITCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGAGNNCGAAGGCTCCTGTCTCTGTAGT
P5-Lib3RITCGTCGGCAGCGTCAGATGTATAAGAGACAGNNNCGAAGGCTCCTGTCTCTGTAGT
التمهيدي للتحقق من الصحة
Lib0F (التحقق من صحة المكتبة)AAGTTCAGCGTCCGGgGGA
Lib0R (التحقق من صحة المكتبة)CAGCTTGCCGGTAGGTGGCAT

الجدول 1: البادئات المستخدمة في هذا البروتوكول.

مزيج تفاعل تفاعل PCR
مكوناتحجم
دي دي إتش2س13.4 ميكرولتر
5x HF Buffer4 ميكرولتر
10 ملي مولار dNTPs0.4 ميكرولتر
التمهيدي الأمامي 10 ميكرومتر0.5 ميكرولتر
التمهيدي العكسي 10 ميكرومتر0.5 ميكرولتر
(كدنا)1 ميكرولتر
بوليميراز الحمض النووي عالي الدقة0.2 ميكرولتر
قم بتشغيل برنامج PCR (تفاعل 20 ميكرولتر)
درجة الحرارةالوقتدورات
التمسخ الأولي98 درجة مئوية1 دقيقة1
التمسخ98 درجة مئوية30 ثانية10–20
الصلب65 درجة مئوية30 ثانية
امتداد72 درجة مئوية30 ثانيةالعودة إلى التمسخ
التمديد النهائي72 درجة مئوية5 دقائق1
مسك4 درجة مئويةمسكمسك

الجدول 2: إعدادات التدوير الحراري.

3. التعبير عن الجينات المصغرة للتضفير واستعادتها من خلايا الثدييات

  1. زراعة الخلايا: حافظ على HEK293T خلايا في وسط النسر المعدل (DMEM) من دولبيكو المكمل بمصل أبقار الجنين (FBS) بنسبة 10٪ ، و 100 وحدة / مل من البنسلين والستربتومايسين ، و 2 ملي ل-جلوتامين في 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 عند 37 درجة مئوية.
  2. تعداء الجينات الصغيرة للربط:
    1. اللوحة 5 × 105 خلايا HEK293T في 2 مل من الوسط في ألواح 6 آبار قبل 24 ساعة من التعدي.
    2. خلايا ترانسفكت مع 1-2 ميكروغرام من تركيبات MaPSy ، محتضنة مسبقا لمدة 5 دقائق مع كاشف تعدادية 3.75 ميكرولتر ، وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة. يشار إلى التعداء الناجح من خلال وجود إشارات EGFP من المكتبة المقسمة.
    3. تحلل الخلايا باستخدام 250 ميكرولتر تريزول (أو ما يعادله) 24 ساعة بعد التعدي.
  3. استخراج الحمض النووي الريبي: استخراج الحمض النووي الريبي الكلي باستخدام مجموعة التحضير المصغرة للحمض النووي الريبي ، باتباع بروتوكول الشركة المصنعة. على وجه التحديد ، اربط الحمض النووي الريبي في Trizol بأغشية العمود ، واغسله بمخازن تحتوي على 70٪ من الإيثانول لإزالة الأملاح والبروتينات والشوائب الأخرى ، وقم بإزالة الحمض النووي الريبي المنقى باستخدام ماء منخفض الملح أو خالي من النوكلياز.
    تحذير: تريزول (أو ما يعادله) شديد التآكل وسام. يمكن أن يؤدي التعرض إلى حروق كيميائية خطيرة وتندب دائم وفشل كلوي.
    ملاحظة: يمكن تخزين الحمض النووي الريبي في Trizol (أو كاشف مكافئ قائم على Trizol ، مثل مستخرج الحمض النووي الريبي TOOLSmart بواسطة TOOLS) عند -80 درجة مئوية لمدة تصل إلى عام واحد (نقطة توقف). يمكن تخزين الحمض النووي الريبي المنقى عند -80 درجة مئوية لمدة تصل إلى عامين إذا تم تقليل دورات التجميد والذوبان (نقطة التوقف).
  4. النسخ العكسي: قم بإعداد (كدنا) من إجمالي 2 ميكروغرام من الحمض النووي الريبي باستخدام النسخ العكسي مع سداسي عشوائي ، باتباع بروتوكول الشركة المصنعة. على وجه التحديد ، احتضن الحمض النووي الريبي مع سداسي عشوائي 50 ميكرومتر في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق للسماح بالتلدين ، ثم قم بإجراء النسخ العكسي عند 55 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.
    ملاحظة: يمكن تخزين (كدنا) عند -20 درجة مئوية لمدة تصل إلى عام واحد (نقطة التوقف).
  5. تضخيم الجينات الصغيرة المقسمة: قم بإجراء تفاعل البوليميراز المتسلسل باستخدام تسلسلات التحضير المحددة للجينات المصغرة المقسمة (الجدول 2). استخدم الحد الأدنى من الدورات اللازمة لتصور المنتج على جل الاغاروز.
    ملاحظة: يجب أن تكون الأشرطة المختلطة من المنتجات غير المقسمة والمقسمة مرئية على الجل. قد تظهر العصابات منتشرة بسبب المجموعات المختلطة لأنواع الحمض النووي (الشكل 4 أ).
  6. قم بتنظيف منتج PCR باستخدام أعمدة التنقية كخطوة 2.1.2.
  7. إرفاق محولات التسلسل: قم بإجراء جولة أخيرة من تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) لإرفاق تسلسلات محول التسلسل بنهايات المبلكون. قم بتضمين 0-3 نيوكليوتيدات عشوائية في نهاية الأمبليكونات لضمان الكشف المتوازن عن التألق على منصة NextSeq (الجدول 1).
  8. قم بتنظيف منتج PCR باستخدام أعمدة التنقية كخطوة 2.1.2.

4. تسلسل وتحليل Amplicon

  1. تسلسل القراءة القصيرة: قم بإخضاع مكبرات PCR ل 150 تسلسلا مقترنا باستخدام Illumina Miseq أو Novaseq أو ما يعادلها ، من خلال منشأة أساسية أو خدمة تجارية.
  2. نسق:
    1. إنشاء جينوم مرجعي: قم بإنشاء "جينوم مرجعي" اصطناعي عن طريق تصنيف كل نمط وراثي فريد على أنه كروموسوم منفصل. يتضمن الجينوم المرجعي الإكسونات والإنترونات الاصطناعية الموجودة داخل المضخمات.
    2. محاذاة قراءات التسلسل: قم بمحاذاة قراءات الطرف المقترن مع الجينوم المرجعي باستخدام HISAT222،23 ، وضبط المعلمات للتحكم في العناصر الخاصة بالربط (انظر الملف التكميلي 2 للحصول على تفاصيل سطر الأوامر).
    3. حدد قراءات عالية الجودة: قم بتحويل SAM إلى تنسيق BAM، وقم بالتصفية للحصول على قراءات عالية الجودة (جودة التعيين ≥60)، ثم قم بفرز وفهرسة ملفات BAM24 (راجع الملف التكميلي 2 للحصول على تفاصيل سطر الأوامر).
    4. تحديد تقاطعات لصق وحساب قراءات التقاطع: قم بتحديد استخدام تقاطع اللصق عن طريق استخراج أحداث تخطي exon من سلاسل CIGAR في ملف BAM المحاذاة. حدد قراءات التقاطع الممتدة استنادا إلى عمليات "N" ، وأعداد القراءة المجمعة لكل إحداثيات الوصلة والخيط لتقييم أنماط الربط (راجع الملف التكميلي 2 للحصول على تفاصيل سطر الأوامر).
    5. تصنيف مواقع لصق الكنسية: تصنيف مواقع لصق على أنها أساسية إذا كانت تتطابق مع تقاطعات GT-AG المشروحة.
      ملاحظة: في حالات نادرة ، قد تستخدم الأليلات المرجعية في MaPSy مواقع لصق غير قانونية. يقرأ أن تفتقر إلى التقاطعات التي تمتد على موضع موقع لصق معين يتم الاحتفاظ بها كقراءات غير مقسمة.
  3. التحليل الإحصائي لتحديد متغيرات الربط: تصنيف القراءات إلى ثلاث مجموعات:
    (1) قراءات مقسمة مقابل قراءات غير مقسمة ؛
    (2) الكنسية مقابل غير القانونية بين جميع القراءات المقسمة ؛
    (3) قراءات أساسية مقابل غير قانونية بالإضافة إلى قراءات غير مقسمة.
    قم بإجراء اختبار فيشر الدقيق على الوجهين ، متبوعا بتصحيح معدل الاكتشاف الخاطئ (FDR) (الجدول 3) ، لتقييم تأثير المتغيرات على كفاءة الربط ودقته.
  4. تصفية لمتغيرات الربط عالية الثقة: صنف كلا الزوجين المرجعيين / المتغيرين اللذين يتجاوز 100 عدد قراءة بقيمة q أقل من 0.05 عبر أربعة تكرارات على أنها مهمة. بعد ذلك ، ضع في اعتبارك المرشحين الذين لديهم تغيير في نسبة الاحتمالات بمقدار 2 ضعف مع وجود أليل مرجعي أو متغير يحتوي على >5٪ من القراءات غير المقسمة وغير المتعارف عليها ، ومتغيرات الربط عالية الثقة (الشكل 4 ب).
يقراتقسمغير مقسم و / أو غير قانوني
مرجعab
متغيرcd

الجدول 3: جدول اثنين في اثنين لاختبار فيشر الدقيق.

5. التحقق من الصحة

  1. التضفير Minigene للتحقق من الصحة:
    1. توليف Oligo وتضخيمه: تجميع قلة الحمض النووي لتسلسلات مرشحة MaPSy المختارة بشكل فردي (على سبيل المثال ، بواسطة تقنيات الحمض النووي المتكاملة). بعد ذلك ، قم بتضخيم oligos باستخدام التسلسلات الجانبية المصممة إلى خيوط مزدوجة بواسطة تفاعل البوليميراز المتسلسل باستخدام بوليميراز الحمض النووي عالي الدقة (الجدول 2).
    2. استنساخ الجينات المصغرة: هضم كل من منتجات تفاعل البوليميراز المتسلسل الناتجة و pGint-CAMTA2 بواسطة BbsI و SmaI وربط المنتج المهضوم بواسطة DNA ligases.
    3. تعدي: نقل التركيبات الناتجة إلى HEK293T الخلايا باستخدام كاشف تعداء كخطوة 3.2.2.
    4. استخراج الحمض النووي الريبي: استخراج الحمض النووي الريبي من الخلايا المنقولة ، كما هو موضح في الخطوة 3.3.
    5. النسخ العكسي: إجراء تفاعل البوليميراز المتسلسل للنسخ العكسي (RT-PCR) باستخدام سداسي عشوائي.
    6. تضخيم الشكل الإسوي للربط: قم بتضخيم الأشكال الإسوية للربط باستخدام بادئات تستهدف أول إكسونين من الجين المصغر (Lib0F و Lib0Rl ، الجدول 1 ، إعدادات التدوير الحراري في الجدول 2). حل المنتجات المضخمة عن طريق الرحلان الكهربائي والتصور باستخدام نظام Gel Doc.
    7. القياس الكمي: تحديد شدة الإشارة لكل شكل إسوي للربط باستخدام ImageJ (المعاهد الوطنية للصحة ، الولايات المتحدة الأمريكية) 25،26. بدلا من ذلك ، استخدم مجموعة فحص الحمض النووي باستخدام محلل الحمض النووي عالي الأداء eGENE HDA-GT12 لتحديد الكثافة والوزن الجزيئي لمنتجات تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR).
    8. استخراج الشكل الإسوي وتأكيده: عزل كل شكل إسوي عن طريق استخراج هلام الاغاروز كخطوة 2.3 ، وتأكيد نتيجة التضفير عن طريق تسلسل سانجر لمنتجات تفاعل البوليميراز المتسلسل من خلال منشأة أساسية أو خدمة تجارية ، وتقييم الربط الطبيعي ، وإدراج الإنترون ، وتخطي الإكسون.
  2. الجينات الصغيرة للربط متعدد exon:
    1. بعد التحقق من صحة نتائج MaPSy ، حدد المتغير محل الاهتمام واستنساخ ثلاثة إلى خمسة إكسونات من الحمض النووي الجيني (gDNA) لتوفير سياق جينومي أكثر لعيب التضفير الملحوظ.
    2. قم بإجراء الطفرات الموجهة للموقع باستخدام بادئات مطفرة وتفاعل البوليميراز المتسلسل المتداخل لتجميع تركيبات الجينات الصغيرة التي تؤوي تغيير التسلسل المطلوب في الموقع المستهدف.
      ملاحظة: إذا كانت الإنترونات المرافقة طويلة جدا للاستنساخ ، فاحتفظ بحوالي 300 nt من التسلسل intronic لكل موقع لصق لضمان سياق الربط المناسب.
    3. قم بإجراء فحص الربط المستند إلى الخلية كما هو موضح أعلاه في 5.1.
  3. التحقق الخلوي: للتحقق من صحة تأثير الربط في الخلايا ، استخدم تحرير CRISPR المستند إلى القالب لتغيير تسلسل المتغيرات المحددة في نموذج خلوي مناسب.
    ملاحظة: عندما يكون ذلك ممكنا ، استخدم عينات بشرية تحمل المتغير المحدد لتقييم نمط الربط مباشرة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

بعد الربط الخلوي لتركيبات MaPSy ، توجد كل من المنتجات المقسمة وغير المقسمة كخليط. نظرا لتنوع حجم المكتبة وإمكانية الربط غير المتعارف عليه ، قد يبدو كلا النوعين من المنتجات منتشرين إلى حد ما على مادة هلامية. في التركيبات التي تستهدف نهاية 3 '، يميل الإنترون الثاني، الذي يحتوي على تسلسلات فيروسية غدية جزئية، إلى اللصق بقوة شديدة (الشكل 4 أ).

في تجارب MaPSy ، يظهر ما يقرب من 10-30٪ من المتغيرات ذات الصلة بالأمراض تغيرا في التضفير ، حيث أظهرت غالبية الحالات المهمة انخ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تتيح إشارة EGFP الجوهرية في بنية MaPSy الكشف القائم على التألق لتخطي exon. إذا كان التسلسل في الإكسون الأوسط أو الإنترونات يعزز تخطي exon ، فإن ربط الإكسونات الأولى والثالثة ينتج إشارة EGFP يمكن اكتشافها بواسطة FACS ، مما يجعل هذه طريقة قيمة لتحديد المتغيرات التي تؤثر على تخطي exon وتسهيل التصور القائم على المجهر لمتغيرات الربط13. ومع ذلك ، فإن نهج تسلسل مكبر الصوت الموصوف هنا لا يلتقط منتجات تخطي exon ، لأنها تفتقر إلى معلومات المكتبة وبالتالي لا يتم تسلسلها. وبا...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعلن المؤلفون عدم وجود تضارب في المصالح.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم توفير الدعم التمويلي لهذا العمل من خلال جائزة التطوير الوظيفي ، وبرنامج أبحاث السحابة الصحية متعدد التخصصات ، ومنحة التحدي الكبير لبذور أكاديميا سينيكا (AS-CDA-108-M03 ، و AS-PH-109-01-3 و AS-GCS-113-L03) ، وجائزة التطوير الوظيفي للمعاهد الوطنية للبحوث الصحية ، تايوان (NHRI-EX112-10908BC) ، ومنح أبحاث الباحثين الشباب الممتازين وجائزة Ta-You Wu التذكارية للمجلس الوطني للعلوم والتكنولوجيا ، تايوان (MOST 112-2628-B-001-009-MY3 و 108-2118-M-001-013-MY5).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
مجموعة Direct-zol RNA MiniPrep Plusأبحاث زيمو2072 راند
دولبيكو النسر المعدل s متوسط (DMEM)ثيرمو فيشر العلمي11965084
مصل الأبقار الجنينية (FBS)ثيرمو فيشر العلمي26140079
لام-الجلوتامينثيرمو فيشر العلميA2916801 
ليبوفيكتامين 3000 ثيرمو فيشر العلميL3000015
البنسلين - الستربتومايسينثيرمو فيشر العلمي15140122
pGint البلازميدأدجين24217
Phusion عالية الدقة بوليميراز الحمض النوويثيرمو فيشر العلميF530L
طقم استخراج الجل QIAquickكياجين28706
طقم تنقية QIAquick PCR   ؛كياجين28106
طقم فحص الحمض النووي QIAxcel (2400)كياجين929004
النسخ العكسي SuperScript IVثيرمو فيشر العلمي18090010

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Baralle, F. E., Giudice, J. Alternative splicing as a regulator of development and tissue identity. Nat Rev Mol Cell Biol. 18 (7), 437-451 (2017).
  2. Gooding, C., et al. A class of human exons with predicted distant branch points revealed by analysis of AG dinucleotide exclusion zones. Genome Biol. 7 (1), R1(2006).
  3. Wilkinson, M. E., Charenton, C., Nagai, K. RNA splicing by the spliceosome. Annu Rev Biochem. 89, 359-388 (2020).
  4. Jaganathan, K., et al. Predicting splicing from primary sequence with deep learning. Cell. 176 (3), 535-548.e24 (2019).
  5. Lim, K. H., Ferraris, L., Filloux, M. E., Raphael, B. J., Fairbrother, W. G. Using positional distribution to identify splicing elements and predict pre-mRNA processing defects in human genes. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (27), 11093-11098 (2011).
  6. Calabrese, C., et al. Genomic basis for RNA alterations in cancer. Nature. 578 (7793), 129-136 (2020).
  7. Mercer, T. R., et al. Genome-wide discovery of human splicing branchpoints. Genome Res. 25 (2), 290-303 (2015).
  8. Taggart, A. J., et al. Large-scale analysis of branchpoint usage across species and cell lines. Genome Res. 27 (4), 639-649 (2017).
  9. Pineda, J. M. B., Bradley, R. K. Most human introns are recognized via multiple and tissue-specific branchpoints. Genes Dev. 32 (7-8), 577-591 (2018).
  10. Zeng, Y., et al. Profiling lariat intermediates reveals genetic determinants of early and late co-transcriptional splicing. Mol Cell. 82 (24), 4681-4699 (2022).
  11. Xiong, H. Y., et al. The human splicing code reveals new insights into the genetic determinants of disease. Science. 347 (6218), 1254806(2015).
  12. Cheng, J., et al. MMSplice: modular modeling improves the predictions of genetic variant effects on splicing. Genome Biol. 20 (1), 48(2019).
  13. Chong, R., et al. A multiplexed assay for exon recognition reveals that an unappreciated fraction of rare genetic variants cause large-effect splicing disruptions. Mol Cell. 73 (1), 183-194.e8 (2019).
  14. Rosenberg, A. B., Patwardhan, R. P., Shendure, J., Seelig, G. Learning the sequence determinants of alternative splicing from millions of random sequences. Cell. 163 (3), 698-711 (2015).
  15. Jian, X. Q., Boerwinkle, E., Liu, X. M. In silico tools for splicing defect prediction: a survey from the viewpoint of end users. Genet Med. 16 (7), 497-503 (2014).
  16. Riepe, T. V., Khan, M., Roosing, S., Cremers, F. P. M., 't Hoen, P. A. C. Benchmarking deep learning splice prediction tools using functional splice assays. Hum Mutat. 42 (7), 799-810 (2021).
  17. Chiang, H. L., et al. Mechanism and modeling of human disease-associated near-exon intronic variants that perturb RNA splicing. Nat Struct Mol Biol. 29 (11), 1043-1055 (2022).
  18. Gupta, A. K., et al. Degenerate minigene library analysis enables identification of altered branch point utilization by mutant splicing factor 3B1 (SF3B1). Nucleic Acids Res. 47 (2), 970-980 (2019).
  19. Landrum, M. J., et al. ClinVar: public archive of interpretations of clinically relevant variants. Nucleic Acids Res. 44 (D1), D862-D868 (2016).
  20. Sherry, S. T., Ward, M. H., Sirotkin, K. dbSNP-database for single nucleotide polymorphisms and other classes of minor genetic variation. Genome Res. 9 (8), 677-679 (1999).
  21. Quinlan, A. R., Hall, I. M. BEDTools: a flexible suite of utilities for comparing genomic features. Bioinformatics. 26 (6), 841-842 (2010).
  22. Kim, D., Landmead, B., Salzberg, S. L. HISAT: a fast spliced aligner with low memory requirements. Nat Methods. 12 (4), 357-360 (2015).
  23. Kim, D., Paggi, J. M., Park, C., Bennett, C., Salzberg, S. L. Graph-based genome alignment and genotyping with HISAT2 and HISAT-genotype. Nat Biotechnol. 37 (8), 907-915 (2019).
  24. Danecek, P., et al. Twelve years of SAMtools and BCFtools. Gigascience. 10 (2), giab008(2021).
  25. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
  26. Lind, R. Open Source Software for Image Processing and Analysis: Picture this with ImageJ. Open Source Software in Life Science Research. , Woodhead Publishing. Cambridge. (2012).
  27. Huang, A. C., et al. SpliceAPP: an interactive web server to predict splicing errors arising from human mutations. BMC Genomics. 25 (1), 600(2024).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

Splicing ErrorsIntronic VariantsRNA SplicingMassively Parallel AssaySplicing MinigenesExon JunctionSpliceosome AssemblyGenome EditingSplicing EfficiencyDisease Mutations

مقالات ذات صلة