مقالة منهجية

تطبيق الرحلان الكهربائي هلام بولي أكريلاميد في تحليل الكسور الفرعية للبروتين الدهني ذات الصلة بأمراض القلب والأوعية الدموية تصلب الشرايين

DOI:

10.3791/68996

⸱

أكتوبر 24, 2025

 ,  ,  ,  ,  , 
1Laboratory Medicine, Guangdong Provincial People's Hospital (Guangdong Academy of Medical Sciences), Southern Medical University

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يهدف هذا البروتوكول إلى تطوير طريقة تحليل الكسور الفرعية للبروتين الدهني بناء على الرحلان الكهربائي لهلام بولي أكريلاميد ، والذي يوفر أساسا تشخيصيا مهما لتقييم مخاطر أمراض القلب والأوعية الدموية. يمكن أن يقسم LDL إلى سبعة كسور فرعية. تتميز LDL1 و LDL2 بجسيمات كبيرة ، بينما تتميز LDL3 إلى LDL7 بجسيمات صغيرة.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

كوليسترول البروتين الدهني منخفض الكثافة (LDL-C) هو عامل رئيسي في تطور أمراض القلب والأوعية الدموية تصلب الشرايين (ASCVD). ترتبط المستويات المرتفعة من LDL-C ارتباطا وثيقا بتكوين لويحات تصلب الشرايين وخطر الإصابة بأمراض القلب والأوعية الدموية. ومع ذلك ، فإن عدم تجانس LDL يؤثر بشكل كبير على قدرته على تعزيز تصلب الشرايين. تشير الأبحاث إلى أنه يمكن تصنيف جزيئات البروتين الدهني منخفض الكثافة (LDL) إلى LDL صغير كثيف (sdLDL) وLDL كبير الطفو (lbLDL). من بين هؤلاء ، من المرجح أن يخترق sdLDL بطانة الأوعية الدموية وله نشاط تعديل أكسدي أقوى ، والذي يرتبط بشكل خاص ب ASCVD. في المرضى الذين يعانون من متلازمة التمثيل الغذائي والسكري وفرط شحوم الدم ، قد تكون مستويات LDL-C طبيعية ، لكن نسبة sdLDL مرتفعة ، مما يؤدي إلى التقليل من مخاطر القلب والأوعية الدموية. لذلك ، فإن الكشف الدقيق عن الكسور الفرعية LDL أمر بالغ الأهمية لتقسيم مخاطر ASCVD إلى طبقات وتحسين استراتيجيات التدخل.

تعكس طرق الكشف التقليدية عن LDL-C ، مثل صيغة Friedewald والقياس المباشر ، مستويات الكوليسترول الكلي فقط ولا يمكنها التفريق بين الكسور الفرعية. تشمل طرق الكشف عن الكسور الفرعية LDL-C تقنيات الطرد المركزي الفائق (UC) ، والكروماتوغرافيا السائلة عالية الأداء (HPLC) ، والرنين المغناطيسي النووي (NMR). ومع ذلك ، فإن هذه الطرق لها متطلبات تقنية عالية أو عمليات معقدة أو معدات باهظة الثمن ، مما يجعلها غير عملية للاستخدام السريري على نطاق واسع.

تفصل تقنية الرحلان الكهربائي لهلام بولي أكريلاميد (PAGE) جزيئات البروتين الدهني من خلال تأثير المنخل الجزيئي واختلافات الشحن. تستخدم هذه التقنية أنظمة جل متدرجة غير متغير الطبيعة ، جنبا إلى جنب مع بقع محددة مثل السودان الأسود ، مما يوفر دقة عالية وقابلية استنساخ قوية وسهولة التشغيل. يمكن أن توفر كتابة البروتين الدهني باستخدام تقنية PAGE تقييما أكثر شمولا ودقة لمستويات البروتين الدهني لدى المرضى ، مما يساعد في قرارات العلاج السريري. قدمت هذه المقالة خمس نتائج تمثيلية. متوسط حجم جسيمات LDL للعينة A و B و C و D و E هو 275.3 Å و 266.6 Å و 258.2 Å و 257.4 Å و 252.9 Å ، مما يشير إلى خطر منخفض وهامشي وخفيف ومتوسط وشديد للإصابة بأمراض القلب والأوعية الدموية بسبب عسر شحميات الدم ، على التوالي.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وفقا لتقرير منظمة الصحة العالمية لعام 2021 ، لا تزال أمراض القلب والأوعية الدموية (CVD) السبب الرئيسي للوفاة بين الأمراض البشرية. يشير التقرير إلى أن 17.9 مليون شخص في جميع أنحاء العالم ماتوا بسبب الأمراض القلبية الوعائية في عام 2019 ، وهو ما يمثل ما يقرب من ثلث الوفيات العالمية1. ASCVD ، وهو نوع من الأمراض القلبية الوعائية ، هو السبب الرئيسي للوفاة بين سكان المناطق الحضرية والريفية في الصين ، ويشكل أكثر من 40٪ من جميع الوفيات2. تصلب الشرايين هو مرض التهابي مزمن في الأوعية الدموية مدفوع بعوامل الخطر التقليدية وغير التقليدية3. يتميز بترسب الدهون في جدار الشرايين4 ، وتكاثر الأنسجة الليفية وتكلس ، مما يؤدي في النهاية إلى سماكة جدار الوعاء الدموي ، وتقليل المرونة وتضييق التجويف. عسر شحميات الدم هو عامل الخطر الأكثر أهمية ل ASCVD ، حيث يعتبر LDL-C عامل خطر ممرض ل ASCVD ، ويلعب دورا مهما في تطور ASCVD5. العديد من الدراسات الوبائية, الدراسات العشوائية المندلية, والتجارب العشوائية ذات الشواهد العشوائية أظهرت باستمرار أن مستويات LDL-C في البلازما ترتبط ارتباطا إيجابيا بخطر ASCVD. يمكن أن يقلل خفض مستويات LDL-C من خطر ASCVD6.

LDL هو البروتين الدهني الأساسي المسؤول عن نقل الكوليسترول الداخلي في الجسم7. LDL في البلازما غير متجانسة ، وتتكون من مجموعة متنوعة من الجسيمات بأحجام وكثافات وتركيبات كيميائية مختلفة8. تتميز جزيئات LbLDL بكثافة أقل وحجم أكبر ، بينما تتميز جزيئات sdLDL بكثافة أعلى وحجم أصغر. يكمن عدم تجانس LDL في آثاره البيولوجية المتنوعة9. جزيئات LbLDL أكبر في القطر (≥ 25.5 نانومتر) ، وأقل كثافة (قريبة من 1.02 جم / مل) وفضفاضة في التشكل ، وتتكون من LDL1 و LDL2. تحتوي جزيئات LbLDL على كمية أعلى من استرات الكوليسترول. هم أقل عرضة للأكسدة أو اختراق بطانة الأوعية الدموية ، مما يجعلها أكثر أمانا نسبيا. في المقابل ، فإن جزيئات sdLDL لها قطر أصغر (< 25.5 نانومتر) 10 ، وكثافة أعلى (قريبة من 1.06 جم / مل) وبنية كثيفة ، تتكون من LDL3 إلى LDL7. تحتوي جزيئات SdLDL على كمية أقل من إستر الكوليسترول ولكن مستويات أعلى من الدهون الثلاثية والبروتين الشحمي B (ApoB) مقارنة ب lbLDL. خصائصها الفيزيائية تجعلها أكثر عرضة لاختراق الحاجز البطاني الشرياني. تحت البطانة الفرعية ، تتأكسد جزيئات sdLDL بواسطة أنواع الأكسجين التفاعلية (ROS) لتكوين LDL المؤكسد (ox-LDL) 11. يثبط Ox-LDL نشاط سينسيز أكسيد النيتريك البطاني (eNOS) ، ويقلل من إنتاج NO ويحفز الخلايا البطانية على التعبير عن VCAM-1 / MCP-1 ، مما يعزز التصاق الخلايا الوحيدة والهجرة12. تتمايز الخلايا أحادية النواة البطانية المهاجرة إلى بلاعم ، والتي تمتص الثور الضار بلا حدود من خلال مستقبلات الزبال. يتحول تراكم إستر الكوليسترول داخل الخلايا إلى خلايا رغوية ، وهي المكونات الأساسية لخطوط الدهون المتصلبة للشرايين. تفرز الخلايا الرغوية عوامل التهابية مثل IL-1β و TNF-α ، مما يزيد من الإجهاد التأكسدي وتلف البطانة ، وتشكل حلقة ردود فعل إيجابية13. يمكن أن ينشط التهاب الخلايا البطانية ، ويعزز تكوين الخلايا الرغوية ويسرع من تقدم البلاك. أظهرت دراستان جماعيتان كبيرتان أن sdLDL-C له قيمة مرجعية سريرية أكبر من LDL-C في التنبؤ بالمخاطر المحتملة ل ASCVD14-15 وتقييمها. لكن طريقة الكشف التقليدية عن LDL-C لا يمكنها اختبار الكسور الفرعية للبروتين الدهني بسبب محدودية الطريقة.

تعكس جزيئات LDL (LDL-P) عدد جزيئات LDL لكل وحدة حجم من الدم وتعمل كناقلات لجزيئات LDL ، كل منها يحتوي على جزيء ApoB واحد وجزيئات كوليسترول متعددة. يمثل LDL-C الكتلة الإجمالية للكوليسترول التي تحملها هذه الجسيمات. تتأثر مستويات LDL-C بعدد جزيئات LDL وكثافة الكوليسترول ، والتي قد لا تعكس تماما الخطر الفعلي16. على سبيل المثال ، قد يكون لدى المرضى الذين يعانون من متلازمة التمثيل الغذائي أو مرض السكري أو فرط الدهون مستويات LDL-C طبيعية ولكن LDL-P مرتفعة بشكل غير طبيعي (بسبب الجزيئات الصغيرة وانخفاض محتوى الكوليسترول). حتى مستويات LDL-C تحقق الهدف ، لا يزال ارتفاع LDL-P يمكن أن يزيد من مخاطر القلب والأوعية الدموية المتبقية. أظهرت الدراسات أن LDL-P أكثر تنبؤية من أي معلمة أخرى تتعلق ب LDL17. يعد تحليل الكسور الفرعية للبروتين الدهني أمرا بالغ الأهمية لفهم التسبب في ASCVD ، وتقييم المخاطر المتبقية ، وتوجيه العلاج الدقيق. في السنوات الأخيرة ، أوصت المبادئ التوجيهية المحلية أيضا بالكسور الفرعية LDL كمؤشرات لتقييم مخاطر ASCVD أو مراقبة العلاج18.

ASCVD هو السبب الرئيسي للوفاة على مستوى العالم. تعتمد استراتيجيات الوقاية والسيطرة بشكل كبير على إدارة الدهون. حاليا, فحص الأفراد الذين يعانون من عسر شحميات الدم في الممارسة السريرية يعتمد في المقام الأول على اختبارات الدهون الأربعة التقليدية, بما في ذلك الدهون الثلاثية (TG), الكولسترول الكلي (TC), نسبة الكولسترول في البروتين الدهني عالية الكثافة (HDL-C) و LDL-C. بالإضافة إلى ذلك ، تستخدم علامات الدهون الأخرى مثل البروتين الدهني (أ) ، والبروتين الشحمي A1 (ApoA1) ، و ApoB بشكل أساسي للسكان المعرضين لمخاطر عالية من ASCVD19 ، مثل مرضى السكري ومرضى ارتفاع ضغط الدم والمدخنين أو أولئك الذين تم التحكم في مستويات LDL-C لديهم ولكنهم لا يزالون يشكلون خطرا كبيرا.

مع تقدم البحث ، أصبحت قيود اختبار الدهون التقليدية واضحة بشكل متزايد ، لا سيما في فعالية الإنذار المبكر وشرح المخاطر المتبقية. يتم تشخيص عدد كبير من مرضى ASCVD في البداية بمستويات الدهون الطبيعية ، مما يجعل LDL-C غير فعال للتحذير الأولي. تظهر البيانات الوبائية أن حوالي 20٪ من المرضى الذين يعانون من متلازمة الشريان التاجي الحادة لديهم مستويات LDL-C ضمن المعدل الطبيعي (<3.4 مليمول / لتر) عند القبول ، مما يشير إلى أن اختبار الدهون التقليدي قد يفوت الأفراد المعرضين لمخاطر عالية. علاوة على ذلك ، حتى بعد تحقيق أهداف LDL-C ، قد يظل مرضى ASCVD يواجهون مخاطر عالية متبقية للأمراض الوعائية. في هؤلاء المرضى ، لا يمكن تفسير معظم أحداث الشريان التاجي المتبقية بانخفاض مستويات LDL-C. لذلك ، قد لا يلبي اختبار LDL-C البسيط تماما الاحتياجات السريرية لتشخيص وعلاج ASCVD ، لأن اختبارات الدهون الروتينية لا يمكن أن تفرق بين lbLDL-C و sdLDL-C.

أكدت دراسات متعددة وجود علاقة واضحة بين الكسور الفرعية للبروتين الدهني و ASCVD. يمكن أن تكون النتائج غير الطبيعية من اختبار الكسر الفرعي للبروتين الدهني بمثابة تحذير للوقاية الأولية من ASCVD لدى الأفراد ذوي مستويات الدهون الطبيعية ، مما يساعد على تحديد المجموعات المخفية عالية الخطورة. للوقاية الثانوية من ASCVD ، حيث تكون مستويات LDL-C بالفعل ضمن النطاقات المستهدفة ، يمكن أن يساعد اختبار الكسر الدهني في تقييم المخاطر المتبقية وتوجيه المزيد من العلاج20. لذلك ، من المتوقع أن يوفر الكشف عن الكسور الفرعية LDL الجديدة أهدافا جديدة للوقاية والعلاج من عسر شحميات الدم و ASCVD مقارنة باختبارات الدهون التقليدية.

يستخدم نظام الكشف والتحليل في مختبرنا بشكل أساسي PAGE لفصل الكسور الفرعية للبروتينات الدهنية بناء على حجمها وشحنتها. يتم فصل جزيئات البروتين الدهني بشكل أساسي حسب الحجم بسبب الغربلة الجزيئية في مصفوفة بولي أكريلاميد بواسطة PAGE. تهاجر الجزيئات الصغيرة بسرعة بينما يعيق الانسداد الفراغي الجزيئات الكبيرة وتهاجر ببطء. وكلما زادت الشحنة التي يحملها الجزيء ، زادت سرعة هجرته. يمكن لهذه الطريقة تقسيم البروتينات الدهنية بسرعة إلى اثني عشر جزءا فرعيا. ينقسم LDL إلى سبعة كسور فرعية ، تسمى LDL1 إلى LDL7. لديهم جميعا أحجام مميزة, كثافة, خصائص فيزيائية وكيميائية, سلوكيات التمثيل الغذائي وإمكانات تصلب الشرايين. يتم تصنيف LDL1 و LDL2 على أنهما lbLDL ، بينما يتم تصنيف LDL3 إلى LDL7 على أنه sdLDL. تشمل تقنيات الكشف عن الكسور الفرعي للبروتين الدهني UC و HPLC و NMR. ومع ذلك ، نظرا لمتطلبات المعدات العالية والتشغيل المعقد واستهلاك الوقت ، فإن تطبيقها السريري محدود نسبيا21. تفصل طريقة PAGE بكفاءة بين الكسور الفرعية المختلفة من LDL ، مما يجعلها أكثر سهولة في الاستخدام مقارنة بالتقنيات الأخرى. المعدات المستخدمة فعالة من حيث التكلفة ومحمولة ، مما يجعلها أكثر ملاءمة للاستخدام على نطاق واسع في المختبرات الروتينية السريرية. تهدف هذه الدراسة إلى التحقق من صحة PAGE كطريقة سريعة وفعالة من حيث التكلفة لتحليل الكسور السفلية LDL في عينات المصل لدعم اتخاذ القرار السريري.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يتم تقييم جميع العينات في هذه الدراسة والموافقة عليها من قبل لجنة مراجعة الأخلاقيات في مستشفى مقاطعة قوانغدونغ الشعبي (رقم الموافقة: KY2025-435-01). وقع جميع المشاركين موافقة خطية مستنيرة قبل التجربة.

1. إعداد المجموعة

  1. تحضير عازلة الجل
    1. تحضير 30٪ من مادة الأكريلاميد (ACR): يزن 30 جم من مادة الأكريلاميد ، ويضاف 80 مل من الماء منزوع الأيونات ، ويحرك حتى يذوب ، ويضبط على 100 مل. يحفظ في درجة حرارة 4 درجات مئوية في الظلام حتى الاستخدام.
    2. تحضير 1٪ بيساكريلاميد (BIS): يزن 1 غرام من بيساكريلاميد ، ويضاف 80 مل من الماء منزوع الأيونات ، ويحرك حتى يذوب ، ويضبط على 100 مل. يحفظ في درجة حرارة 4 درجات مئوية في الظلام حتى الاستخدام.
    3. تحضير 25٪ سكروز: يزن 25 جم من السكروز ، ويضاف 70 مل من الماء منزوع الأيونات ، ويحرك حتى يذوب ، ويضبط على 100 مل للتخزين عند 4 درجات مئوية.
    4. تحضير 10٪ من كبريتات الأمونيوم (APS): قم بإذابة 0.1 جم من كبريتات الأمونيوم في 1 مل من الماء منزوع الأيونات واستخدامه على الفور.
    5. تحضير 1M Tris (الرقم الهيدروجيني = 6.8): يزن 121.14 جم من trishydroxymethylaminomethane ، ويضاف 800 مل من الماء منزوع الأيونات ، ويحرك حتى يذوب ، ويضبط قيمة الأس الهيدروجيني على 6.8 ، ثم يصنع ما يصل إلى 1000 مل.
    6. تحضير 1M Tris (الرقم الهيدروجيني = 8.6): يزن 121.14 جم من trishydroxymethylaminomethane ، ويضاف 800 مل من الماء منزوع الأيونات ، ويحرك حتى يذوب ، ويضبط قيمة الأس الهيدروجيني على 8.6 ، ثم يصنع ما يصل إلى 1000 مل.
      ملاحظة: عند التعامل مع مادة الأكريلاميد ، ارتد قفازات مطاطية من البوتيل ، ونظارات واقية ، وملابس واقية ، وتعمل في غطاء دخان. في حالة ملامسة الجلد ، اغسلها على الفور بالماء والصابون ، ثم اطلب العناية الطبية. في حالة الاستنشاق ، انتقل إلى الهواء النقي.
  2. تحضير هلام الفصل
    1. خذ أنبوبا زجاجيا نظيفا وأغلق الطبقة السفلية بغشاء مانع للتسرب.
    2. أضف 8.29 مل من 30٪ ACR ، و 17.76 مل من 1٪ BIS ، و 10 مل من 25٪ سكروز ، و 1 مل من 10٪ APS ، و 10 مل من 1M Tris (الرقم الهيدروجيني = 8.6) ، و 0.1 مل من رباعي ميثيل إيثيلين ديامين (TEMED) ، و 32.85 مل من الماء منزوع الأيونات في دورق نظيف بالتسلسل. تخلط جيدا للحصول على 80 مل من الخمور الأم (بتركيز بولي أكريلاميد 3.3٪) وأضفها إلى الأنبوب الزجاجي بمعدل 1.2 مل لكل جذر. قم بالبلمرة في درجة حرارة الغرفة لمدة 60 دقيقة وأغلق السائل بالماء النقي لضمان سطح سائل مستو.
  3. تحضير الغراء المركز
    1. أضف 4.07 مل من 30٪ ACR ، و 3.05 مل من 1٪ مكرر ثانية ، و 5 مل من 25٪ سكروز ، و 0.5 مل من 10٪ APS ، و 5 مل من 1M Tris (الرقم الهيدروجيني = 6.8) ، و 0.05 مل من TEMED ، و 32.33 مل من الماء منزوع الأيونات في دورق نظيف بالتسلسل ، واخلطه جيدا للحصول على 50 مل من الخمور الأم (مع تركيز بولي أكريلاميد 3.05٪) ، أضفه إلى الأنبوب الزجاجي بسعة 0.2 مل لكل جذر. قم بالبلمرة في درجة حرارة الغرفة لمدة 60 دقيقة وأغلق السائل بالماء النقي لضمان سطح سائل مستو.
  4. تحضير محلول الحفظ
    1. يزن 6.4 جم من تريس ، و 75 جم من السكروز ، و 2.5 مل من الجلسرين ، و 0.3 مل من PC-300 (مادة حافظة مضادة للبكتيريا) وأضف 800 مل من الماء منزوع الأيونات ، وحركه حتى يذوب ، واضبط قيمة الأس الهيدروجيني على 6.8 ، وأخيرا يخفف إلى 1000 مل. يبلغ تركيز Tris-HCl حوالي 52 مليمولار.
  5. تحضير محلول تلطيخ سودان أسود
    1. يزن 0.03 جرام من أسود السودان ويذوب في خليط من 2 مل من الإيثيلين جلايكول ، و 6 مل من الإيثانول اللامائي ، و 2 مل من ثنائي ميثيل سلفوكسيد. بعد الترشيح ، قسمها إلى 1 مل لكل قارورة.
      ملاحظة: عند التعامل مع سوداء السودان وثنائي ميثيل سلفوكسيد ، ارتد قفازات النتريل والنظارات الواقية لمنع الاتصال المباشر. يجب إجراء العمليات في بيئة جيدة التهوية. اشطف الجلد والعينين على الفور بالماء بعد التعرض ، ثم اطلب العناية الطبية إذا لزم الأمر.
  6. التعبئة الداخلية
    1. تغليف كامل وفقا لمتطلبات تكوين المجموعة.

2. تكوين المجموعة

  1. تأكد من أن المنتج يحتوي على أعمدة مسبقة الصنع ومحلول حافظة ومحلول تلطيخ سودان أسود. يجب أن تحتوي الأعمدة الجاهزة على مادة الأكريلاميد ، وبيساكريلاميد ، والسكروز ، وبرسلفات الأمونيوم ، وتريس ، ورباعي ميثيل إيثيلين دينيديامين. يبلغ طول العمود الجاهز 75 ± 0.5 مم ، والقطر الداخلي 5.5 ± 0.02 مم ، والقطر الخارجي 7.0 ± 0.02 مم. يجب أن يحتوي محلول المواد الحافظة على تريس والسكروز والجلسرين والمواد الحافظة. يجب أن يحتوي محلول التلوين الأسود السوداني على أسود السودان ، والإيثيلين جلايكول ، والإيثانول اللامائي ، وثنائي ميثيل سلفوكسيد. تأكد من اختلاف مواصفات التعبئة والتغليف وفقا لكمية الأعمدة الجاهزة. يجب أن تحتوي حصة واحدة من الكاشف على عمود واحد مسبق الصنع. لا تجمع بين مجموعات الكاشف من دفعات مختلفة ، لأن ذلك قد يؤثر على النتائج التجريبية.

3. تحضير العينة

  1. تحضير المريض: تأكد من أن المريض على معدة فارغة أثناء سحب عينات الدم.
  2. استخدم أنابيب أخذ عينات جل فصل المصل وقم بجمع العينات وفقا لإجراءات التشغيل القياسية. يجب فصل الدم في أسرع وقت ممكن بعد جمع الدم لتجنب انحلال الدم.
  3. اختبر عينات المصل بعد الفصل في أسرع وقت ممكن في درجة حرارة الغرفة. إذا لم يكن الاختبار الفوري ممكنا ، فقم بتخزين العينات في درجة حرارة 2-8 درجة مئوية لمدة تصل إلى 7 أيام أو عند -20 درجة مئوية لمدة تصل إلى 30 يوما.
  4. أعد العينات إلى درجة حرارة الغرفة واخلطها بالكامل قبل الاستخدام ، خاصة بالنسبة للعينات المجمدة والمذابة. لا يسمح بالتجميد والذوبان المتكرر لأنه قد يضر بسلامة العينة. قد تؤثر عينة كل من الدهون وانحلال الدم على نتائج الاختبار. إذا كانت عينة من شحم الدم أو انحلال الدم الخفيفة ، فمن المستحسن إجراء الطرد المركزي عالي السرعة عند 14,462 × جم في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة. بالنسبة لعينات الدهون ، استخدم ماصة لشفط الطبقة الشفافة بأكملها من الأسفل. بالنسبة لعينات انحلال الدم ، اجمع المادة الطافية. ثم انقله إلى أنبوب طرد مركزي جديد وصمة عار. ومع ذلك ، إذا كان شحمية الدم أو انحلال الدم شديدا جدا ، فمن المستحسن سحب الدم مرة أخرى.

4. خطوات التشغيل

  1. اعداد
    1. أخرج الأعمدة والعينات الجاهزة لاختبارها. استخدم ماصة لشفط سائل الحفظ المتبقي من منفذ العينة للأعمدة الجاهزة. قم بموازنة الأعمدة والعينات الجاهزة إلى درجة حرارة الغرفة وإذابة مسحوق عازلة كهربائية 14.3 جم مع 800 مل من الماء منزوع الأيونات.
  2. صبغ
    1. خذ أنابيب طرد مركزي نظيفة وقم بترقيمها. يتوافق عدد الأنابيب مع ترتيب أنابيب جمع الدم. أضف أنابيب الطرد المركزي بنسبة 50 ميكرولتر إلى 10 ميكرولتر من محلول تلطيخ سودان أسود ، واخلطها جيدا ، واتركها لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة حتى تلطخ.
      ملاحظة: يعتمد مبدأ تلطيخ السودان الأسود على خصائصه المحبة للدهون. يمكن أن يحفز تفاعلات كروموجينية محددة مع المواد الدهنية مثل الدهون المحايدة والفوسفوليبيدات والمنشطات داخل الخلايا ، مما يؤدي إلى جزيئات سوداء بنية أو سوداء داكنة. في هذا النظام ، قمنا بتحسين وقت التلوين والجرعة باستخدام تصميم تجريبي أحادي العامل مع البروتوكول التالي. يتم اختيار ثلاث عينات مصل LDL-C (تركيزات عالية ومتوسطة ومنخفضة) ، مع أحجام تلطيخ مقابلة تبلغ 5 ميكرولتر و 10 ميكرولتر و 15 ميكرولتر و 20 ميكرولتر على التوالي. يتم ضبط فترات التلوين على 10 دقائق و 15 دقيقة و 20 دقيقة و 25 دقيقة و 30 دقيقة و 35 دقيقة و 45 دقيقة و 60 دقيقة. يتم إجراء تجارب الرحلان الكهربائي ، متبوعة بتحليل التدرج الرمادي للنطاقات الكهربية للتحقق من فعالية التلوين. يتم تحديد الظروف المثلى لتكون حجم تلطيخ 10 ميكرولتر مع مدة تلطيخ تتراوح ± 5 دقائق. يؤدي انخفاض حجم التلوين ومدته إلى تلطيخ كوليسترول البروتين الدهني بشكل خافت في حين أن الظروف المثلى قد حققت التوازن ، إلا أن حجم التلوين الأكبر ومدته ليسا ضروريين.
  3. الفصل الأيوني
    1. أدخل أعمدة متوازنة مسبقا في المقبس المطاطي لخزان الرحلان الكهربائي. يبعد منفذ العينة لعمود الهلام حوالي 2 سم عن السدادة المطاطية. تأكد من إغلاقه بإحكام وعدم حدوث تسرب. عندما لا يكون عدد أعمدة الجل النموذجية ممتلئا ، املأ المساحة الفارغة بسدادة مطاطية بدون فتحات.
    2. ثم صب المخزن المؤقت للرحلان الكهربائي في الخزانات العلوية والسفلية. قم بإزالة الفقاعات الموجودة في فم الأعمدة الجاهزة. أضف 25 ميكرولتر من العينات الملطخة إلى منفذ العينة للأعمدة الجاهزة.
    3. قم بتغطية الغطاء ، وقم بتوصيل مفتاح الطاقة ، واضبط معلمات الجهد (U = 100 فولت) ، والتيار (I = 3 مللي أمبير / أنبوب) ، والطاقة (P = 120 واط) ، والوقت (T = 70 دقيقة) لفصل الرحلان الكهربائي.
      ملاحظة: الجهد والطاقة والوقت هي معلمات ثابتة. يجب ضبط التيار وفقا لعدد عينات الاختبار (على سبيل المثال ، 10 أنابيب عينة ، I = 3 مللي أمبير × 10 أنابيب = 30 مللي أمبير).
    4. بعد اكتمال الرحلان الكهربائي ، قم بإيقاف تشغيل الطاقة وإزالة الغطاء واسكب المخزن المؤقت للرحلان الكهربائي على الجزء العلوي من جهاز الرحلان الكهربائي. أخرج أعمدة الجل بدورها وضعها على إطار التثبيت ، واسكب المخزن المؤقت للرحلان الكهربائي الزائد على السطح العلوي وقم بتحليله في نظام تحليل المسح.
  4. تحليل المسح الضوئي
    ملاحظة: نوع المحلل هو DY-03 ، وبرنامج الفحص هو KBL 3.3.9 GD.
    1. قم بتشغيل مفتاح الطاقة الخاص بمحلل المسح الضوئي، وانقر نقرا مزدوجا فوق برنامج نظام سطح المكتب، وانقر فوق Collection للدخول إلى واجهة البرنامج. انقر فوق تصدير علبة العينة في واجهة البرنامج ، ضع أعمدة الهلام على رف العينة بحيث يكون طرف أخذ العينات متجها نحو الجزء الداخلي من الجهاز. تأكد من وضع أعمدة الجل في المواضع المرقمة المقابلة. تم تخصيص الموضعين 25 و 26 لاختبار مراقبة الجودة فقط.
    2. انقر فوق استيراد علبة عينة على واجهة البرنامج لاستيراد درج العينة إلى الجهاز. انقر فوق مسح ضوئي للحصول على عينة من صور المسح الضوئي. يحتوي الجهاز على نظام تركيز تلقائي مدمج. يقوم تلقائيا بضبط التركيز بين وحدة المسح وأنبوب الجل لضمان تصوير واضح. يحدد البرنامج تلقائيا الموضع الأولي (VLDL) وموضع الإنهاء (HDL) للمخطط الكهربائي. عندما يتم اكتشاف قمم واضحة في هذه المواضع ، يتم قفل البرنامج على منطقة التحليل المخصصة للتحليل الطيفي.
    3. بعد إدخال معلومات المرضى ومسح الباركود ضوئيا ، انقر فوق التحليل والمعالجة في واجهة البرنامج ، سيقوم النظام تلقائيا بتحليل وإنشاء تقارير الاختبار. انقر فوق تحميل LIS لنقل تقارير الاختبار إلى نظام LIS.
    4. إخراج الأعمدة الجاهزة بعد المسح والتحليل ومعالجتها وفقا لمواصفات النفايات الطبية.

5. مراقبة الجودة

  1. قم بإجراء اختبار مراقبة الجودة من مستويين قبل اختبار العينة اليومي. خطوات تشغيل اختبار مراقبة الجودة هي نفسها خطوات اختبار العينة. مرجع النوع A هو متوسط قطر الجسيمات الأكبر من 268 Å. مرجع النوع B هو متوسط قطر الجسيمات الأقل من 265 Å.
    ملاحظة: تحليل النتائج: النوع A، متوسط حجم جسيمات LDL هو > 268 Å، ويتمثل LDL1 و LDL2 أكثر من ذلك، مما يشير إلى انخفاض خطر الإصابة بالأمراض القلبية الوعائية. النوع الوسيط (النوع INT) ، متوسط حجم جسيمات LDL هو 265 إلى 268 Å ، مما يشير إلى أن نسبة LDL3 إلى LDL7 أعلى من القيمة الحرجة. النوع B ، متوسط حجم جسيمات LDL هو < 265 Å ، حساب LDL3 إلى LDL7 أكثر ، مما يشير إلى ارتفاع خطر الإصابة بالأمراض القلبية الوعائية.

6. التحسينات التقنية

  1. لضمان نتائج تشخيصية دقيقة ، يجب تنفيذ التحسينات التقنية التالية.
    1. الفحص المسبق: تأكد من أن المرضى صائمون بالكامل قبل جمع الدم. استخدم مصل الدم أو البلازما المضادة للتخثر EDTA بدلا من البلازما المضادة للتخثر في الهيبارين. تأكد من دقة الماصة في امتصاصها. تجنب العينات الشديدة أو الانحلال الهي.
    2. أثناء الفحص: اضبط معلمات الرحلان الكهربائي للجهد (U = 100 فولت) ، التيار (I = 3 مللي أمبير / أنبوب) ، الطاقة (P = 120 واط) ، الوقت (T = 70 دقيقة) وفقا للبروتوكولات القياسية. ارتد قفازات معقمة لمنع تلوث الأنابيب الزجاجية التي قد تؤثر على القدرة على التقاط الصور والمسح الضوئي.
    3. بعد الفحص: عند إصدار التقارير ، راجع الكروماتوغرام غير الطبيعي بحثا عن التداخل المحتمل وقم بإعادة التحليل لتجنب تقديم استنتاجات تشخيصية غير صحيحة.
      1. الكروماتوگرام الطبيعي: في الموضع الأولي ل VLDL وفي موضع إنهاء HDL ، يكون لكل كلاهما ذروة مميزة (انظر قسم النتائج التمثيلية).
      2. مخطط كروماتوغرافي الشذوذ: في الموضع الأولي ل VLDL أو موضع إنهاء HDL لا يحتوي على قمة واحدة أو أكثر.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تهدف هذه الدراسة إلى ابتكار طريقة باستخدام PAGE للكشف عن الكسور الفرعية للبروتين الدهني في مصل المشاركين. الهدف هو تحديد ما إذا كانت الكسور الفرعية LDL-C هي في المقام الأول جزيئات كبيرة (LDL1 و LDL2) أو جزيئات صغيرة (LDL3 إلى LDL7). بعد تلطيخه باللون الأسود السوداني ، يتم فصل العينات بواسطة جهاز الرحلان الكهربائي في هلام بولي أكريلاميد. ثم يتم فصل البروتينات الدهنية إلى نطاقات مميزة داخل أنابيب الهلام ، ويتم إجراء تحليل الكسور السفلية باستخدام نظام تحليل المسح.

يحسب الجهاز التحليلي شكل الذروة ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

على الرغم من أن دور sdLDL كعامل خطر القلب والأوعية الدموية في تطور تصلب الشرايين قد تم تأكيده من خلال البحث ، إلا أنه لا توجد حاليا طريقة ثابتة لتحديد الكسور الفرعية LDL. على مدى العقود القليلة الماضية ، تم إحراز تقدم كبير في تطوير طرق الكشف عن الكسور الفرعية LDL. تعتبر جامعة كاليفورنيا المعيار الذهبي. يمكنه فصل الكسور الفرعية LDL بناء على اختلافات كثافتها ، والتمييز بين sdLDL و lbLDL بدقة عالية. ومع ذلك ، تتطلب هذه الطريقة أجهزة طرد مركزي فائقة باهظة الثمن ووقت طويل للطرد المركزي ، مما ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعلن المؤلفون أنه ليس لديهم مصالح متضاربة.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هذه الدراسة مدعومة بمنح من مشروع صندوق أبحاث العلوم والتكنولوجيا الطبية في مقاطعة قوانغدونغ (A2024108).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
مسحوق عازلة كهربائيشركة قوانغشي كانغبولاي للتكنولوجيا25030401لتحضير المحاليل العازلة وتوفير ظروف الرحلان الكهربائي
منتجات مراقبة الجودة عالية القيمةشركة قوانغشي كانغبولاي للتكنولوجيا25030301لمراقبة الدقة والدقة
محلول فصل كثافة عينة البروتين الدهني (الرحلان الكهربائي للهلام المتدرج)شركة قوانغشي كانغبولاي للتكنولوجياLSS60-SB1-A1  25030301لفصل مكونات النوع الفرعي للبروتين الدهني عن عينات المصل
منتجات مراقبة الجودة منخفضة القيمةشركة قوانغشي كانغبولاي للتكنولوجيا25030301لمراقبة الدقة والدقة
محلول تلطيخ سوداء في السودانشركة قوانغشي كانغبولاي للتكنولوجياLSS60-SB1-A1  25030301لتلوين العينة

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Qiao, Y. N., et al. Low-density lipoprotein particles in atherosclerosis. Front Physiol. 13, 931931(2022).
  2. Li, J. J., et al. 2023 Chinese guideline for lipid management. Front Pharmacol. 14, 1190934(2023).
  3. Kong, P., et al. Inflammation and atherosclerosis: signaling pathways and therapeutic intervention. Signal Transduct Target Ther. 7 (1), 131(2022).
  4. Xiang, Q., et al. New insight into dyslipidemia-induced cellular senescence in atherosclerosis. Biol Rev Camb Philos Soc. 97 (5), 1844-1867 (2022).
  5. Chen, L., et al. Low-density lipoprotein cholesterol, cardiovascular disease risk, and mortality in China. JAMA Netw Open. 7 (7), e2422558(2024).
  6. Mansoor, T., et al. Inclisiran as a siRNA inhibitor of proprotein convertase subtilisin/kexin type 9 (PCSK9): past, present, and future. Am J Cardiovasc Drugs. 25 (3), 293-306 (2025).
  7. Alam, M. R., et al. Lipid profile of coronary heart disease patients: a prospective observational study. World J Cardiovasc Surg. 11 (11), 114-124 (2021).
  8. Thongtang, N., et al. Metabolism and proteomics of large and small dense LDL in combined hyperlipidemia: effects of rosuvastatin. J Lipid Res. 58 (7), 1315-1324 (2017).
  9. Wang, J., et al. Discordance of small dense LDL cholesterol beyond LDL cholesterol or non-HDL cholesterol and carotid plaque. JACC Asia. 5 (8), 1012-1028 (2025).
  10. Ivanova, E. A., et al. Small dense low-density lipoprotein as biomarker for atherosclerotic diseases. Oxid Med Cell Longev. 2017, 1273042(2017).
  11. Libby, P. The changing landscape of atherosclerosis. Nature. 592 (7855), 524-533 (2021).
  12. Li, J., et al. The EGR3 gene modulates CRP and VCAM-1 expression to promote the development of atherosclerosis. Gene. 963, 149630(2025).
  13. Rodríguez-Fernández, M. A., et al. Virtual screening and molecular dynamics of cytokine-drug complexes for atherosclerosis therapy. Int J Mol Sci. 26 (7), 2931(2025).
  14. Ikezaki, H., et al. Small dense low-density lipoprotein cholesterol is the most atherogenic lipoprotein parameter in the prospective Framingham offspring study. J Am Heart Assoc. 10 (5), e019140(2021).
  15. Higashioka, M., et al. Small dense low-density lipoprotein cholesterol and the risk of coronary heart disease in a Japanese community. J Atheroscler Thromb. 27 (7), 669-682 (2020).
  16. Qiao, Y. N., et al. Low-density lipoprotein particles in atherosclerosis. Front Physiol. 13, 931931(2022).
  17. Kanonidou, C. Small dense low-density lipoprotein: analytical review. Clin Chim Acta. 520, 172-178 (2021).
  18. Joint Committee on the Chinese Guidelines for Lipid Management. Chinese guidelines for lipid management (2023). Zhonghua Xin Xue Guan Bing Za Zhi. 51 (3), 221-255 (2023).
  19. Jha, M., et al. Lipoprotein(a) - from biomarker to therapy: a review for the clinician. Am J Cardiol. 245, 42-53 (2025).
  20. Hirano, T. Clinical significance of small dense low-density lipoprotein cholesterol measurement in type 2 diabetes. J Diabetes Investig. 16 (3), 370-383 (2025).
  21. Rief, M., et al. Comparison of two nuclear magnetic resonance spectroscopy methods for the measurement of lipoprotein particle concentrations. Biomedicines. 10 (7), 1766(2022).
  22. Kroner, G. M., et al. Retrospective comparison of results for simultaneous orders for LDL particle count, apolipoprotein B, and LDL-C. Clin Chim Acta. 518, 38-42 (2021).
  23. Chary, A., et al. Association of LDL-cholesterol subfractions with cardiovascular disorders: a systematic review. BMC Cardiovasc Disord. 23 (1), 533(2023).
  24. Duan, R., et al. Estimation of the LDL subclasses in ischemic stroke as a risk factor in a Chinese population. BMC Neurol. 20 (1), 414(2020).
  25. Kotani, K., et al. Similarity and differences in small dense low-density lipoprotein assessment: two methods compared. Arch Med Sci Atheroscler Dis. 6, e166-e168 (2021).
  26. Simachew, Y. M., et al. Lipoproteins and cholesterol homeostasis in paediatric nephrotic syndrome patients. Biochem Med (Zagreb). 32 (2), 020706(2022).
  27. Hirano, T. Hypertriglyceridemia contributes significantly to high prevalence of small dense LDL-cholesterol in patients with type 2 diabetes, even when LDL-C targets are achieved. Diabetol Int. 14 (3), 288-293 (2023).
  28. Zhang, C., et al. Lipid and lipoprotein particle profiles in patients with type 2 diabetes mellitus: a comparative study between highlanders and lowlanders. Lipids. 60 (5), 293-302 (2025).
  29. Waldmann, E., et al. Effect of PCSK9 inhibition with evolocumab on lipoprotein subfractions in familial dysbetalipoproteinemia (type III hyperlipidemia). PLoS One. 17 (3), e0265838(2022).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

LDL LDL LDL

مقالات ذات صلة