يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

دمج علم الأدوية الشبكي لدراسة تأثير السينامالديهايد الوقائي ضد السمية العصبية الناتجة عن الأوكساليبلاتين

458 مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/69013

⸱

نوفمبر 28, 2025

 ,  ,  , 
1Department of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine Medical Oncology, Cancer Hospital of China Medical University, Cancer Hospital of Dalian University of Technology, Liaoning Cancer Hospital & Institute, 2China Medical University, 3Liaoning University of Traditional Chinese Medicine

في هذه المقالة

ملخص

تبحث هذه الدراسة في التأثيرات الوقائية للسينامالديهيد (CA) ضد الضرر الناتج عن الأوكساليبلاتين (OXA) في خلايا عقدة الجذر الظهرية للفئران (DRG). الآلية الأساسية تتضمن قمع مسار الإشارة JAK2/STAT3 وتنشيط مسار SLC7A11-GSH-GPX4، كما يتضح من خلال علم الأدوية الشبكي والتحقق التجريبي.

الملخص

تبحث هذه الدراسة في التأثيرات الوقائية للسينامالديهيد (CA) ضد الضرر الناتج عن الأوكساليبلاتين (OXA) في خلايا عقدة الجذر الظهرية للفئران (DRG). تم تحليل الأنشطة الدوائية للطب الصيني التقليدي، وتحديد أهدافه المحتملة، إلى جانب مستقلباته، باستخدام قاعدة بيانات وتحليل أنظمة الأدوية التقليدية للطب الصيني (TCMSP)، ومنصة البحث الحوسبي الشبكي المعتمدة على علم الأدوية التكاملي في الطب الصيني التقليدي (TCMIP)، ومنصات PharmMapper. يستخدم اختبار CCK-8 لتحديد التركيزات المثلى للأدوية، بينما تطبق اختبارات المالوندياليديهيد (MDA) لتقييم مستوى الأكسدة الدهنية. تم قياس مستويات Fe2+ وأنواع الأكسجين التفاعلي (ROS) داخل الخلايا باستخدام مجسات فلورية. تم فحص تأثير CA على مستويات تعبير البروتين، بما في ذلك p-STAT3 وXCT وGPX4، في خلايا DRG المعالجة ب OXA من خلال القطع المناعي. حدد تحليل علم الأدوية الشبكي 14 هدفا متداخلا بين "الألم العصبي المزمن-NP-الفيروبتوزيس". أظهرت النتائج التجريبية أن العلاج لمدة 24 ساعة ب 4.0 ميكرومول/لتر CA أعطى نتائج مثالية، حيث قلل بشكل كبير من مستويات MDA وFe2+ وROS في خلايا DRG (P < 0.05). علاوة على ذلك، أدى علاج CA إلى خفض تعبير JAK2، STAT3، p-STAT3، TFRC، ErbB-1، والعامل النووي-كابا B (NF-κB) (P < 0.05) مع زيادة تعبير XCT وGPX4 وFTH1 (P < 0.05). تشير هذه النتائج إلى أن CA يخفف من الضرر الناتج عن OXA في خلايا DRG من خلال تثبيط مسار إشارة JAK2/STAT3 وتنشيط محور SLC7A11-GSH-GPX4.

المقدمة

في السنوات الأخيرة، ثبت أن الفيروبتوزيس، كنوع غير موت الخلايا المماتة، متورط في تلف الأنسجة الناتج عن أدوية العلاج الكيميائي المختلفة. الآلية الأساسية للفيروبتوز هي تراكم منتجات بيروكسيد الدهونالمعتمدة على الحديد 1. تكشف الأبحاث حول آليات سمية السيسبلاتين العصبية أن هذا الدواء يحفز الفيروبتوزيس العصبي عبر عدة مسارات، ويرتبط هذا الدواء مباشرة بتطور السمية العصبية. على وجه التحديد، يثبط السيسبلاتين نشاط غلوتاثيون بيروكسيداز 4 (GPX4). باعتباره "جزيء فرامل" حيوي في الفيروبتوزيس، فإن تعطيل GPX4 يمنع إزالة هيدروبروكسيدات الدهون (L-OOH)، مما يسبب ضررا تأكسديا لأغشية الخلايا العصبية2. وفي الوقت نفسه، يمكن للأكساليبلاتين أن يعزز إطلاق الفيروبتوزيس في الخلايا العصبية ويزيد من إنتاج أنواع الأكسجين التفاعلية (ROS) عبر تفاعل فينتون، مما يزيد من تضخم سلسلة الفيروبتوزيس3. تشير هذه الأدلة إلى أن التنظيم المستهدف للتنكس العصبي قد يكون استراتيجية محتملة لتخفيف السمية العصبية لأكساليبلاتين.

أوكساليبلاتين (OXA)، وهو عامل كيميائي واسع الاستخدام يستخدم على نطاق واسع من الجيل الثالث القائم على البلاتين لعلاج سرطان القولون والمستقيم، يوفر فعالية قوية مضادة للأورام لكنه غالبا ما يرتبط بسمية عصبية كبيرة. غالبا ما يؤدي الإعطاء المزمن إلى ألم عصبي ناتج عن OXA (OINP)، مع معدل حدوث يصل إلى 60٪4، ويتميز بالألودينية الميكانيكية، فرط الألم الحراري، وفرط الحساسية للبرد5. على الرغم من انتشاره، لا تزال استراتيجيات العلاج الحالية لعلاج OINP غير كافية، مما يقلل بشكل كبير من جودة حياة المرضى. وبالتالي، فإن توضيح الآليات الجزيئية الكامنة وراء OINP وتحديد أهداف علاجية جديدة لا تزال مجالات حاسمة في البحث الجاري6.

السينامالديهيد (CA)، المكون النشط الأساسي لزيت القرفة الأساسي، هو سائل أصفر ولزج 7,8 ذو أنشطة بيولوجية متنوعة، بما في ذلك المبيد الحشري9، المضاد للميكروبات10، مضاد الفطريات11، مضاد أكسدة12، مضاد السكري13، مضاد للسرطان14، مضاد للالتهابات، وتأثيرات حماية عصبية وعائية15,16. تشير الأدلة الناشئة إلى أن CA قد يعيق تنشيط مسار إشارات JAK/STAT رقم 17. الصيغة الكيميائية ل CA هي C9H8O، وتركيبها الكيميائي موضح في الشكل 1. باعتبارها أحادية طبيعية للطب الصيني التقليدي، تظهر CA مجموعة واسعة من الأنشطة الدوائية. فيما يتعلق بالحماية العصبية، أكدت عدة دراسات أن CA يمكنه دخول الجهاز العصبي المركزي عبر الحاجز الدموي الدماغي، وتعزيز تعبير الإنزيمات المضادة للأكسدة (مثل HO-1 وNQO1) عن طريق تنشيط مسار إشارات Nrf2/ARE، وتقليل تراكم ROS في الخلايا العصبية، وبالتالي تخفيف الضرر التأكسدي العصبي في السكتة الدماغية الإقفاري. مرض الزهايمر وأمراض أخرى18،19. وفي الوقت نفسه، يمكن للكاليدولوجيا الكيميائية أن تثبط فرط تنشيط الخلايا الدبقية الدقيقة، وتقلل من إفراز عوامل الالتهاب (مثل TNF-α، IL-1β)، وتقلل من الاستجابة الالتهابية العصبية20. ومع ذلك، لم يتم الإبلاغ عما إذا كان حمض الجلوسيف الكيميائي يمكنه تخفيف السمية العصبية الناتجة عن الأوكساليبلاتين من خلال تنظيم مسار الفيروبتوزيس.

مسار الإشارة JAK2/STAT3 هو آلية مهمة لنقل الإشارات داخل الخلية تنقل الإشارات المستقبلة من غشاء الخلية إلى نواة الخلية، ويرتبط ارتباطا وثيقا بالعمليات البيولوجية الرئيسية مثل تكاثر الخلايا، التمايز، الاستماتة المبرمجة، الإجهاد التأكسدي، والاستجابات الالتهابية21. كمسار مرتبط ارتباطا وثيقا بالاستجابات الالتهابية، يمكن لمسار إشارة JAK3/STAT3 أن يحفز استجابات التهابية في حالة نشطة، مما يؤدي إلى تلف النسيج الالتهابي. تشير الدراسات إلى أن تثبيط مسار إشارة JAK3/STAT3 يمكن أن يقلل من الاستجابة الالتهابية والضرر التأكسدي في الفئران المصابة بالخرف الوعائي، وبالتالي يحسن الوظائف الإدراكية للفئران. بالإضافة إلى ذلك، يمكن لتثبيط مسار إشارات JAK3/STAT3 أن يخفف أيضا من الاستجابة الالتهابية لدى الفئران المصابة بالصرع، ويقلل من معدل الموت المبرمج العصبي، ويخفف من إصابة الدماغ23. على الرغم من أن حمض الكافيك (CA) له تأثير وقائي معين على الجهاز العصبي، إلا أنه لم يتم تحديد ما إذا كان تأثيره التحسن مرتبطا بتنظيم مسار إشارات JAK3/STAT3 حتى الآن.

تهدف هذه الدراسة إلى التحقق مما إذا كان التثبيط الصناعي لإشارات JAK2/STAT3 وتنشيط محور LC7A11-GSH-GPX4 يمكن أن يخفف من الضرر الناتج عن OXA في خلايا DRG لدى الفئران. بالإضافة إلى ذلك، يستكشف الكتاب التأثيرات المضادة للفيروبتوز المحتملة للحمض الكيميائي ويفحص دور الأهداف الرئيسية التي تم تحديدها من خلال علم الأدوية الشبكي في تنظيم الالتهاب في خلايا DRG.

تركز الأساليب العلاجية الحالية لسمية الأعصاب الناتجة عن الأوكساليبلاتين بشكل أساسي على تخلب أيونات البلاتين الحرة للتخفيف من تلف الأعصاب، مثل استخدام مركبات الكالسيوم والمغنيسيوم، مع الهدف الرئيسي هو تخفيف الاعتلالات العصبية الطرفية الحادة (مثل الخدر والوخز في اليدين والقدمين)24. ومع ذلك، لا تزال الآليات الدقيقة غير واضحة. تفتقر هذه العلاجات إلى القدرة على عكس الحالات المزمنة مثل تدهور المحاور العصبية وتدهور ألياف الأعصاب الناتج عن الأوكساليبلاتين، وتظهر فعالية محدودة في الوقاية من السمية العصبية التراكمية. في هذه التجربة، تم استكشاف التأثير الوقائي العصبي لعلاج 4 ميكرومولار CA تحت علاج OXA بمقدار 5 ميكرومولار من خلال دمج آليات مضادة للالتهابات ومضادة للفيروبتوسيس. تؤكد النتائج أن تفعيل هذه الآلية يعد خطوة أساسية حاسمة في OINP. قد يحل اكتشاف مثبطات محددة محل الأساليب غير المحددة القائمة، مما يعزز دقة وفعالية التدخلات العلاجية.

النموذج المخبري المستخدم في هذه التجربة يتضمن خلايا عصبية العقدة الظهرية الظهرية للجرذان معزولة لدراسة OINP. ومع ذلك، يختلف هذا النموذج بشكل كبير عن الخلايا الأولية البشرية في الخلفية الجينية، والخصائص الأيضية، وحساسية السمية، مما قد يجعل استنتاجات البحث صعبة التطبيق السريري بشكل مباشر. علاوة على ذلك، يعتمد الحفاظ الوظيفي للأنسجة العصبية في الجسم الحي على تنظيم دقيق للتنسيق متعدد الخلايا والبيئات الدقيقة الديناميكية - وهي عوامل معقدة يصعب تكرار نماذج المختبر بشكل كامل.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

ملاحظة: تم اشتقاق خط الخلايا من خطوط خلايا الفئران.

1. تحليل علم الأدوية الشبكي

ملاحظة: يمكن العثور على الروابط في جدول المواد.

  1. إيجاد أهداف محتملة ل CA
    1. استرجاع المعلومات الهيكلية من قاعدة بيانات PubChem واستكشاف الآليات البيولوجية المحتملة للكتل الكيميائي. بعد ذلك، أجر تحليل التنبؤ بالهدف باستخدام SwissTargetPrediction، مستفيدا من قدراته الحاسوبية المتقدمة.
    2. لتعزيز دقة وشمولية التحليل، قم بمقارنة الأهداف المتوقعة مع قواعد بيانات خاصة بالطب الصيني التقليدي، بما في ذلك TCMSP وTCMIP.
    3. راجع الأدبيات ذات الصلة لتحديد أهداف محتملة إضافية. تكرار قائمة الأهداف الموحدة لإنشاء مجموعة بيانات شاملة، تعمل كمرجع حيوي لمزيد من الدراسات وتطوير الأدوية التي تشمل CA.
  2. تحديد الأهداف المحتملة للألم العصبي (NP)
    1. باستخدام قاعدة بيانات GeneCards وقاعدة بيانات TTD، قم بإجراء بحث موسع باستخدام الكلمات المفتاحية "الألم العصبي" و"الفيروبتوزيس". أعط الأولوية لأهداف الجينات من قاعدة بيانات GeneCards مع "درجة الصلة" التي تتجاوز المتوسط، حيث تظهر هذه الجينات أهمية أكبر لتركيز البحث.
    2. دمج الأهداف الجينية المختارة مسبقا مع البيانات المسترجعة من قاعدة بيانات الأهداف العلاجية (TTD). ضمان التعرف الشامل على الأهداف المحتملة أثناء عملية التكامل من خلال مقارنة جميع أهداف الجينات المختارة مع مدخلات قاعدة بيانات TTD. إزالة المدخلات المكررة بشكل منهجي من مجموعة البيانات المتكاملة لأهداف الجينات. تحقق من أن مجموعة البيانات الناتجة تحتوي على قائمة فريدة من الأهداف المحتملة.
  3. تحديد أهداف تقاطع "CA-NP- فيروبوتوسيس"
    1. حدد تقاطع الأهداف ل CA وNP والفيروبتوزيس باستخدام مخطط فين تم إنشاؤه عبر الإنترنت.
    2. تم تعيين هذه الأهداف التقاطعية كمرشحين محتملين ل "مسار NP-ferroptosis المنظم من قبل كاليفورنيا."
  4. بناء شبكة تفاعل البروتين والبروتين (PPI)
    1. للمزيد من البحث، يرجى تقديم الأهداف الشائعة ل "CA-NP-ferroptosis"، "CA-NP"، و"CA-ferroptosis" إلى قاعدة بيانات STRING.
    2. اضبط عتبة درجة التفاعل عند "أعلى ثقة > 0.4" وحدد الحد الأقصى لعدد المتفاعلين إلى 10 لكل من الطبقتين الأولى والثانية من التفاعل. تطبيق الإعدادات الافتراضية لجميع المعلمات الأخرى، وإنشاء شبكة 4.5 PPI ل "CA-NP-ferroptosis".
  5. تحليلات إثراء GO وKEGG
    1. قم بتحميل أهداف التقاطع ل "CA-NP-ferroptosis" على منصة DAVID مع المعايير التالية: "اختر المعرف: رمز الجين الرسمي"، "نوع القائمة: الجينات"، و"النوع: الإنسان العاقل." تم إجراء تحليل إثراء الجينات (GO) عبر ثلاث فئات: العملية البيولوجية (BP)، المكون الخلوي (CC)، والوظيفة الجزيئية (MF).
    2. قم بإجراء تحليل إثراء مسار KEGG، وتصور البيانات الناتجة باستخدام مخططات الشريط التي تم إنشاؤها على منصة Hiplot.

2. الالتحام الجزيئي

  1. لتوضيح التفاعل بين المركبات الفعالة وأهدافها المرتبطة بالأمراض، احصل على معلومات هيكلية للمواد الفعالة من قاعدة بيانات PubChem كجزيئات صغيرة، مع استرجاع البنى ثلاثية الأبعاد للبروتينات المستهدفة من بنك بيانات البروتين (PDB) كنماذج بروتينية.
  2. استخدم PyMOL لمعالجة هياكل مستقبلات البروتين مسبقا عن طريق إزالة جزيئات الماء والروابط غير الأساسية. بعد ذلك، جهز البروتينات المستهدفة والمواد الفعالة للالتحام باستخدام أدوات الأوتودوك 1.5.7، وتنفيذ الالتحام الجزيئي شبه المرن باستخدام أوتودوك فينا.
  3. تحليل طاقات الارتباط ومواقع ارتباط المواد الفعالة على بروتينات المستقبلات. بالنسبة لبروتين JAK2، تم اختيار تركيبه (معرف PDB: 3e64) من قاعدة بيانات PDB بناء على بيانات البلورات بالأشعة السينية والدقة المثلى.
  4. استخدم برنامج PyMOL لتحضير بنية JAK2 عن طريق إزالة الربطات، وإزالة جزيئات الماء، وإضافة الهيدروجينات. تم الحصول على هياكل الجزيئات الصغيرة للمركبات الفعالة من PubChem.
  5. قم بتحميل البروتين والهياكل المركبة في AutoDock Tools 1.5.7، وحدد صناديق الإرساء، وقم بتنفيذ الالتحام الجزيئي باستخدام AutoDock Vina.

3. زراعة الخلايا

ملاحظة: سيتم استخدام الخطوات التالية مرارا وتكرارا في تجربة التحقق. التزم بتقنيات التعقيم الصارمة. استخدم هذا الجزء من التجربة جهاز طرد مركزي أفقي منخفض السرعة.

  1. قم بتعقيم التغليف الخارجي وزجاجات الزراعة الخاصة بالخلايا المعقمة التي تم شراؤها بنسبة 75٪ كحول، ثم انقله إلى أطباق الزراعة على طاولة عمل نظيفة جدا للزراعة الفرعية حتى يتم توزيع الخلايا على خمسة أطباق بتري قطرها 10 سم لضمان كمية كافية من المخزون الخلوي.
  2. حافظ على الخلايا بالتبريد عند -80 درجة مئوية للتجارب اللاحقة.
    1. جهز DMEM، وDMSO من درجة زراعة الخلايا، ومصل الأبقار الجنينية (FBS)، وأنابيب طرد مركزي بسعة 15 مل، وماصات، وأجهزة تبريد، وحمام ثلج. اخلط 1 مل من DMSO، و1 مل من FBS، و8 مل من DMEM لتحقيق حجم إجمالي 10 مل. برد DMSO على الجليد لمدة 15 دقيقة. أولا، انقل الوسط الأساسي إلى أنبوب الطرد المركزي، ثم أضف DMSO المبرد مسبقا ببطء أثناء الدوران. اخلط جيدا باستخدام الماصة، ثم أضف FBS بلطف وامزج مرة أخرى. خزن الخليط في حمام ثلج لاستخدامه لاحقا.
      ملاحظة: تركيز 20٪-50٪ من DMSO أدى إلى زيادة كبيرة في إفراز LDH، مما يشير إلى أن التركيزات العالية من DMSO سامة للخلايا، بينما 10٪ DMSO آمنة نسبيا. هذا لم يؤثر على تجربتنا25.
    2. خذ الخلايا التي تنمو لوغاريتميا، اغسلها ثلاث مرات باستخدام PBS، ثم أضف 0.25٪ تريبسين عند طبق 400 ميكرولتر/10 سم.
      ملاحظة: بمجرد حدوث انحسار السيتوبلازمي، أو تصبح الوصلات مرتخية، أو إذا ظهرت علامات على طفو واسع النطاق، يتم إيقاف عملية الهضم فورا.
    3. تحضير الهضم المسبق: تسخين الكواشف الرئيسية (محلول تريبسين-إيدتا 0.25٪ ووسط DRG كامل) إلى 37 درجة مئوية. قم بإزالة قارورة زراعة الخلايا من الحاضنة وتخلص من الوسط القديم باستخدام ماصة معقمة لمنع الوسط المتبقي من التأثير على كفاءة الهضم. اشطف الخلايا المزروعة بطبقة واحدة مرتين بسعة 5 مل من PBS معقمة لإزالة المصل المتبقي مع تجنب إزهار الخلايا.
    4. أضف 2 مل من محلول تريبسين-إيدتا المسخن مسبقا بنسبة 0.25٪ إلى وعاء الزراعة، لضمان تغطية طبقة الخلية المفردة بالكامل. حضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 1-3 دقائق. خلال هذه الفترة، راقب الخلايا تحت المجهر المقلوب كل 30 ثانية. توقف الهضم فورا عندما تبدأ معظم الخلايا في الانكماش وتصبح دائرية وتظهر مساحات خلايا مميزة (لمنع فرط الهضم وتلف الخلايا).
    5. أضف بسرعة 4 مل من الوسط المسخن مسبقا بالكامل إلى وعاء الزرعة. قم بعمل الماصة بلطف على الخليط 5 مرات باستخدام ماصة معقمة لتشتيت تجمع الخلايا في تعليق خلية واحدة. انقل كامل نظام التعليق أحادي الخلية إلى أنابيب طرد مركزية معقمة بسعة 15 مل وجمع حبيبات الخلية عن طريق الطرد المركزي عند 300 × g خلال 5 دقائق باستخدام طرد مركزي أفقي منخفض السرعة عند 25 درجة مئوية.
    6. تخلص من المادة الفائقة وأضف 5 مل من وسط الحفظ المحضر. انفخ بلطف باستخدام الماصة لخلط الخلايا بشكل متساو. وزعها بالتساوي في 5 قوارير.
    7. ضع علامة على الكريوفيال باسم الخلية، وتاريخ التجميد، والمشغل؛ ضعه في وعاء مجمد وخزنه في فريزر بدرجة حرارة -80 درجة مئوية، ثم انقله إلى النيتروجين السائل بعد التخزين طوال الليل.
  3. إنعاش الخلايا
    1. ارتد القفازات، وأخرج القارورة من علبة النيتروجين السائل، واغمرها فورا في ماء دافئ بدرجة حرارة 37 درجة مئوية مع هزها أحيانا لضمان الذوبان السريع (خلال دقيقة واحدة).
    2. أخرج القارورة من حمام الماء بدرجة حرارة 37 درجة مئوية، افتح الغطاء، استنشق تعليق الخلية باستخدام ماصة، انقله إلى أنبوب طرد مركزي، أضف عشرة أضعاف حجم وسط الزراعة، اخلط جيدا، واستخدم الطرد المركزي عند 300 x g لمدة 5 دقائق (25 درجة مئوية).
    3. تخلص من السوبرناتان، أضف 5 مل من وسط الزراعة مع 10٪ مصل أبقار جنيني (الوسط الكامل لهذه الحالة من الزراعة الخلوية)، تلقيح طبق الزراعة، وحضانة ثابتة في حاضنة بدرجة حرارة 37 درجة مئوية، 95٪ رطوبة، و5٪ ثاني أكسيد الكربون 2.
    4. استبدل وسط الزراعة في اليوم التالي (لإزالة بقايا DMSO والخلايا الميتة)، واستمر في مراقبة حالة النمو في الزرعة. إذا كانت كثافة الخلايا عالية، قم بإجراء الزراعة الفرعية بسرعة للتجارب اللاحقة.
  4. عد الخلايا
    ملاحظة: استخدم هذا الجزء من التجربة جهاز طرد مركزي أفقي منخفض السرعة.
    1. جهز 75٪ كحول مسبقا لتنظيف غرفة العد وغطاء الخزان، ثم جففها لاستخدامها لاحقا.
    2. أعد تعليق الخلايا المهضومة والمطردة مركزيا في 1 مل من الوسط، وتخفيف 50 ميكرولتر من تعليق الخلية مع 150 ميكرولتر من الوسط في أنبوب EP بسعة 1.5 مل لعمل تخفيف رباعي الأضعاف.
    3. اهتز بشكل متساو، خذ 10 ميكرولتر، واحقن بين غطاء الغطاء وغرفة العد لملء الحجرة بالكامل مع تجنب الفقاعات. ضعها تحت المجهر للملاحظة والعد. مبادئ العد: لا تحذف أو تعيد العد؛ عد الخلايا التي تلامس الحدود العليا واليسرى، لكن استثنيت تلك التي تلمس الحدود السفلية واليمنى.
    4. وفقا لمتطلبات التجريب، يتم حساب حجم الخلية بناء على عدد الخلايا المرغوب في الطلاء أو الزرع في الصحون ونتائج العد، ثم تكمل حجم الوسط الكلي بالوسط الكامل.

4. بروتوكول اختبار قابلية الخلايا

ملاحظة: تم اختيار دولوكسيتين كعامل مكافحة في الطب الغربي لأنه دواء مستخدم على نطاق واسع ومعتمد سريريا لعلاج الألم العصبي المحيطي. الفعالية الثابتة في هذا المؤشر (المدعومة بإرشادات الممارسة السريرية والتجارب العشوائية المحكمة) تضمن أن المجموعة الضابطة يمكنها توفير مرجع موثوق لتقييم الفعالية النسبية لتدخل الاختبار.

  1. أولا، تخلص من وسط الزراعة القديم من وعاء الزراعة وشطف سطح الخلية ب 5 مل PBS لإزالة المصل المتبقي. ثم أضف 2 مل من محلول تربسين-EDTA بنسبة 0.25٪ وحضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 1-3 دقائق. عندما تكشف الملاحظة المجهرية عن انكماش الخلية واستدارتها وانفصالها، أضف فورا 4 مل من وسط DRG الكامل لإنهاء الهضم وإعادة تعليق الخلايا عن طريق استخدام الماصات.
  2. انقل تعليق الخلية إلى أنبوب طرد مركزي واجمع حبيبات الخلية عن طريق الطرد المركزي عند 300 × g لمدة 5 دقائق باستخدام طرد مركزي أفقي منخفض السرعة عند 25 درجة مئوية. تخلص من المادة الفائقة وأعد تعليق الحبيبات الخلوية في أنبوب طرد مركزي بسعة 15 مل، ثم أعد تعليق التعليق جيدا وامزج التعليق.
  3. خذ أنبوب EP بسعة 1.5 مل، وأضف أولا 150 ميكرولتر من وسط الزراعة، يليه 50 ميكرولتر من تعليق الخلية. اخلط جيدا لتحقيق تخفيف أربع أضعاف.
  4. ثم استخدم 75٪ كحول لتنظيف غرفة العد وتغطية الزجاج، وتجفيفها، وهز أنبوب EP بشكل متساو مرة أخرى.
  5. أخرج 10 ميكرولتر من تعليق الخلية وحقنها بين زجاج الغطاء وغرفة العد، لضمان ملء السائل بغرفة العد دون توليد فقاعات.
  6. راقب تحت المجهر وعد عدد الخلايا وفقا لمبدأ العد، متجنبا الحذف أو التكرار.
    ملاحظة: إذا كان عدد الخلايا المحسوب، فإن تركيز الخلايا في أنبوب الطرد المركزي يكون n/mL.
  7. وفقا لمتطلبات التجريب، يتم زرع الخلايا في صفيحة مكونة من 96 بئر بكثافة 2000 خلية لكل بئر حسب الحاجة.
  8. أولا، حقن 200 ميكرولتر من PBS في كل بئر من الدائرة الطرفية لصفيحة مكونة من 96 بئر، ثم أضف وسط زراعة يحتوي على الخلايا حسب التجميع.
  9. بعد الحضانة في حاضنة 37 درجة مئوية، 95٪ رطوبة، 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة 24 ساعة، استنشق الوسط القديم وغسل مرتين ب 200 ميكرولتر من PBS. وفقا للإعداد التجريبي، قم بتخفيف CA خطوة بخطوة (0 ميكرومول، 2 ميكرومولار، 4 ميكرومولار، 8 ميكرومولار، 16 ميكرومولار، 32 ميكرومولار) وأضف 200 ميكرولتر إلى صفيحة ذات 96 بئر.
  10. يعالج الخلايا مسبقا ب OXA (5 ميكرومولار) لمدة 24 ساعة، ثم يعالج خلايا DRG بتركيزات متفاوتة من CA (0 ميكرومولار، 2 ميكرومولار، 4 ميكرومولار، 8 ميكرومولار، 16 ميكرومولار، 32 ميكرومولار) لمدة 24 ساعة على التوالي.
    ملاحظة: يهدف هذا الجزء من التجربة إلى تحديد التركيز الأمثل للدواء للحمض الكيميائي.
  11. اغسل صفيحة ال 96 بئر ثلاث مرات باستخدام مخزن PBS، ثم أضف 200 ميكرولتر من محلول CCK-8 الجاهز حديثا إلى كل بئر. يتم تنفيذ هذه الخطوة في الظلام، ويتم التحكم في وقت التجربة ليتم إكمالها خلال 10 دقائق. حضن المحلول لمدة 4 ساعات في حاضنة بدرجة حرارة 37 درجة مئوية، رطوبة 95٪، و5٪ ثاني أكسيد الكربون 2. وأخيرا، قس قيم الامتصاص باستخدام قارئ الميكروبلايت. كرر جميع التجارب ثلاث مرات على الأقل تحت ظروف متطابقة.

5. MDA

  1. زرع 10 ×10 خلايا DRG في طبق بحجم 15 سم وزرع طوال الليل في حاضنة بدرجة حرارة 37 درجة مئوية، رطوبة 95٪، و5٪CO2. أزل وسط الزراعة، أضف الأدوية، وحضن لمدة 24 ساعة في حاضنة بدرجة حرارة 37 درجة مئوية، رطوبة 95٪، و5٪ ثاني أكسيد الكربون.
  2. أزل وسط الزراعة واغسله مرة واحدة ب 5 مل من PBS. بعد الهضم، اجمع الخلايا في أنبوب مخروطي باستخدام وسط DMEM.
  3. أضف خلايا DRG المعالجة إلى أنابيب دقيقة بحجم 5 مل على التوالي. قم بالطرد المركزي عند 300 × g لمدة 5 دقائق باستخدام طرد مركزي أفقي منخفض السرعة، وإزالة السوبرناتانت. ثم أضف 1 مل من PBS، وامزجه بأنبوب أنابيب أنابيب بحجم 1.5 مل. قم بالطرد المركزي عند 300 × g لمدة 5 دقائق باستخدام طرد مركزي أفقي منخفض السرعة، وإزالة السوبرناتانت.
  4. أضف 100 ميكرولتر من محلول PBS المضاد للأكسدة، ثم استخدم الماصة للخلط، وحضر تعليق الخلية. جهز الحل القياسي ل MDA.
    ملاحظة: انظر تحضير محلول MDA القياسي باستخدام طريقة الفلورة؛ راجع قسم "مكونات المجموعة" في المجموعة لمزيد من الإجراءات التفصيلية.
  5. أضف 100 ميكرولتر من مخزن التحلل إلى أنبوب العينة والأنبوب القياسي على التوالي، وامزج جيدا باستخدام مذبذب الدوامة. اتركه في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق.
  6. أضف 250 ميكرولتر من محلول العمل المحضر إلى كل أنبوب، وامزج جيدا باستخدام خلاط الدوامة. سخن حوض الماء إلى 95 درجة مئوية في بيئة ضوء طبيعي لمدة 15 دقيقة، ثم ضعه في حمام الثلج لمدة 5 دقائق ليبرد. جهاز طرد مركزي زاوي عالي السرعة عند 10,000 × g لمدة 10 دقائق (4 درجات مئوية).
  7. خذ 100 ميكرولتر من المادة الفائقة وأضفها إلى صفيحة سوداء بسعة 96 بئر. قس شدة الفلورة باستخدام قارئ ميكرولوح فلوري (مثال: 540 نانومتر، كهرونوم: 590 نانومتر). احسب تركيز MDA في العينة بناء على المنحنى القياسي.

6. محتوى Fe2+ في الخلايا المقاس باستخداممجموعة كشف Fe2+

  1. سخن حمام الماء مسبقا وارفع درجة الحرارة إلى 37 درجة مئوية. ارتد القفازات، واسحب خلايا DRG من النيتروجين السائل، ولفها في طبقة من كيس بلاستيكي، ثم غمرها في ماء دافئ بدرجة حرارة 37 درجة مئوية مع هزها بلطف بشكل متقطع لضمان الذوبان الكامل خلال دقيقة واحدة.
  2. بعد إذابة الجليد، أزل القارورة من حمام الماء بدرجة حرارة 37 درجة مئوية، وافتح الغطاء، واسحب تعليق الخلية، وانقلها إلى أنبوب طرد مركزي بسعة 15 مل، وأضف 10 مل من وسط الزراعة بقطر كامل، مع خلط جيد. جهاز طرد مركزي أفقي أفقي منخفض السرعة عند 300 × g لمدة 5 دقائق (25 درجة مئوية).
  3. بعد الطرد المركزي، تخلص من السوبرناتانت، أضف 10 مل من وسط الزراعة الطازج، ثم استخدم الماصة لخلطها جيدا، ثم استخدم الطرد المركزي مرة أخرى. كرر هذه العملية ثلاث مرات قبل التطعيم على أطباق الزراعة الجديدة.
  4. زراعة الخلايا بشكل ثابت في حاضنة بدرجة حرارة 37 درجة مئوية، رطوبة 95٪، و5٪ ثاني أكسيد الكربون 2. استبدل الوسط في اليوم التالي لإزالة بقايا DMSO والخلايا الميتة، ثم استمر في الزراعة. إذا كانت كثافة الخلايا عالية، فيجب زراعة الفروع في الوقت المناسب. بعد ذلك، يجمع الخلايا في مرحلة النمو اللوغاريتمي، ويهضمها، ويقوم بالطرد المركزي، ثم يعيدها للتعليق. زرع الخلايا المعلقة في صفائح بئر 12 بكثافة بين 70٪-80٪، ثم أعيد وضع الصفائح في حاضنة CO2 بدرجة حرارة 37 درجة مئوية، رطوبة 95٪، و5٪CO2 لمزيد من الزراعة.
  5. راقب حالة الخلية في اليوم التالي، وقدم المعالجات المقابلة وفقا للإعداد التجريبي، ثم أعدها إلى حاضنة بدرجة حرارة 37 درجة مئوية، 95٪ رطوبة، و5٪ ثاني أكسيد الكربون للاستمرار في الزراعة.
  6. بعد 24 ساعة من إعطاء الدواء، تخلص من وسط الزراعة الأصلي وغسل الخلايا مرة واحدة باستخدام متلازمة زبدة الفول السوداني (PBS). أضف 300 ميكرولتر لكل بئر من مسبار فيرو أورانج (1 ميكرومتر) مخفف في HBSS، وحضن عند 37 درجة مئوية، ورطوبة 95٪، وثاني أكسيد الكربون 5٪ لمدة 30 دقيقة.
  7. ثم أضف محلول تلوين الخلايا الحية Hoechst 33342 (100x) إلى صفيحة الخلية بنسبة 1:100، ثم حضن في درجة حرارة الغرفة في الظلام لمدة 5 دقائق لتلوين نوى الخلية.
  8. راقب تأثير التلوين تحت مجهر الفلورة والتقط صورا للتوثيق. بعد ذلك، استخدم ImageJ لحساب متوسط شدة الفلورة، مع تكرار التجربة ثلاث مرات للتحليل الإحصائي.

7. مجموعة كشف ROS

  1. خذ الخلايا في مرحلة النمو اللوغاريتمي، هضمها، وقم بالطرد المركزي، وأعد تعليقها، ثم زرع الخلايا في صفيحة مكونة من 12 بئر بكثافة (70٪-80٪). بعد خلط الخلايا جيدا، ضعها في حاضنة بدرجة حرارة 37 درجة مئوية، رطوبة 95٪، و5٪ ثاني أكسيد الكربون 2 لمواصلة الزراعة.
    ملاحظة: لخطوات الهضم، والطرد المركزي، وإعادة التعليق، يرجى الرجوع إلى الخطوة 4.1.
  2. راقب حالة الخلية في اليوم التالي، وأعط العلاجات المتوافقة وفقا لإعداد التجربة، ثم أعد الخلايا إلى حاضنة بدرجة حرارة 37 درجة مئوية، رطوبة 95٪، و5٪ ثاني أكسيد الكربون لمواصلة الزراعة. بعد 24 ساعة من إعطاء الدواء، تخلص من وسط الزراعة الأصلي وغسل الخلايا مرتين باستخدام HBSS.
  3. أضف 200 ميكرولتر من محلول الصبغة DCFH-DA عالي الحساسية، ثم حضن على حرارة 37 درجة مئوية، رطوبة 95٪، حاضنة ثاني أكسيد الكربون 5٪ لمدة 30 دقيقة.
  4. تخلص من السوبرناتانت، واغسلها مرتين باستخدام HBSS، ثم صبغ بمحلول تلوين هوشت 33342 الحية بسعة 2 ميكرولتر (100x) لمدة 5 دقائق، ثم افحصه تحت مجهر فلوري. كرر التجربة ثلاث مرات مع التحليل الإحصائي.

8. الشكل الميتوكوندري للخلايا التي لوحظت باستخدام TEM

  1. تخلص من وسط الزراعة من الخلايا المزروعة جيدا، أضف 1 مل من محلول تثبيت غلوتارالديهايد بنسبة 2.5٪ في درجة حرارة الغرفة، وثبت الخلايا في الظلام بدرجة حرارة الغرفة لمدة تقارب 5 دقائق. قم بكشط الخلايا بلطف في اتجاه واحد باستخدام مكشطة الخلايا.
  2. انقل تعليق الخلية إلى أنبوب طرد مركزي وجهاز طرد مركزي عند 25 درجة مئوية، 600 × g لمدة 3 دقائق باستخدام جهاز طرد مركزي أفقي منخفض السرعة.
  3. بعد التخلص من الفائق في المحلول المثبت، أضف مثبت المجهر الإلكتروني الجديد (استخدم 1 مل لكل بئر للوحة تحتوي على 12 بئر)، وثبت على درجة حرارة الغرفة بعيدا عن الضوء لمدة 30 دقيقة، ثم انقله إلى 4 درجات مئوية للتخزين.
  4. تسرب الجفاف: أدخل العينة في لوحة التضمين وضعها في فرن بدرجة حرارة 37 درجة مئوية طوال الليل.
  5. قم بتقليص الوسط المدمج في فرن بدرجة حرارة 60 درجة مئوية لمدة 48 ثانية. اقطع مقاطع رقيقة جدا بحجم 60-80 نانومتر باستخدام فائق ميكروتوم.
  6. صبغ الأقسام بمحلول كحول مشبع بأسيتات يورانيل بنسبة 2٪ لمدة 15 دقيقة، ثم استخدم سترات الرصاص لمدة 15 دقيقة أخرى. جفف الأجزاء الملطخة طوال الليل في درجة حرارة الغرفة. راقب وصور الأقسام تحت مجهر إلكتروني ناقل.

9. البلوتينج الغربي

  1. استخلاص البروتين الكلي من الخلايا
    1. عالج الخلايا وتلقيح في طبق بتري بقطر 6 سم حتى تصل إلى كثافة 70٪.
      ملاحظة: راجع الخطوة 3.3 للحصول على تعليمات حول إحياء الخلايا والتطعيم.
    2. في طبق الزراعة، أضف 3 مل من التوتھر (5 ميكرومتر) وبعد 4 ساعات، أضف CA (4 ميكرومتر).
    3. حضر علبة ثلج، وأنابيب PBS قبل التبريد، وكاشطات الخلايا، ومخزن تحلل جاهز، وعدة أنابيب EP معنونة مسبقا.
    4. بعد العلاج الدوائي، أزل وسط الزراعة من الخلايا واغسلها مرتين باستخدام PBS المبرد مسبقا. قم بتنفيذ هذه العملية على الجليد، واسحب أي بقايا PBS باستخدام جهاز طرد مركزي مفرغ.
    5. ضع علامة على كل طبق بتري، ثم أضف 300 ميكرولتر من محلول التحلل واتركه واقفا على الثلج لمدة 5 دقائق مع تحريك مستمر لمنع التحلل غير الكامل والتجميد.
    6. ثم استخدم مكشطة خلية مبردة مسبقا لفصل الخلايا الملتصقة، وجمع 300 ميكرولتر في أنبوب EP بعد كل كشط. استخدم مكشطة خلايا جديدة لكل كشط ولا تعيد استخدامها.
    7. امسك أعلى أنبوب EP وامزجه جيدا على خلاط دوامة، ثم استمر في وضعه على الثلج لمدة 25 دقيقة. في هذا الوقت، قم بتشغيل جهاز الطرد المركزي الزاوي عالي السرعة بسرعة 4 درجات مئوية مسبقا، حيث يتطلب تبريد الطرد المركزي وقتا معينا من الوقت.
    8. بعد انتهاء المؤقت، يتم تشغيل الدوامة مرة أخرى، ثم يتم تشغيل طرد مركزي زاوي عالي السرعة عند 4500 x g لمدة 15 دقيقة في جهاز طرد مركزي بدرجة حرارة 4 درجات مئوية.
    9. الآن شغل سخان الحمام الجاف واضبط درجة الحرارة على 100 درجة مئوية.
    10. أخرج مجموعة قياس كمية بروتين BCA، أضف عينات ومواد كيميائية إلى لوحة 96 بئر، اخلط جيدا، وتفاعل في حاضنة بدرجة حرارة 37 درجة مئوية، رطوبة 95٪، و5٪CO2 لمدة 30 دقيقة. قم بقياس محتوى البروتين المستخرج باستخدام قارئ ميكروبليت متعدد الوظائف، ثم قم بضبط المخزن المتبقي بناء على النتائج لضمان ثبات تركيز كل عينة.
    11. وأخيرا، بناء على محتوى كل سوبرناتينت، أضف 1/5 حجم من 6× مخزن تحميل لتحضير نظام تحميل البروتين. استنشق بعناية 150 ميكرولتر من المادة الفائقة في أنبوب EP جديد. أضف 30 ميكرولتر من مخزن تحميل 6× إلى الفائق وامزج جيدا (عادة بنسبة 1:5). خزن الخليط على الثلج.
    12. ثم سخن على حرارة 100 درجة مئوية على المدفأة لمدة 6 دقائق، مع التأكد من تثبيت غطاء أنبوب EP لمنع انفجاره. بعد التسخين، قم بتبريده في حمام ثلج.
  2. حضر جل بروتين بتركيز 10٪.
    1. اشطف لوح الجل بماء نقي، جففه بالهواء، امسح الرطوبة الزائدة، وتجنب بقع الماء والغبار قدر الإمكان.
    2. أخرج حامل الجل المصبب، مع وجود الألواح القصيرة لللوحين الزجاجيين في الأمام والألواح الطويلة في الخلف، ومحاذاة الأسفل لضمان أن الفجوة بين الألواح الزجاجية تتناسب بإحكام مع شريط الختم في أسفل الحامل لمنع التسرب، ثم ثبت الألواح بإحكام للتحضير لصب الجل.
    3. جهز الهلام السفلي ب 6 مل من الماء النقي، و3.75 مل من 1.5 م Tris-HCl (رقم الرقم 8.8)، و0.15 مل من 10٪ SDS، و5 مل من 30٪ Acry/bis، و75 ميكرولتر من 10٪ APS، و7.5 ميكرولتر من TEMED.
    4. حرك بلطف لتجنب تكوين رغوة، ثم أضف بسرعة وبشكل متساو بين اللوحين الزجاجيين، واترك مساحة للجل العلوي. بعد ذلك، قم بتسطيح سطح السائل ب 1 مل من الإيزوبروبانول واتركه واقفا لمدة تقارب 30 دقيقة.
    5. اشطف المشط لتحضير الجل بماء نقي، جفف بالهواء، وضعه جانبا. بعد أن يتصلب الهلام السفلي تماما، صب الأيزوبروبانول، اشطفه بعناية 2-3 مرات بالماء النقي، امتص السائل، واقلب صفيحة الهلام لتصريف أي سائل متبق.
    6. جهز جل التكديس العلوي ب 6 مل من الماء النقي، 2.5 مل من 0.5 م Tris-HCl (الرقم الهيدروجيني 6.8)، 0.1 مل من 10٪ SDS، 1.34 مل من 30٪ Acry/bis، 50 ميكرولتر من 10٪ APS، و10 ميكرولتر من TEMED.
    7. املأ الطبقة العليا وأدخل مشطا بسمك 1.5 مم بحذر. بعد دقيقة إلى دقيقتين، قم بملء الفجوات، مع الحرص على تقليل تكوين الفقاعات أثناء هذه العملية. استخدم جل بوليمر بالكامل.
  3. الرحلان الكهربائي الهلام البروتيني
    1. قم بإعداد مخزن التشغيل ومخزن النقل مسبقا، مع تبريد مخزن النقل مسبقا في ثلاجة بدرجة حرارة 4 درجات مئوية.
    2. اشطف جل البروتين بماء فائق النقي، وأخرج خزان الرحلان الكهربائي نظيفا، وثبت اللوحين القصيرين من جل البروتين إلى الداخل والمقابل لبعضهما البعض، ثم صب المخزن الجاري، وتحقق من وجود أي تسرب.
    3. قم بإزالة المشط بعناية، وحمل 10 ميكرولتر لكل بئر مع مجموع 4 مجموعات عينات. حمل 3 مجموعات عينة لكل جل، مفصولة بمؤشر بروتين 4 ميكرولتر بين كل مجموعة، ليصبح المجموع 15 بئرا.
    4. بعد تحميل العينات، صب كل المخزن الكهربائي المتبقي في خزان الرحلان الكهربائي، غطه بالغطاء، اضبط الجهد على 140 فولت، وقم بإجراء الرحلان الكهربائي بجهد ثابت لمدة 20 دقيقة.
    5. عندما تدخل نطاقات البروتين جل الفصل بعد التركيز، اضبط الجهد إلى 120 فولت للحصول على الرحلان الكهربائي الثابت. خلال هذه العملية، انقع غشاء NC في مخزن النقل. أوقف الرحلان الكهربائي عندما يشير اللون الأزرق إلى أن العينة وصلت إلى الحافة السفلية للجل، واستعد لنقل الغشاء.
    6. املأ صندوق رغوة نصف المسافة بالثلج، وأخرج مشبك النقل، ومخزن النقل المبرد مسبقا، وغشاء NC المبلل. اسكب نصف مخزن النقل في وعاء مربع مسطح.
    7. أخرج جل البروتين، اشطفه جيدا بماء فائق النقي، ضع الجانب الأسود متجها للأسفل، والجانب الشفاف للأعلى. في المنتصف، رتب طبقة من الإسفنجة، وطبقة من ورق الترشيح، وجل البروتين، وغشاء NC، ثم ضع طبقة أخرى من ورق الفلتر والإسفنجة.
    8. بعد الضغط لإزالة فقاعات الهواء، قم بتثبيت شريط النقل وضعه في خزان النقل. بمجرد إدخال كلتا الهلام البروتيني بالكامل، صب كل محلول النقل في خزان النقل، ثم أضف كيسين ثلجيين للتبريد وغطه بالغطاء.
    9. أحاط شريط النقل بالثلج وانقل بجهد ثابت 120 فولت لمدة 90 دقيقة. تولد عملية النقل حرارة كبيرة، لذا يلزم استخدام حمام ثلج للتبريد.
    10. أخرج غشاء NC، غمره وصبغه في محلول صبغ Ponceau S سعة 20 مل، حدد حجم القلم بالقلم الرصاص، وقص الغشاء بالقلم حسب حجم البروتين المستهدف المراد اكتشافه.
    11. استرجع محلول التلوين Ponceau S. اغسل محلول التلوين باستخدام PBS وحضن غشاء NC بسعة 20 مل من حاجز الحاجز، ثم قم بإزالة المحلول في درجة حرارة الغرفة على جهاز هزاز بسرعة منخفضة لمدة ساعة إلى ساعتين.
    12. تخلص من محلول الانسداد، وشطف الغشاء بسرعة مرتين باستخدام PBS على جهاز إزالة اللون لإزالة محلول الانسداد تماما، ثم أضف الأجسام المضادة المقابلة وفقا لنسب استخدام Western Blot لكل جسم مضاد في صندوق حضانة الأجسام المضادة، وحضن الغرفة طوال الليل عند 4 درجات مئوية.
    13. استرجع الأجسام المضادة الأساسية بشكل منفصل وقم بتخزينها عند -20 درجة مئوية. تم غسل الأغشية بسرعة 4 مرات باستخدام TBST على جهاز إزالة اللون، لمدة 5 دقائق في كل مرة، لإزالة الأجسام المضادة الأساسية بالكامل. ثم أضف 4 مل من المخزن الحاجز مع الأجسام المضادة الثانوية، وحضن الأغشية في درجة حرارة الغرفة على هزاز بطيء لمدة ساعة واحدة.
    14. اغسل الجسم المضاد الثانوي أربع مرات باستخدام مخزن TBST لمدة 5 دقائق لكل مرة، ثم استبدلها بمحلول PBS لترطيب غشاء NC بالكامل.
    15. وفقا لدليل تعليمات مادة الإضاءة الكيميائية ECL، جهز المحلول المضيء ووضعه على سطح الغشاء، ثم حضنه لمدة دقيقة إلى دقيقتين قبل التطوير باستخدام نظام تصوير هلامي.
    16. معالجة البيانات الخام في نظام Image J التصويري، ثم نقلها إلى برنامج Photoshop لإنشاء الشكل.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

علم الأدوية الشبكي والالتحام الجزيئي
تحديد الأهداف المحتملة للكائنات الكيميائية: في التحقيق الشامل لنشاط التحليل الدوائي للكائنات الكيميائية، تم اختيار 60 هدفا محتملا بدقة من مراجعة شاملة للأدبيات ذات الصلة. ولتوسيع نطاق التحليل أكثر، تم تحديد 12 هدفا محتملا إضافيا مرتبطا ب CA من خلال قاعدة بيانات TCMSP. لتعزيز الدقة والدقة، تم استخدام القدرات التنبؤية المتقدمة لمنصة SwissTargetPrediction، مما أتاح هدفا محتملا إضافيا. بعد التكامل وإزالة النسخ الصارمة لجميع مصادر البيا...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

الفيروبتوزيس، وهو نمط حديث من موت الخلايا، يتميز بتراكم مفرط للحديد داخل الخلايا وتأكسد الدهون. من الناحية الشكلية، يظهر الفيروبتوزيس على شكل انكماش ميتوكوندري، فقدان أو تراجع هياكل الكريستاي، وزيادة كثافة الغشاء، بينما يبقى شكل الغشاء الخلوي والنوى غير متأثرين26. ميكانيكيا، يتم دفع الفيروبتوزيس إلى استنزاف الجلوتاثيون (GSH) وضعف نشاط GPX4، مما يمنع استقلاب بيروكسيد الدهون عبر تفاعل إزيز الجلوتاثيون المحفز GPX4. تحفز أيونات الحديد الحديدية أكسدة الدهون، م...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

لا توجد تضارب مصالح مالية يمكن الإفصاح عنه

شكر وتقدير

نعبر عن امتناننا العميق للظروف المتميزة التي وفرها المستشفى وأقسامه، والتي مكنتنا من تحقيق هذه النتائج. وفي الوقت نفسه، نقدم أيضا خالص شكرنا للعديد من أعضاء المختبر على جهودهم الدؤوبة ومساهماتهم القيمة على مر السنين. العمل الجاد لكل مشارك هو جزء لا غنى عنه من نجاحنا، وفي المستقبل سنواصل العمل معا لتعزيز التقدم في مجال الطب. المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية الصينية (82104838)، برنامج الشرارة لمؤسسة تعزيز الصين (XH-D001)، برنامج البحث والتطوير الرئيسي في مقاطعة لياونينغ (2024JH2/102500062)، ومؤسسة العلوم الطبيعية الإقليمية في لياونينغ (2025-MSLH-490).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
  الجلايسينبيوفروكس1275KG001
  تريس-بيسالبايوفروكس1115KG001
0.5  M  مخزن Tris-HCl (pH  6.8)بيوراد1610799
1 متر ثلاثي الهيدروميل (PH 7.5)بيوتايمST775
1.5  M  مخزن Tris-HCl (pH  8.8)بيوراد1610798
APSبيوتايمST005
مصدر الطاقة الأساسي للرحلان الكهربائيBIO-RAD باورباك بيسكان
مجموعة قياس بروتين BCAبيوتايمP0012
الأجسام المضادة المؤتلفة بيتا أكتينهوابيو81115-1-RR
حاضنة ثاني أكسيد الكربونالترمو150L
مجموعة اختبار CCK-8أبيكسبيوK1018
مجموعة اختبار نشاط الخلايا والسمية الخلويةبيوتايمC2015M
سينامالديهايد (كاليفورنيا)ماكلينC805134النقاء 98٪
هزاز إزالة اللونكايلين-بيلTS-100
DMEM (المتوسط المعدل من دولبيكو)BasalMediaL110KJ
DMSOسيغماD2650
عقدة الجذر الظهري (DRG)سيرة فوهينغFH165الرقم التسلسلي: 20211227-1
DRG الوسيط الكاملسيرة فوهينغFH-DRG
محلول ECL المضيءالترمو34580
ErbB-1بروتين تك06-8471:2000
Fetal  بوفين  المصلماكلينFO193
مسبار كشف الأيونات الحديدية - فيرو أورانجدوجيندوF374
FTH1تقنية الإشارة الخلوية4393S1:1000
نظام التصوير الهلاميBIO-RAD لمسة ChemiDoc
محلول هانكس المتوازن للملح (HBSS)سولاربيولوجياH1025
الطرد المركزي المبرد عالي السرعةإبندورف5804R
محلول هوشست 33342 لتلوين الخلايا الحيةبيوتايمC1028
مجموعة الكيمياء المناعيةبايوشاربBS-24-PB
نظام المجهر الفلوري المقلوبلايكالايكا دي إم آي 8
الأجسام المضادة أحادية النسيلة للأرنب المؤتلفة JAK2 [SY0245]هوابيوET1607-351:2000
مجهر التباين العكسي في المختبرلايكالايكا دي إم آي 1
جهاز الطرد المركزي منخفض السرعةإبندورف5804
مجموعة كشف محتوى MDAسانغونD799762
قارئ الميكروبليتشروق الشمس تيكان
قارئ الميكروبليت متعدد الوظائفBMGلاب تيك فيرا ستار إف إس
NF-& kappa; B p65 الأجسام المضادة متعددة النسيراتبروتين تك10745-1-AP1:1000
بارافورمالديهايدماكلينP804536
محلول صبغة بونسوبيوتايمP0022
علامة البروتينالترمو26617
P-STAT3 (Ser727)تقنية الإشارة الخلوية9134S1:1000
P-STAT3 (Tyr705)تقنية الإشارة الخلوية9145S1:2000
الأجسام المضادة المضادة للجلوتاثيون بيروكسيداز 4 المؤتلف[EPNCIR144]أبكامab1250661:1000
الأجسام المضادة المضادة المؤتلفة المضادة ل XCT[EPR27115-64]أبكامAB3076011:1000
مجموعة اختبار ROSدوجيندوR252
مخزن تحميل البروتين SDS-PAGE (6X)بيوتايمP0289
مسحوق الحليب الخالي من الدسمبايوشاربBS102-500g
كبريتات الصوديوم الدوديسيل SDSالبايوفروكس3250GR500
ستات3 (F-2)سانتا كروزSC-80191:200
TEMEDسولاربيولوجيا    T8090   
TFRCإنفيتروجين13-68000.5 وميكرو؛ g/mL
Tween80سيليكS6702
طاولة عمل فائقة النظافةHDLDL-CJ-2NDI
المجهر القائمأوليمبوسCX 31
الرحلان الكهربائي العموديBIO-RAD ميني بروتيان تترا
خزان النقل الرطبBIO-RAD ميني ترانس بلوت
α-توبولينα-توبولينER130905
منشور جراف بادالتحليل الإحصائي
برنامج ImageJاحصل على القيمة الرمادية لبقعة البروتين

المراجع

  1. Dolma, S., Lessnick, S. L., Hahn, W. C., Stockwell, B. R. Identification of genotype-selective antitumor agents using synthetic lethal chemical screening in engineered human tumor cells. Cancer Cell. 3 (3), 285-296 (2003).
  2. Ye, L. F., et al. Radiation-induced lipid peroxidation triggers ferroptosis and synergizes with ferroptosis inducers. ACS Chem Biol. 15 (2), 469-484 (2020).
  3. Huang, L., Bian, M., Zhang, J., Jiang, L. Iron metabolism and ferroptosis in peripheral nerve injury. Oxid Med Cell Longev. 2022, 5918218(2022).
  4. Hao, D., et al. Supercritical fluid extract of Angelica sinensis promotes the anti-colorectal cancer effect of oxaliplatin. Front Pharmacol. 13, 1007623(2022).
  5. Binder, A., et al. Pain in oxaliplatin-induced neuropathy: sensitisation in the peripheral and central nociceptive system. Eur J Cancer. 43 (18), 2658-2663 (2007).
  6. Finnerup, N. B., et al. Pharmacotherapy for neuropathic pain in adults: a systematic review and meta-analysis. Lancet Neurol. 14 (2), 162-173 (2015).
  7. Dorri, M., Hashemitabar, S., Hosseinzadeh, H. Cinnamon (Cinnamomum zeylanicum) as an antidote or a protective agent against natural or chemical toxicities: a review. Drug Chem Toxicol. 41 (3), 338-351 (2018).
  8. Hajimonfarednejad, M., et al. Cinnamon: a systematic review of adverse events. Clin Nutr. 38 (2), 594-602 (2019).
  9. Zaio, Y. P., et al. Cinnamaldehyde and related phenylpropanoids, natural repellents, and insecticides against Sitophilus zeamais (Motsch.): a chemical structure-bioactivity relationship. J Sci Food Agric. 98 (15), 5822-5831 (2018).
  10. Thirapanmethee, K., et al. Cinnamaldehyde: a plant-derived antimicrobial for overcoming multidrug-resistant Acinetobacter baumannii infection. Eur J Integr Med. 48, 101376(2021).
  11. Bi, Z., et al. Improvement of mould resistance of wood with cinnamaldehyde chitosan emulsion. Wood Sci Technol. 56 (1), 187-204 (2022).
  12. Qureshi, K. A., et al. Cinnamaldehyde-based self-nanoemulsion (CA-SNEDDS) accelerates wound healing and exerts antimicrobial, antioxidant, and anti-inflammatory effects in rats' skin burn model. Molecules. 27 (16), 5225(2022).
  13. Safaei, F., Tamaddonfard, E., Nafisi, S., Imani, M. Effects of intraperitoneal and intracerebroventricular injection of cinnamaldehyde and yohimbine on blood glucose and serum insulin concentrations in ketamine-xylazine-induced acute hyperglycemia. Vet Res Forum. 12 (2), 149-156 (2021).
  14. Al Tbakhi, B., et al. Cinnamaldehyde-cucurbituril complex: investigation of loading efficiency and its role in enhancing cinnamaldehyde in vitro anti-tumor activity. RSC Adv. 12 (12), 7540-7549 (2022).
  15. Zhu, R., et al. Cinnamaldehyde in diabetes: a review of pharmacology, pharmacokinetics and safety. Pharmacol Res. 122, 78-89 (2017).
  16. Yang, D., et al. Anti-oxidative and anti-inflammatory effects of cinnamaldehyde on protecting high glucose-induced damage in cultured dorsal root ganglion neurons of rats. Chin J Integr Med. 22 (1), 19-27 (2016).
  17. Malemud, C. J. Negative regulators of JAK/STAT signaling in rheumatoid arthritis and osteoarthritis. Int J Mol Sci. 18 (3), 484(2017).
  18. Zhang, Q., et al. Activation of Nrf2/HO-1 signaling: an important molecular mechanism of herbal medicine in the treatment of atherosclerosis via the protection of vascular endothelial cells from oxidative stress. J Adv Res. 34, 43-63 (2021).
  19. Bagheri-Mohammadi, S., Askari, S., Alani, B., Moosavi, M., Ghasemi, R. Cinnamaldehyde regulates insulin and caspase-3 signaling pathways in the sporadic Alzheimer's disease model: involvement of hippocampal function via IRS-1, Akt, and GSK-3β phosphorylation. J Mol Neurosci. 72 (11), 2273-2291 (2022).
  20. Fu, Y., et al. Trans-cinnamaldehyde inhibits microglial activation and improves neuronal survival against neuroinflammation in BV2 microglial cells with lipopolysaccharide stimulation. Evid Based Complement Alternat Med. 2017, 4730878(2017).
  21. Guo, B., et al. Targeting the JAK2/STAT3 signaling pathway with natural plants and phytochemical ingredients: a novel therapeutic method for combatting cardiovascular diseases. Biomed Pharmacother. 172, 116313(2024).
  22. Gao, Y., et al. Modified Erchen decoction ameliorates cognitive dysfunction in vascular dementia rats via inhibiting JAK2/STAT3 and JNK/BAX signaling pathways. Phytomedicine. 114, 154797(2023).
  23. Hu, Q. P., et al. Genistein protects epilepsy-induced brain injury through regulating the JAK2/STAT3 and KEAP1/NRF2 signaling pathways in developing rats. Eur J Pharmacol. 912. 912, 174620(2021).
  24. Kang, L., Tian, Y., Xu, S., Chen, H. Oxaliplatin-induced peripheral neuropathy: clinical features, mechanisms, prevention and treatment. J Neurol. 268 (9), 3269-3282 (2021).
  25. Brayton, C. F. Dimethyl sulfoxide (DMSO): a review. Cornell Vet. 76 (1), 61-90 (1986).
  26. Yang, W. S., Stockwell, B. R. Synthetic lethal screening identifies compounds activating iron-dependent, nonapoptotic cell death in oncogenic-RAS-harboring cancer cells. Chem Biol. 15 (3), 234-245 (2008).
  27. Xiao, Z., La Fontaine, S., Bush, A. I., Wedd, A. G. Molecular mechanisms of glutaredoxin enzymes: versatile hubs for thiol-disulfide exchange between protein thiols and glutathione. J Mol Biol. 431 (2), 158-177 (2019).
  28. Georgiadis, M. M., et al. Small-molecule activation of apurinic/apyrimidinic endonuclease 1 reduces DNA damage induced by cisplatin in cultured sensory neurons. DNA Repair (Amst). 41, 32-41 (2016).
  29. Wei, G., et al. Platinum accumulation in oxaliplatin-induced peripheral neuropathy. J Peripher Nerv Syst. 26 (1), 35-42 (2021).
  30. Maung, K., Chu, E., Rothenberg, M. Oxaliplatin combinations as first-line therapy in advanced colorectal cancer. Clin Colorectal Cancer. 2 (2), 78-80 (2002).
  31. Egashira, N., et al. Mexiletine reverses oxaliplatin-induced neuropathic pain in rats. J Pharmacol Sci. 112 (4), 473-476 (2010).
  32. Lainez, S., Tsantoulas, C., Biel, M., McNaughton, P. A. HCN3 ion channels: roles in sensory neuronal excitability and pain. J Physiol. 597 (17), 4661-4675 (2019).
  33. Siau, C., Bennett, G. J. Dysregulation of cellular calcium homeostasis in chemotherapy-evoked painful peripheral neuropathy. Anesth Analg. 102 (5), 1485-1490 (2006).
  34. Gauchan, P., Andoh, T., Kato, A., Kuraishi, Y. Involvement of increased expression of transient receptor potential melastatin 8 in oxaliplatin-induced cold allodynia in mice. Neurosci Lett. 458 (2), 93-95 (2009).
  35. Carozzi, V. A., Canta, A., Chiorazzi, A. Chemotherapy-induced peripheral neuropathy: what do we know about mechanisms. Neurosci Lett. 596, 90-107 (2015).
  36. Di Cesare Mannelli, L., et al. Glial role in oxaliplatin-induced neuropathic pain. Exp Neurol. 261, 22-33 (2014).
  37. Ta, L. E., Espeset, L., Podratz, J., Windebank, A. J. Neurotoxicity of oxaliplatin and cisplatin for dorsal root ganglion neurons correlates with platinum-DNA binding. Neurotoxicology. 27 (6), 992-1002 (2006).
  38. Bobylev, I., Joshi, A. R., Barham, M., Neiss, W. F., Lehmann, H. C. Depletion of mitofusin-2 causes mitochondrial damage in cisplatin-induced neuropathy. Mol Neurobiol. 55 (2), 1227-1235 (2018).
  39. Nassini, R., et al. Oxaliplatin elicits mechanical and cold allodynia in rodents via TRPA1 receptor stimulation. Pain. 152 (7), 1621-1631 (2011).
  40. Lee, J. H., Kim, W. The role of satellite glial cells, astrocytes, and microglia in oxaliplatin-induced neuropathic pain. Biomedicines. 8 (9), 324(2020).
  41. Makker, P. G., et al. Characterisation of immune and neuroinflammatory changes associated with chemotherapy-induced peripheral neuropathy. PLoS One. 12 (1), e0170814(2017).
  42. Holmes, J., et al. Comparative neurotoxicity of oxaliplatin, cisplatin, and ormaplatin in a Wistar rat model. Toxicol Sci. 46 (2), 342-351 (1998).
  43. Podratz, J. L., et al. Cisplatin-induced mitochondrial DNA damage in dorsal root ganglion neurons. Neurobiol Dis. 41 (3), 661-668 (2011).
  44. Trecarichi, A., et al. Preclinical evidence for mitochondrial DNA as a potential blood biomarker for chemotherapy-induced peripheral neuropathy. PLoS One. 17 (1), e0262544(2022).
  45. Mao, Y. F., et al. Edaravone, a free radical scavenger, is effective on neuropathic pain in rats. Brain Res. 1248, 68-75 (2009).
  46. Kim, H. K., Zhang, Y. P., Gwak, Y. S., Abdi, S. Phenyl N-tert-butylnitrone, a free radical scavenger, reduces mechanical allodynia in chemotherapy-induced neuropathic pain in rats. Anesthesiology. 112 (2), 432-439 (2010).
  47. Han, R., Li, X., Gao, X., Lv, G. C. Cinnamaldehyde: pharmacokinetics, anticancer properties and therapeutic potential. Mol Med Rep. 30 (3), 163(2024).
  48. Liao, J. C., et al. Anti-inflammatory activities of Cinnamomum cassia constituents in vitro and in vivo. Evid Based Complement Alternat Med. 2012, 429320(2012).
  49. Liu, P., et al. Cinnamaldehyde suppresses NLRP3-derived IL-1β via activating succinate/HIF-1 in rheumatoid arthritis rats. Int Immunopharmacol. 84, 106570(2020).
  50. Li, X., Wang, Y. Cinnamaldehyde attenuates the progression of rheumatoid arthritis through down-regulation of PI3K/AKT signaling pathway. Inflammation. 43 (5), 1729-1741 (2020).
  51. Dai, X. Y., et al. Targeting the JAK2/STAT3 signaling pathway for chronic pain. Aging Dis. 15 (1), 186-200 (2024).
  52. Reddy, A. M., et al. Cinnamaldehyde and 2-methoxycinnamaldehyde as NF-κB inhibitors from Cinnamomum cassia. Planta Med. 70 (9), 823-827 (2004).
  53. Youn, H. S., et al. Cinnamaldehyde suppresses toll-like receptor 4 activation mediated through the inhibition of receptor oligomerization. Biochem Pharmacol. 75 (2), 494-502 (2008).
  54. Chen, X., Kang, R., Kroemer, G., Tang, D. Ferroptosis in infection, inflammation, and immunity. J Exp Med. 218 (6), e20210518(2021).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

الحماية العصبية بالسينامالدهيدالسمية العصبية للأوكساليبلاتينالعقدة الجذرية الظهريةمسار الموت الحديديتأشير JAK2 STAT3تعبير GPX4مقايسة بيروكسيد الدهونأنواع الأكسجين التفاعليةتحليل التعبير البروتيني
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.