مقالة منهجية

سير العمل الموحد ل SDS-PAGE لتحديد بروتين كورونا المخصص في الكشف المبكر عن السرطان

1.1K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/69090

⸱

ديسمبر 19, 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1NanoDelivery Lab, Department of Molecular Medicine, Sapienza University of Rome

في هذه المقالة

ملخص

يقوم هذا البروتوكول بتوحيد تحليل SDS-PAGE لتحديد التوصفات الشخصية للبروتين على الجسيمات النانوية، مما يتيح اكتشافا قابلا للتكرار والتوسع ومنخفض التكلفة لتوقيعات خاصة بالسرطان. صمم للتشخيص المبكر لسرطان الغدة في قناة البنكرياس، ويقدم بديلا عمليا ومتوافقا مع REASSURE لطرق البروتينية المعقدة في كل من البحث والسرير.

الملخص

برز تكوين هالة بروتين شخصية (PC) على الجسيمات النانوية (NPs) عند التعرض للسوائل البيولوجية كاستراتيجية واعدة وطفيفة التوغل للكشف المبكر عن السرطان. تقدم هذه الدراسة بروتوكولا موحدا لتحديد هولة البروتين باستخدام الرحلان الكهربائي الهلام ثنائي الكبريتات الصوديوم ثنائي الأكريلاميد (SDS-PAGE)، محسن لضمان المتانة والقابلية للتكرار والأتمتة. تم التحقق من صحة الطريقة بدقة عبر مجموعة متنوعة من منصات الجسيمات النانوية (NP)، ومصادر البلازما، وظروف التجارب، مما أظهر ملفات تعريف قابلة للتكرار باستمرار مع أقل قدر ممكن من التغير المعتمد على المشغل. بالمقارنة مع تقنيات البروتيومكس التقليدية، يقدم هذا النهج حلا أسرع وأكثر فعالية من حيث التكلفة يفي بمعايير RESURE الخاصة بمنظمة الصحة العالمية للتشخيص. عند تطبيقه على سرطان الغدة في قنوات البنكرياس (PDAC)، وهو ورم خبيث شديد العدوانية مع مؤشرات حيوية مبكرة محدودة، حقق هذا السير دقة تصنيف تصل إلى 90٪، حتى في المرضى في مراحلهم المبكرة. تمثل هذه المنصة الموحدة تقدما كبيرا نحو أدوات تشخيصية قابلة للتوسع، وقابلة للترجمة سريريا، وبأسعار معقولة لفحص السرطان.

المقدمة

هالة بروتين الجسيمات النانوية (NP-PC)

التوصيف الذي يتكون على سطح الممرضين الممارسين بعد تعرضهم للسوائل البيولوجية ظهر كاستراتيجية قوية لتشخيص الأمراض والطب الشخصي1. هذه الطبقة من البروتينات الممتزة، الديناميكية والخاصة بالأمراض في تركيبها، تحول الهوية التركيبية للبروتينات النارية وتحرك تفاعلاتها البيولوجية2. تركيب ال PC ليس عشوائيا لكنه يعتمد بشكل كبير على الخصائص الفيزيائية والكيميائية للكائنات غير القابلة للطيور والبيئة البيولوجية التي يتم إدخالهافيها 3. عوامل مثل حجم NP، وشكلها، وشحنة السطح، وتركيبها يمكن أن تؤثر بشكل كبير على الألفة والحركية والترتيب البنيوي للبروتينات الممتصة. وبالمثل، يلعب السائل البيولوجي، ومصدره، وتعقيده، وحالة المرض، دورا رئيسيا في تحديد التركيب النهائي للإكليلة 4,5,6.

الطبيعة الديناميكية للهالة تزيد من تعقيد تحليله، حيث يتطور هيكله مع مرور الوقت من طبقة خارجية ناعمة وغير مربوطة إلى نواة داخليةأكثر استقرارا وممتزة بإحكام 7,8. تتطلب هذه البنية المتطورة، الناتجة عن أحداث امتصاص البروتينات التنافسية، أن يتم توصيف أساليب محددة زمنيا وموحدة بشكل ذي معنى9. على الرغم من هذا التعقيد، أصبح من المعترف الآن على نطاق واسع أن جهاز PC ليس مجرد قطعة أثرية، بل هو طبقة معلوماتية بيولوجية قادرة على التقاط التغيرات الجهازية للأمراض بطريقة غير غازية. الهدف من الطريقة الموصوفة في هذه الورقة هو توحيد استخدام SDS-PAGE للتنميط القوي والقابل للتكرار والسهولة في الوصول إلى جهاز الكمبيوتر الشخصي، خاصة للكشف المبكر عن السرطان من خلال طرق الخزعة السائلة10.

الحاسوب الشخصي وأهميته في اكتشاف السرطان

الأساس العلمي لهذه الطريقة يكمن في مفهوم الحاسوب الشخصي. عند الحضانة مع بلازما المريض، يمتص الممرضون بصمة فريدة من البروتينات تعكس الحالة الفسيولوجية أو المرضية للفرد11,12. وقد تم تأكيد هذا المفهوم من خلال دراسات أظهرت تغيرات كبيرة في تركيب السرطان العضلي في وجود مرض، بما في ذلك سرطان الغدة القنوية في البنكرياس (PDAC)، وسرطان الرئة13، والورم السحايا14، والورم الأرومي الدبقي متعدد الأشكال15. على وجه التحديد، في PDAC، تختلف الأقراص المشتقة من بلازما المرضى بشكل كبير عن تلك الخاصة بالمتبرعين الأصحاء. تم استغلال هذه الفروقات في نماذج المصنفين التي تحقق دقة تشخيصية تصل إلى 90٪. يعمل جهاز PC بذلك كمركز نانو للإشارات الخاصة بالأمراض16.

أظهرت الدراسات الحديثة أن المعالجات النفسية من مرضى السرطان غنية بالبروتينات المشاركة في الالتهاب، والتخثر، وتنشيط المكملات، ونقل الحويصلات خارج الخلية، وهي مسارات بيولوجية معروفة بأنها غير منظمة في الأورام الخبيثة17. هذه الأنماط البروتينية قابلة للتكرار بشكل كبير داخل فئات المرضى الفردية، لكنها متميزة بوضوح بين حالات الأمراض المختلفة، مما يشير إلى أن الكورونا يمكن أن يعمل ليس فقط كحساس عام للمرض بل أيضا كمصنف خاص بالمرض. في سياق PDAC، أحد أكثر الأورام الخبيثة فتكا وخفيرة، كانت مجموعتنا رائدة في اختبارات الدم المدعومة بالNP (NEB) بناء على توصيف PC:18، 19، 20. يستفيد هذا النهج طفيف التوغل من قدرة المضادات الطبيعية على إثراء البروتينات البلازمية منخفضة الوفرة والمغيرة بفعل الأمراض بشكل انتقائي، مما يجعلها قابلة للكشف عن طريق الفصل الكهربائي البسيط على سطح الطاولة.

المزايا مقارنة بالتقنيات التقليدية للبروتيوم

ينبع مبرر تطوير هذا النهج من محدوديات تقنيات البروتيوميات التقليدية مثل مطيافية الكتلة (MS)، والتي، رغم توفر تغطية عميقة للبروتيوم، إلا أنها مكلفة وتستغرق وقتا طويلا وغير مناسبة للفحص عالي الإنتاجية أو التشخيص في نقاط الرعاية21. تحد رئيسي آخر يكمن في التعقيد الجوهري للتصلب المتعدد، حيث تساهم التغيرات في تحضير العينات، معايرة الأجهزة، معلمات الاستحواذ، وسير عمل تحليل البيانات في فروق كبيرة بين المختبرات في تركيبة PC22 المبلغ عنها. على النقيض من ذلك، يوفر تحليل SDS-PAGE للجهاز وسيلة سريعة وفعالة من حيث التكلفة لالتقاط أنماط البروتيومية المرتبطة بالمرض. والأهم من ذلك، أن قراءة SDS-PAGE لا تعتمد على التحديد المطلق للمؤشرات الحيوية، بل على اكتشاف التغيرات المنهجية في ملف البروتين العالمي، والتي يمكن تحليلها من خلال قياس الكثافة والإحصاءات متعددة المتغيرات.

على عكس الاختبارات القائمة على الأجسام المضادة، التي تقتصر على الأهداف المعروفة وعرضة للتفاعل المتبادل، تقدم SDS-PAGE رؤية غير متحيزة لمشهد البروتين، محافظة على سلامة العينة الأصلية وتسمح بالتكامل لاحقا مع منصات مكملة مثل LC-MS/MS لتحديد البروتينات. علاوة على ذلك، نظرا لأن SDS-PAGE لا يتطلب خطوات تجزئة أو استنزاف العينات، فهو مناسب بشكل خاص لتحليل العينات البيولوجية منخفضة الحجم، وهي ميزة أساسية للتطبيقات التي تتضمن التشخيص المبكر أو الفحص للمجموعات الهشة23. لهذه الأسباب جميعها، يتوافق هذا البروتوكول مع عدة معايير SURE الخاصة بمنظمة الصحة العالمية (الاتصال في الوقت الحقيقي، سهولة جمع العينات، ميسور التكلفة، حساس، محدد، سهل الاستخدام، قوي، خالي من المعدات، وقابل للتسليم)، مما يجعله أداة عملية للتشخيص القابل للتوسع24. استنادا إلى هذه الأدلة، تم افتراض أن الممرضات الممرضات الحضنات مع بلازما المريض تمتص جهاز تناسخ يمكن تكرار المرض وتحديده يمكن تحليله بشكل منهجي باستخدام SDS-PAGE. نقترح أيضا أن التحليل الكهربائي الموحد لهذه التاجات الجنسية يمكن أن يميز مرضى السرطان عن الأفراد الأصحاء، مما يوفر أداة تشخيصية قوية وقابلة للترجمة سريريا.

سير العمل وقابلية التطبيق السريري

يقوم بروتوكول التحليل الكروي القائم على SDS-PAGE بتنظيم كل خطوة: من تحضير NPs وحضانتها باستخدام بلازما مخففة، إلى عزل الإكليل، والرحلان الكهربائي بالهلام، والتحليل الكمومي للكثافة (الشكل 1). يتم ضبط المعايير الرئيسية مثل وقت الحضانة، وتخفيف البلازما، ونوع NP25 بدقة لضمان التقاط البروتين الأمثل ودقة صورة الجل. كما يعالج البروتوكول القضايا العملية مثل معدل نقل العينة، واستقرار التخزين، والاتساق من الدفعة إلى الدفعة26. علاوة على ذلك، وبما أنها تقنية غير مدمرة، يمكن دمج SDS-PAGE بسلاسة مع طرق بروتيومية تكميلية مثل MS لتحديد التركيب الجزيئي لمجموعات البروتين الفردية15. تم تحسين سير العمل ليكون قابلية تكرار عالية بين المشغلين، بما في ذلك التوافق مع منصات التوصيل اليدوي والأتمت، وهو قوي عبر مختلف الكيمياء النارية وتركيزات البلازما. تضمن هذه الميزات إمكانية تطبيق الطريقة في بيئات مختبرية متنوعة، مما يجعلها مناسبة لكل من مراكز التشخيص المركزية والمختبرات البحثية اللامركزية. لذا، فإن هذه التقنية مناسبة بشكل خاص للباحثين والأطباء المشاركين في التشخيصات المبكرة، واكتشاف المؤشرات الحيوية، والطب النانوي الانتقالي. يمكن تطبيقه على مجموعة واسعة من الأمراض وقابل للتكيف مع سوائل بيولوجية متنوعة تتجاوز البلازما، بما في ذلك اللعاب أو البول. مرونة ومتانة هذا البروتوكول تجعله مرشحا قويا للدمج في خطوط التحقق السريري، ودراسات الفحص واسعة النطاق، ومنصات نقاط الرعاية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

يوفر هذا البروتوكول سير عمل مفصل وموحى لتحضير واحتجاز البلازما البشرية (HP)، وعزلها، وتحليل ال PC المكون على أنواع مختلفة من NPs. الشكل 2 يمثل البروتوكول بأكمله، يوضح الخطوات التجريبية المتسلسلة من تخليق NP إلى التحليل متعدد المتغيرات SDS-PAGE لملفات البروتين. ومن المهم أن المنهجية قد تم توحيدها من قبل مجموعتنا، كما هو موضح في الأعمال السابقة18، 26، مما يضمن قابلية تكرار وموثوقية النتائج. المواد المستخدمة والمواد المستخدمة مدرجة في جدول المواد.

1. تحضير وتوصيف NPs

  1. صفائح النانو GO
    1. قم بتخفيف محلول مخزون بسعة 4 ملغ/مل في ماء فائق النقاء إلى التركيز المطلوب. قم بسونيك لمدة دقيقتين عند سعة 28٪ (النبضة: 0.8/0.6 ثانية) لضمان التشتت الصحيح.
    2. قياس التركيز باستخدام مطيافية UV-Vis
    3. قياس الحجم الهيدروديناميكي وجهد زيتا باستخدام تشتت الضوء الديناميكي (DLS) باستخدام ليزر He-Ne بقطر 633 نانومتر. تحضير العينات عن طريق التخفيف في مياه فائقة النقاء بناء على حدود كشف الكوفيت (مثل تخفيف 1:100 لكوفيتات بسعة 1 مل). متوسط السجل ± الانحراف المعياري (SD) من ثلاثة نسخ.
  2. المتاجر الذهبية
    1. استخدم NPs ذهبية 100 نانومتر مستقرة بالسترات (تركيز من المخزون: 3.8E+9 جسيمات/مل) دون تعديل إضافي.
    2. قياس الحجم الهيدروديناميكي وجهد زيتا باستخدام تشتت الضوء الديناميكي (DLS) باستخدام ليزر He-Ne بقطر 633 نانومتر. تحضير العينات عن طريق التخفيف في مياه فائقة النقاء بناء على حدود كشف الكوفيت (مثل تخفيف 1:100 لكوفيتات بسعة 1 مل). متوسط السجل ± SD من ثلاث نسخ.
  3. ليبوزومات DOTAP
    1. قم بإذابة مسحوق 1,2-ديولويل-3-تريميثيل أمونيوم-بروبان (DOTAP) في الكلوروفورم داخل غطاء بخار كيميائي معتمد مع ارتداء معدات الحماية الشخصية المناسبة (معطف مختبر، قفازات، نظارات واقية). تبخر تحت الفراغ لمدة ساعتين، ثم أعد تعليق طبقة الدهون بماء فائق النقي للوصول إلى تركيز نهائي يبلغ 1 ملغ/مل، ثم ترطيب الرطوبة طوال الليل عند 4 درجات مئوية. وأخيرا، قم ببثق محلول الليبوسوم 20 مرة عبر فلتر بولي كربونات بحجم 0.1 ميكرومتر.
    2. قياس الحجم الهيدروديناميكي وجهد زيتا باستخدام تشتت الضوء الديناميكي (DLS) باستخدام ليزر He-Ne بقطر 633 نانومتر. تحضير العينات عن طريق التخفيف في مياه فائقة النقاء بناء على حدود كشف الكوفيت (مثل تخفيف 1:100 لكوفيتات بسعة 1 مل). متوسط السجل ± SD من ثلاث نسخ.
      تحذير: استخدم الكلوروفورم في غطاء بخار مع معدات الحماية الكاملة (PPE). التخلص من نفايات المذيبات العضوية وفقا لإجراءات السلامة الكيميائية المؤسسية.
      ملاحظة: بالنسبة لGO مع توزيعات الحجم التي تتركز تقريبا عند 300 نانومتر، قم بتشغيل السونيك لمدة 10 دقائق عند 125 واط، والطرد المركزي عند 7,700 x g لمدة 30 دقيقة عند 4 درجات مئوية، وجمع السوبرناتينت، ثم الطرد المركزي مرة أخرى عند 18,620 x g لمدة 30 دقيقة، ثم أعد تعليق الحبيبة. بالنسبة ل GO مع توزيعات الحجم التي تتركز تقريبا عند 100 نانومتر، قم بتشغيل سونيكات 3 × 180 دقيقة عند 4 درجات مئوية، والطرد المركزي عند 10,000 × g لمدة 30 دقيقة، عند 4 درجات مئوية بعد كل جولة، وجمع السوبرناتينت النهائي.

2. تحضير بلازما الإنسان

  1. بلازما الإنسان التجارية (HP)
    1. قم بتخفيف البلازما التجارية المزيفة بالليوفيليا بماء فائق النقاء حسب الحاجة.
    2. قم بالطرد المركزي بالبلازما المعاد تشكيلها عند 18620 x g لمدة 15 دقيقة عند 4 درجات مئوية، ثم جمع المادة الفائقة وخزنها عند -80 درجة مئوية حتى الاستخدام.
  2. نقاط الصحة المشتقة من المريض
    1. عينات دم الطرد المركزي بقوة 1216 x g لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية وجمع المادة الفائقة لفصل البلازما.
    2. عينات بلازما Aliquot بحجم 450 ميكرولتر في أنابيب بروتين منخفضة الارتباط بحجم 0.5 مل وتخزينها عند -80 درجة مئوية حتى الاستخدام.
      ملاحظة: يتم جمع جميع عينات البلازما البشرية وفقا للإرشادات الأخلاقية المؤسسية، وتم الحصول على موافقة مستنيرة من جميع المشاركين.
      تحذير: البلازما البشرية خطيرة بيولوجيا. تعامل داخل خزانة السلامة البيولوجية (BSC) باستخدام القفازات، ومعطف المختبر، ونظارات واقية. التخلص من جميع المواد التي تحتوي على بلازما وفقا للوائح السلامة البيولوجية والتخلص من النفايات المؤسسية.

3. تشكيل حزب PC

  1. مناولة السوائل يدويا
    1. تحديد نسبة NP:البلازما المثلى عن طريق قياس تركيز البروتين عبر اختبار حمض البيسينكونينيك (BCA) لضبط تخفيف البلازما.
    2. أضف 100 ميكرولتر من تعليق NP إلى 100 ميكرولتر من البلازما للوصول إلى تركيزات البلازما المطلوبة.
    3. حضانا عند 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة.
      ملاحظة: لاختبار BCA، اخلط الكوشفين A و B (50:1)، وحضر تخفيفات BSA القياسية، وأضف 10-25 ميكرولتر عينة لكل مادة كاشف قياسي + 200 ميكرولتر، واحتضن 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية، وقس الامتصاص عند 562 نانومتر. عادة ما يتم تعديل تركيزات البلازما بين 0.5٪ و50٪ v/v بالنسبة لحجم NP، حسب نوع NP. بالنسبة ل GO، استخدم تركيزات أقل (من 0.5٪ إلى 5٪ موصى بها)؛ بالنسبة لنقاط DOTAP/الذهب، استخدم تركيزات أعلى (حتى 50٪). استخدم أنابيب بروتين 1.5 مل منخفضة الترابط.
  2. بروتوكول الحضانة الآلي
    1. تحميل بروتوكول برنامج معالجة السوائل على منصة التوصيل الآلية (رؤوس 20 ميكرولتر + 200 ميكرولتر)
    2. توزيع 100 ميكرولتر من كل نوع NP في أنابيب منخفضة الربط بسعة 1.5 مل.
    3. أضف البلازما المعاد تشكيلها المحضرة كما في 2.1 و2.2، وفقا للصيغة التالية:
      حيث VNP هو حجم التعليق NP. بالنسبة ل 100 ميكرولتر من NP:
      figure-protocol-1
      5٪: 5.3 ميكرولتر حصان
      20٪: 25 ميكرولتر حصان
      50٪: 100 ميكرولتر حصان
    4. أضف ماء فائق النقاء للوصول إلى 200 ميكرولتر:
      5٪: 94.7 ميكرولتر
      20٪: 75 ميكرولتر
      50٪: لا شيء
    5. عينات الميكس:
      5٪: 15 ميكرولتر دورة
      20٪: 50 ميكرولتر دورة
      50٪: دورة 100 ميكرولتر 3.2.6. الحضانة عند 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة
      ملاحظة: يوضح الشكل التكميلي 1 الواجهة الرسومية للإعداد الآلي المستخدم لتحضير خلطات NP-HP عند ثلاث تركيزات بلازما نهائية (5٪، 20٪، و50٪ v/v)، كل تركيز ثلاثي. يشمل تصميم السطح رفوف الطرف، وخزان نفايات، ورف أنابيب منخفض الربط بسعة 3 × 4 يحتوي على تعليقات NP (GO، كرامات نانوية ذهبية، وDOTAP ليبوسوم) (NP)، وHP، وماء فائق نقي (H2O). استخدم أنابيب منخفضة الارتباط بالبروتين.

4. تحليل الحاسوب بواسطة SDS-PAGE

  1. عزل الحاسوب الشخصي
    1. قم بعمل الطرد المركزي على عينات NP-HP عند 18,620 × جم، 4 درجات مئوية، لمدة 15 دقيقة. يجب أن يكون هناك حبيبة مرئية في أسفل الأنبوب. تخلص بعناية من السوبرناتانت، الذي يجب أن يبدو واضحا قبل المتابعة (انظر الشكل التكميلي 2).
    2. اغسل الحبيبات بماء فائق نقي 200 ميكرولتر، أعد تعليقها، ثم أعد تمركزها في الطرد المركزي. كرر هذه الخطوة مرتين. بعد الغسل النهائي، يجب أن يظل الحبيبات المضغوطة مرئية، مما يؤكد العزل الناجح لمجمعات بروتين NP (انظر الشكل التكميلي 2).
    3. تجهيز مخزن التحميل (LB):
    4. احسب حجم ال LB الكلي بناء على حالة البلازما وعامل العزل الخلط (1:10)، وبروتينات إزالة الطبيعة لمخزن عينات SDS (1:2)، والماء.
    5. أعد تعليق الحبيبات بحجم مناسب يبلغ 1x رطل واغلي على حرارة 100 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.
    6. جهاز الطرد المركزي عند 18,620 × جرام، 4 درجات مئوية، لمدة 15 دقيقة. اجمع السوبرناتانت.
  2. تحميل عينات SDS-PAGE
    1. جهز السلم عن طريق تخفيف معيار الوزن المولي (MW) باستخدام مخزن التحميل.
    2. قم بتخفيف 10x من Tris/Glycine/SDS مع تشغيل المخزن إلى 1x.
    3. قم بتجميع غرفة الرحلان الكهربائي باستخدام جل خال من البقع بنسبة 4٪-20٪ وأضف محلول كهربائي حتى يصل إلى المستوى الموصى به من قبل الشركة المصنعة.
    4. حمل 10 ميكرولتر عينات و7 ميكرولتر سلم في كل بئر. شغل الجل على 150 فولت لمدة ~90 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
      ملاحظة: يجب حساب حجم LB بناء على تركيز البلازما المختار في 3.1.1 لضمان الرؤية المثلى للبروتين في صورة الجل (عادة 10 ميكروغرام بروتينات في 20 ميكرولتر رطل).
      تحذير: لتحقيق أفضل قابلية تكرار، قم بإجراء تحليل SDS-PAGE باستخدام عينات NP-plasma معدة حديثا. أدى تخزين الحبيبات المغسولة عند -80 درجة مئوية لمدة 24 ساعة إلى تغييرات قابلة للكشف في الخصائص الفيزيائيةوالكيميائية (بعد إعادة التعليق وقياسات جهد DLS/Zeta) وبصمات بصمات الكورال البروتيني (عند معالجة الحبيبات بدءا من الخطوة 4.3.1 من البروتوكول؛ انظر الشكل التكميلي 3).

5. تحليل أنماط البروتين

  1. معالجة الصور
    1. جل الصور باستخدام جهاز تصوير كيميائي للتوليخ.
    2. عالج صورة الجل كما يلي:
      1. استورد صورة الجل وحفظها كملف TIFF، وصححه للكشف عن التأثيرات غير المرغوب فيها، مثل تشوهات المسارات المائلة التي تؤثر بشكل خاص على المسارات الطرفية. اكتشف جميع خطوط الجل. اطرح إشارة الخلفية من الصورة.
      2. معايرة الإزاحات الرأسية عن طريق تحويل وحدات البكسل إلى وحدات وزن جزيئي، بناء على توافق أسي مزدوج المدى لمسار العلامة. توليد مخرجات رسومية لعرض ملفات تعريف الشدة وتوزيعات الإشارات الخاصة بالمسار.
    3. تصدير البيانات المعالجة، أي الملفات الشخصية أحادية البعد المحسوبة.
    4. احسب توزيعات الوزن الجزيئي عن طريق تطبيع الملفات الشخصية، وحساب المساحات التكاملية عبر نطاقات الميغاواط المطلوبة لكل مسار.
    5. تصدير بيانات المخرجات، أي المناطق المتكاملة ضمن نطاقات الوزن الجزيئي المحددة.
  2. التحليل متعدد المتغيرات للتشخيص
    1. تطبيق التحليل الخطي المميز (LDA) أو طرق متعددة المتغيرات الأخرى لتحليل التصنيف.
    2. احسب الدقة والحساسية والتخصص، وقم بإجراء تحليل ROC.
      ملاحظة: السكربتات المستخدمة لمعالجة الصور، وتطبيع الملف الشخصي، والتركيب، والتصنيف متوفرة من27، حيث يتم توفير دليل المستخدم المقابل أيضا.
      تحذير: اتبع بروتوكولات السلامة البيولوجية عند التعامل مع بلازما الإنسان.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

أحد التحديات الرئيسية في توحيد تجارب الحاسب الشخصي يكمن في تقليل التباين التقني والمعتمد على المشغل، كما أبرزت سابقا هذه الدراسة26. لا تزال الأسئلة المفتوحة قائمة حول تأثير المتغيرات التجريبية مثل تحيز المشغلين وتأثير الأدوات الآلية على قابلية التكرار18،28.

أولا، تقدم هذه الدراسة التقييم المنهجي لمتانة البروتوكول ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

مرونة الطرق وقابلية التكرار عبر أنواع NP

يوفر البروتوكول المعروض هنا سير عمل موحد وقابل للتكرار لعزل وتوصيف الحاسوب الشخصي الذي يتكون على NP عند الحضانة مع HP. كما أظهر في الدراسات السابقة والحالية33، تمكن هذه الطريقة من توليد بصمات جزيئية تعتمد على SDS-PAGE تلتقط الميزات البيولوجية والتشخيصية ذات الصلة للحاسوب الشخصي. الاتساق الملحوظ بين سير العمل اليدوي والآلي يعالج تحديا مركزيا في أبحاث الحوسبوب الشخصية: تقليل التفاو...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

لا يوجد لدى المؤلفين تضارب مصالح للكشف عنها.

شكر وتقدير

تم تمويل البحث جزئيا من قبل MUR، الخطة الوطنية للاستثمارات التكميلية ل NRRP، الممولة من الاتحاد الأوروبي-NextGenerationEU، مشروع "D3 4 HEALTH-التشخيصات الرقمية المدفوعة بالبيانات، التنبؤات والعلاجات من أجل الرعاية الصحية المستدامة". PNC0000001، سبوك 3 لينيا تيماتيكا 2، ميشيني 4، كومبوننت 2 CUP: B53C22006120001. وقد دعم هذا العمل أيضا مؤسسة AIRC ضمن مشروع IG 2020-ID. 24521، P.I. Pozzi Daniela.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
أنبوب لوبيند بروتين 1.5 ملإبندورف22431081
10x تريس/جلايسين/SDSبيوراد1610732
الطرد المركزيلابورتكنيكZ 216 MK Hermleاستخدمت عند 18,620 قدم رعب لمدة 20 دقيقة عند 4 فوه؛ C
نظام تصوير ChemiDocبيو-راد12003153يستخدم لالتقاط صور الجل
الكلوروفورمسيغما ألدريتشC2432-1Lمذيب ل DOTAP
كورنينج 1-200 وميكرو؛ رؤوس مضرب الأنابيب الضخمة من Universal Fitكورنينغ4845
جل كريتيريون TGX الخالي من الصبغات مسبقا الصببيوراد5678095
ماء مقطر 6 × 1 لترثيرمو فيشر15230001
DOTAP (1,2-ديولويل-3-تريميثيل أمونيوم-بروبان)أفانتي بولار ليبيدات890890P-200mgيستخدم لتحضير ليبوزومات كاتيونية؛ مذاب في الكلوروفورم، تبخر، ترطيب، ومطرود
مزود طاقة Enduro 300V  Labnet E0303-230V
قارئ الميكروبليت GloMax DiscoverبروميغاGM3000
جسيمات الذهب النانوية (مستقرة بالسترات)سيغما-ألدرتش742031-25MLيستخدم كمادة نانوية؛ يستخدم دون تنقية إضافية
جل البولي أكريلاميد التدرج (4– 20٪ TGX)بيو-راد5678095يستخدم ل SDS و ndash; الصفحة
جرانت إنسترومنت  Thermoshaker HC24N (أنابيب دقيقة 24 × 1.5 مل)فيشر العلميPHMT-PSC24N
محلول أكسيد الجرافين (GO)الجرافينياGO-4-1000يستخدم كمادة نانوية؛ مخفف إلى 0.25 ملغ/مل وتم تحويله إلى القطع الصوتية
بلازما الإنسان (HP)سيغما-ألدرتشP9523-5MLيستخدم في حضانة الجسيمات النانوية
برنامج إيمجلاببيو-رادي. الإصدار 6.1.0.07/يستخدم لتصدير صورة الجل كملفات tiff
مخزن تحميل Laemmli 2xبيوراد1610737يستخدم لإعادة تعليق الحبيبات
ماتلابMathWorks. الإصدار R2022a/يستخدم لمعالجة الصور، وتحليل البيانات، وحساب الملفات الشخصية
ميني-بثقلأفانتي بولار ليبيدات610020يستخدم لتحضير الليبوسوم
عامل تقليل عينات NuPAGE (10X)ثيرمو ساينتفيكNP004
محلول المحلول الملحي الفوسفاتكورنينغ 21-031-سميستخدم لعينات DOTAP-HP
مجموعة اختبار بروتين بيرس BCA، مجموعة واحدة (1 لتر)ثيرموفيشر23225
أطراف الطباعة من 0.5 إلى 10 أول شفافأكسجينT-300-STK
PIPETMAN L P10L، 0.5-10 وميكرو؛ L، قاذف معدنيجيلسونFA10002M
PIPETMAN P20، 2-20 وميكرو؛ L، قاذف معدنيجيلسونF144056M
PIPETMAN P200، 20-200 وميكرو؛ L، قاذف معدنيجيلسونF144058M
نظام التوصيل الآلي PIPETMAXجيلسونGSYS0021يستخدم في التعامل الآلي مع العينات
فلتر البولي كربونات (0.1 وميكرو؛ m)أفانتي بولار ليبيدات610005-1EAيستخدم في بثق الليبوسوم
بروتين بريسيجن بلس بروتينات مصطنعة بالكامل باللون الأزرقبيوراد1610373
معايير بروتين غير مصبوغ من Precision Plus بيوراد1610363EDU
جهاز الصوت VC505 باستخدام Vibra Cellشركة سونيكس آند ماتيريالزVC505
زيتا سايزرمالفرنZS90يستخدم لقياسات تشتت الضوء الديناميكي (DLS) والرحلان الكهربائي الدقيق (ME)

المراجع

  1. Cai, R., Chen, C. The crown and the scepter: Roles of the protein corona in nanomedicine. Adv Mater. 31 (45), 1805740(2019).
  2. Caputo, D., et al. Nanotechnology meets oncology: A perspective on the role of the personalized nanoparticle-protein corona in the development of technologies for pancreatic cancer detection. Int J Mol Sci. 23 (18), 10591(2022).
  3. Lundqvist, M., et al. The evolution of the protein corona around nanoparticles: A test study. ACS Nano. 5 (9), 7503-7509 (2011).
  4. Hajipour, M. J., et al. Personalized protein coronas: A "key" factor at the nanobiointerface. Biomater Sci. 2 (9), 1210-1221 (2014).
  5. Quagliarini, E., et al. Protein corona-enabled serological tests for early-stage cancer detection. Sens Int. 1, 100025(2020).
  6. Caracciolo, G., et al. Size and charge of nanoparticles following incubation with human plasma of healthy and pancreatic cancer patients. Colloids Surf B Biointerfaces. 123, 673-678 (2014).
  7. Barrán-Berdón, A. L., et al. Time evolution of nanoparticle-protein corona in human plasma: Relevance for targeted drug delivery. Langmuir. 29 (21), 6485-6494 (2013).
  8. Yu, Y., Luan, Y., Dai, W. Dynamic process, mechanisms, influencing factors, and study methods of protein corona formation. Int J Biol Macromol. 205, 731-739 (2022).
  9. Hadjidemetriou, M., Kostarelos, K. Evolution of the nanoparticle corona. Nat Nanotechnol. 12 (4), 288-290 (2017).
  10. Caputo, D., et al. A protein corona-enabled blood test for early cancer detection. Nanoscale. 9 (1), 349-354 (2017).
  11. Pozzi, D., Caracciolo, G. Exploiting differences in personal nanoparticle corona profiles for cancer diagnostics. , Taylor & Francis. 431-433 (2025).
  12. Vence, M. G., et al. Potential clinical applications of the personalized, disease-specific protein corona on nanoparticles. Clin Chim Acta. 501, 102-111 (2020).
  13. Di Domenico, M., et al. Nanoparticle-biomolecular corona: A new approach for the early detection of non-small-cell lung cancer. J Cell Physiol. 234 (6), 9378-9386 (2019).
  14. Papi, M., et al. Exploitation of nanoparticle-protein interactions for early disease detection. Appl Phys Lett. 114 (16), 163702(2019).
  15. Di Santo, R., et al. Protein corona profile of graphene oxide allows detection of glioblastoma multiforme using a simple one-dimensional gel electrophoresis technique: A proof-of-concept study. Biomater Sci. 9 (13), 4671-4678 (2021).
  16. Caputo, D., et al. Synergistic analysis of protein corona and haemoglobin levels detects pancreatic cancer. Cancers. 13 (1), 93(2020).
  17. Colapicchioni, V., et al. Personalized liposome-protein corona in the blood of breast, gastric and pancreatic cancer patients. Int J Biochem Cell Biol. 75, 180-187 (2016).
  18. Di Santo, R., et al. Personalized graphene oxide-protein corona in the human plasma of pancreatic cancer patients. Front Bioeng Biotechnol. 8, 491(2020).
  19. Digiacomo, L., et al. Efficient pancreatic cancer detection through personalized protein corona of gold nanoparticles. Biointerphases. 16 (1), 011010(2021).
  20. Caputo, D., Caracciolo, G. Nanoparticle-enabled blood tests for early detection of pancreatic ductal adenocarcinoma. Cancer Lett. 470, 191-196 (2020).
  21. Caracciolo, G., et al. Challenges in molecular diagnostic research in cancer nanotechnology. Nano Today. 27, 6-10 (2019).
  22. Ashkarran, A. A., et al. Measurements of heterogeneity in proteomics analysis of the nanoparticle protein corona across core facilities. Nat Commun. 13 (1), 6610(2022).
  23. Pederzoli, F., et al. Protein corona and nanoparticles: How can we investigate on. Wiley Interdiscip Rev Nanomed Nanobiotechnol. 9 (6), e1467(2017).
  24. Otoo, J. A., Schlappi, T. S. REASSURED multiplex diagnostics: A critical review and forecast. Biosensors. 12 (2), 124(2022).
  25. Papi, M., Caracciolo, G. Principal component analysis of personalized biomolecular corona data for early disease detection. Nano Today. 21, 14-17 (2018).
  26. Giulimondi, F., et al. Reproducibility of biomolecular corona experiments: A primer for reliable results. Part Part Syst Charact. 40 (2), 2200169(2023).
  27. Renzi, S., et al. Structuring lipid nanoparticles, DNA, and protein corona into stealth bionanoarchitectures for in vivo gene delivery. Nat Commun. 15 (1), 9119(2024).
  28. Van Dorpe, S., et al. Integrating automated liquid handling in the separation workflow of extracellular vesicles enhances specificity and reproducibility. J Nanobiotechnology. 21 (1), 157(2023).
  29. Quagliarini, E., et al. The influence of protein corona on graphene oxide: Implications for biomedical theranostics. J Nanobiotechnology. 21 (1), 267(2023).
  30. Jiříčková, A., et al. Synthesis and applications of graphene oxide. Materials. 15 (3), 920(2022).
  31. Saorin, A., et al. A redefined protocol for protein corona analysis on graphene oxide. ACS Nanosci Au. , (2025).
  32. Digiacomo, L., et al. Nanoparticle-protein corona enhances accuracy of Ca-19.9-based pancreatic cancer classification. Nanoscale. 17 (12), 7066-7075 (2025).
  33. Caputo, D., et al. Improving the accuracy of pancreatic cancer clinical staging by exploitation of nanoparticle-blood interactions: A pilot study. Pancreatology. 18 (6), 661-665 (2018).
  34. Quagliarini, E., et al. A decade of the liposome-protein corona: Lessons learned and future breakthroughs in theranostics. Nano Today. 47, 101657(2022).
  35. Wu, S. Y., An, S. S. A., Hulme, J. Current applications of graphene oxide in nanomedicine. Int J Nanomedicine. 10 Suppl 1, 9-24 (2015).
  36. Caputo, D., et al. Multiplexed detection of pancreatic cancer by combining a nanoparticle-enabled blood test and plasma levels of acute-phase proteins. Cancers. 14 (19), 4658(2022).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

BCA

مقالات ذات صلة